一種蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)在制備抗食道癌藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥品的新用途，尤其是一種蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)在制備抗食道癌藥品 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食道癌是由于暴怒憂思、傷及肝脾，脾傷則氣結(jié)，氣結(jié)則津液不能輸流，阻而成痰， 肝傷則氣郁，氣郁則血液不能暢行，遂而為瘀，瘀痰阻塞食道，結(jié)聚胃腑，故食物難于下行， 或由外因飲食不節(jié)，長期刺激食道而引起的病癥。
[0003]CN93104343公開了治療食管癌的中成藥，由砒石、斑蝥、蟾蜍、蛇毒、蜈蚣水蛭、蝎 尾、守宮、牛黃、人參等14種中藥組成；CN1475233公開了一種治療食道癌中藥粉末的制備 方法，由珍珠、牛黃、冰片、薏苡仁、月石、小皂角、白礬、冬蟲夏草、陳皮等11種中藥組成； CN101129607A公開了一種治療食管癌患者化療后免疫功能損傷的中藥空腹也，由人參、黃 芪、冬蟲夏草、白術(shù)、茯苓、甘草、當(dāng)歸、枸杞子等中藥草組成；CN100391525公開了一種治療 食道癌的中藥，由山慈菇、紫河車、半枝蓮、金銀花、蜈蚣、全蝎、地龍、人參、三期、靈芝、甘草 等16種中藥組成。
[0004] 201210178608. 4公開了人工培殖蜈蚣蛆蟲的方法，該發(fā)明以蜈蚣等為原料，經(jīng)多 步驟定向培殖蜈蚣蛆蟲，培殖過程可控，適合工業(yè)化生產(chǎn)，培殖的蜈蚣蛆蟲消除了蜈蚣具有 的毒性，該蟲體機(jī)體成分具有較高的生物活性。
[0005]上述由原植物組成的中藥制劑都可以用于抗食管癌藥品制備，但是由于前述的幾 個藥方中藥物繁多，每種中草藥由于種植區(qū)域、氣候、品種、采收時間、炮制及加工方法的差 異，在工業(yè)化生產(chǎn)中難于保證產(chǎn)品的一致性，也難于控制質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)在制備抗食道癌藥品中的應(yīng)用，采用蜈 蚣蛆蟲為原料，通過一系列的工藝條件分離純化成為蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)，制備成四項給藥系 統(tǒng)，具有藥效高、一致性好的特點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： (1)將1000 g蜈蚣蛆蟲在常溫膨化裝置（200520108339.X)中常溫條件下膨化粉碎。
[0008] 本步驟中，所述膨化壓力為0?l~5MPa，時間為10~60min。
[0009] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)粗品。
[0010] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH3 ?H2O組成或由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0011] 本步驟中，所述提取溫度為10~20°c，時間為10~30min。
[0012] (3)收集含有蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液并且用微孔過濾器過濾去掉雜質(zhì)。
[0013] 本步驟中，所述微孔過濾器的孔徑為0. 5~50Mffl。
[0014] (4)用超濾機(jī)超濾處理，收集含有相應(yīng)分子量的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液。
[0015]本步驟中，所述超濾機(jī)的孔徑為50~100nm。
[0016] (5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0017] 本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0018] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0019] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1.25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0020] (7)純化后的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)制備成凍干蛋白粉。
[0021] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_30~50°C、時間為18~26h。
[0022] (8)賦予不同的藥用輔助材料，分別制備成注射劑、口服靶向給藥系統(tǒng)等，可用于 制備抗食道癌藥品。
[0023] 本技術(shù)方案中分離的純化蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向聚丙烯酰 胺凝膠電泳及瓊脂聚糖免疫電泳譜上測得非均一蛋白質(zhì)；用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 及葡聚糖凝膠G-75凝膠過濾法測得相對分子量為10. 6~11.SKPa;用等電聚焦發(fā)測定其等 電點(diǎn)為PH8. 9~9. 6;常規(guī)化學(xué)法分析結(jié)果表明其不含糖基；紫外分光光度法測定純化的蜈 蚣蛆蟲蛋白質(zhì)含量為98. 2%。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限如此，凡是對 本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0025] 實施例1: (1) 將1000 g蜈蚣蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至〇.l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，蜈蚣蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的蜈蚣蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ?H2O,加壓至2~10MPa，形成膨 脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，蜈蚣蛆蟲粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓 至常壓，生成蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)粗品與甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑0. 5~5〇Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質(zhì)； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應(yīng)分子量的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預(yù)處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡,用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱,常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3.OKW，頻率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外檢測器波長260~280nm; (7)純化后的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-30~50°C、時間18~26h干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0026] 實施例2: (1) 將1000 g蜈蚣蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至〇.l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，蜈蚣蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的蜈蚣蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液態(tài)二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ?H2O,加壓至5MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度15°C，時間20min，蜈蚣蛆蟲粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓至常壓，生成蜈蚣蛆蟲蛋 白質(zhì)粗品與甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑3〇Mm的微孔過濾器過濾去處固體雜 質(zhì)； (4) 溶液用孔徑IOOnm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 5MPa，溫度為常溫，收集含有相應(yīng)分 子量的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化預(yù)處理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用1〇~80%的乙腈梯度脫洗，流速 5mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率I. 0KW，頻率500KHz，流速200mL/ min，紫外檢測器波長260nm; (7) 純化后的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-30~40°C、時間20h干燥制備 成凍干蛋白粉。
[0027] 實施例3: (1) 將1000 g蜈蚣蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至〇.l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，蜈蚣蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的蜈蚣蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨，加壓至2~10MPa，形成膨脹 溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，蜈蚣蛆蟲粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓至 常壓，生成蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)粗品與乙醇-氯化銨的混合液； (3) 收集含有蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑0. 5~5〇Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質(zhì)； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應(yīng)分子量的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預(yù)處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡,用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱,常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1.25:3.75:5)溶劑體系中， 用超聲駐波液相制備色譜（200920274485. 8 )分離純化，超聲波功率0. 2~3.OKW，頻率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外檢測器波長 260~280nm; (7) 純化后的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)在溫度-30~50°C、時間18~26h干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0028] 實施例4: (1) 將1000 g蜈蚣蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至2MPa，時間40min，然后迅速釋放壓力至常壓，蜈蚣蛆蟲被膨化 成粉體； (2) 膨化粉碎后的蜈蚣蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入6Kg液態(tài)二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化銨，加壓至6MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度20°C，時間lOmin，蜈蚣蛆蟲粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然后降壓至常壓，生成蜈蚣蛆蟲蛋 白質(zhì)粗品與乙醇-氯化銨的混合液； (3) 收集含有蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液，用孔徑5〇Mm的微孔過濾器過濾去處固體雜 質(zhì)； (4) 溶液用孔徑IOOnm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 5MPa，溫度為常溫，收集含有相應(yīng)分 子量的蜈蚣蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用60%乙腈活化預(yù)處理，加0. 08%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用1〇~80%的乙腈梯度脫洗，流速 8mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)溶劑體系中，用超 聲駐波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率2. 0KW，頻率lOOOKHz，流速 300mL/min，紫外檢測器