壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)在制備抗卵巢癌藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)的新用途，尤其是壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)在制備抗卵巢 癌藥品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢癌是發(fā)生于卵巢組織的惡性腫瘤，他是重要威脅婦女健康常見的惡性腫瘤之 一，在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位，在我國發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌。
[0003] 卵巢癌主要分類為以下三種：（1)上皮腫瘤：包括黏液腺瘤、漿液腺瘤、子宮內(nèi)膜 樣腺瘤、透明細(xì)胞瘤、勃勒瘤及混合上皮瘤；（2)性索間質(zhì)腫瘤：包括顆粒間質(zhì)細(xì)胞瘤、胚胎 瘤、多胚瘤、絨癌、畸胎瘤等；（4)類脂細(xì)胞瘤、非卵巢特意性軟組織腫瘤、性母細(xì)胞瘤、轉(zhuǎn)移 性腫瘤、瘤樣病變等。
[0004] 公認(rèn)的病因及發(fā)病機(jī)制與環(huán)境因素、內(nèi)分泌因素、遺傳因素、飲食習(xí)慣、病毒感染、 化學(xué)、放射線、精神因素等均與卵巢癌發(fā)病有關(guān)。
[0005] 治療方法采用手術(shù)外科治療、放療、化療，中醫(yī)則將卵巢癌的癥狀分為脾腎陽虛 型、肝腎陰虛型、氣血虧虛型、血瘀內(nèi)結(jié)型及肝氣內(nèi)結(jié)型，對癥下藥，分類型治療。
[0006] CN103146703A公開了抑制上皮性卵巢腫瘤生長的SiRNA及其重組載體與應(yīng)用。該 發(fā)明篩選到一種抑制上皮性卵巢癌基因表達(dá)的干擾序列及構(gòu)建了含有該干擾序列的重組 載體。
[0007] CN102670944A公開了一種治療卵巢癌的中藥復(fù)方制劑及其制備方法。該中藥復(fù)方 制劑由黃芪、黨參、生地、半枝蓮、白術(shù)、枸杞、木香、天冬、白芍等11種中草藥的提取物制成 固體或液體劑型，經(jīng)過動物實(shí)驗(yàn)表明，具有較明顯療效。
[0008] CN102876770A公開了一種腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物基因及其應(yīng)用，該發(fā)明提供了一種腫瘤 轉(zhuǎn)移標(biāo)志物基因及其用于抗癌的新藥物開發(fā)的應(yīng)用，還提供了腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志基因在制備診 斷癌癥的診斷劑的應(yīng)用。
[0009] CN102908321A公開了一種白蛋白結(jié)合型紫杉醇納米粒凍干制劑及其制備方法。該 發(fā)明的制劑由紫杉醇、人血清白蛋白、表面活性劑、油相、凍干骨架劑、穩(wěn)定劑、PH調(diào)節(jié)劑制 備成凍干制劑。
[0010] CN102783461A公開了人工培殖壁虎蛆蟲的工藝，本發(fā)明以壁虎等原料培殖培養(yǎng) 基，通過一種溫和條件使壁虎機(jī)體大分子轉(zhuǎn)換為小分子成分，培育過程消除了壁虎的毒素 及過敏源，擴(kuò)大了壁虎藥用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)在制備抗卵巢癌藥品中的應(yīng)用，本發(fā)明 工藝過程中采用適宜的方法提取分離壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)，并根據(jù)壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)的特性輔以 相應(yīng)的材料至制備成不同劑型的藥劑。
[0012] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： (1)將1000 g壁虎蛆蟲在常溫膨化裝置（200520108339. X)中常溫條件下膨化粉碎。
[0013] 本步驟中，所述膨化壓力為0· l~5MPa，時間為10~60min。
[0014] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)粗品。
[0015] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 · H2O組成或由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0016] 本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時間為10~30min。
[0017] (3)收集含有壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液并且用微孔過濾器過濾去掉雜質(zhì)。
[0018] 本步驟中，所述微孔過濾器的孔徑為0. 5~50Mm。
[0019] (4)用超濾機(jī)超濾處理，收集含有相應(yīng)分子量的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液。
[0020] 本步驟中，所述超濾機(jī)的孔徑為50~100nm。
[0021] (5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0022] 本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0023] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0024] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0025] (7)純化后的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)制備成凍干蛋白粉。
[0026] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_30~50°C、時間為18~26h。
[0027] (8)賦予不同的藥用輔助材料，分別制備成注射劑、口服劑、栓劑等，可用于制備抗 卵巢癌藥品。
[0028] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：通過本發(fā)明分離純化的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì) 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法及葡聚糖凝膠G-75凝膠過濾法測得相對分子量為 11. 8~12. 6KPa ;用等電聚焦法測定其等電點(diǎn)為pH9. 6~10. 7 ;常規(guī)化學(xué)法分析結(jié)果表明其不 含糖類和磷酸基團(tuán)；紫外分光光度法分析在260nm和280nm測定純化的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)含 量為98. 2%;分子結(jié)構(gòu)屬非典型、非單一的昆蟲蛋白質(zhì)，鏈內(nèi)與鏈間不含二硫鍵，其三級結(jié) 構(gòu)構(gòu)象單元以無規(guī)卷曲為主，α螺旋與β折疊的含量比例基本相當(dāng)。本發(fā)明制備的壁虎 蛆蟲蛋白質(zhì)制劑質(zhì)量穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)清楚，藥理明晰，療效明顯，含量可檢可測，劑型多樣，成本 較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限如此，凡是對 本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0030] 實(shí)施例1: (1)將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至0. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 · H2O,加壓至2~10MPa，形成膨 脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓 至常壓，生成壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)粗品與甲醇-NH 3 · H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質(zhì)； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應(yīng)分子量的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預(yù)處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外檢測器波長260~280nm ; (7) 純化后的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-30~50°〇、時間18~2611干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0031] 實(shí)施例2: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至0. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液態(tài)二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 · H2O,加壓至5MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度15°C，時間20min，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓至常壓，生成壁虎蛆蟲蛋 白質(zhì)粗品與甲醇-NH 3 · H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑30Mm的微孔過濾器過濾去處固體雜 質(zhì)； (4) 溶液用孔徑IOOnm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 5MPa，溫度為常溫，收集含有相應(yīng)分 子量的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化預(yù)處理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用1〇~80%的乙腈梯度脫洗，流速 5mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率I. 0KW，頻率500KHz，流速200mL/ min，紫外檢測器波長260nm ; (7) 純化后的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-30~40°C、時間20h干燥制備 成凍干蛋白粉。
[0032] 實(shí)施例3: (1)將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至0. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨，加壓至2~10MPa，形成膨脹 溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓至 常壓，生成壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)粗品與乙醇-氯化銨的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質(zhì)； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應(yīng)分子量的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預(yù)處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)溶劑體系中， 用超聲駐波液相制備色譜（200920274485. 8 )分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外檢測器波長 260~280nm ; (7) 純化后的壁虎蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-30~50°〇、時間18~2611干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0033] 實(shí)施例4: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至2MPa，時間40min，