專利名稱：具有改善的可制備性的FAPα特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合成纖維細(xì)胞活化蛋白α(FAPα)的抗體蛋白。本發(fā)明還涉及上述抗體用于診斷和治療目的的應(yīng)用以及生產(chǎn)上述抗體的方法。
背景技術(shù)：
上皮癌的侵入性生長是同支持基質(zhì)中很多特征性的細(xì)胞和分子改變相關(guān)的。很多類型上皮癌的反應(yīng)性基質(zhì)的高度一致的分子特征是成纖維細(xì)胞活化蛋白α(此后稱為FAP)的誘導(dǎo)，F(xiàn)APα是最初由單克隆抗體F19鑒定出來的反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞的一種細(xì)胞表面分子(Garin-Chesa P.,Old L.J.和Rettig W.J.(1990)反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白作為人上皮癌中一個潛在的抗體的靶。美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.)87:7235)。由于FAP抗原選擇性地表達(dá)于一系列上皮癌的基質(zhì)中而不依賴于位置和組織學(xué)類型，所以發(fā)展了一種FAP靶向構(gòu)想來顯象、診斷和治療上皮癌以及某些其它情況。為了此目的，研制出一種被稱為F19的特異性結(jié)合FAP的單克隆抗體，并描述于美國專利5,059,523和WO93/05804中，此處它們被完整引入作為參考。
在非人抗體用于人體內(nèi)應(yīng)用時產(chǎn)生的一個嚴(yán)重問題是它們迅速引起一種人抗非人的反應(yīng)，其在患者體內(nèi)降低抗體的效果并影響繼續(xù)給藥。非人抗體的人源化通常按照兩種方法之一來實(shí)現(xiàn)(1)通過構(gòu)建非人/人嵌合抗體，其中將非人的可變區(qū)連接至人的恒定區(qū)(Boulianne G.L.,Hozumi N.和ShulmanM.J.(1984)功能性小鼠/人嵌合抗體的產(chǎn)生，自然(Nature)312:643)或者(2)通過將互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)從非人的可變區(qū)移植至人的可變區(qū)，然后將這些“重構(gòu)的”人的可變區(qū)連接至人的恒定區(qū)(Riechmann L., Clark M., Waldmann H.和Winter G.(1988)重構(gòu)人的抗體用于治療，自然332:323)。嵌合抗體雖然明顯優(yōu)于小鼠的抗體，但仍在人體內(nèi)引發(fā)一種抗小鼠的反應(yīng)(LoBuglio A.F.,Wheeler R.H.,Trang J.,Haynes A.,Rogers K.,Harvey E.B.,Sun L.,Ghrayeb J.和Khazaeli M.B.(1989)在人體內(nèi)的小鼠/人嵌合單克隆抗體動力學(xué)和免疫應(yīng)答，美國國家科學(xué)院進(jìn)展86:4220)。CDR移植的或重構(gòu)的人抗體含有很少或者沒有可以被鑒定為源自小鼠抗體的蛋白質(zhì)序列。雖然一種通過CDR移植進(jìn)行人源化的抗體可能仍能引發(fā)一些免疫反應(yīng)，例如即使利用天然的人的抗體也可見到的抗同種異型或抗獨(dú)特型反應(yīng)，但CDR移植的抗體的免疫原性將明顯低于小鼠的抗體，因此能夠?qū)颊哌M(jìn)行更長期的治療。
同抗體用于診斷、顯象和治療的商業(yè)用途相關(guān)的另一個嚴(yán)重的限制是它們大量生產(chǎn)的可能性。很多情況下，天然的、嵌合的和/或CDR移植的抗體在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的重組表達(dá)很差。對較差的可制備性起作用的因素可能包括先導(dǎo)序列的選擇和用于生產(chǎn)的宿主細(xì)胞的選擇，以及不適當(dāng)?shù)恼郫B和分泌的減少。不適當(dāng)?shù)恼郫B可以導(dǎo)致重鏈和輕鏈難以組裝或者產(chǎn)生妨礙一條或兩條鏈分泌的不適于轉(zhuǎn)運(yùn)的構(gòu)象。通常認(rèn)為L-鏈提供組裝蛋白分泌的能力。在一些情況下，多個或者甚至單個替換可以引起抗體的可制備性增加。
由于在人類中特定疾病相關(guān)抗原的體外和體內(nèi)特異性免疫學(xué)靶向?qū)τ谠\斷和治療的臨床重要性，所以對于聯(lián)合抗原特異性、低免疫原性以及高可制備性特征的抗體的需要不斷增加。
因此，本發(fā)明要解決的問題是提供抗體蛋白，其聯(lián)合了特異性結(jié)合FAP、在人體內(nèi)低免疫原性以及在重組系統(tǒng)中高可制備性的性質(zhì)。
發(fā)明的公開通過在權(quán)利要求中說明特征的實(shí)施方案解決了技術(shù)問題。
本發(fā)明提供具有單克隆抗體F19(ATCC入藏登記號HB8269)的互補(bǔ)決定區(qū)的新型抗體蛋白，所述的新型抗體蛋白特異性結(jié)合成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)，并以其具有框架修飾為特征，這些框架修飾導(dǎo)致同帶有F19的可變區(qū)和外源的恒定區(qū)的嵌合抗體相比在宿主細(xì)胞中的可制備性提高。
如本文所用的，“抗體蛋白”是具有單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性的蛋白。
根據(jù)Kabat(Kabat E.A.,Wu T.T.,Perry H.M.,Gottesman K.S.和Foeller C.(1991)有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列(第5版),NIH出版號91-3242,U.S.Department of Health and Human Services,Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD.)連同Chothia和Lesk(Chothia和Lesk(1987)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)196:901-917)，“單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)”被理解為參與特異性抗原結(jié)合的那些氨基酸序列。
如本文所用的，術(shù)語“框架修飾”指在可變區(qū)中圍繞各互補(bǔ)性性決定區(qū)的一個或多個氨基酸的交換、缺失或添加?？蚣苄揎椏赡軐贵w蛋白的免疫原性、可制備性或結(jié)合特異性有影響。
“成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)”，也稱成纖維細(xì)胞活化蛋白α(FAPα)，是屬于絲氨酸蛋白酶基因家族的一種膜結(jié)合糖蛋白(WO 97/34927)。尚不了解脫落或分泌形式的FAP。FAP可以通過其結(jié)合單克隆抗體F19來鑒定(F19可獲自保藏于ATCC的入藏登記號HB 8269的雜交瘤細(xì)胞系)。
術(shù)語抗體蛋白的“成纖維細(xì)胞活化蛋白特異性結(jié)合”本文是指其特異性識別和結(jié)合表達(dá)FAP的人類細(xì)胞的能力。本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性可以通過如在實(shí)施例6、8和實(shí)施例12中舉例描述的用于評價結(jié)合特異性的標(biāo)準(zhǔn)方法來確定。
術(shù)語“嵌合抗體”指具有如在

圖17和18中所描述的輕鏈和重鏈可變區(qū)以及外源恒定區(qū)的抗體蛋白。本文所定義的“外源恒定區(qū)”為不同于F19的恒定區(qū)的恒定區(qū)。為了將本發(fā)明的抗體蛋白同一種嵌合抗體進(jìn)行比較，這樣的嵌合抗體必需含有與所述抗體蛋白相同的的恒定區(qū)。單純?yōu)榱苏f明和比較，在圖19至22中所描述的人的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)被用來作為一種示范。
為了提供本發(fā)明的抗體蛋白，從提取自F19的雜交瘤細(xì)胞(ATCC入藏登記號HB 8269)的RNA中確定了被稱為F19的小鼠抗體的重鏈和輕鏈基因核酸序列。
在一個實(shí)施方案中本發(fā)明涉及具有F19單克隆抗體(ATCC入藏登記號HB 8269)的互補(bǔ)性決定區(qū)的抗體蛋白，所述的新型抗體蛋白特異性結(jié)合成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)，并以其具有框架修飾為特征，這些框架修飾導(dǎo)致同具有F19的可變區(qū)和外源恒定區(qū)的嵌合抗體相比在宿主細(xì)胞中可制備性提高，其中所述的抗體蛋白源自被稱為F19的小鼠抗體(ATCC入藏登記號HB8269)。
為了產(chǎn)生人源化的FAP特異性抗體蛋白，構(gòu)建了一種嵌合抗體，其分別具有F19的輕鏈和重鏈可變區(qū)以及人的輕鏈和重鏈恒定區(qū)。小鼠/人嵌合抗體的構(gòu)建和制備是眾所周知的(Boulianne等(1984)，上面所參考的)，而且在實(shí)施例1和2中以一種示范的方式進(jìn)行說明。
本發(fā)明抗體蛋白的可變區(qū)通常連接至免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常為人免疫球蛋白的部分。對于人恒定區(qū)的DNA序列可以按照所周知的方法分離自多種人類細(xì)胞，但優(yōu)選永生化的B細(xì)胞(見Kabat等，同上，以及WO 87/02671)。因此，本發(fā)明的抗體蛋白可能含有全部或者僅僅一部分的恒定區(qū)，只要它們表現(xiàn)出對FAP抗原的特異性結(jié)合。恒定區(qū)的類型和范圍的選擇依賴于是否需要像補(bǔ)體固定或者抗體依賴的細(xì)胞毒這樣的效應(yīng)物功能，以及抗體蛋白的預(yù)期藥理學(xué)特性。本發(fā)明的抗體蛋白通常為一種由2個輕鏈/重鏈對組成的四聚體，但也可能為二聚體，即由一個輕鏈/重鏈對組成，例如Fab或Fv片段。
因此，在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白，其以具有均連接至人的恒定區(qū)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)為特征。特別是，輕鏈可變區(qū)連接至人K恒定區(qū)，而重鏈可變區(qū)連接至人γ1恒定區(qū)。其它用于人源化輕鏈和重鏈的人的恒定區(qū)對于專家也是可利用的。
因此，在一個特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體蛋白包括一個人K恒定區(qū)。
此外，在另一個特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體蛋白包括一個人γ1恒定區(qū)。
一個特定的“F19嵌合抗體”蛋白(cF19)由在圖17至22中所描述的輕鏈和重鏈可變區(qū)以及恒定區(qū)組成。cF19顯示出對FAP抗原的特異性結(jié)合和高度的親和力。如在實(shí)施例2中所顯示的，cF19在COS細(xì)胞(源自一種非洲綠猴腎臟的細(xì)胞)中的表達(dá)很差，從大約10到60ng/ml，其比大多數(shù)抗體低至少10倍。
為了增加cF19的表達(dá)水平，通過在-9位處將脯氨酸替換為亮氨酸來改變F19 VL區(qū)的先導(dǎo)序列。這種在先導(dǎo)序列中氨基酸的單個改變導(dǎo)致在COS細(xì)胞中所制備的嵌合抗體的量至少翻一番。對于這種特定的嵌合抗體在COS細(xì)胞中的表達(dá)，利用了下面突變的輕鏈先導(dǎo)序列MDSQAQVLMLLLLWVSGTCG，以及下面的重鏈先導(dǎo)序列MGWSWVFLFLLSGTAGVLS。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語在宿主細(xì)胞中“改善的可制備性”指在同未進(jìn)行框架修飾的嵌合抗體的表達(dá)水平和/或抗體產(chǎn)量相比時，表達(dá)水平和/或純化抗體的產(chǎn)量顯著改善。說明改善的可制備性的兩個特定但非限制性的實(shí)例以COS細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(在實(shí)施例2和5中)和CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(在實(shí)施例10和11中)為例。
雖然先導(dǎo)序列的突變僅僅導(dǎo)致F19嵌合抗體表達(dá)產(chǎn)量翻一番，但本文所限定的顯著改善指表達(dá)水平和/或純化產(chǎn)量至少10倍的改善。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，它們以其在原始培養(yǎng)基樣品中通過ELISA測定的表達(dá)水平和/或純化抗體的產(chǎn)量超過無框架修飾的嵌合抗體的表達(dá)水平和/或純化產(chǎn)量至少10倍為特征。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，它們以其在原始培養(yǎng)基樣品中通過ELISA測定的表達(dá)水平和/或純化抗體的產(chǎn)量超過無框架修飾的嵌合抗體的表達(dá)水平和/或純化產(chǎn)量至少20倍為特征。
在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體蛋白，它們以其在原始培養(yǎng)樣品中通過ELISA測定的表達(dá)水平和/或純化抗體的產(chǎn)量超過無框架修飾的嵌合抗體的表達(dá)水平和/或純化產(chǎn)量至少100倍為特征。
如對于COS和CHO(中國倉鼠卵巢來源的細(xì)胞)真核細(xì)胞(見實(shí)施例5和11)所示的，可以證實(shí)通常真核細(xì)胞中本發(fā)明重組抗體蛋白的可制備性改善。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及以在真核細(xì)胞中表現(xiàn)出改善的可制備性為特征的重組抗體蛋白。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其中所述的真核細(xì)胞為中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)。
意外發(fā)現(xiàn)，輕鏈可變區(qū)的某些框架修飾決定了本發(fā)明抗體蛋白的改善的可制備性。制備了3型重構(gòu)的輕鏈可變區(qū)，被指定為A型、B型和C型，其被描述于圖1至6中。
A型、B型和C型輕鏈可變區(qū)顯示出在CHO細(xì)胞中顯著改善的可制備性(見實(shí)施例11)。雖然A型和C型輕鏈可變區(qū)比B型輕鏈可變區(qū)僅有兩個常見氨基酸殘基不同，但它們在可制備性上表現(xiàn)出更顯著的改善。在人重構(gòu)的F19輕鏈B型和A或C型之間抗體分泌水平存在至少10倍的差別。重構(gòu)的人F19輕鏈A型和B型其氨基酸序列中的差異僅在36位(Tyr到Phe突變)和87位(Tyr到Asp突變)處(根據(jù)Kabat命名)。如果Tyr到Asp和Tyr到Phe突變分別或聯(lián)合僅僅引起蛋白質(zhì)不適當(dāng)?shù)恼郫B，那么這種對于含有輕鏈可變區(qū)B型的抗體的分泌能力的負(fù)效應(yīng)可能是間接的。但這不可能是事實(shí)，因?yàn)榭乖Y(jié)合檢測表明帶有F19輕鏈B型的免疫球蛋白與帶有F19輕鏈A或C型的免疫球蛋白具有相似的親合力，提示它們大概并未錯誤折疊。
重構(gòu)的人F19輕鏈B型與A和C型相比，其87位殘基似乎格外是分泌減少的原因。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白，其中在輕鏈區(qū)的Kabat 87位上的氨基酸不是天冬酰胺。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白，其中在輕鏈區(qū)的Kabat 87位上的氨基酸選自芳香族或脂肪族氨基酸。
在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白， 其中在輕鏈區(qū)的Kabat 87位上的芳香族氨基酸為酪氨酸或苯丙氨酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白，其中在輕鏈區(qū)的Kabat 36位上的氨基酸選自芳香族氨基酸。
在一特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及特異的抗體蛋白，其可以由單個公開的輕鏈和重鏈的重構(gòu)可變區(qū)來制備。
特別是輕鏈可變區(qū)A和C型因?yàn)槠湓诒Ａ羧縁AP結(jié)合特異性和實(shí)現(xiàn)低的免疫原性的同時具有格外高的可制備性而非常適于實(shí)施本發(fā)明。這在同具有F19可變區(qū)和相同恒定區(qū)的嵌合抗體相比以及同輕鏈B型相比時是成立的。
因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:2中所示的輕鏈可變區(qū)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及抗體蛋白，其以輕鏈可變區(qū)由在SEQID NO:1中所示的核苷酸序列編碼為特征。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:6中所示的輕鏈可變區(qū)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及抗體蛋白，其以輕鏈可變區(qū)由在SEQID NO:5中所示的核苷酸序列編碼為特征。
本發(fā)明還公開了幾種不同的重鏈可變區(qū)，它們與輕鏈可變區(qū)A和C型聯(lián)合可很好地改善可制備性。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:8、10、12、14中所示的重鏈可變區(qū)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其以重鏈可變區(qū)是由在SEQID NO:7、9、11、13的任何一個中所示的核苷酸序列所編碼為特征。
在一個非常特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其含有在SEQ IDNO:2中所示的輕鏈可變區(qū)以及在SEQ ID NO:12中所示的重鏈可變區(qū)。最優(yōu)選該抗體蛋白額外含有在SEQ ID NO:20中所示的輕鏈恒定區(qū)以及在SEQ IDNO:22中所示的重鏈恒定區(qū)。
因此，本發(fā)明的另一個方面為一種抗體蛋白，其含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。更優(yōu)選這種抗體蛋白進(jìn)一步含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。更優(yōu)選所述抗體蛋白進(jìn)一步含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個方面為一種抗體蛋白，如在此段中所描述的，其偶聯(lián)一種放射性同位素，優(yōu)選131I、125I、186Re、188Re或90Y。本發(fā)明的另一方面為一種DNA分子，其編碼在此段中所描述的抗體蛋白。本發(fā)明的另一個方面為攜帶這樣一種DNA分子的宿主細(xì)胞。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個方面為制備此段中所描述的抗體蛋白的方法，所述的方法包括在所述抗體蛋白由所述的宿主細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞以及分離該蛋白。本發(fā)明的另一個方面為一種藥物組合物，其包括本發(fā)明的抗體蛋白以及一種可藥用的載體。在另一特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其特征是輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列所編碼而重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO:11所示核苷酸序列所編碼。
在另一特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:2中所示的輕鏈可變區(qū)和在SEQ ID NO:8中所示的重鏈可變區(qū)。
在另一特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體蛋白，其特征是輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列所編碼而重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO:7所示核苷酸序列所編碼。
小鼠抗體可變區(qū)的人源化可以通過利用本領(lǐng)域已知的方法來實(shí)現(xiàn)。EP0239400公布了將小鼠可變區(qū)的CDR移植至人可變區(qū)的框架中。WO90/07861公布了通過引入另外的框架修飾來對一個CDR移植的可變區(qū)重構(gòu)的方法。WO 92/11018公布了聯(lián)合供者CDR和一個與供者框架高度同源的受者框架來制備人源化Ig的方法。WO 90/05274公布了從一小鼠抗體開始的框架突變抗體的制備。其它同小鼠單克隆抗體的人源化相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的參考有EP 0368684；EP 0438310；WO 92/07075或WO 92/22653。因此，專家可以從公開提供的小鼠單克隆抗體F19開始并利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如WO 92/05274來制備本發(fā)明的抗體。編碼本發(fā)明抗體蛋白的DNA分子當(dāng)然也可以通過現(xiàn)有技術(shù)中的合成方法來獲得，例如通過相應(yīng)寡核苷酸的化學(xué)合成以及隨后的連接和擴(kuò)增步驟(見例如Frank等(1987)酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)154:221-249)。
在另一個方面，本發(fā)明涉及核酸分子，其含有如上面所公布的根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白的編碼信息。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的核酸分子為含有選自SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13或15的一個核苷酸序列的核酸分子。
本發(fā)明的另一個方面為一種重組DNA載體，其含有上述核酸中任何一個的核苷酸序列，特別是在所述的核苷酸序列可操作連接至表達(dá)載體中的表達(dá)控制序列時。優(yōu)選重組DNA載體，所述的載體為表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個方面為一種宿主細(xì)胞，其攜帶所述載體，特別是表達(dá)載體。這樣一種宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。優(yōu)選這樣一種宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或者哺乳動物細(xì)胞。更優(yōu)選，所述的宿主細(xì)胞為CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞或COS細(xì)胞。
相應(yīng)地，本發(fā)明還有另一個方面為制備根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白的方法。這樣一種方法包括以下步驟(a)在所述抗體蛋白由上述宿主細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，并且(b)分離所述的抗體蛋白。
哺乳動物宿主細(xì)胞，特別CHO或COS，是優(yōu)選的。用于制備本發(fā)明抗體蛋白的宿主細(xì)胞可以由同時包含輕鏈和重鏈表達(dá)單位的單個載體來轉(zhuǎn)染(見，例如WO 94/11523)。在一個特定的實(shí)施方案中，制備根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白的方法涉及宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞由分別攜帶輕鏈和重鏈表達(dá)單位的兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染(見，例如EP 0481790)。
本發(fā)明的抗體蛋白提供了用于將治療試劑靶向至FAP抗原的高度特異性的工具。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白，其中所述的抗體蛋白結(jié)合至一種治療試劑。在本領(lǐng)域已知的多種治療試劑中，優(yōu)選選自放射性同位素、毒素、類毒素、致炎介質(zhì)、酶、反義分子、肽、細(xì)胞因子以及化療試劑的治療試劑。在放射性同位素中，發(fā)射γ、β和α射線的放射性同位素可以用作治療試劑。優(yōu)選發(fā)射β射線的放射性同位素作為用于治療的放射性同位素。已經(jīng)證實(shí)186錸、188錸、131碘和90釔是實(shí)現(xiàn)局部照射和破壞惡性腫瘤細(xì)胞的特別有效的發(fā)射γ-射線的放射性同位素。因此，特別優(yōu)選選自186錸、188錸、131碘和90釔的放射性同位索作為結(jié)合本發(fā)明抗體蛋白的治療試劑。例如，可以利用在WO 93/05804中所公布的方法對本發(fā)明的抗體進(jìn)行放射性碘標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白，其以被標(biāo)記為特征。這樣一種標(biāo)記的FAP特異性抗體使得可以進(jìn)行FAP抗原的體外和/或體內(nèi)定位和/或檢測。標(biāo)記定義為可以直接或間接檢測的標(biāo)志物。間接標(biāo)志物定義為一種標(biāo)志物，其本身不能被檢測到，還需要特異性針對該間接標(biāo)志物的另一種直接可檢測的標(biāo)志物。用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記為可檢測的標(biāo)志物。在大量可檢測的標(biāo)志物中，最優(yōu)選選自酶、染料、放射性同位素、地高辛配基和生物素的可檢測的標(biāo)志物。
本發(fā)明的另一個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白，其以結(jié)合一種可顯象試劑為特征。各種各樣的可顯象試劑，特別是放射性同位素，是現(xiàn)有技術(shù)中可提供的。對于實(shí)施本發(fā)明更優(yōu)選發(fā)射γ-射線的放射性同位素。最優(yōu)選的是125碘。
本發(fā)明的一個方面涉及藥物組合物，其含有一種如上所述的根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白以及一種可藥用的載體。此類藥物組合物對于治療腫瘤是有效的，其中所述的腫瘤同活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞相關(guān)。抗腫瘤基質(zhì)免疫療法有兩個可能的效應(yīng)物原則，它們可以協(xié)同作用(a)根據(jù)本發(fā)明的一種未修飾(非結(jié)合的，“裸露的”)的抗體可以在腫瘤基質(zhì)中誘導(dǎo)免疫破壞或者炎癥反應(yīng)，而(b)一種結(jié)合了治療試劑例如放射性同位素或其它毒性物質(zhì)的抗體，可以實(shí)現(xiàn)對惡性腫瘤細(xì)胞的局部照射和破壞。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個方面為所描述的抗體蛋白對于制備藥物組合物，特別是制備用于腫瘤治療的藥物組合物的應(yīng)用。
另一個實(shí)施方案為藥物組合物，其包括結(jié)合有如上所述的治療試劑的根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白以及對于治療腫瘤有效的可藥用的載體，其中所述的腫瘤同活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞相關(guān)。另一實(shí)施方案涉及藥物組合物，其包括結(jié)合有如上所述的可顯象試劑的根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白以及對于使患者體內(nèi)正在愈合的傷口、發(fā)炎的皮膚或腫瘤中存在的活化基質(zhì)成纖維細(xì)胞顯象有效的可藥用的載體。一個最優(yōu)選的實(shí)施方案涉及上面提到的藥物組合物，其中所述的腫瘤選自結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肺癌、侵入性膀胱癌、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移癌。
在動物或人體內(nèi)，可以證實(shí)根據(jù)疾病或所治療異常情況例如腫瘤的類型和起源，通過靜脈內(nèi)或其它途徑，例如系統(tǒng)地、局部地或外用地向目的組織或器官應(yīng)用上述藥物組合物是便利的。例如，當(dāng)不同的器官或器官系統(tǒng)需要治療，如在例如系統(tǒng)性自身免疫病，或者過敏，或者外源器官或組織的移植，或者播散的或難以定位的腫瘤中時，需要一種系統(tǒng)的作用方式。在預(yù)期只有腫瘤或免疫學(xué)作用的局部表現(xiàn)，例如局部的腫瘤時，將考慮一種局部的作用方式。
本發(fā)明的抗體蛋白可以通過專家已知的不同用藥途徑用藥，特別是靜脈注射或直接注射至靶組織中。對于系統(tǒng)性用藥，靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服或鞘內(nèi)途徑都是優(yōu)選的。更局部的用藥可以經(jīng)皮下、皮內(nèi)、賁門內(nèi)、葉內(nèi)、髓內(nèi)、肺內(nèi)或直接進(jìn)入或者臨近待治療組織(結(jié)締組織、骨組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、上皮組織)而發(fā)揮作用。根據(jù)治療的預(yù)期持續(xù)時間和效果，藥物抗體組合物可以被一次或數(shù)次施予，也可以間斷施予，例如每日用藥持續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月并以不同的劑量。
對于制備用于上述用途的適當(dāng)抗體制劑，專家可以使用已知的可注射的、生理可接受的無菌溶液。制備腸胃外注射或輸注的隨時可用的溶液時，可方便地選用等滲的水溶液，例如鹽水，或者相應(yīng)的血漿蛋白溶液。藥物組合物可以呈現(xiàn)為凍干劑或干燥制劑，其在使用前可以在無菌條件下直接用已知的可注射溶液，例如作為部分的一個試劑盒進(jìn)行復(fù)原。通過將純化的根據(jù)本發(fā)明的抗體同無菌的生理可接受溶液相混合來制備本發(fā)明抗體組合物的最終制劑用于注射、輸注或灌注，其中可以補(bǔ)加已知的載體物質(zhì)或/和添加劑(例如血清白蛋白、葡萄糖、亞硫酸氫鈉、EDTA)。
所用抗體的量有賴于疾病的性質(zhì)。在癌癥患者中，“裸露”抗體的用藥劑量可以在每次用藥0.1到100mg/m2之間，優(yōu)選在5到50mg/m2之間。對于如用碘-131標(biāo)記的放射性標(biāo)記抗體，必需確定在治療中一定不能超過的最大耐受量(MTD)。因而放射性標(biāo)記的抗體在癌癥患者體內(nèi)的應(yīng)用可以通過(每月或每周地)重復(fù)靜脈內(nèi)輸注低于MTD的劑量來進(jìn)行(見，例如Welt等(1994)臨床腫瘤學(xué)雜志(J.Clin.Oncol.)12:1193-1203)。
此外，本發(fā)明的一個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白用于癌癥治療的應(yīng)用。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合上述用于癌癥治療的治療試劑的本發(fā)明抗體蛋白的應(yīng)用。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合用于顯象活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的一種可顯象試劑的本發(fā)明抗體蛋白的應(yīng)用。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記抗體蛋白用于檢測樣品中活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞存在的應(yīng)用。
本發(fā)明的一個方面涉及一種治療腫瘤的方法，其中該腫瘤與能夠同根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白特異性形成復(fù)合物的活化基質(zhì)成纖維細(xì)胞相關(guān)，其中的抗體蛋白表現(xiàn)為裸露/未修飾的抗體、修飾的抗體蛋白，例如融合蛋白、或者結(jié)合治療試劑的抗體蛋白，該方法包括使腫瘤同有效量的上述抗體相接觸。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療如上所述腫瘤的方法，其中該腫瘤為具有選自結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肺癌、侵入性膀胱癌、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞的腫瘤。治療如上所述的腫瘤的方法可以在體外或體內(nèi)發(fā)揮作用。
本發(fā)明的另外一個方面涉及檢測正在愈合的傷口、炎癥或腫瘤中是否有活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的一種方法，其特征是(a)在適于所述抗體和抗原形成復(fù)合物的條件下，將一種可能含有活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的樣品同根據(jù)本發(fā)明的一種抗體蛋白相接觸，(b)檢測所述復(fù)合物的存在，由此檢測正在愈合的傷口、炎癥或腫瘤中活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的存在。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測腫瘤中活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞存在的方法，其中腫瘤為具有選自結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肺癌、侵入性膀胱癌、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞的腫瘤。本發(fā)明最優(yōu)選的抗體蛋白是以如上所述被標(biāo)記為特征的那些。
本發(fā)明的另一個方面還涉及使人類患者體內(nèi)正愈合的傷口、發(fā)炎的組織(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肝硬變均為陽性)或腫瘤中存在的活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞顯象的一種方法，其特征是(a)在適于形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，將結(jié)合顯象試劑的根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白施予患者，(b)顯象以該方式所形成的任何復(fù)合物，(c)由此顯象患者中活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的存在在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在腫瘤中顯象如上所述活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞存在的方法，其中腫瘤為具有選自結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞的腫瘤。
在另一個方面，本發(fā)明還涉及一種檢測腫瘤-基質(zhì)的方法，其特征是(a)在適于形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，將一適當(dāng)?shù)臉悠吠鶕?jù)本發(fā)明的抗體蛋白相接觸，(b)檢測因此所形成的任何復(fù)合物的存在，(c)將所述復(fù)合物的存在和腫瘤-基質(zhì)的存在相聯(lián)系用于實(shí)施本發(fā)明的抗體蛋白優(yōu)選用可檢測的標(biāo)志物標(biāo)記。
在另一個方面，本發(fā)明還涉及在患者中顯象腫瘤-基質(zhì)的方法，其包括(a)在適于形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，施予患者如上所述結(jié)合可顯象試劑的根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白，(b)顯象因此所形成的任何復(fù)合物，并由此在患者中顯象腫瘤-基質(zhì)的存在。
圖的說明圖1．重構(gòu)的人F19輕鏈可變區(qū)A型(hF19LA)的DNA序列，SEQ IDNO:1。
圖2．重構(gòu)的人F19輕鏈可變區(qū)A型(hF19LA)的氨基酸序列，SEQ IDNO:2。
圖3．重構(gòu)的人F19輕鏈可變區(qū)B型(hF19LB)的DNA序列，SEQ IDNO:3。與A型不同的核苷酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖4．重構(gòu)的人F19輕鏈可變區(qū)B型(hF19LB)的氨基酸序列，SEQ IDNO:4。與A型不同的氨基酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖5．重構(gòu)的人F19輕鏈可變區(qū)C型(hE19LC)的DNA序列，SEQ IDNO:5。與A型不同的核苷酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖6．重構(gòu)的人F19輕鏈可變區(qū)C型(hF19LC)的氨基酸序列，SEQ IDNO:6。與A型不同的氨基酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖7．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)A型(hF19HA)的DNA序列，SEQ IDNO:7。
圖8．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)A型(hF19HA)的氨基酸序列，SEQ IDNO):8。
圖9．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)B型(hF19HB)的DNA序列，SEQ IDNO:9。與A型不同的核苷酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖10．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)B型(hF19HB)的氨基酸序列，SEQ IDNO:10。與A型不同的氨基酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖11．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)C型(hF19HC)的DNA序列，SEQ IDNO:11。與A型不同的核苷酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖12．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)C型(hF19HC)的氨基酸序列，SEQ IDNO:12。與A型不同的氨基酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖13．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)D型(hF19HD)的DNA序列，SEQ IDNO:13。與A型不同的核苷酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖14．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)D型(hF19HD)的氨基酸序列，SEQ IDNO:14。與A型不同的氨基酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖15．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)E型(hF19HE)的DNA序列，SEQ IDNO:15。與A型不同的核苷酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖16．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)E型(hF19HE)的氨基酸序列，SEQ IDNO:16。與A型不同的氨基酸標(biāo)有下劃線并為粗體。
圖17．F19嵌合輕鏈可變區(qū)(chF19LC)的氨基酸序列，SEQ IDNO:17。
圖18．F19嵌合重鏈可變區(qū)(chF19HC)的氨基酸序列，SEQ IDNO:18。
圖19．人κ輕鏈恒定區(qū)的DNA序列，SEQ ID NO:19。
圖20．人輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，SEQ ID NO:20。
圖21．人重鏈恒定區(qū)的DNA序列，SEQ ID NO:21。
圖22．人重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，SEQ ID NO:22。
圖23．哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，其用于制備具有人K輕鏈和人γ-1重鏈的嵌合人抗體和重構(gòu)的人抗體。
(a)輕鏈表達(dá)載體pKN100(b)重鏈表達(dá)載體pG1D105圖24．修飾來用于構(gòu)建嵌合的F19輕鏈的小鼠F19輕鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。限制性酶切位點(diǎn)用粗體字母標(biāo)出。Kozak序列、CDR 1至3和剪接供體位點(diǎn)標(biāo)有下劃線。
圖25．修飾來用于構(gòu)建嵌合的F19重鏈的小鼠F19重鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。限制性酶切位點(diǎn)用粗體字母標(biāo)出。Kozak序列和剪接供體位點(diǎn)標(biāo)有下劃線。
圖26．克隆到pKN100哺乳動物表達(dá)載體中的F19嵌合抗體的DNA序列。限制性酶切位點(diǎn)由粗體字母和下劃線標(biāo)出。CDR1至3和剪接供體位點(diǎn)標(biāo)有下劃線。這是在pKN100真核表達(dá)載體內(nèi)的小鼠F19輕鏈的DNA序列。該載體具有人x恒定區(qū)基因(同種異型Km(3))的-種cDNA，其被一個強(qiáng)的人工終止序列所終止。此外，Neo篩選基因也被該人工序列所終止，而且也處于同x輕鏈表達(dá)盒相同的方向。
pKN100真核表達(dá)載體的基本組分為1-6=EcoRⅠ位點(diǎn)7-1571 =HCMVi啟動子/增強(qiáng)子583-587=TATAA盒610=轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)728-736=剪接供體位點(diǎn)731=內(nèi)含子起點(diǎn)1557 =內(nèi)含子終點(diǎn)1544-1558 =剪接受體位點(diǎn)1590-1598 =Kozak序列1599-1658 =肽先導(dǎo)序列1659-1997 =小鼠F19輕鏈1996-2004 =剪接供體位點(diǎn)2011-2657 =人x恒定區(qū)(Km(3))基因的cDNA拷貝2664-2880 =人工的spaC2終止序列2887-7845 =其為包括Amp抗性基因(處于相反的方向)、ColEⅠ和SV40復(fù)制起點(diǎn)以及Neo抗性基因(處于同HCMVi-KCT表達(dá)盒相同的方向)的pSV2neo載體DNA片段7852-8068 =人工spaC2終止信號該序列在緊靠序列起點(diǎn)處的EcoRⅠ位點(diǎn)(位點(diǎn)1-6)的上游終止。作為一種載體，該DNA序列將是環(huán)形的。
圖27．克隆到pgld105哺乳動物表達(dá)載體中的F19嵌合抗體的DNA序列。限制性酶切位點(diǎn)由粗體字母和下劃線標(biāo)出。CDR1至3和剪接供體位點(diǎn)標(biāo)有下劃線。這是含有小鼠F19重鏈可變區(qū)的真核表達(dá)載體pG1D105的DNA序列。該載體含有人γ-1恒定區(qū)(同種異型Glm(non-a,z,-x)，也稱為Gml(17)同種異型)的一種cDNA。
該構(gòu)建體的基本組分為1-2501 =基于pBR322并包括氨芐青霉素抗性基因和ColEⅠ起點(diǎn)加上SV40起點(diǎn)以及殘缺的SV40早期啟動子的序列2502-3226 =dhfr基因3233-4073 =SV40多聚A序列等4074-4079 =連接的BamHⅠ和BglⅡ位點(diǎn)(BstYⅠ)4080-4302 =SPA位點(diǎn)加上C2終止信號4303-5867 =HCMVi啟動子5879-5885 =用于克隆免疫球蛋白可變區(qū)基因的唯一Hind Ⅲ限制性位點(diǎn)5886-5894 =Kozak序列5895-5951 =信號肽5952-6323 =小鼠F19重鏈6323-6330 =剪接供體位點(diǎn)6331-6336 =用于克隆免疫球蛋白可變區(qū)基因的唯一BamHⅠ限制性位點(diǎn)6337-7388 =人γ-1恒定區(qū)的cDNA拷貝，其前面有一62bp的內(nèi)含子7389-7709 =Amie終止序列在該構(gòu)建體中所用的人γ-l恒定區(qū)具有一個Glm(non-a,z,-x)，也稱為Gml(17)的同種異型，其被限定為356位(根據(jù)Eu編號)的谷氨酸殘基(E)、358位(根據(jù)Eu編號)的蛋氨酸殘基(M)以及214位(根據(jù)Eu編號)的賴氨酸殘基(K)。這3個氨基酸在上面的序列中均標(biāo)有下劃線。
圖28．基于PCR的用于構(gòu)建人重構(gòu)的F19輕鏈的方法。該圖提供了構(gòu)建策略的簡要示意圖。虛線表示在引物間一段至少21個堿基的互補(bǔ)序列。
圖29．重構(gòu)的人F19輕鏈可變區(qū)A型、B型和C型的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列。將核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列對齊排列并同A型的相比較，短劃線表示同該序列核苷酸的相同性，點(diǎn)表示同該序列氨基酸的相同性。氨基酸根據(jù)Kabat等(1991)來編號。CDR的位置用框標(biāo)出。
圖30．克隆到pKN100哺乳動物表達(dá)載體中的F19LA(人重構(gòu)的輕鏈A型)的DNA序列。限制性酶切位點(diǎn)由粗體字母和下劃線標(biāo)出。CDR1至3和剪接供體位點(diǎn)標(biāo)有下劃線。這是克隆至pKN100真核表達(dá)載體中的重構(gòu)F19輕鏈A型的DNA序列。該載體具有人χ恒定區(qū)基因(同種異型Km(3))的一種cDNA，其被一個強(qiáng)的人工終止序列所終止。此外，Neo篩選基因也被該人工序列所終止，而且也處于同χ輕鏈表達(dá)盒相同的方向。
該載體的基本組分為7-1571=HCMVi啟動子/增強(qiáng)子583-587 =TATAA盒610 =轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)728-736 =剪接供體位點(diǎn)731 =內(nèi)含子起點(diǎn)1557 =內(nèi)含子終點(diǎn)1544-1558 =剪接受體位點(diǎn)1590-1598 =Kozak序列1599-1658 =肽先導(dǎo)序列1659-1997 =重構(gòu)的F19輕鏈A型1996-2004 =剪接供體位點(diǎn)2011-2657 =人x恒定區(qū)(Km(3))基因的cDNA拷貝2664-2880 =人工的spaC2終止序列2887-7845 =其為包括Amp抗性基因(處于相反的方向)、ColEⅠ和SV40復(fù)制起點(diǎn)以及Neo抗性基因(處于同HCMVi-KCT表達(dá)盒相同的方向)的pSV2neo載體DNA片段7852-8068 =人工spaC2終止信號該序列終止于緊靠以下序列起點(diǎn)處的EcoRⅠ位點(diǎn)(位點(diǎn)1-6)的上游。作為一種載體，該DNA序列是環(huán)形的。
圖31．基于PCR的用于構(gòu)建人重構(gòu)的F19重鏈的方法。該圖提供了構(gòu)建策略的簡要示意圖。虛線表示在引物間一段至少21個堿基的互補(bǔ)序列。
圖32．重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)A型至E型的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列。將核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列對齊排列并同A型的相比較，短劃線表示同該序列核苷酸的相同性，點(diǎn)表示同該序列氨基酸的相同性。氨基酸根據(jù)Kabat等(1991)來編號。CDR的位置用框標(biāo)出。
圖33．克隆到pg1d105哺乳動物表達(dá)載體中的F19Ha(人重構(gòu)的重鏈A型)的DNA序列。限制性酶切位點(diǎn)由粗體字母和下劃線標(biāo)出。CDR 1至3和剪接供體位點(diǎn)標(biāo)有下劃線。這是含有重構(gòu)的F19重鏈可變區(qū)A型的真核表達(dá)載體pG1D105的DNA序列。該載體含有人γ-1恒定區(qū)(同種異型Glm(non-a,z,-x)，也稱為Gml(17)同種異型)的一種cDNA。
該構(gòu)建體的基本組分為1-2501 =基于pBR322并包括氨芐青霉素抗性基因和ColEⅠ起點(diǎn)加上SV40起點(diǎn)以及殘缺的SV40早期啟動子的序列2502-3226 =dhfr基因3233-4073 =SV40多聚A序列等4080-4302 =SPA位點(diǎn)加上C2終止信號4303-5867 =HCMVi啟動子/增強(qiáng)子5879-5885 =用于克隆免疫球蛋白可變區(qū)基因的唯一Hind Ⅲ限制性位點(diǎn)5886-5894 =Kozak序列5895-5951 =信號肽5952-6323 =重構(gòu)的F19重鏈A型6323-6330 =剪接供體位點(diǎn)6331-6336 =用于克隆免疫球蛋白可變區(qū)基因的唯一BanHⅠ限制性位點(diǎn)6337-7388 =人γ-1恒定區(qū)的cDNA拷貝，其前面有一62bp的內(nèi)含子7389-7709 =Arnie終止序列在該構(gòu)建體中所用的人γ-1恒定區(qū)具有一個Glm(non-a,z,,-x)，也稱為Gml(17)的同種異型，其被限定為356位(根據(jù)Eu編號)的谷氨酸殘基(E)、358位(根據(jù)Eu編號)的蛋氨酸殘基(M)以及214位(根據(jù)Eu編號)的賴氨酸殘基(K)。這3個氨基酸在上面的序列中均標(biāo)有下劃線。
圖34．在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)抗體F19期間發(fā)生的重鏈(圖A)和輕鏈(圖B)RNA剪接事件——簡要示意圖。
(a)重鏈RNA剪接(b)x輕鏈RNA剪接圖35．LAHC上清結(jié)合CD8-FAP的濃度依賴性。
圖36．生物素化LAHC結(jié)合人FAP。
圖37．CD8-FAP攜帶用cF19檢測到的F19表位。
實(shí)施例實(shí)施例1小鼠-人嵌合基因的構(gòu)建嵌合F19(cF19)抗體被設(shè)計(jì)為具有分別連接至人x和γ1恒定區(qū)的小鼠F19 VL和VH區(qū)。將PCR引物用于修飾在編碼小鼠F19VL和VH區(qū)的cDNA序列兩側(cè)的5’和3’序列(表1)。設(shè)計(jì)了特異性針對F19輕鏈V區(qū)的PCR引物。將這些修改的小鼠F19可變區(qū)亞克隆至已含有人χ(pKN100載體)或γ1(pG1D105)恒定區(qū)的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中(圖23)。這些載體利用人巨細(xì)胞病毒(HCMV)啟動子/增強(qiáng)子來有效轉(zhuǎn)錄輕鏈和重鏈。載體還含有SV40復(fù)制起點(diǎn)使得可以在COS細(xì)胞中進(jìn)行有效的DNA復(fù)制和隨后的蛋白質(zhì)表達(dá)。將表達(dá)載體設(shè)計(jì)成具有作為Hind Ⅲ-BamHⅠ片段插入的可變區(qū)。設(shè)計(jì)PCR引物用來在編碼V區(qū)的cDNA的5’(HindⅢ)和3’(BamHⅠ)末端引入這些限制性位點(diǎn)。此外，設(shè)計(jì)PCR引物用來在輕鏈和重鏈cDNA的5’末端處引入Kozak序列(GCCGCCACC)使得可以進(jìn)行有效的翻譯(KozakM.在AUG啟始密碼子前的至少6個核苷酸增強(qiáng)在哺乳動物細(xì)胞中的翻譯。(1987)分子生物學(xué)雜志196:947)，并在輕鏈和重鏈cDNA的3’末端處引入剪接供體位點(diǎn)以將可變區(qū)剪接至恒定區(qū)。在嵌合F19輕鏈和重鏈的構(gòu)建中所用的PCR引物示于表1中。修改來在嵌合F19輕鏈和重鏈的構(gòu)建中使用的小鼠F19 VL和VH區(qū)的DNA和氨基酸序列示于圖24和25中。分別克隆至真核表達(dá)載體pKN100和pG1D105中的小鼠F19輕鏈和重鏈的DNA序列示于圖26和27中。表1用于嵌合F19抗體構(gòu)建的PCR引物A．輕鏈可變區(qū)1．用于5’末端構(gòu)建的引物(37聚體)5′CAGA AAGCTT GCCGCCACC ATG GAT TCA CAG GCC CAG 3′HindⅢ Kozak序列 M D S Q A Q2．用于3’末端構(gòu)建的引物(35聚體)5′CCGA GGATCC ACTCACG TTT CAG CTC CAG CTT GGT 3′BamHI 剪接供體位點(diǎn)B．重鏈可變區(qū)1．用于5’末端構(gòu)建的引物(37聚體)5′CAGA AAGCTT GCCGCCACC ATG GGA TGG AGC TGG GTC 3′HindⅢ Kozak序列 M G W S W V2．用于3’末端構(gòu)建的引物(35聚體)5′ CCGA GGATCC ACTCACC TGA GGA GAC GGT GAC TGA 3′BamHⅠ 剪接供體位點(diǎn)實(shí)施例2嵌合F19抗體的表達(dá)和結(jié)合活性將編碼嵌合F19輕鏈和重鏈的2種質(zhì)粒DNA(見實(shí)施例1)共轉(zhuǎn)染至COS細(xì)胞中來觀察如下所述嵌合F19抗體的瞬時表達(dá)。溫育72小時后，收集培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞碎片，并通過ELISA分析人IgG1樣抗體的產(chǎn)生。分析含有嵌合F19抗體的COS細(xì)胞上清結(jié)合表面表達(dá)有FAP抗原的HT 1080細(xì)胞的能力(見實(shí)施例13)。
利用電穿孔法轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞在COS細(xì)胞中測試分別含有嵌合或重構(gòu)的人重鏈和輕鏈型的哺乳動物表達(dá)載體pg1d105和pKN100來觀察F19抗體的瞬時表達(dá)。將COS細(xì)胞在含有青霉素(50IU/ml)、鏈霉素(50μg/ml)、L-谷氨酰胺和10％熱滅活的無γ球球蛋白的胎牛血清(FCS,Harlan Sera-Lab cat.#D0001)的DMEM(Gibco BRLcat.#41966)中常規(guī)傳代。利用Gene Pulsar apparatus(BioRad)通過電穿孔將DNA引入COS細(xì)胞中。將DNA(每種載體10μg)加入到在磷酸鹽緩沖液(PBS，無Ca2+和Mg2+)中1×107細(xì)胞/ml的一份0.8ml液中。以1,900伏特，25μF電容發(fā)送一個脈沖。于環(huán)境溫度下的10分鐘恢復(fù)期后，將電穿孔的細(xì)胞加入到8ml含有5％FCS的DMEM中。于37℃溫育72小時后，收集培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞碎片并在無菌條件下于4℃短期保存或者于-20℃長期保存。
ELISA方法檢測在COS細(xì)胞上清中組裝的IgG1/x抗體的濃度通過ELISA對在轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體樣品進(jìn)行檢測以確定產(chǎn)生了多少嵌合的或重構(gòu)的人抗體。對于抗體的檢測，利用山羊抗人IgG(Fcγ片段特異性)抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.#109-005-098)包被酶標(biāo)板。將來自COS細(xì)胞的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，并加到每個孔中。于37℃溫育1小時以及洗板后，加入辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗人x輕鏈(Sigma,A-7164)。37℃溫育30分鐘以及洗板后，室溫下加入K-藍(lán)色底物(一種3,3’,5,5’，四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫的混合物，Bionostics Limited,#KB175)30分鐘。利用紅色終止液(Bionostics Limited,#RS20)終止反應(yīng)，并在一酶標(biāo)儀上讀取650nm處的光密度。將已知濃度的純化的人IgGl/x抗體(Sigma,I-3889)用作標(biāo)準(zhǔn)品。
嵌合F19抗體在COS細(xì)胞中的表達(dá)是很差的(表2)，介于10到60ng/ml之間，起比大多數(shù)抗體低至少10倍。
為了增加嵌合F19抗體的表達(dá)水平，通過將-9位的亮氨酸替換為脯氨酸來改變F19 VL區(qū)的先導(dǎo)序列。這種在先導(dǎo)序列中的單個氨基酸改變引起在COS細(xì)胞中產(chǎn)生的嵌合抗體的量至少翻一番。
細(xì)胞結(jié)合結(jié)果顯示嵌合F19特異性結(jié)合FAP靶，并具有預(yù)期的親和力。
表2在COS細(xì)胞上清中嵌合F19抗體的濃度(這些為3個獨(dú)立轉(zhuǎn)染的結(jié)果)
實(shí)施例3重構(gòu)的人F19輕鏈A型至C型(LA-LB)的構(gòu)建重構(gòu)人F19 VL區(qū)中所述第一型(LA)的構(gòu)建利用重疊PCR片段進(jìn)行，方法類似于Daugherty B.L.,DeMartino J.A.,Law M.F.,Kawka D.W.,SingerⅠ.Ⅰ.和Mark G.E.(1991)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使針對白細(xì)胞整合素CD18組分的小鼠單克隆抗體的克隆、CDR移植以及快速表達(dá)更簡化。核酸研究(Nucl.Acids Res.)19:2471所述。合成了10個寡核苷酸，組成5對引物對，APCRl-vla1、vla2-vla3、vla4-vla5、vla6-vla7和vla8-APCR4(表3和圖28)。在鄰近的引物對之間存在至少21個堿基的重疊序列(圖28)。APCR1和APCR4同pUC19載體序列側(cè)翼雜交。設(shè)計(jì)誘變引物以便它們的5’末端緊隨一個密碼子的擺動位點(diǎn)之后。該策略用于阻止PCR過程中由DNA聚合酶在誘變引物互補(bǔ)鏈的3’末端無故加入一個核苷酸(Sharrocks A.D.和ShawP.E.(1992)改進(jìn)的引物設(shè)計(jì)用于基于PCR的定點(diǎn)誘變。核酸研究20:1147)。在50μl含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、200μM dNTPs以及1.5mM MgCl2的PCR緩沖液中將適當(dāng)?shù)囊飳?各0.2μM)同10ng的重構(gòu)的人L25 VL區(qū)B型的cDNA以及1單位的AmpliTaq(Perkin ElmerCetus)DNA聚合酶混合。將其用礦物油覆蓋并將PCR進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)由一個94℃1分鐘的變性步驟、一個55℃1分鐘的引物退火步驟以及一個72℃2分鐘的延伸步驟組成。隨后進(jìn)行一個由一72℃10分鐘的更進(jìn)一步延伸步驟所組成的單個循環(huán)，隨后降溫至4℃。在引物退火和延伸步驟之間的間隔時間為2.5分鐘。然后通過凝膠電泳對5個反應(yīng)的PCR產(chǎn)物(A、B、C、D和E)進(jìn)行純化，隨后利用WizardPCRpreps(Promega)進(jìn)行DNA洗脫。將PCR產(chǎn)物A、B、C、D和E通過它們彼此間的互補(bǔ)性進(jìn)行組裝。在第二組PCR反應(yīng)中，將PCR產(chǎn)物B和C以及D和E，(各50ng)加入到各含有1單位的AmpliTaq(Perkin Elmer Cetus)DNA聚合酶的50μlPCR反應(yīng)液(如上所述)中。按照上面所描述地將反應(yīng)進(jìn)行20個循環(huán)，但將退火溫度升至60℃。在第三組PCR反應(yīng)中，分別用每種1μl前面的PCR反應(yīng)液以及適當(dāng)?shù)腜CR引物對(vla2-vla5或者vla6-APCR4)對PCR產(chǎn)物F和G進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在50μl PCR反應(yīng)液(如上所述)中含有1單位的AmpliTaq DNA聚合酶，并在第一個階段擴(kuò)增25個循環(huán)。在第四組PCR反應(yīng)中，利用每種1μl前面的PCR反應(yīng)液以及vla2-APCR4 PCR引物對對PCR產(chǎn)物H進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后利用RSP和UP作為末端引物在一個同上面所描述的相似的兩步PCR反應(yīng)中通過其自身的互補(bǔ)性對PCR產(chǎn)物A和H進(jìn)行組裝。對包括一個先導(dǎo)序列的代表整個重構(gòu)的人F19VL區(qū)的完整組裝片段用HindⅢ和BamHⅠ消化并克隆到pUC19中用于測序。一個具有正確DNA序列的克隆被指定為reshF19La(圖29)，然后將其亞克隆至真核表達(dá)載體DKN100中?？寺≈羛KN100中的reshF19La的DNA序列示于圖30中。
用所述La的方案的相同方案構(gòu)建了重構(gòu)的人F19VL區(qū)的第二型(LB)，但其中的vla4和vla7引物分別被vlb4和vlb7所取代(表3)。LB的DNA序列示于圖29中。
利用來自Stratagene的QuikChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒構(gòu)建了重構(gòu)的人F19VL區(qū)的第三型(LC)。按照制造商的說明利用pKN100中的reshF19La作為雙鏈DNA模板實(shí)施QuikChange定點(diǎn)誘變方法。按照制造商的說明設(shè)計(jì)在該方法中所用的F19LC-正義和F19LC-反義誘變寡核苷酸引物(表3)。簡言之，兩種誘變引物都含有預(yù)期的點(diǎn)突變(在49位Kabat殘基(Phe)處的密碼子TTT改變?yōu)榫幋aTyr的TAT)，而且都退火為pKN100載體中LA的相對鏈上的相同序列。通過對整個VL區(qū)的DNA測序證實(shí)點(diǎn)突變。LC的DNA序列示于圖29中。為了消除在PCR反應(yīng)過程中于pKN100中發(fā)生隨機(jī)突變的可能性，將VL區(qū)作為一個Hind Ⅲ/BamHⅠ片段從pKN100載體中切下，并重新亞克隆至一個用前述相同的兩種限制性內(nèi)切酶切割的未修飾的pKN100載體中。
表3用于構(gòu)建重構(gòu)的人F19輕鏈可變區(qū)的PCR引物1．用于合成“A”型的引物F19vla1(36聚體)5′GTCATCACAATGTCTCCGGAGGAACCTGGAACCCAG 3′F19vla2(29聚體)5′CTCCGGAGACATTGTGATGACCCAATCTC 3′F19vla3(45聚體)5′GAATATAAAAGGCTCTGACTGGACTTGCAGTTGATGGTGGCCCTC 3′F19vla4(72聚體)5′CAGTCAGAGCCTTTTATATTCTAGAAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCC 3′F19vla5(44聚體)5′ACCCCAGATTCCCTAGTGCTAGCCCAAAAGATGAGGAGTTTGGG 3′F19vla6(67聚體)5′TAGCACTAGGGAATCTGGGGTACCTGATAGGTTCAGTGGCAGTGGGTTTGGGACAGACTTCACCCTC 3′F19vla7(53聚體)5′GTCCCTTGTCCGAACGTGAGCGGATAGCTAAAATATTGCTGACAGTAATAAAC 3′F19vla8(33 聚體)5′GCTCACGTTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAAT 3′2．用于合成 “B” 型的引物F19vlb4(72聚體)5′CAGTCAGAGCCTTTTATATTCTAGAAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGACAGCC 3′F19vlb7(57聚體)5′GTCCCTTGTCCGAACGTGAGCGGATAGCTAAAATATTGCTGACAGTCATAAACTGCC 3′3．用于合成 “C ” 型的引物F19Lc-正-義(34聚體)5′CCCAAACTCCTCATCTATTGGGCTAGCACTAGGG 3′F19Lc-反義(34聚體)5′CCCTAGTGCTAGCCCAATAGATGAGGAGTTTGGG 3′4．同pUC19載體側(cè)翼序列雜交的引物APCR1(17聚體，正義引物)5′TACGCAAACCGCCTCTC 3′APCR4(18聚體，反義引物)5′GAGTGCACCATATGCGGT 3′RSP(-24)(16聚體，正義引物)5′AACAGCTATGACCATG 3′UP(-40)(17聚體，反義引物)5′GTTTTCCCAGTCACGAC 3′實(shí)施例4重構(gòu)的人F19重鏈A型至E型(HA-HE)的構(gòu)建利用為構(gòu)建重構(gòu)的人F19 VL區(qū)“A”型(LA)所用的相同PCR方法構(gòu)建重構(gòu)的人F19 VH區(qū)“A”型(HA)(圖31)。模板DNA為重構(gòu)人226VH“A”型(Leger O.J.R,Yednock T.A.,Tanner L.,Homer H.C.,Hines D.K.,Keen S.,Saldanha J.,Jones T.,Fritz L.C.和Bendig M.M.(1997)?？谷甩?4整合素的小鼠抗體的人源化用于多發(fā)性硬化癥治療的一種潛在的療法。人源抗體(Hum.Antibod.)8:3)。設(shè)計(jì)并合成了6個PCR引物用于重構(gòu)的人F19 VH區(qū)“A”型的構(gòu)建(表4)。分別利用APCR-Vha1、Vha2-Vha3、Vha4-Vha5和Vha6-APCR4作為PCR引物對獲得了PCR產(chǎn)物A、B、C和D。PCR條件基本上與所描述用于重構(gòu)的人F19 VL區(qū)的構(gòu)建的相同。一個具有正確DNA序列的克隆被指定為reshF19Ha(圖32)，并將其亞克隆至真核表達(dá)載體pG1D105中?？寺≈羛G1D105中的reshF19Ha的DNA序列示于圖33中。
利用與所描述的對于HA的相同方案構(gòu)建了重構(gòu)的人F19VH區(qū)的第三型(HC)，但其中的Vha4引物被Vhc4所取代(表4)。HC的DNA序列示于圖32中。根據(jù)Kamman等的PCR誘變方法(Kamman M.,Laufs J.,Schel]J.和Gronenborn B.(1989)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的DNA快速插入誘變。核酸研究17:5404)構(gòu)建重構(gòu)的人F19 VH區(qū)的第二型(HB)和第四型(HD)。對于HB和HD，在分別以HA和HC為模板DNA的PCR反應(yīng)中，利用誘變引物F19VHbd6(Tyr-91到Phe-91，表4)同APCR4配對。對PCR產(chǎn)物VHb和VHd利用PstⅠ和BamHⅠ進(jìn)行限制性酶消化，并分別亞克隆至預(yù)先用相同的兩種限制性酶消化的reshF19Ha和reshF19Hc中。HB和HD的DNA序列示于圖32中。
根據(jù)上面已經(jīng)提到的Kamman等的PCR誘變方法(1989)構(gòu)建重構(gòu)的人F19VH區(qū)“E”型(HE)。
對于reshF19He在PCR反應(yīng)中以克隆到Pg1d105哺乳動物表達(dá)載體中的HC為模板DNA，用誘變引物F19MsclHe(表5)同引物F19VHHindⅢ配對。在100μl含有10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.8)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100以及200μMdNTPs的PCR緩沖液中將適當(dāng)?shù)囊飳?各0.2μM)同10ng重構(gòu)的人226 VH區(qū)A型的cDNA混合。將反應(yīng)混合物用礦物油覆蓋并在94℃放置5分鐘。然后加入1單位的DeepVent DNA聚合酶(New England Biolabs)(“熱啟動”PCR；Chou Q,RussellM.,BirchD.,Raymond J.和Bloch W.(1992)對PCR前的錯誤啟動和引物二聚化的預(yù)防改善了低拷貝數(shù)的擴(kuò)增。核酸研究20:1717)，并在TRIO-Thermoblock熱循環(huán)儀(Biometra,G_ttingen,Germany)進(jìn)行25個PCR循環(huán)。每個循環(huán)由一個94℃1分鐘的變性步驟、一個70℃1分鐘的引物退火步驟以及一個72℃2分鐘的延伸步驟組成。隨后進(jìn)行一個由一72℃10分鐘的更進(jìn)一步延伸步驟所組成的單個循環(huán)，隨后降溫至4℃。然后利用QIAquickTM凝膠抽提試劑盒按照制造商(QIAGEN Ltd.,UK)提供的方法從TAE1.4％標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠中抽提和純化PCR產(chǎn)物。隨后對PCR產(chǎn)物VHe用MscⅠ和HindⅢ進(jìn)行限制性酶消化，并連接到預(yù)先用相同的兩個限制性酶消化的克隆至Pg1d105中的reshF19Hc中。MscⅠ限制性識別位點(diǎn)對于所有重構(gòu)的人F19VH區(qū)型都是唯一的，而且在Pgld105表達(dá)載體中不存在。HindⅢ限制性識別位點(diǎn)在pgld105中是用于克隆VH免疫球蛋白基因的單一位點(diǎn)。經(jīng)電穿孔而成為感受態(tài)的大腸桿菌XL-1Blue細(xì)胞用1μl連接DNA轉(zhuǎn)化，并涂布于含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板上。然后利用同Pgld105載體側(cè)翼序列雜交的引物HCMi和Hucγ1(表5)通過對菌落的直接PCR篩選插入片段的存在和正確大小(GüssoW D.和Clackson T.(1989)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從噬斑和菌落進(jìn)行直接克隆鑒定。核酸研究17:4000)篩選存在而且正確大小的插入片段的菌落。利用Plasmid Midi試劑盒按照制造商(QIAGEN Ltd.,UK)提供的方法制備陽性克隆的DNA。利用傳統(tǒng)的熱變性(Andersen A.,Pettersson A.和Kieldsen T.(1992)一種用測序酶經(jīng)熱變性測序質(zhì)粒DNA的快速而簡單的技術(shù)。生物技術(shù)(Biotechniques)13:678)和測序酶2.0(USB,Cleveland,OH)通過雙脫氧鏈終止法(Sanger F.,Nicklen S.和Coulson A.(1977)利用鏈終止抑制物的DNA測序。美國國家科學(xué)院進(jìn)展74:5463)直接從環(huán)狀載體DNA進(jìn)行DNA測序。reshF19He的DNA序列示于圖32中。
表4用于構(gòu)建重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)A型至D型的PCR引物1．用于“A”型合成的引物F19vha1(47聚體)5′GTGTATTCAGTGAAGGTGTATCTACTAGTTTTACAGCTGACTTTCAC 3′F19vha2(53聚體)5′TAGTAGATACACCTTCACTGAATACACCATACACTGGGTTAGACAGGCCCCTG 3′F19vha3(71聚體)5′CCCTTGAACTTCTGGTTGTAGTTAGGAATACCATTGTTAGGATTAATACCTCCTATCCACTCCAGCCTTTG 3′F19vha4(71聚體)5′TAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGGGCCACCTTGACCGTAGGCAAGTCTGCCAGCACCGCCTACATGG 3′F19vha5(63聚體)5′GCATGGCCCTCGTCGTAACCATAGGCGATTCTTCTTCTGGCGCAGTAGTAGACTGCAGTGTCC 3′
F19vha6(48聚體)5＇ CTATGGTTACGACGAGGGCCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAAC 3＇2．用于“C”型合成的引物F19vhc4(71聚體)5＇TAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGGGTCACCATCACCGTAGACACCTCTGCCAGCACCGCCTACATGG 3＇3．用于“B”型和“D”型合成的引物F19vhbd6(27聚體)5＇GGAGACTGCAGTCTACTTCTGCGCCAG 3＇4．同pUC19載體側(cè)翼序列雜交的引物APCR1(17聚體，正義引物)5＇TACGCAAACCGCCTCTC 3＇APCR4(18聚體，反義引物)5＇GAGTGCACCATATGCGGT 3＇表5用于構(gòu)建重構(gòu)的人F19重鏈可變區(qū)E型的PCR引物1．用于“E”型合成的引物F19MscIHe(65聚體，反義):
5＇CCTTTGGCCAGGGGCCTGTCTAACCGAGTGTATGGTGTA'I-FCAGTGAAGGTGMsclTATCCACTAGTTTCCACTAGTTT 3＇2．同pgld105哺乳動物表達(dá)載體側(cè)翼序列雜交的引物HCMi(28聚體，正義)5＇GTCACCGTCCTTGACACGCGTCTCGGGA 3＇Hucγ(17聚體，反義)5＇TTGGAGGAGGGTGCCAG 3＇實(shí)施例5在COS細(xì)胞上清中重構(gòu)的人F19抗體的濃度用一系列重構(gòu)的人F19抗體構(gòu)建體中的一對轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞并利用如在實(shí)施例2中所描述的IgG1/x ELISA檢測人抗體的濃度。表6在COS細(xì)胞上清中重構(gòu)的人F19抗體的濃度
表7在COS細(xì)胞上清中重構(gòu)的人F19抗體的濃度
免疫球蛋白基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)所需RNA剪接事件哺乳動物表達(dá)載體pKN100和pgld105在可變區(qū)和恒定區(qū)之間都具有一個內(nèi)含子，在基因表達(dá)的過程中其被去除以產(chǎn)生一個信使RNA。由一個在重鏈或輕鏈剪接供體位點(diǎn)和免疫球蛋白剪接受體位點(diǎn)間的DNA重組所組成的剪接過程描述于圖34中。
實(shí)施例6cF19和LAHC結(jié)合表達(dá)FAP的人類細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析測試了LAHC結(jié)合細(xì)胞表面重組的和內(nèi)源性表達(dá)的FAP的能力。
用實(shí)施例確定LAHC對細(xì)胞FAP的結(jié)合。天然表達(dá)FAP的MF-SH人腫瘤細(xì)胞(Shirasuma K.等，癌癥(Cancer)1985,55:2521-32)和FAP轉(zhuǎn)染的人腫瘤細(xì)胞系都被用作細(xì)胞靶。通過在細(xì)胞熒光測定術(shù)中評價對靶細(xì)胞的直接結(jié)合以及通過對結(jié)合小鼠F19或嵌合cF19抗FAP抗體的抑制效應(yīng)而研究了LAHC。
所用的抗體和細(xì)胞系為F19(小鼠抗人FAP單克隆抗體，IgG1亞類)、mIgG(小鼠免疫球蛋白，IgG類)、cF19(嵌合抗人FAP單克隆抗體，IgG1亞類)、LAHC(重構(gòu)的抗人FAP單克隆抗體，IgGl亞類)、hIgGl(人免疫球蛋白，IgG1亞類)、MF-SH(人惡性纖維組織細(xì)胞瘤細(xì)胞系)、HET-1080(人纖維肉瘤細(xì)胞系)、HT-1080FAP克隆33(用編碼人FAP的cDNA轉(zhuǎn)染的HT-1080細(xì)胞系)。如在實(shí)施例8和12中所描述的將抗體生物素化。
LAHC對人腫瘤細(xì)胞系表面的FAP的直接結(jié)合在總體積0.2ml的補(bǔ)充有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中將需研究的腫瘤細(xì)胞系的5×105個細(xì)胞同指定濃度的測試抗體或?qū)φ湛贵w在冰上溫育30分鐘。隨后，細(xì)胞用2ml PBS洗滌2次，重懸于0.2ml補(bǔ)充有1％BSA的PBS中，加入1∶20稀釋的FITC標(biāo)記的小鼠抗人IgG[Dianova]作為次級試劑，并在冰上繼續(xù)溫育30分鐘。
或者，在總體積0.2ml的補(bǔ)充有1％BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)中將需研究的腫瘤細(xì)胞系的5×105個細(xì)胞同指定濃度的生物素標(biāo)記的cF19在冰上溫育30分鐘。隨后，細(xì)胞用2ml PBS洗滌2次，重懸于0.2ml補(bǔ)充有1％BSA的PBS中，并在冰上同作為次級試劑的1∶40稀釋的鏈親和素-FITC(Dianova)一起繼續(xù)溫育30分鐘。
細(xì)胞用2ml PBS再次洗滌2次，重懸于總體積0.5ml的補(bǔ)充有1％低聚甲醛(PFA)的PBS中，并放置冰上。利用細(xì)胞熒光測定術(shù)在EPICS XL(Coulter)熒光激發(fā)的細(xì)胞分析儀上通過分析在488nm處的細(xì)胞綠色熒光來確定單細(xì)胞熒光。
LAHC對于生物素化cF19結(jié)合表達(dá)FAP的人類細(xì)胞系上的細(xì)胞表面FAP的競爭將需研究的腫瘤細(xì)胞系的5×105個細(xì)胞同與1μg/ml生物素標(biāo)記的cF19抗體一起加入的指定數(shù)量的未標(biāo)記的測試抗體或?qū)φ湛贵w進(jìn)行溫育。隨后，細(xì)胞用2ml PBS洗滌2次，重懸于0.2ml補(bǔ)充有1％BSA的PBS中，加入1∶40稀釋的鏈親和素-FITC(Dianova)作為次級試劑，并在冰上繼續(xù)溫育30分鐘。
然后細(xì)胞用2ml PBS再次洗滌2次，重懸于總體積0.5ml的補(bǔ)充有1％低聚甲醛(PFA)的PBS中，并放置冰上。利用細(xì)胞熒光測定術(shù)在EPICSXL(Coulter)熒光激發(fā)的細(xì)胞分析儀上通過分析在488nm處的細(xì)胞綠色熒光來確定單細(xì)胞熒光。
cF19和LAHC都以一種濃度依賴的方式特異性地結(jié)合于FAP轉(zhuǎn)染的HT-1080FAP克隆33人類腫瘤細(xì)胞(表8)。未檢測到對FAP陰性HT-1080細(xì)胞的結(jié)合(表9)。cF19和LAHC都以一種濃度依賴的方式結(jié)合于內(nèi)源性表達(dá)FAP的人MF-SH細(xì)胞(表10)。
生物素化的cF19以一種濃度依賴的方式結(jié)合于人HT-1080FAP克隆33(表11)。未檢測到對FAP陰性HT-1080細(xì)胞的結(jié)合(表12)。
生物素化的cF19對HT-1080FAP克隆33細(xì)胞的結(jié)合被未標(biāo)記的cF19和未標(biāo)記的LAHC所抑制。
嵌合抗人FAP單克隆抗體cF19以及重構(gòu)的人抗人FAP單克隆抗體LAHC(實(shí)施例10)被證明直接結(jié)合于在內(nèi)源性表達(dá)該蛋白的或者用編碼它的cDNA所轉(zhuǎn)染的人類細(xì)胞系上所表達(dá)的FAP。這種結(jié)合被表明為濃度依賴的。生物素化cF19的結(jié)合可以被未標(biāo)記的cF19和未標(biāo)記的LAHC所抑制。
利用細(xì)胞熒光測定技術(shù)，對特異性結(jié)合試劑的直接結(jié)合以及抑制表明嵌合cF19和重構(gòu)的LAHC人單克隆抗體對表達(dá)FAP的細(xì)胞表面的特異性。表8抗FAP抗體對HT-1080FAP克隆33細(xì)胞的結(jié)合
表9抗FAP抗體對非轉(zhuǎn)染的HT-1080細(xì)胞的結(jié)合
表10抗FAP抗體對MF-SH細(xì)胞的結(jié)合
n.d.未做表11生物素化的cF19抗體對HT-1080FAP克隆33細(xì)胞的結(jié)合
表12生物素化的cF19抗體對非轉(zhuǎn)染的HT-1080細(xì)胞的結(jié)合
表13抗FAP抗體同生物素化cF19對HT-1080FAP克隆33細(xì)胞結(jié)合的競爭
在表13中所示的所有測試中，生物素化cF19的濃度為1μg/ml。
實(shí)施例7單克隆抗體LAHC的體外免疫效應(yīng)物作用進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)來確定特異性針對成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)的單克隆抗體(mAb)LAHC分別在人補(bǔ)體或人單個核白細(xì)胞存在下裂解表達(dá)FAP的靶細(xì)胞的潛能。
特別是，研究了LAHC介導(dǎo)針對表面表達(dá)人FAP的HT-1080FAP克隆33細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)的能力。利用下述的方法體外確定細(xì)胞毒性將51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞在LAHC存在下同作為補(bǔ)體來源的人血清或作為效應(yīng)物的人MNC(外周血單個核細(xì)胞)一起溫育。測定51Cr的釋放作為靶細(xì)胞裂解的度量。
所用的抗體和細(xì)胞系為LAHC(重構(gòu)的人抗人FAP IgGl抗體)、hIgGl(人IgGl同種型對照)、3S193(小鼠抗LewisyIgG3單克隆抗體)、mI[gG(小鼠IgG對照)、HT-1080(人纖維肉瘤)、HT-1080FAP克隆33(用編碼人FAP的cDNA轉(zhuǎn)染的HT-1080)、MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞系)。
補(bǔ)體介導(dǎo)的LAHC對靶細(xì)胞的裂解通過在RPMI 1640培養(yǎng)基中同100μCi51Cr(NEN)于37℃溫育1小時來對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記。隨后，在無51Cr的培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞2次，并以每毫升2×105個細(xì)胞的濃度重懸。
作為補(bǔ)體來源的人血清是從不同自愿者的血液中新鮮制備的。通過上臂靜脈穿刺取血，并在室溫放置1小時使其發(fā)生凝結(jié)，然后4℃放置過夜。通過離心分離血清并將其從沉淀中移走。
將所研究的抗體在RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中從儲存液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛取?br> 在不同濃度的測試或?qū)φ湛贵w以及作為人補(bǔ)體來源的25％(v/v)人血清存在下，將1×105個放射性標(biāo)記的指定細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞在孵箱(95％空氣和5％CO2)中于37℃溫育2h。在U形96孔培養(yǎng)板中于總體積200μl的RPMI1640中進(jìn)行溫育，并重復(fù)3次。溫育階段后，將培養(yǎng)板離心，移走100μl的上清，并在γ計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)放射活性。通過檢測104個靶細(xì)胞來確定所摻入放射活性的總量。自發(fā)釋放被定義為在所述溫育過程中在無抗體和補(bǔ)體存在下從靶細(xì)胞釋放的活性。
按照如下公式計(jì)算特異性裂解 LAHC的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)通過在RPMI 1640培養(yǎng)基中同100μCi51Cr于37℃溫育1小時來對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記。隨后，在無51Cr的培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞2次，并以每毫升2×105個細(xì)胞的濃度重懸。
從通過健康自愿者上臂靜脈穿刺所采的外周血中制備MNC(外周血單個核細(xì)胞)。通過加入20％檸檬酸鹽緩沖液來抗凝。通過在3ml淋巴細(xì)胞分離液(Boehringer Mannheim，德國)上離心(400G室溫30分鐘)來純化4ml這種血液標(biāo)本中的MNC。將MNC(外周血單個核細(xì)胞)從梯度中取出，洗滌3次，并用RPMI 1640稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛取NC(外周血單個核細(xì)胞)通過以每毫升1.3×106個細(xì)胞的啟始濃度在100U重組人白細(xì)胞介素-2(IL-2)存在下，在-95％空氣和5％CO2的孵箱中于37℃溫育5天來獲得淋巴細(xì)胞活化的殺傷(LAK)細(xì)胞。將所研究的抗體在RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中從儲存液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛取?br> 在不同濃度的測試或?qū)φ湛贵w以及MNC存在下，將1×104個放射性標(biāo)記的指定細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞在37℃和5％CO2中溫育5h。MNC以達(dá)到指定的效應(yīng)靶細(xì)胞比的數(shù)量加入。在U形96孔培養(yǎng)板中于總體積200μl的RPMI 1640中進(jìn)行溫育，并重復(fù)2次。
溫育階段后，將培養(yǎng)板離心，移走100μl的上清，并在γ計(jì)數(shù)儀中測定放射活性。通過檢測104個靶細(xì)胞來確定所摻入放射活性的總量。自發(fā)釋放被定義為在所述溫育過程中在無抗體和補(bǔ)體存在下從靶細(xì)胞釋放的活性。
按照如下公式計(jì)算特異性裂解 抗體介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的補(bǔ)體裂解在以高達(dá)50μg/ml的濃度的LAHC處理的HT-1080FAP克隆33細(xì)胞中未觀察到LAHC特異性補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解(高于用同種型對照需研究的到的)(表14、表15a)。
通過在12.5μg/ml 3S193(一種具有已知的補(bǔ)體激活能力的小鼠抗Lewisy單克隆抗體)存在下MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的裂解顯示了用作補(bǔ)體來源的人血清的裂解活性(表15b)。
抗體介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞裂解在高達(dá)10μg/ml的濃度的LAHC存在下，未檢測到通過裂解測定的LAHC介導(dǎo)人MNC(表16)或人LAK細(xì)胞(淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞，表17)對HT-1080FAP克隆33細(xì)胞的ADCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性)高于用一種同型種對照以50∶1的效應(yīng)靶細(xì)胞比所觀察到的。
在適當(dāng)?shù)囊匀搜a(bǔ)體或人MNC作為效應(yīng)物的體外測試中，人抗FAP單克隆抗體LAHC顯示對于表達(dá)FAP的腫瘤細(xì)胞系HT-1080FAP克隆33沒有可檢測到的超過同種型對照的細(xì)胞毒效應(yīng)。
表14LAHC介導(dǎo)對HT-1080FAP克隆33腫瘤細(xì)胞靶的特異性補(bǔ)體裂解(％)
溫育于37℃2小時，分別來自自愿者A或B的25％血清作為補(bǔ)體的來源。
表15a由人抗FAP單克隆抗體LAHC介導(dǎo)的HT-1080FAP克隆33腫癌細(xì)胞靶的特異性補(bǔ)體裂解(％)
溫育于37℃2小時，分別來自自愿者A、B或C的25％血清作為補(bǔ)體的來源。
表15b由小鼠抗Lewisy單克隆抗體3S193介導(dǎo)的MCF-7腫瘤細(xì)胞靶的特異性補(bǔ)體裂解(％)
溫育于37℃2小時，分別來自自愿者A、B或C的25％血清作為補(bǔ)體的來源。
表16由LAHC介導(dǎo)的通過人MNC(外周血單個核細(xì)胞)對HT-1080FAP克隆33靶細(xì)胞的ADCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒)(特異性裂解以％表示)HT-1080FAP克隆33
溫育于37℃5小時，104靶細(xì)胞以及50∶1的效應(yīng)靶細(xì)胞比。
表17由LAHC介導(dǎo)的通過LAK細(xì)胞(淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞)對HT-1080FAP克隆33靶細(xì)胞的ADCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒，特異性裂解以％表示)
溫育于37℃5小時，104靶細(xì)胞以及50∶1的效應(yīng)靶細(xì)胞比。
實(shí)施例8單克隆抗體LAHC結(jié)合正常和惡性人類組織的免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)來確定人源化mAb LAHC對正常和惡性人類組織的結(jié)合特性。
利用了下面的抗體按照現(xiàn)有技術(shù)的方法將LAHC、cF19和陰性對照hIgG1直接進(jìn)行生物素化，并以在2％BSA/PBS(在磷酸鹽緩沖液中的牛血清白蛋白)中的2.5到0.25mg/ml的濃度來使用。所用小鼠mAbF19為F19雜交瘤的組織培養(yǎng)上清并在2％BSA/PBS中1∶5到1∶10的稀釋。
下面的試劑用于免疫化學(xué)檢測鏈親和素過氧化物酶復(fù)合物(VectorLabs,Burlingame,CA,USA)、親和素-生物素過氧化物酶復(fù)合物(VectorLabs.)、生物素化的馬抗小鼠(Vector Labs.)、DAB(二氨基聯(lián)苯胺，SigmaChemical Co.St.Louis,MO,USA)、Harris’蘇木素。
所檢測的新鮮的冰凍組織標(biāo)本包括正常結(jié)腸、乳腺、肺、胃、胰腺、皮膚、喉、膀胱、平滑肌和骨骼肌。在腫瘤中所檢測的為來自乳腺、結(jié)腸、肺、食管、子宮、卵巢、胰腺、胃以及頭和頸的癌。
按照現(xiàn)有技術(shù)在5微米厚的新鮮冰凍切片上實(shí)施間接免疫過氧化物酶方法(Garin-ChesaP,OldLJ,ReMigWJ反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白作為人上皮癌的一個潛在的抗體靶。美國國家科學(xué)院進(jìn)展(1990)87:7235-7239)。DAB用作最終反應(yīng)產(chǎn)物的底物。將切片用Harrs’蘇木素進(jìn)行復(fù)染，并檢測抗原表達(dá)。
在正常人組織中LAHC的表達(dá)除了正常胰腺中用LAHC、cF19和F19鑒定出在Langerhans島中的一個內(nèi)分泌細(xì)胞亞群(A細(xì)胞)為陽性以外，所檢測的正常組織LAHC表達(dá)是陰性的(表18)。用hIgGl(人免疫球蛋白IgGl亞類)作為陰性對照未觀察到免疫反應(yīng)性。
在腫瘤中LAHC的表達(dá)在腫瘤標(biāo)本中，LAHC、cF19和F19在腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞中顯示出無法區(qū)分的表達(dá)模式。在所檢測的大多數(shù)病例中觀察到一種強(qiáng)而且均一的表達(dá)，特別是在來自乳腺、結(jié)腸、肺、胰腺的癌癥標(biāo)本中以及在所檢測的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(SQCC)中(表19)。用hIgGl作為陰性對照未觀察到免疫反應(yīng)性。
在所檢測的上皮癌標(biāo)本中LAHC、cF19和F19顯示出對腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。未觀察到LAHC或F19對正常器官間質(zhì)的纖維細(xì)胞或者正常成人器官的實(shí)質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。僅僅在胰島中一個內(nèi)分泌細(xì)胞亞群(可能為分泌胰高血糖素的A細(xì)胞)以及在所檢測的9個子宮標(biāo)本中的4個(代表這些組織中的基質(zhì)成纖維細(xì)胞亞群)中觀察到抗FAP免疫反應(yīng)性。
對正常人體組織和表達(dá)FAP的人類癌癥中LAHC的免疫組織化學(xué)分析表明對LAHC、cF19和小鼠mAbF19具有無法區(qū)分的結(jié)合模式。
表18mAbLAHC、cF19和F19對正常人體組織的免疫反應(yīng)性
通過生物素-親和素復(fù)合免疫過氧化物酶方法檢測丙酮固定的冰凍切片。
No，來自不同受試個體的組織標(biāo)本數(shù)*根據(jù)形態(tài)學(xué)和在胰島內(nèi)的定位鑒定A細(xì)胞#在所檢測的9個標(biāo)本的4個的基質(zhì)中為陽性免疫反應(yīng)性。陽性標(biāo)本代表早期(×2)和中期(×2)增殖性子宮內(nèi)膜。
實(shí)施例9在組織切片中LAHC結(jié)合的物種特異性進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法來評價LAHC對來自小鼠、大鼠、兔和短尾猴的組織的反應(yīng)性。
在這些實(shí)驗(yàn)中還利用cF19和人IgGl(hIgGl)作為陰性對照。用于免疫組織化學(xué)的試劑為鏈親和素過氧化物酶復(fù)合物(Vector Labs.,Burlingame,CA,USA)、DAB(Sigma Chemical Co.,St Louis,MO,USA)以及Harris’蘇木素。
對來自小鼠、大鼠、兔和短尾猴的下述新鮮冰凍組織標(biāo)本進(jìn)行了檢測腦、肝臟、肺、腎臟、胃、胰腺、腸、胸腺、皮膚、肌肉、心臟、脾臟、卵巢、子宮和睪丸。在每個檢測中都包括來自正常人胰腺和一個乳腺癌標(biāo)本的切片作為陽性對照。
免疫組織化學(xué)按照現(xiàn)有技術(shù)所描述的在5微米厚的新鮮冰凍切片上實(shí)施間接免疫過氧化物酶方法(Garin-Chesa P,Old LJ,Rettig WJ反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白作為人上皮癌的一個潛在的抗體靶。美國國家科學(xué)院進(jìn)展(1990)87:7235-7239)。按照現(xiàn)有技術(shù)將抗體LAHC、cF19和hIgGl(為1μg/ml)進(jìn)行生物素化，并用鏈親和素過氧化物酶復(fù)合物進(jìn)行檢測。DAB用作最終反應(yīng)產(chǎn)物的底物。將切片用Harris’蘇木素進(jìn)行復(fù)染，并檢測抗原表達(dá)。
在實(shí)驗(yàn)中，所檢測的正常組織不與LAHC或cF19反應(yīng)(表1)。
用作陽性對照的正常人胰腺顯示，如同預(yù)先對F19所描述的，在Langerhans島的一個內(nèi)分泌細(xì)胞亞群中有LAHC和cF19的結(jié)合。另外，在乳腺癌標(biāo)本的腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞中觀察到LAHC和cF19的結(jié)合。
在所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，來自小鼠、大鼠、兔和短尾猴的正常組織的免疫組織化學(xué)分析未檢測到任何LAHC或cF19的結(jié)合。
表20通過免疫組織化學(xué)所確定的LAHC對非人物種組織切片的結(jié)合
nt，未檢測實(shí)施例10產(chǎn)生嵌合的以及重構(gòu)的抗FAP單克隆抗體的細(xì)胞系的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)的目的是證實(shí)根據(jù)本發(fā)明在CHO DG44細(xì)胞中表達(dá)LAHC、LAHA、LBHB、LBHD和cF19的穩(wěn)定的細(xì)胞系。制備人源化的或嵌合的F19抗體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞系，并通過用來自每個轉(zhuǎn)染子的基因組DNA作為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)來對其進(jìn)行證實(shí)。
將CHO DG44細(xì)胞培養(yǎng)于無血清的SFM-Ⅱ培養(yǎng)基中。Lipofectin(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑)和SFM-Ⅱ無血清培養(yǎng)基獲自Gibco/BRL。遺傳霉素以及所有的限制性酶獲自Boehringer Mannheim。Pfu聚合酶獲自Stratagene。
利用QiaFilter Maxi Cartridges(Qiagen)按照制造商的說明從大腸桿菌細(xì)胞中純化用于轉(zhuǎn)染的DNA。所有DNA制劑均通過限制性酶消化檢驗(yàn)。在每個載體中的LAHC可變區(qū)序列均利用ABI PRISM 310測序儀(Perkin-Elmer)來證實(shí)。
所用載體和DNA序列的其它信息在前面的實(shí)施例中提供。
CHO DG44細(xì)胞的轉(zhuǎn)染將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于含有1ml新鮮SFM-Ⅱ培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將編碼人源化或嵌合F19的重鏈和輕鏈的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO DG44細(xì)胞中。除了利用SFM-Ⅱ培養(yǎng)基來稀釋所有試劑外，按照對LipofectAMINE轉(zhuǎn)染的描述，利用6μl Lipofectin試劑(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑)和0.5μg的各種載體(一種為預(yù)期重鏈的，一種為輕鏈的)制備脂質(zhì)體。24小時后，將細(xì)胞按1∶10稀釋至含有300μg/ml遺傳霉素的SFM-Ⅱ培養(yǎng)基中。在細(xì)胞殺傷的啟始階段(10-14天)過去后，將遺傳霉素的濃度降至200μg/ml，并加入氨甲蝶呤至終濃度5nM。在10-14天后，將氨甲蝶呤的濃度增加至終濃度20nM。
轉(zhuǎn)染子DNA的PCR擴(kuò)增在Eppendorf微量離心管中將107CHO DG44細(xì)胞全速瞬時離心，用PBS洗滌一次，然后再沉淀一次。在對細(xì)胞沉淀進(jìn)行SDS裂解以及蛋白酶K處理后，通過乙醇沉淀制備基因組DNA。
利用含有下列引物對之一、dNTPs、緩沖液以及Pfu聚合酶的混合物，以基因組DNA作為模板，擴(kuò)增重鏈或輕鏈可變區(qū)。以適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇λ@的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析來對其進(jìn)行證實(shí)。
輕鏈引物組5′-GAG ACA TTG TGA CCC AAT CTC C - 3′PKN 16905′-GAC AGT CAT AAA CTG CCA CAT CTT C - 3′ PKN.1930.R重鏈引物組5′- TTG ACA CGC GTC TCG GGA AGC T T - 3′ PG 58635′-GGC GCA GAG GAT CCA CTC ACC T - 3′ PG 6332.R未消化的重鏈PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為469bp，而輕鏈PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小為286bp。通過用BstEⅡ(重鏈)或NlaⅣ(輕鏈)進(jìn)行限制性酶消化來確定它們的特性。
對CHO細(xì)胞系用LAHC、LAHA、LBHB、LBHD以及cF19進(jìn)行轉(zhuǎn)染。獲得了遺傳霉素抗性細(xì)胞，并進(jìn)一步篩選這些細(xì)胞對氨甲蝶呤的抗性。輕鏈和重鏈DNA的PCR擴(kuò)增和隨后進(jìn)行的限制性酶切產(chǎn)生了預(yù)期的條帶并證實(shí)了LAHC、LBHB、LAHA、LBHD轉(zhuǎn)染子的特性。
將所描述的細(xì)胞始終培養(yǎng)于無血清的條件下，而且不用動物來源的產(chǎn)品，如胰蛋白酶來處理。
制備了用表達(dá)LAHC、LAHA、LBHB、LBHD以及cF19單克隆抗體所轉(zhuǎn)染的制備細(xì)胞系。利用對它們的重鏈和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對所獲PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性酶切來證實(shí)它們的特性。
實(shí)施例11抗體蛋白在中國倉鼠卵巢DG44細(xì)胞中的表達(dá)及其純化本實(shí)驗(yàn)的目的是表達(dá)和純化LAHC、LAHA、LBHB和LBHDmAb以便能對其進(jìn)行鑒定。其它目的包括建立一種定量ELISA以便能夠檢測在原始培養(yǎng)樣品和純化的Ig樣品中抗體的濃度以及利用這種檢測方法確定各種人源化F19構(gòu)建體的相對表達(dá)水平。
無血清CHO DG44細(xì)胞和USP級氨甲蝶呤獲自Karl Thomae GmbH博士的Biotechnical Production Unit,Biberach，德國；這兩種均為商品化的產(chǎn)品。將細(xì)胞始終培養(yǎng)于無血清條件下。SFM-Ⅱ無血清培養(yǎng)基獲自Gibco/BRL。蛋白A瓊脂糖來自Pierce Chemical(Indianapolis,IN,USA)。人IgGl標(biāo)準(zhǔn)品(Cat.No.13889)、對硝基苯磷酸鹽片(N 2640)、牛血清白蛋白(BSA)(A7906)以及山羊抗人χ鏈特異性堿性磷酸酶結(jié)合的抗體(A 3813)獲自Sigma Chemical(St.Louis,MO,USA)。山羊抗人γ鏈特異性堿性磷酸酶結(jié)合的抗體獲自Jackson Immunoresearch Laboratories(通過StratechScientfic)。Tris緩沖鹽溶液(TBS)由150mM NaCl、50mM Tris,pH7.5組成。
用于抗體表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)條件在T-175培養(yǎng)瓶中將細(xì)胞非攪拌地培養(yǎng)于SFM-Ⅱ無血清培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基含有200μg/ml遺傳霉素以及20nM氨甲蝶呤，無抗生素。通過稀釋將細(xì)胞傳代，不貼壁，并呈小簇狀生長。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到生長穩(wěn)定期時，收集培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞，并于-20℃凍存直至使用。
LAHC的純化所用的純化步驟均在4℃進(jìn)行。用蛋白A瓊脂糖(3ml柱床體積)填充C10/10柱(Pharmacia Fine Chemicals)。用TBS洗滌該柱子并用pH3.0的0.1M檸檬酸鈉預(yù)洗脫一次以保證在柱子中不殘留疏松結(jié)合的材料。然后立即用TBS重平衡柱子，并于4℃保存。將余下的(spent)培養(yǎng)上清融化，在蛋白A層析前以10,000×g離心30分鐘以去除碎片，并用等體積的TBS稀釋。用P-1蠕動泵(Pharmacia)將該材料以0.5ml/min的速度上樣于蛋白A柱上，并用TBS洗滌直至在280nm處的吸光度無法檢測到。用pH3.0的0.1M檸檬酸鈉以大約0.2ml/min的速度開始抗體的洗脫。在280nm處對洗脫進(jìn)行監(jiān)控并將洗脫材料按每份1ml收集在含有足夠的Tris堿pH9來中和檸檬酸鹽緩沖液的試管中。將含有蛋白的級分匯集起來，利用帶有YM-30濾膜的Amicon過濾裝置濃縮，并對PBS透析。將柱子立即用TBS再生。用BioRad(Hercules,Califomia)蛋白質(zhì)測定試劑盒，按照制造商的說明，用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行蛋白質(zhì)染料結(jié)合測試。
人IgG(γ免疫球蛋白)ELISA將ELISA板用100μl山羊抗人γ鏈特異性堿性磷酸酶結(jié)合的抗體以在包被緩沖液中0.4mg/ml的濃度4℃包被過夜。取出包被抗體，平板用2％BSA-PBS封閉2小時。隨后所有的步驟均在37℃進(jìn)行。封閉緩沖液用以稀釋緩沖液連續(xù)稀釋的抗體標(biāo)本或人IgG1標(biāo)準(zhǔn)品200μl代替，并溫育1小時。陰性對照包括稀釋緩沖液和/或非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液。洗滌反應(yīng)孔，加入100μl以1∶5000稀釋的山羊抗人x鏈特異性堿性磷酸酶結(jié)合的抗體，并溫育1小時。洗滌反應(yīng)孔，加入100μl反應(yīng)緩沖液，并溫育30分鐘。通過加入1MNaOH來終止反應(yīng)，并在一ELISA讀板儀上讀取405nm處的吸光度。通過四參數(shù)重復(fù)曲線擬合法來分析結(jié)果。
按照現(xiàn)有技術(shù)中可用的方法來進(jìn)行氨基酸分析。
制備單充隆抗體LAHC并利用蛋白A親和層析純化至均一。利用人IgGl作為標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA檢測表明LAHC的回收超過70％。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳估計(jì)該材料的純度大于90％。代表性的表達(dá)資料和典型的純化產(chǎn)量示于表21中。
表21FAP抗體蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)資料和純化產(chǎn)量
顯示了在該研究中制備的每種抗FAP抗體的代表性表達(dá)資料。蛋白A瓊脂糖親和層析后的回收是基于以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品對純化Ig的蛋白質(zhì)染料結(jié)合測量法。
實(shí)施例12單克隆抗體LAHC對分離的重組人FAP的結(jié)合。
本研究的目的是鑒定LAHC對分離的重組人FAP的結(jié)合。
CD8-FAP ELISA將ELISA板用100μl在包被緩沖液中1∶2000稀釋的小鼠抗大鼠抗體(Sigma Chemical R0761)4℃包被過夜。取出包被抗體，平板用2％BSA-PBS封閉1小時。隨后所有的步驟均在室溫下進(jìn)行。用100μl的1μg/ml大鼠抗CD8抗體(Pharmingen 01041D)替換封閉緩沖液，并溫育1小時。洗滌酶標(biāo)板，加入100μl CD8-FAP培養(yǎng)上清(見實(shí)施例14)(以1∶2稀釋于PBS中)，并允許結(jié)合1小時。洗滌酶標(biāo)板，加入100μl體積的抗體樣品(2倍連續(xù)稀釋)，并溫育1小時。陰性對照包括人IgG和/或非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液。洗滌反應(yīng)孔，加入100μl在稀釋緩沖液中1∶500稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的小鼠抗人IgGl抗體(Zymed 05-3320)，并溫育1小時。洗滌反應(yīng)孔，加入100μl HRP底物(連氮基-雙-(3-乙基苯噻唑啉6-磺)酸，Sigma Chemical A9941)并溫育60分鐘。通過加入1M NaOH來終止反應(yīng)，并在一ELISA讀板儀上讀取405/490nm處的吸光度。通過四參數(shù)曲線重復(fù)曲線擬合法來分析結(jié)果。
或者，直接用cF19包被酶標(biāo)板。如上使FAP(重組人FAP，見實(shí)施例13)能夠結(jié)合這些酶標(biāo)板，然后加入生物素化的LAHC(～1μg/ml)。如上用HRP-鏈親和素結(jié)合物檢測抗體的結(jié)合。
膜結(jié)合型人FAP的可溶化用PBS洗滌表達(dá)FAP的293FAP I/2細(xì)胞或?qū)φ盏?93細(xì)胞，并用在Tris緩沖鹽溶液中的1％Triton X-114裂解。通過在10,000×g離心去除核以及碎片。將上清進(jìn)行相分配(Estreicher A,Wohlend A,Belin D,ScheuningWD,Vasalli JD。尿激酶型纖溶酶原激活物的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的鑒定。(1989)生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)264:1180-1189)來富集膜蛋白。收集去污劑相并在含有1％Empigen BB(Calbiochem)的緩沖液中稀釋以防止Triton X-114的再凝集。將該材料用于進(jìn)行伴刀豆球蛋白A瓊脂糖層析(Rettig WJ,Garin-Chesa P,Healey JH,Su SL,Ozer HL,Schwab M,Albino AP,OldLJ。間充質(zhì)和神經(jīng)外胚層來源的正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中成纖維細(xì)胞活化蛋白的調(diào)節(jié)以及異聚體結(jié)構(gòu)。(1993)癌癥研究(Cancer Res)53:3327-3335)。
LAHC的生物索化LAHC(1-2mg)對50mM的碳酸氫鹽緩沖液透析，并在室溫下用10倍摩爾過剩的磺基琥珀酰亞胺-6-生物素酰胺己酸鹽(NHS-LC生物素，PierceChemical,Rockford,Illinois,USA)生物素化2小時。通過在一微量濃縮器中反復(fù)微量透析來去除未反應(yīng)的產(chǎn)物。
瞬時轉(zhuǎn)染通過電穿孔用編碼LAHC重鏈和輕鏈的載體共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，提交號(reference number)CRL 1651)。
將抗CD8單克隆抗體固定于微量滴定板上。使被CD8-FAP桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中的CD8-FAP能夠結(jié)合這些板。將分別用編碼LAHC的2個載體瞬時轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)液余下的培養(yǎng)液連續(xù)稀釋并加入到含有固相CD8-FAP的孔中。LAHC結(jié)合所分離的固相CD8-FAP蛋白(圖35)。來自假轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)上清未檢測到結(jié)合。
將來自293FAP I/2細(xì)胞的去污劑抽提物或?qū)φ粘樘嵛锏闹亟M膜結(jié)合型FAP連續(xù)稀釋，并通過結(jié)合微量滴定板上的嵌合F19單克隆抗體來固定。生物素化的LAHC以一種濃度依賴的方式結(jié)合由cF19所固定的重組人FAP(圖36)。
LAHC識別所分離的固相重組人FAP，其攜帶有針對小鼠F19的表位。LAHC結(jié)合在昆蟲細(xì)胞中所產(chǎn)生的CD8-FAP以及在293FAP I/2細(xì)胞中所產(chǎn)生的FAP蛋白。
轉(zhuǎn)染的3天后收集來自用編碼LAHC重鏈和輕鏈的載體轉(zhuǎn)染的或者無DNA(對照)轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞培養(yǎng)上清。如在文本中所描述的，通過一種抗CD8抗體固定CD8-FAP。使COS7上清的連續(xù)稀釋液結(jié)合固相CD8-FAP，隨后用HRP-結(jié)合的抗人IgGl抗體來檢測。
將表達(dá)FAP的293FAP I/2細(xì)胞或?qū)φ?93細(xì)胞的去污劑抽提物連續(xù)稀釋，并加入到cF19包被的微量滴定板中。加入生物素化的LAHC并用HRP-結(jié)合的鏈親和素來檢測生物素化LAHC的結(jié)合。
實(shí)施例13對人FAP的cDNA所轉(zhuǎn)染的HT-1080纖維肉瘤細(xì)胞和293人胚腎細(xì)胞的鑒定成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)是一種攜帶F19表位的細(xì)胞表面膜結(jié)合蛋白，并且表達(dá)于腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞上。制備了表達(dá)重組FAP蛋白的細(xì)胞系和相應(yīng)的不表達(dá)FAP的對照用于抗FAP單克隆抗體的鑒定。
所用的細(xì)胞為HT-1080細(xì)胞(提交號CCL 121)和293人胚腎細(xì)胞(提交號CRL 1573)，它們均獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Maryland,USA)。Transfectam獲自Promega(Madison,WI)。遺傳霉素和所有的限制性酶獲自Boehringer Mannheim。利用QiaFilter Maxi Cartridges(Qiagen)按照制造商的說明從大腸桿菌細(xì)胞中純化用于轉(zhuǎn)染的DNA。所有DNA制劑均通過限制性酶消化檢驗(yàn)。利用ABI PRISM 310測序儀證實(shí)載體序列。
關(guān)于所用載體和DNA序列的其它信息已描述于Scanlan MJ,Raj BK,Calvo B,Garin-Chesa P,Sanz-Moncasi MP,Healey JH,Old LJ,RettigWJ.選擇性表達(dá)于上皮性癌的基質(zhì)成纖維細(xì)胞中的絲氨酸蛋白酶家族成員，成纖維細(xì)胞活化蛋白α的分子克隆。(1992)美國國家科學(xué)院進(jìn)展89:10832-10836中。FAP cDNA序列已經(jīng)保藏于Genbank(登記號HS09287)。
細(xì)胞培養(yǎng)和免疫檢測利用Transfectam按照制造商的說明以1mg DNA轉(zhuǎn)染HT-1080細(xì)胞。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法用10mgDNA轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞(BrannMR；BuckleyNJ；Jones SVP；Bonner TI.克隆的毒蕈堿受體在A9L細(xì)胞中的表達(dá)。(1987)分子藥理學(xué)(Mol Pharmacol)32:450-455)。24小時后，將細(xì)胞1∶10稀釋至含有200μg/ml遺傳霉素的新鮮培養(yǎng)基中。挑取菌落并如在RettigWJ；Garin-ChesaP；Beresford HR；Oettgen HF；Melamed MR；Old LJ.人腫瘤的細(xì)胞表面糖蛋白在正常和惡性組織以及培養(yǎng)細(xì)胞中的分化表達(dá)。(1988)美國國家科學(xué)院進(jìn)展85:3110-3114中所描述的通過免疫熒光檢測FAP的表達(dá)。
如在Rettig WJ,Garin-Chesa P,Healey JH,Su SL,Ozer HL,Schwab M,Albino AP,Old LJ.在間充質(zhì)和神經(jīng)外胚層來源的正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中成纖維細(xì)胞活化蛋白的調(diào)節(jié)以及異聚體結(jié)構(gòu)。(1993)癌癥研究(CancerRes)53:3327-3335中所描述的，用代謝性標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行同cF19的免疫沉淀。
HT-1080和293細(xì)胞的FAP抗原表達(dá)在免疫熒光檢測中用抗FAP抗體檢測，并發(fā)現(xiàn)為抗原陰性。這些細(xì)胞用FAP.38載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳霉素抗性菌落。挑取獨(dú)立的菌落，并通過免疫熒光分析FAP的表達(dá)。鑒定了兩個細(xì)胞克隆并指定為HT-1080FAP克隆33和293FAPI/2，它們表達(dá)由cF19抗體所識別的細(xì)胞表面結(jié)合型FAP蛋白。用cF19抗體對非透化的HT-1080FAP充隆33和293FAP I/2染色證實(shí)了FAP蛋白的細(xì)胞表面定位。
將35S-蛋氨酸標(biāo)記的HT-1080FAP克隆33細(xì)胞或293FAP I/2細(xì)胞的抽提物中放射標(biāo)記的FAP蛋白同cF19免疫沉淀導(dǎo)致在放射自顯影后出現(xiàn)一條93千道爾頓的條帶。在親代HT-1080或293細(xì)胞提取物的免疫沉淀中檢測不到該條帶。
如在免疫學(xué)檢測中用抗FAP抗體所確定的，2個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，HT-1080FAP克隆33和293FAP I/2在其細(xì)胞表面表達(dá)FAP。親代HT-1080或親代293細(xì)胞不表達(dá)可檢測水平的FAP。
買施例14:CD8-FAP融合蛋白的產(chǎn)生和鑒定在昆蟲細(xì)胞中生成以CD8-FAP融合蛋白形式存在的可溶性人FAP(成纖維細(xì)胞活化蛋白)用于鑒定含有抗FAP mAb結(jié)合位點(diǎn)的LAHC。選擇小鼠CD8以使蛋白可以分泌，并提供一個額外的表位標(biāo)簽。
用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法將小鼠CD8α(GenbankM12825)中前189個氨基酸所組成的CD8胞外區(qū)的編碼cDNA連接至FAP胞外區(qū)(27至760位氨基酸)的編碼cDNA，基本上按照由Lane等(Lane P,Brocker T,Hubele S,PadovanE,Lazavecchia A,McConnell.可溶性CD40配體在T細(xì)胞依賴的活化中可以取代正常T細(xì)胞來源的CD40配體向B細(xì)胞傳遞信號。(1993)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J Exp Med)177:1209-1213)所述。通過DNA測序確證所有克隆的可靠性。將所獲的DNA插入到pVL1393載體(Invitrogen)中，并按照所描述的(桿狀病毒表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)室手冊。O'Reilly DR,Miller LK,LuckowVA，(編)牛津大學(xué)出版社紐約，1994)用該載體轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞(Invitrogen)和擴(kuò)增所獲的重組桿狀病毒。收集用重組CD8-FAP桿狀病毒感染4天的HighFiveTM細(xì)胞(Invitrogen)的余下培養(yǎng)液并通過超速離心使之澄清。
上面已經(jīng)描述了CD8-FAP ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))(實(shí)施例12)。
用CD8-FAP病毒感染的昆蟲培養(yǎng)物向培養(yǎng)基中分泌一種融合蛋白，其攜帶有F19表位而且被抗FAP抗體識別(圖1)。單純細(xì)胞培養(yǎng)液或用CD8-CD40L融合蛋白感染的昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)液都不結(jié)合抗FAP抗體。
攜帶F19表位的可溶性CD8-FAP蛋白被分泌至被感染的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中。對照構(gòu)建體所感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清不含有攜帶F19表位的抗原。
在昆蟲細(xì)胞中生成可溶形式的FAP,CD8-FAP，而且CD8-FAP被證明攜帶有被cF19所識別的表位。
在感染的4天后收集來自用編碼CD8-FAP或CD8-CD40L融合蛋白的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞的上清。將無細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基用作一種額外的對照(培養(yǎng)基)。將這些材料的連續(xù)稀釋物加入到抗CD8抗體包被的微量滴定板中并使其能夠結(jié)合。隨后加入cF19(1mg/ml)并使其可以結(jié)合。用辣根過氧化物酶結(jié)合的抗人抗體來檢測所結(jié)合的cF19。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)姓名Boehringer Ingelheim Intemational GmbH(B)街名Rheinstrasse(C)城市Ingelheim am Rhein(E)國家德國(F)郵編55216(G)電話++49-6132-772770(H)電傳++49-6132-774377(ⅱ)發(fā)明標(biāo)題具備改善的可制備性的FAPα-特異性抗體(ⅲ)序列數(shù)101(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID N0: 1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度339個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1GACATTGTGA TGACCCAATC TCCAGACTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGGA GAGGGCCACC60ATCAACTGCA AGTCCAGTCA GAGCCTTTTA TATTCTAGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC 120TGGTATCAGC AGAAACCAGG ACAGCCACCC AAACTCCTCA TCTTTTGGGC TAGCACTAGG 180GAATCTGGGG TACCTGATAG GTTCAGTGGC AGTGGGTTTG GGACAGACTT CACCCTCACC 240ATTAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTACT GTCAGCAATA TTTTAGCTAT 300CCGCTCACGT TCGGACAAGG GACCAAGGTG GAAATAAAA 339(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度113個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser20 25 30Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln85 90 95Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度339個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO: 3GACATTGTGA TGACCCAATC TCCAGACTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGGA GAGGGCCACC 60ATCAACTGCA AGTCCAGTCA GAGCCTTTTA TATTCTAGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC120TGGTTCCAGC AGAAACCAGG ACAGCCACCC AAACTCCTCA TCTTTTGGGC TAGCACTAGG180GAATCTGGGG TACCTGATAG GTTCAGTGGC AGTGGGTTTG GGACAGACTT CACCCTCACC240ATTAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATGACT GTCAACAATA TTTTAGCTAT300CCGCTCACGT TCGGACAAGG GACCAAGGTG GAAATAAAA 339(2)SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度113個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser20 25 30Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 7580Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Asp Cys Gln Gln85 90 95Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO:5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度339個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5GACATTGTGA TGACCCAATC TCCAGACTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGGA GAGGGCCACC 60ATCAACTGCA AGTCCAGTCA GAGCCTTTTA TATTCTAGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC120TGGTATCAGC AGAAACCAGG ACAGCCACCC AAACTCCTCA TCTATTGGGC TAGCACTAGG180GAATCTGGGG TACCTGATAG GTTCAGTGGC AGTGGGTTTG GGACAGACTT CACCCTCACC240ATTAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTACT GTCAGCAATA TTTTAGCTAT300(2)SEQ ID NO:6的資料(ⅰ)序列特征(A)長度113個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 510 15Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser20 25 30Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln85 90 95Tyr phe Ser Tyr pro Leu Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO:7的資料(ⅰ)序列特征(A)長度372個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO:7CAGGTGCAAC TAGTGCAGTC CGGCGCCGAA GTGAAGAAAC CCGGTGCTTC CGTGAAAGTC60AGCTGTAAAA CTAGTAGATA CACCTTCACT GAATACACCA TACACTGGGT TAGACAGGCC 120CCTGGCCAAA GGCTGGAGTG GATAGGAGGT ATTAATCCTA ACAATGGTAT TCCTAACTAC 180AACCAGAAGT TCAAGGGCCG GGCCACCTTG ACCGTAGGCA AGTCTGCCAG CACCGCCTAC 240ATGGAACTGT CCAGCCTGCG CTCCGAGGAC ACTGCAGTCT ACTACTGCGC CAGAAGAAGA 300ATCGCCTATG GTTACGACGA GGGCCATGCT ATGGACTACT GGGGTCAAGG AACCCTTGTC 360ACCGTCTCCT CA 372(2)SEQ ID NO:8的資料(ⅰ)序列特征(A)長度124個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列述:SEQ ID NO:8Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr20 25 30Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Gly Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO:9的資料(ⅰ)序列特征(A)長度372個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9CAGGTGCAAC TAGTGCAGTC CGGCGCCGAA GTGAAGAAAC CCGGTGCTTC CGTGAAAGTC 60AGCTGTAAAA CTAGTAGATA CACCTTCACT GAATACACCA TACACTGGGT TAGACAGGCC 120CCTGGCCAAA GGCTGGAGTG GATAGGAGGT ATTAATCCTA ACAATGGTAT TCCTAACTAC 180AACCAGAAGT TCAAGGGCCG GGCCACCTTG ACCGTAGGCA AGTCTGCCAG CACCGCCTAC 240ATGGAACTGT CCAGCCTGCG CTCCGAGGAC ACTGCAGTCT ACTTCTGCGC CAGAAGAAGA 300ATCGCCTATG GTTACGACGA GGGCCATGCT ATGGACTACT GGGGTCAAGG AACCCTTGTC 360ACCGTCTCCT CA372(2)SEQ ID NO:10的資料(ⅰ)序列特征(A)長度124個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr20 25 30Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Ash Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Gly Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO:11的資料(ⅰ)序列特征(A)長度372個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述 SEQ ID NO:11CAGGTGCAAC TAGTGCAGTC CGGCGCCGAA GTGAAGAAAC CCGGTGCTTC CGTGAAAGTC 60AGCTGTAAAA CTAGTAGATA CACCTTCACT GAATACACCA TACACTGGGT TAGACAGGCC120CCTGGCCAAA GGCTGGAGTG GATAGGAGGT ATTAATCCTA ACAATGGTAT TCCTAACTAC180AACCAGAAGT TCAAGGGCCG GGTCACCATC ACCGTAGACA CCTCTGCCAG CACCGCCTAC 240ATGGAACTGT CCAGCCTGCG CTCCGAGGAC ACTGCAGTCT ACTACTGCGC CAGAAGAAGA 300ATCGCCTATG GTTACGACGA GGGCCATGCT ATGGACTACT GGGGTCAAGG AACCCTTGTC 360ACCGTCTCCT CA372(2)SEQ ID NO:12的資料(ⅰ)序列特征(A)長度124個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr20 25 30Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp100 105110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO:13的資料(ⅰ)序列特征(A)長度372個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13CAGGTGCAAC TAGTGCAGTC CGGCGCCGAA GTGAAGAAAC CCGGTGCTTC CGTGAAAGTC 60AGCTGTAAAA CTAGTAGATA CACCTTCACT GAATACACCA TACACTGGGT TAGACAGGCC120CCTGGCCAAA GGCTGGAGTG GATAGGAGGT ATTAATCCTA ACAATGGTAT TCCTAACTAC180AACCAGAAGT TCAAGGGCCG GGTCACCATC ACCGTAGACA CCTCTGCCAG 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CTAGTGGATA CACCTTCACT GAATACACCA TACACTGGGT TAGACAGGCC120CCTGGCCAAA GGCTGGAGTG GATAGGAGGT ATTAATCCTA ACAATGGTAT TCCTAACTAC180AACCAGAAGT TCAAGGGCCG GGTCACCATC ACCGTAGACA CCTCTGCCAG CACCGCCTAC240ATGGAACTGT CCAGCCTGCG CTCCGAGGAC ACTGCAGTCT ACTACTGCGC CAGAAGAAGA300ATCGCCTATG GTTACGACGA GGGCCATGCT ATGGACTACT GGGGTCAAGG AACCCTTGTC360ACCGTCTCCT CA372(2)SEQ ID NO:16的資料(ⅰ)序列特征(A)長度124個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr20 25 30Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gly Ile Ash Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp100 105 110Tyr Trp GIy Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 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Phe165 170 175Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val180 185 190Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val195 200 205Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys210 215 220Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu225 230 235 240Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp val260 265 270Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val275 280 285Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser290 295 300Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu305 310 315 320Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala325 330 335Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro340 345 350Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Ash Gln355 360 365Val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala370 375 380Val Glu Trp Glu 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7020AAGCCCTCCC AGCCCCCATC GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC 7080CACAGGTGTA CACCCTGCCC CCATCCCGGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 7140CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG AGCAATGGGC 7200AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGCTGGA CTCCGACGGC TCCTTCTTCC 7260TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT 7320CCGTGATGCA TGAGGCTCTG CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG 7380GTAAATGAGT GCGACGGCCG GCAAGCCCCG CTCCCCGGGC TCTCGCGGTC GCACGAGGAT 7440GCTTGGCACG TACCCCCTGT ACATACTTCC CGGGCGCCCA GCATGGAAAT AAAGCACCGG 7500ATCTAATAAA AGATATTTAT TTTCATTAGA TATGTGTGTT GGTTTTTTGT GTGCAGTGCC 7560TCTATCTGGA GGCCAGGTAG GGCTGGCCTT GGGGGAGGGG GAGGCCAGAA TGACTCCAAG 7620AGCTACAGGA AGGCAGGTCA GAGACCCCAC TGGACAAACA GTGGCTGGAC TCTGCACCAT 7680AACACACAAT CAACAGGGGA GTGAGCTGGA AATTTGCTAG CGAATTAATT C 7731(2)SEQ ID NO:43的資料(ⅰ)序列特征(A)長度472個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro 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NO:51的資料(ⅰ)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:51ACCGTCTCCT CAGCCTCCAC CAAGGGC27(2)SEQ ID NO:52的資料(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:52Thr Val Ser Ser A1a Ser Thr Lys Gly1 5(2)SEQ ID NO:53的資料(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:53GAAATAAAAC GTGAGTGGAT CC 22(2)SEQ ID NO:54的資料(ⅰ)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:54CTTCTTTCCT CAGGAACTGT GGCTGCA27(2)SEQ ID NO:55的資料(ⅰ)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:55Thr Val Ala Ala1(2)SEQ ID NO:56的資料(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:56GAAATAAAAC GAACTGTGGC TGCA 24(2)SEQ ID NO:57的資料(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:57Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala1 5(2)SEQ ID NO:58的資料(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:58GAAATAAAAC GAACTGTGGC TGCA 24(2)SEQ ID NO:59的資料(ⅰ)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:59Glu Ile Lys Arg Thr Val Kia Ala1 5(2)SEQ ID NO:60的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:60Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Thr Cys Gly20(2)SEQ ID NO:61的資料(ⅰ)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:61Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15Val Leu Ser(2)SEQ ID NO:62的資料(ⅰ)序列特征(A)長度9個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:62GCCGCCACC(2)SEQ ID NO:63的資料(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/deSC=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:63CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGGATTCACA GGCCCAG37(2)SEQ ID NO:64的資料(ⅰ)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO:64Met Asp Ser Gln Ala Gln1 5(2)SEQ ID NO:65的資料(ⅰ)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:65CCGAGGATCC ACTCACGTTT CAGCTCCAGC TTGGT 35(2)SEQ ID NO:66的資料(ⅰ)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:66CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGGGATGGAG CTGGGTC 37(2)SEQ ID NO:67的資料(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:67Met Gly Trp Ser Trp Val1 5(2)SEQ ID NO:68的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:68CCGAGGATCC ACTCACCTGA GGAGACGGTG ACTGA 35(2)SEQ ID NO:69的資料(ⅰ)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:69GTCATCACAA TGTCTCCGGA GGAACCTGGA ACCCAG 36(2)SEQ ID NO:70的資料(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO:70CTCCGGAGAC ATTGTGATGA CCCAATCTC 29(2)SEQ ID NO:71的資料(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:71CTCCGGAGAC ATTGTGATGA CCCAATCTC29(2)SEQ ID NO:72的資料(ⅰ)序列特征(A)長度72個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:72CAGTCAGAGC CTTTTATATT CTAGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ATCAGCAGAA 60ACCAGGACAG CC 72(2)SEQ ID NO:73的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:73ACCCCAGATT CCCTAGTGCT AGCCCAAAAG ATGAGGAGTT TGGG 44(2)SEQ ID NO:74的資料(ⅰ)序列特征(A)長度67個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:74TAGCACTAGG GAATCTGGGG TACCTGATAG GTTCAGTGGC AGTGGGTTTG GGACAGACTT 60CACCCTC 67(2)SEQ ID NO:75的資料(ⅰ)序列特征(A)長度53個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:75GTCCCTTGTC CGAACGTGAG CGGATAGCTA AAATATTGCT GACAGTAATA AAC 53(2)SEQ ID NO:76的資料(ⅰ)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc= 引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:76GCTCACGTTC GGACAAGGGA CCAAGGTGGA AAT 33(2)SEQ ID NO:77的資料(ⅰ)序列特征(A)長度72個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:77CAGTCAGAGC CTTTTATATT CTAGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT TCCAGCAGAA60ACCAGGACAG CC72(2)SEQ ID NO:78的資料(ⅰ)序列特征(A)長度57個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:78GTCCCTTGTC CGAACGTGAG CGGATAGCTA AAATATTGCT GACAGTCATA AACTGCC 57(2)SEQ ID NO:79的資料(ⅰ)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:79CCCAAACTCC TCATCTATTG GGCTAGCACT AGGG 34(2)SEQ ID NO:80的資料(ⅰ)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:80CCCTAGTGCT AGCCCAATAG ATGAGGAGTT TGGG 34(2)SEQ ID NO:81的資料(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸
(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:81TACGCAAACC GCCTCTC 17(2)SEQ ID NO:82的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:82GAGTGCACCA TATGCGGT 18(2)SEQ ID NO:83的資料(ⅰ)序列特征(A)長度16個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:83AACAGCTATG ACCATG 16(2)SEQ ID NO:84的資料(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:84GTTTTCCCAG TCACGAC 17(2)SEQ ID NO:85的資料(ⅰ)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:85GTGTATTCAG TGAAGGTGTA TCTACTAGTT TTACAGCTGA CTTTCAC 47(2)SEQ ID NO:86的資料(ⅰ)序列特征(A)長度53個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:86TAGTAGATAC ACCTTCACTG AATACACCAT ACACTGGGTT AGACAGGCCC CTG 53(2)SEQ ID NO:87的資料(ⅰ)序列特征(A)長度71個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:87CCCTTGAACT TCTGGTTGTA GTTAGGAATA CCATTGTTAG GATTAATACC TCCTATCCAC 60TCCAGCCTTT G71(2)SEQ ID NO:88的資料(ⅰ)序列特征(A)長度71個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:88TAACTACAAC CAGAAGTTCA AGGGCCGGGC CACCTTGACC GTAGGCAAGT CTGCCAGCAC 60CGCCTACATG G71(2)SEQ ID NO:89的資料(ⅰ)序列特征(A)長度63個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:89GCATGGCCCT CGTCGTAACC ATAGGCGATT CTTCTTCTGG CGCAGTAGTA GACTGCAGTG60TCC 63(2)SEQ ID NO:90的資料(ⅰ)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:90CTATGGTTAC GACGAGGGCC ATGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAAC 48(2)SEQ ID NO:91的資料(ⅰ)序列特征(A)長度71個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:91TAACTACAAC CAGAAGTTCA AGGGCCGGGT CACCATCACC GTAGACACCT CTGCCAGCAC 60CGCCTACATG G71(2)SEQ ID NO:92的資料(ⅰ)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:92GGACACTGCA GTCTACTTCT GCGCCAG27(2)SEQ ID NO:93的資料(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:93TACGCAAACC GCCTCTC 17(2)SEQ ID NO:94的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:94GAGTGCACCA TATGCGGT18(2)SEQ ID NO:95的資料(ⅰ)序列特征(A)長度76個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:95CCTTTGGCCA GGGGCCTGTC TAACCCAGTG TATGGTGTAT TCAGTGAAGG TGCTATCCAC 60TAGTTTCCAC TAGTTT 76(2)SEQ ID NO:96的資料(ⅰ)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:96GTCACCGTCC TTGACACGCG TCTCGGGA 28(2)SEQ ID NO:97的資料(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:97TTGGAGGAGG GTGCCAG17(2)SEQ ID NO:98的資料(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(xi)序列描述SEQ ID NO:98GAGACATTGT GACCCAATCT CC 22(2)SEQ ID NO:99的資料(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc= “引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:99GACAGTCATA AACTGCCACA TCTTC25(2)SEQ ID NO:100的資料(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10023TTGACACGCG TCTCGGGAAG CTT(2)SEQ ID NO:101的資料(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:101GGCGCAGAGG ATCCACTCAC CT 2權(quán)利要求
1.一種具有單克隆抗體F19(ATCC登記號HB 8269)的互補(bǔ)性決定區(qū)的抗體蛋白，所述的抗體蛋白特異地結(jié)合成纖維細(xì)胞活化蛋白，并以其具有框架修飾為特征，其中這些框架修飾導(dǎo)致與具有F19的可變區(qū)和外源的恒定區(qū)的嵌合抗體相比在宿主細(xì)胞中改善的可制備性。
2.一種抗體蛋白，其以具有根據(jù)權(quán)利要求1的一輕鏈可變區(qū)和一重鏈可變區(qū)為特征，所述兩區(qū)分別連接人的恒定區(qū)。
3.權(quán)利要求2的抗體蛋白，其中所述的人輕鏈恒定區(qū)為人x恒定區(qū)。
4.權(quán)利要求2的抗體蛋白，其中所述的人重鏈恒定區(qū)為人γ-1恒定區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其以在原始培養(yǎng)基樣品中通過ELISA測定的表達(dá)水平和/或純化抗體的產(chǎn)量超過無框架修飾的嵌合抗體的表達(dá)水平和/或純化產(chǎn)量至少10倍為特征。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其以在原始培養(yǎng)基樣品中通過ELISA測定的表達(dá)水平和/或純化抗體的產(chǎn)量超過無框架修飾的嵌合抗體的表達(dá)水平和/或純化產(chǎn)量至少20倍為特征。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其以在原始培養(yǎng)基樣品中通過ELISA測定的表達(dá)水平和/或純化抗體的產(chǎn)量超過無框架修飾的嵌合抗體的表達(dá)水平和/或純化產(chǎn)量至少100倍為特征。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其以在真核細(xì)胞中顯示出改善的可制備性為特征。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的抗體蛋白，其中所述的真核細(xì)胞為中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其中在輕鏈區(qū)Kabat 87位處的氨基酸不是天冬酰胺。
11.權(quán)利要求10的抗體蛋白，其中輕鏈區(qū)Kabat 87位的氨基酸選自芳香族或脂肪族氨基酸。
12.權(quán)利要求11的抗體蛋白，其中輕鏈區(qū)Kabat 87位的芳香族氨基酸為酪氨酸或苯丙氨酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其中輕鏈區(qū)Kabat 36位的氨基酸選自芳香族氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:2中所示的輕鏈可變區(qū)。
15.權(quán)利要求14的抗體蛋白，其以輕鏈可變區(qū)是由在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列所編碼為特征。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:6中所示的輕鏈可變區(qū)。
17.權(quán)利要求16的抗體蛋白，其以輕鏈可變區(qū)是由在SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序列所編碼為特征。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其含有在SEQ IDNO:8、10、12、14中的任何一個所示的重鏈可變區(qū)。
19.權(quán)利要求18的抗體蛋白，其以重鏈可變區(qū)是由在SEQ ID NO:7、9、11、13中的任何一個所示的核苷酸序列所編碼為特征。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:2中所示的輕鏈可變區(qū)以及在SEQ ID NO:12中所示的重鏈可變區(qū)。
21.權(quán)利要求20的抗體蛋白，其以輕鏈可變區(qū)是由在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列所編碼而重鏈可變區(qū)是由在SEQ ID NO:11中所示的核苷酸序列所編碼為特征。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的抗體蛋白，其含有在SEQ IDNO:20中所示的輕鏈恒定區(qū)以及在SEQ ID NO:22中所示的重鏈恒定區(qū)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至13、18或19中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:2中所示的輕鏈可變區(qū)以及在SEQ ID NO:8中所示的重鏈可變區(qū)。
24.權(quán)利要求23的抗體蛋白，其以輕鏈可變區(qū)是由在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列所編碼而重鏈可變區(qū)是由在SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列所編碼為特征。
25.一段核苷酸序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白。
26.一種重組DNA載體，其含有權(quán)利要求25的核苷酸序列。
27.權(quán)利要求26的重組DNA載體，所述的載體為表達(dá)載體。
28.一種宿主細(xì)胞，其攜帶有根據(jù)權(quán)利要求26或27的載體。
29.權(quán)利要求28的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
30.權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞，其中所述的真核宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞為CHO或COS細(xì)胞。
32.制備根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白的方法，所述的方法包括下述步驟(a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求28至31中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其培養(yǎng)條件使所述抗體蛋白由所述宿主細(xì)胞表達(dá)，并且(b)分離所述的抗體蛋白。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述的宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選為CHO或COS細(xì)胞。
34.權(quán)利要求32或33的方法，其中所述的宿主細(xì)胞由分別攜帶輕鏈和重鏈表達(dá)單位的兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。
35.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其中所述的抗體蛋白結(jié)合一種治療試劑。
36.權(quán)利要求35的抗體蛋白，其中所述的治療試劑選自放射性同位素、毒素、類毒素、炎性介質(zhì)以及化療試劑。
37.權(quán)利要求36的抗體蛋白，其中所述的放射性同位素為發(fā)射β-射線的放射性同位素。
38.權(quán)利要求37的抗體蛋白，其中所述的放射性同位素選自186錸、188錸、131碘和90釔。
39.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其以被標(biāo)記為特征。
40.權(quán)利要求39的抗體蛋白，其中所述的標(biāo)記為可檢測的標(biāo)志物。
41.權(quán)利要求40的抗體蛋白，其中可檢測的標(biāo)志物選自酶、染料、放射性同位素、地高辛配基和生物素。
42.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其結(jié)合一種可顯象試劑。
43.權(quán)利要求42的抗體蛋白，其中可顯象試劑為放射性同位素。
44.權(quán)利要求43的抗體蛋白，其中所述的放射性同位素為發(fā)射γ-射線的放射性同位素。
45.權(quán)利要求44的抗體蛋白，其中所述的放射性同位素為125I。
46.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白以及一種可藥用的載體。
47.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求35至38中任一項(xiàng)的抗體蛋白以及一種可藥用的載體。
48.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求42至45中任一項(xiàng)的抗體蛋白以及一種可藥用的載體。
49.權(quán)利要求46至48的藥物組合物，其用于腫瘤的治療或顯象，其中所述的腫瘤與活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞相關(guān)，優(yōu)選其中所述的腫瘤選自結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移癌。
50.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白在癌癥治療中的應(yīng)用。
51.根據(jù)權(quán)利要求35至38中任一項(xiàng)的抗體蛋白在癌癥治療中的應(yīng)用。
52.根據(jù)權(quán)利要求42至45中任一項(xiàng)的抗體蛋白對于顯象活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的應(yīng)用。
53.根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)的抗體蛋白對于檢測活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞在標(biāo)本中的存在的應(yīng)用。
54.一種治療腫瘤的方法，其中所述腫瘤與能夠同根據(jù)權(quán)利要求1至24或35至38中任一項(xiàng)的抗體蛋白特異性形成復(fù)合物的活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞相關(guān)，該方法包括使腫瘤與腫瘤治療有效量的所述抗體蛋白相接觸。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述腫瘤為具有選自結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞的腫瘤。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述接觸在體外是有效的。
57.權(quán)利要求54的方法，其中所述接觸在體內(nèi)是有效的。
58.一種檢測在正愈合的傷口、炎癥或腫瘤中活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞存在的方法，其特征是(a)在適于所述抗體和抗原形成復(fù)合物的條件下，將一種可能含有活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的樣品同根據(jù)權(quán)利要求1至24或39至41中任一項(xiàng)的抗體蛋白相接觸，(b)檢測所述復(fù)合物的存在，由此檢測在正愈合的傷口、炎癥或腫瘤中活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的存在。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述腫瘤為具有選自結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞的腫瘤。
60.權(quán)利要求58或59的方法，其中所述抗體蛋白為根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)的蛋白。
61.一種顯象在患者體內(nèi)正愈合的傷口、發(fā)炎的皮膚或腫瘤中活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞存在的方法，其特征是(a)在適于形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，將結(jié)合可顯象試劑的根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白施予患者，(b)顯象以該方式所形成的任何復(fù)合物。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述腫瘤為具有選自結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌和腦轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞的腫瘤。
63.一種檢測腫瘤-基質(zhì)的方法，其特征是(a)在適于形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，將一適當(dāng)樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的抗體蛋白相接觸，(b)檢測因此所形成的任何復(fù)合物的存在，(c)將所述復(fù)合物的存在與腫瘤-基質(zhì)的存在相聯(lián)系。
64.權(quán)利要求62的方法，其中所述的抗體被可檢測的標(biāo)志物所標(biāo)記。
65.一種在患者體內(nèi)顯象腫瘤-基質(zhì)的方法，其包括(a)在適于形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，施予患者根據(jù)權(quán)利要求42至45中任一項(xiàng)的抗體蛋白，(b)顯象因此所形成的任何復(fù)合物，并由此在患者體內(nèi)顯象腫瘤-基質(zhì)的存在。
66.一種抗體蛋白，其含有在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的抗體蛋白，其還含有在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。
68.根據(jù)權(quán)利要求66或67的抗體蛋白，其還含有在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列以及在SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。
69.一種DNA分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求66至68中任一項(xiàng)的抗體蛋白。
70.一種宿主細(xì)胞，其攜帶有根據(jù)權(quán)利要求69的DNA分子。
71.一種制備權(quán)利要求66至68中任一項(xiàng)的抗體蛋白的方法，所述的方法包括下述步驟(a)在所述抗體蛋白由權(quán)利要求70的宿主細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并且(b)分離所述的抗體蛋白。
72.根據(jù)權(quán)利要求66至68中任一項(xiàng)的抗體蛋白，其連接放射性同位素，優(yōu)選131I、125I、186Re、188Re或90Y。
73.一種藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求66至68、或72中任一項(xiàng)的抗體蛋白以及一種可藥用的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組抗體蛋白,其特異性結(jié)合成纖維細(xì)胞活化蛋白α(FAPα)并且包含使宿主細(xì)胞中可制備性改善的框架修飾。本發(fā)明還涉及所述抗體用于診斷和治療目的的應(yīng)用以及制備所述抗體的方法。
文檔編號A61K47/48GK1303430SQ99806582
公開日2001年7月11日 申請日期1999年4月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月30日
發(fā)明者約翰·E·帕克, 皮拉爾·加林－切薩, 尤維·班伯格, 沃爾夫?qū)·雷蒂格, 奧利維爾·萊杰, 喬斯·塞爾丹哈 申請人:貝林格爾·英格海姆國際有限公司