專利名稱：含有泊洛沙姆和其它殺微生物劑的局部制劑,以及施用器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有成膜成分和任意活性組分的制劑，特別是局部用制劑。具體而言，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療與粘膜或皮膚有關(guān)或通過它們傳播的由任何致病體，特別是病原體引起的疾病的局部制劑。本發(fā)明還涉及用于將局部制劑均勻給藥以預(yù)防或治療與粘膜腔有關(guān)或傳播的疾病，或防止外源性物質(zhì)如精子或微生物侵入的施用器。
背景技術(shù)：
由免疫缺陷病毒(HIV)、皰疹和其他病原體引起的性傳播病(STD)正以蔓延的節(jié)律傳播。全球STD的發(fā)生率、發(fā)病率和死亡率極其嚴(yán)重。據(jù)推測全世界約有900,000,000人感染了性傳播性病原體。每年美國有12,000,000多人新被感染上STD病原體。在發(fā)達(dá)國家中單純皰疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)是最常見的生殖器潰瘍致病因素。生殖皰疹感染是長期性的，并且可以引起疼痛和復(fù)發(fā)性生殖損害、系統(tǒng)性并發(fā)癥、身心疾病，還可以由分娩傳染HSV導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒疾病。生殖傳播的病原體通常歸因于那些不知其自身已被感染的人群的無癥狀病毒脫落。目前在5個(gè)12歲或更高年齡的美國人中就可檢測出有1人感染了HSV-2。此外，據(jù)估計(jì)三分之一以上的世界人口患有復(fù)發(fā)性HSV感染，且由此可以在生產(chǎn)性感染的發(fā)作期時(shí)傳播病毒。淋病奈瑟氏球菌和沙眼衣原體被認(rèn)為是兩種最盛行的性傳播細(xì)菌感染。據(jù)推測全世界每年的發(fā)生率是淋病25,000,000例，衣原體50,000,000例。在另一方面，最近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，被HIV感染的個(gè)體的數(shù)量在全球范圍內(nèi)急劇增長。按照美國官方所述，在1997年中每天有多達(dá)16,000人被HIV感染。世界健康組織(WHO)提供的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(至1997年末)指出，全世界約3千1百萬人口感染了HIV，并且這個(gè)數(shù)字在2000年將達(dá)到4千萬。
從整體看，異性傳染導(dǎo)致了85-90％的HIV感染。由于沒有抗HIV的疫苗，預(yù)防措施是現(xiàn)今僅有的可以減少這種反轉(zhuǎn)錄病毒傳播的工具。持續(xù)和小心地使用避孕套是抗性傳播的HIV和其他性病病原體的有效屏障，但應(yīng)在所有危險(xiǎn)的性交中使用避孕套以明顯減少獲得感染的可能性。在非洲，最強(qiáng)有力的預(yù)防方案只能是在妓女約70％的性交中增加使用避孕套。所以，避孕套在提高控制高危人群中AIDS流行的可行性受到懷疑。在嚴(yán)重異性傳播HIV的情況中，婦女提防其接觸STD的危險(xiǎn)的預(yù)防性措施成為遏制該流行病的另一種工具。這種預(yù)防工具也可用于男性同性關(guān)系，因該工具在受體伙伴的控制下提供了附加保護(hù)作用。因此，重要的是開發(fā)出可以代替避孕套的防護(hù)方法，其中人們可以在無需詢問其性伙伴下保護(hù)自身不被感染。顯然，能夠?qū)σ餉IDS、皰疹和其他STD疾病的病原體的起始傳播起阻斷作用的預(yù)防方法將產(chǎn)生巨大效益。
在預(yù)防HIV的領(lǐng)域中，國際衛(wèi)生組織(WHO)和國立衛(wèi)生研究所(NIH)實(shí)際上極其優(yōu)先開發(fā)了安全的局部用殺微生物藥。局部殺微生物藥經(jīng)常由活性組分和賦形劑組成?；钚越M分可以通過不同的機(jī)制起作用，其中包括ⅰ)破壞生物細(xì)胞膜、包膜或殼脂質(zhì)或蛋白質(zhì)組成(例如去污劑型殺精子劑/殺微生物藥，例如壬苯醇醚-9)，ⅱ)阻斷對傳染力來說是必要的受體-配體相互作用(例如微生物粘附抑制劑，例如硫酸化化合物)，ⅲ)抑制病原體的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外復(fù)制(例如殺微生物藥)，ⅳ)改變陰道環(huán)境和降低對感染的敏感性(例如維持正常陰道菌落和環(huán)境的緩沖劑和產(chǎn)品)或ⅴ)提高局部免疫反應(yīng)(例如免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑)。局部殺微生物藥對抗引起STD的性傳播病原體的總效能取決于所施用活性組分的效能及其覆蓋整個(gè)陰道/子宮頸區(qū)域以增大對抗病原體效能的性能。這些活性劑覆蓋整個(gè)陰道腔的容量極大程度取決于所用賦形劑的類型。典型賦形劑的制劑包括凝膠、霜劑、泡沫、栓劑、海綿和膜。
最常用的陰道制劑采用殺精子劑壬苯醇醚-9，一種非離子表面活性劑，作為殺微生物藥。在體外，壬苯醇醚-9滅活有包膜病毒，例如HSV、HIV和其他微生物，其中包括沙眼衣原體、淋病奈瑟氏球菌。然而，壬苯醇醚-9對抗HIV的潛在效能仍不清楚并且臨床試驗(yàn)的結(jié)果都有爭議。最近在喀麥隆1292名HIV陰性的妓女中進(jìn)行的控制試驗(yàn)顯示，應(yīng)用含有70mg壬苯醇醚-9的陰道薄膜并未降低新HIV、淋病或衣原體感染的發(fā)生率(Roddy等人，1998，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，339:504-510)。壬苯醇醚-9在降低感染體傳播中的失敗可以歸因于壬苯醇醚-9所用給藥體系對整個(gè)陰道/子宮頸的不完全覆蓋或發(fā)生了有利于粘膜毒性的微生物感染。由于全世界感染HIV、皰疹或其他性傳播病原體的個(gè)體數(shù)量急劇增加，迫切需要開發(fā)可以減少這些病原體傳播同時(shí)粘膜刺激性低且對陰道菌落和pH影響很小的活性產(chǎn)品和/或適當(dāng)給藥體系。
十二烷基硫酸鈉(SLS)是一種硫酸化表面活性劑，該化合物可以將病原體的膜蛋白變性。因此，它具有作為洗滌劑和離液劑的雙重作用。就此概念，我們進(jìn)行了評估SLS對HSV和HIV的潛在殺微生物作用的試驗(yàn)。我們的初步研究清楚地證明，SLS使兩種病毒的體外感染力改性。最近，Howett等人業(yè)已證實(shí)了我們有關(guān)SLS還是HSV-2、HIV-1的有效滅活劑的發(fā)現(xiàn)(《殺微生物藥的化學(xué)治療術(shù)》(Antimicrob.Agents Chemother.)43(2):314-321,1999)。此外，他們還表明，SLS在用低濃度短期治療后可有效對抗兔、牛和人體乳頭瘤病毒(無包膜病毒)。然而，這篇參考文獻(xiàn)沒有建議應(yīng)用賦形劑施用這種有效的殺微生物藥。對賦形劑的選擇至關(guān)重要，因這會影響有效藥物的濃度、藥物的有效期和制劑對粘膜的覆蓋程度，它們是提供防護(hù)侵入病原體的關(guān)鍵因素。另一類令人感興趣的候選殺微生物藥是微生物粘附抑制劑，例如硫酸化化合物，它們阻斷宿主細(xì)胞受體和微生物之間的相互作用。一種已知的微生物粘附抑制劑實(shí)例是葡聚糖硫酸鹽(DS)，該化合物是一種多硫酸化碳水化合物，并且業(yè)已表現(xiàn)出可以體外抑制HIV和皰疹病毒的感染力。
最近，我們開發(fā)出一種可以涂敷在陰道、子宮頸或肛門直腸粘膜上的且能夠有效預(yù)防性傳播病原體的凝膠制劑。該凝膠制劑的一個(gè)首要特征是其熱可逆性。由室溫下的液態(tài)在體溫下向凝膠態(tài)的轉(zhuǎn)化是最重要的，因?yàn)楫?dāng)涂敷在粗糙生理表面如陰道或肛門直腸上皮上時(shí)，該凝膠應(yīng)滲透至最細(xì)小的不規(guī)則表面內(nèi)，形成良好的抗感染物物理屏障。凝膠制劑具有下列FDA和NIH認(rèn)為是很重要的關(guān)鍵特征ⅰ)該制劑無色、無味或無染色，ⅱ)該制劑應(yīng)覆蓋在整個(gè)陰道/子宮頸，因它是以液態(tài)涂敷，ⅲ)該制劑適合于男性乳膠避孕套，ⅳ)該制劑能夠抗水流的沖洗，ⅴ)該制劑具有和健康陰道相類似的pH(pH4.0-4.5)，ⅵ)在極熱和冷的條件下該制劑可以保持理想的流變特性和ⅶ)該制劑在體外不影響正常的陰道菌落，尤其是乳桿菌屬。
我們的國際專利申請(WO97/42962)公開了含成膜成分的制劑的應(yīng)用，該制劑自身能夠形成抗病原體物理屏障。熱可逆凝膠如泊洛沙姆(poloxamer)特別適合于此用途。該成膜制劑還可以含有殺微生物藥、殺精子劑或其他任何藥物，而選擇取決于被滅活或被治療的病原體、生物或疾病。因此，制劑在給藥部位可以有效地用作物理屏障，和任選地用作化學(xué)或藥物屏障，以及適用作藥物緩釋體系。這些制劑可用于預(yù)防性病，并且用于治療感染、癌癥、炎癥或任意需要藥物治療的疾病或情況。另外，該專利公開指出，所述制劑降低有效殺精子劑/殺微生物藥如壬苯醇醚-9的毒性。然而，該專利公開沒有具體教導(dǎo)用SLS作為一種混合在局部制劑中的候選化學(xué)物質(zhì)。
HSV-1和HSV-2是親神經(jīng)病毒，它們主要感染神經(jīng)外胚層組織(包括皮膚)、外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。粘膜或皮膚表面一般是初次感染的部位。復(fù)發(fā)性唇皰疹(labialis herpes)和生殖皰疹分別是與HSV-1和HSV-2感染相關(guān)的最常見的臨床表現(xiàn)形式。復(fù)發(fā)是自發(fā)的，但它們與機(jī)體或情緒緊張、發(fā)燒、紫外線暴曬、組織損傷和免疫抑制有關(guān)聯(lián)。盡管在具有免疫能力的個(gè)體中它是溫和的疾病，但是HSV感染很麻煩，尤其是對于時(shí)常發(fā)作的患者來說。接受免疫療法或遭受疾病的患者具有患HSV感染的高危性。已證實(shí)腎和心臟移植的接受者感染的程度很高。此外，AIDS的暴發(fā)增強(qiáng)了無免疫應(yīng)答宿主HSV臨床疾病的嚴(yán)重性。
目前有效的局部抗病毒療法只是具體針對癥狀性復(fù)發(fā)皰疹產(chǎn)生有限的療效。這些局部制劑對皰疹性粘膜損害的惡化的有限效能可以歸因于藥物滲透入皮膚內(nèi)的能力較低。角質(zhì)層或表皮角質(zhì)層構(gòu)成了多數(shù)物質(zhì)滲透入皮膚的屏障。該層是由包埋在雙層脂質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的角質(zhì)細(xì)胞組成，所述基質(zhì)由膽固醇、游離脂肪酸和神經(jīng)酰胺構(gòu)成。所以，應(yīng)用皮膚滲透促進(jìn)劑是提高局部藥物制劑滲透至皮膚內(nèi)的常規(guī)策略。
SLS是一種表面活性劑，它通過提高表皮脂質(zhì)的流動性而具有皮膚滲透促進(jìn)特性。SLS的皮膚滲透促進(jìn)性質(zhì)結(jié)合其通過其洗滌和離液性(chaotropic properties)改變病毒感染力的性能進(jìn)一步提高了局部藥物制劑的效能。而且，因其離液特性，SLS比其他簡單洗滌劑具有廣譜的抗精子、細(xì)菌、真菌和病毒的活性。
泊洛沙姆被廣泛應(yīng)用于許多藥物用途，并且其無毒特性使它們適合于緩釋給藥體系。泊洛沙姆是皮膚病應(yīng)用的適當(dāng)基質(zhì)。事實(shí)上，當(dāng)以液態(tài)形式應(yīng)用時(shí)，泊洛沙姆因能夠滲透至粘膜和/或皮膚的細(xì)小不規(guī)則處內(nèi)而提供較佳的表面覆蓋度。此外，泊洛沙姆形成的網(wǎng)狀可以作為藥物緩釋體系用來延遲藥物作用。
發(fā)明概述按照本發(fā)明，第一個(gè)目的是提供一種含有成膜成分的涂敷在粘膜或皮膚表面上的制劑，優(yōu)選采用凝膠、霜劑或軟膏的形式。該凝膠制劑可用于覆蓋在不同類型的粘膜如陰道、子宮頸、肛門直腸、眼部、口腔、鼻腔或皮膚上以預(yù)防粘膜和/或皮膚的感染和/或異常狀況。而且，該凝膠制劑可以局部涂敷在眼部以治療和/或預(yù)防感染的眼科病癥。優(yōu)選采用熱可逆凝膠，該凝膠以液態(tài)形式涂敷，涂布在表面，當(dāng)它達(dá)到體表的溫度后形成半固體涂層。更優(yōu)選該熱可逆凝膠由泊洛沙姆407組成。也可以采用類似的聚合物如聚胺(poloxamine)。上述制劑還含有能夠在靶向細(xì)胞、組織或微生物中干擾生物細(xì)胞膜、包膜或殼脂質(zhì)或蛋白質(zhì)組成的試劑。上述成膜成分和上述試劑的組合可以提供效能增高和毒性降低的制劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述試劑可以干擾微生物外蛋白和宿主受體的結(jié)合。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述試劑是微生物粘附抑制劑，或能夠破壞該微生物外蛋白的完整性的洗滌劑或離液劑。在特別具體的實(shí)施方案中，所述微生物粘附抑制劑是葡聚糖硫酸鹽；所述洗滌劑選自十二烷基硫酸鈉、苯扎氯銨、月桂?；“彼?、聚氧化乙烯脂肪酰衍生物和聚氧化乙烯脫水山梨醇脂肪酰酯衍生物；所述離液劑是十二烷基硫酸鈉或胍。在最具體的實(shí)施方案中，所述試劑是SLS，后者因其許多特性而成為作為洗滌劑和離液劑和推定微生物粘附抑制劑的候選化合物。單用SLS可以有效抗微生物。當(dāng)被混合在本發(fā)明制劑中時(shí)，SLS的效能得到進(jìn)一步的提高。所以，可以認(rèn)為，SLS或任何等效產(chǎn)品可以單用或和上述成膜成分合用于預(yù)防微生物感染。SLS可以單用或以適當(dāng)濃度合用于上述制劑，優(yōu)選濃度約為0.1-25％(w/v)，和更優(yōu)選濃度約為1-15％(w/v)。泊洛沙姆407可以采用任何適當(dāng)?shù)臐舛?，?yōu)選濃度約為5-55％(w/v)并且更優(yōu)選的濃度是約15-35(w/v)。最終制劑的物理性質(zhì)極大地取決于混合在其中的藥物、pH和制備制劑所用的溶劑并且取決于為符合指定目的所尋求的粘度。上述制劑還可以含有可以有效預(yù)防粘膜或皮膚感染和/或異常情況的藥物。陰道用制劑因其成膜成分和微生物破壞成分構(gòu)成了物理和化學(xué)屏障。在具有抗感染物的活性的同時(shí)，這些制劑也可以有效地避孕。在制劑中適宜用SLS代替壬苯醇醚-9。SLS具有廣譜的抗精子、包膜或未包膜病毒活性，它是本發(fā)明制劑的候選物質(zhì)。所述凝膠可以含有用于有效預(yù)防粘膜和/或皮膚的感染和/或異常情況的藥物。鑒于本發(fā)明的這個(gè)目的，術(shù)語“藥物”概括了任何可以有效預(yù)防粘膜和/或皮膚感染的殺微生物藥、殺菌劑、抗病毒藥、化療劑、抗炎藥、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)劑或任何其他試劑，或它們的組合物。術(shù)語“藥物”也指能夠刺激免疫應(yīng)答對抗感染的細(xì)胞因子或抗原。所述藥物可以混合在藥物載體如凝膠、脂質(zhì)體、毫微顆粒或環(huán)糊精中，其包封作用導(dǎo)致了提高對感染的預(yù)防作用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種獨(dú)特的施用器，該施用器可用于陰道和/或肛門直腸施用局部制劑以治療和/或預(yù)防粘膜的感染和/或異常情況?？梢砸圆煌绞皆O(shè)計(jì)該施用器以便提供本發(fā)明下文將詳細(xì)描述的相同必要特征。下文還將詳細(xì)討論某些不同概念的實(shí)例，這些實(shí)例用于描述一些該施用器的通用設(shè)計(jì)可行性，但不以任何方式限制其范圍。重要的是，該施用器的最終形狀和外觀可以不同于在此給出的實(shí)施例。
在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明制劑可用來治療病毒性疾病，并且它們進(jìn)一步含有作為藥物的抗病毒劑，如無環(huán)鳥苷或磷卡萘，或任何其他殺微生物藥，這些藥物可以以任意適當(dāng)濃度單用或合用。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該制劑是由泊洛沙姆407構(gòu)成并且含有0.5-5％(w/v)的磷卡萘。在另一個(gè)首選實(shí)施方案中，該制劑是由泊洛沙姆407構(gòu)成并且含有濃度為0.5-5％(w/v)的無環(huán)鳥苷。在另外一個(gè)首選實(shí)施方案中，所述制劑是由泊洛沙姆407構(gòu)成并且含有1-10％的SLS以及上述濃度的磷卡萘或無環(huán)鳥苷。
本發(fā)明的一個(gè)目的是開發(fā)新的預(yù)防粘膜和/或皮膚感染，尤其是性傳播感染且更優(yōu)選由HIV和皰疹引起的那些感染的局部制劑。殺微生物藥或任何其他藥物可以包載在該凝膠制劑中，采取游離形式或被包封在藥物載體如脂質(zhì)體、毫微顆?；颦h(huán)糊精內(nèi)。所述殺微生物凝膠可以延遲局部殺微生物活性，消除局部刺激和降低混合活性藥物的系統(tǒng)副作用。
本發(fā)明的一個(gè)目的還在于開發(fā)一種用于陰道給藥的獨(dú)特施用器，該施用器可以使內(nèi)容物均勻分配在整個(gè)陰道(側(cè)面給藥)和子宮頸(正面給藥)內(nèi)以增大抗性傳播病原體的防護(hù)作用。所以，我們業(yè)已設(shè)計(jì)出一種獨(dú)特的施用器，該施用器能夠使其內(nèi)容物以大致360°分配在陰道內(nèi)并且深達(dá)子宮頸，它是對僅將內(nèi)容物給藥至正前方(僅到子宮頸區(qū)域)的現(xiàn)有常規(guī)陰道施用器的極大改進(jìn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是開發(fā)一種藥物的局部制劑，該制劑提高了化學(xué)或藥理學(xué)活性試劑對抗粘膜感染并且具體地說是對抗HSV引起的那些感染的效能。藥物因混合在適當(dāng)基質(zhì)和/或藥物載體中而提高的效能可以減少給藥間隔，由此提高患者的生活質(zhì)量。本發(fā)明的一個(gè)目的還在于開發(fā)用于治療和/或愈合燙傷和預(yù)防其潛在感染的局部制劑。本發(fā)明具體實(shí)施方案的詳述本發(fā)明下文將參考具體實(shí)施方案和附圖詳細(xì)描述，其目的是舉例說明而不是限定本發(fā)明的范圍。
附圖簡述

圖1表示HSV-1(菌株F)對非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞的感染力，該病毒經(jīng)不同濃度的SLS(A組)或DS(B組)在37℃預(yù)處理1小時(shí)(●)或向未經(jīng)預(yù)處理的病毒中加入SLS或DS(○)。噬斑形成單位(PFU)表示為對照的百分比。結(jié)果為4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖2表示不同濃度SLS(A組)或DS(B組)在非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞中的抗HSV-1(菌株F)效能。噬斑形成單位(PFU)表示為對照的百分比。結(jié)果為4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖3表示在37℃下用500μM的SLS對HIV-1(菌株NL4-3)預(yù)處理1小時(shí)對其感染1G5細(xì)胞的感染力的影響。其中的數(shù)值表示3個(gè)測定值的平均值±SD。
圖4表示用50μM(B組)、75μM(C組)和100μM(D組)SLS在37℃下預(yù)處理1小時(shí)的HSV-1(菌株F)感染的非洲綠猴腎細(xì)胞的電子顯微照片。用不存在SLS下的HSV-1(菌株F)感染細(xì)胞作為對照(A組)。放大率70,000X。
圖5表示非洲綠猴腎細(xì)胞中用12.5、25、50、75和100μM SLS在37℃下預(yù)處理1小時(shí)的HSV-1(菌株F)的糖蛋白D定量。用存在于EMEM+2％FBS中的HSV-1感染的細(xì)胞作為對照物。數(shù)據(jù)表示為和對照物對比的雜交信號強(qiáng)度的百分比。
圖6表示用經(jīng)6.25(●)、25(○)和100(▲)μM的SLS在37℃下預(yù)處理1小時(shí)的HSV-2(菌株22)經(jīng)鼻感染的小鼠隨時(shí)間的存活進(jìn)展。用被未處理病毒感染的小鼠作為對照(□)。結(jié)果取每組8只動物的平均值。
圖7表示經(jīng)不同濃度(6.25(●)、25(○)和100(▲)μM)的SLS(A組)或不同濃度(0.25(●)、1(○)和10(▲)nM)的DS(B組)在37℃下預(yù)處理1小時(shí)的HSV-1(菌株F)經(jīng)皮感染的小鼠的平均損傷評分隨時(shí)間的進(jìn)展情況。用未處理的病毒感染的小鼠作為對照(□)。結(jié)果取每組6只動物的平均值。
圖8表示在感染之前小鼠經(jīng)泊洛沙姆制劑單獨(dú)預(yù)處理5分鐘(○)或1小時(shí)(▲)后或在感染之前小鼠用含5％SLS的泊洛沙姆制劑預(yù)處理5分鐘(●)或1小時(shí)(▲)后，被HSV-1(菌株F)感染的小鼠的平均損傷評分隨時(shí)間的進(jìn)展情況。用未處理的感染小鼠作為對照(□)。結(jié)果取每組6只動物的平均值。
圖9表示感染之前用凝膠單獨(dú)預(yù)處理5分鐘(■,▲,●)的、陰道內(nèi)感染HSV-2(菌株333)的小鼠平均損傷評分(A組)和存活(B組)隨時(shí)間的進(jìn)展情況。用未處理的感染小鼠作為對照(□,△,○)。結(jié)果取每組8只動物的平均值。
圖10表示陰道內(nèi)感染了經(jīng)2.5％SLS(*)或凝膠+2.5％SLS(●)在感染之前預(yù)處理5分鐘的HSV-2(菌株333)小鼠的存活情況隨時(shí)間的進(jìn)展。用未處理的感染小鼠作為對照(□)。結(jié)果取每組8只動物的平均值。
圖11表示了經(jīng)凝膠+5％聚氧化乙烯40硬脂酸酯(●)、凝膠+5％胍(○)，凝膠+2.5％月桂酰肌氨酸(▲)，凝膠+2.5％苯扎氯銨(△)或凝膠+5％吐溫80(◆)預(yù)處理5分鐘的、陰道內(nèi)感染HSV-2(菌株333)的小鼠存活隨時(shí)間的進(jìn)展情況。用未處理的感染小鼠作為對照(□)。結(jié)果取每組7-10只動物的平均值。
圖12a是一幅透視圖，它舉例說明了本發(fā)明所述施用器的第一種實(shí)施方案。
圖12b是一幅側(cè)視圖，它表示圖12a的施用器以英寸計(jì)的尺寸大小。
圖12c是一幅圖12a的施用器構(gòu)件的部件分解圖。
圖12d是一幅透視圖，它詳細(xì)說明了圖12a施用器近端內(nèi)壁的外表面。
圖13a是一幅透視圖，它舉例說明本發(fā)明所述施用器的第二種實(shí)施方案。
圖13b是一幅側(cè)視圖，它表示圖13a的施用器處于插入位置和啟動位置時(shí)以英寸計(jì)的尺寸大小。
圖13c是一幅圖13a的施用器構(gòu)件的部件分解圖。
圖14a是一幅透視圖，它舉例說明本發(fā)明所述施用器的第三種實(shí)施方案；該施用器處于插入位置。
圖14b是一幅圖14a的施用器處于啟動位置時(shí)的透視圖。
圖14c是一幅圖14a施用器處于插入位置時(shí)的詳細(xì)內(nèi)部側(cè)視圖。
圖14d是一幅圖14a施用器處于啟動位置時(shí)的詳細(xì)內(nèi)部側(cè)視圖。
圖15a是一幅透視圖，它舉例說明本發(fā)明所述施用器的第四種實(shí)施方案。
圖15b是一幅圖15a的施用器構(gòu)件的部件分解圖。
圖15c是一幅圖15a的施用器外壁的側(cè)視圖，其中尺寸以英寸計(jì)。
圖15d是一幅圖15a的施用器活塞/儲庫的側(cè)視圖，其中尺寸以英寸計(jì)。
圖15e是部分的圖15a施用器的截面?zhèn)纫晥D，它詳細(xì)描述了活塞/儲庫相對于施用器本體的內(nèi)壁或外壁的安裝。
圖16表示皮膚感染HSV-1且局部用泊洛沙姆單獨(dú)(■)、0.5％磷卡萘的水溶液(○)或含0.5％磷卡萘的泊洛沙姆(●)處理的無毛小鼠的平均損傷評分(A組)和存活(B組)隨時(shí)間的進(jìn)展情況。用未處理的感染小鼠作為對照(□)。感染24小時(shí)后開始處理并且每天重復(fù)3次共4天。數(shù)據(jù)表示為每組4只動物的平均值。
圖17表示皮膚感染HSV-1(菌株F)且感染24小時(shí)后用含5％無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆(●)或Zovirax_軟膏(○)處理一次的無毛小鼠的平均損傷評分(A組)和存活(B組)隨時(shí)間的進(jìn)展情況。用未處理的感染小鼠作為對照(□)。數(shù)據(jù)表示為每組7-10只動物的平均值。
圖18表示皮膚感染HSV-1(菌株F)且用泊洛沙姆單獨(dú)(■)、含5％無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆(●)或Zovirax_軟膏(○)處理的無毛小鼠的平均損傷評分(A組)和存活(B組)隨時(shí)間的進(jìn)展情況。用未處理感染小鼠作為對照(□)。處理是在感染5天后開始并且每天重復(fù)3次共4天。數(shù)據(jù)表示為每組7-10只動物的平均值。
圖19表示用磷卡萘(△,▲)和無環(huán)鳥苷(○,●)局部給藥24小時(shí)后在未感染(A,C,E組)小鼠和感染(B,D,F組)小鼠的皮膚組織中的分布，兩種化合物存在于磷酸鹽緩沖液(空心符號)或存在于泊洛沙姆(實(shí)心符號)中。A組和B組表示磷卡萘和無環(huán)鳥苷在角質(zhì)層帶中的分布。C組和D組表示磷卡萘和無環(huán)鳥苷在表皮中的濃度，而E組和F組表示磷卡萘和無環(huán)鳥苷在真皮中的濃度。數(shù)據(jù)表示為每組4-6只動物的平均值。
圖20表示用無環(huán)鳥苷局部涂敷24小時(shí)后在未感染和感染的小鼠血漿內(nèi)的濃度，無環(huán)鳥苷存在于磷酸鹽緩沖液(空心符號)或泊洛沙姆(實(shí)心符號)中。數(shù)值表示為每組4-6只動物的平均值。
圖21表示皮膚感染HSV-1(菌株F)的用泊洛沙姆單獨(dú)(■)、含3％磷卡萘的泊洛沙姆(○)、含5％SLS的泊洛沙姆(●)或含3％磷卡萘+5％SLS的泊洛沙姆(△)處理的無毛小鼠的平均損傷評分(A組)和存活(B組)隨時(shí)間的進(jìn)展情況。用未處理感染小鼠作為對照(□)。數(shù)據(jù)表示為每組5只動物的平均值。
圖22表示在非洲綠猴腎細(xì)胞內(nèi)HSV-1(菌株F)對不同濃度的磷卡萘和SLS的組合物的敏感性。數(shù)值表示為3個(gè)測量值的平均值±SD。
凝膠制劑泊洛沙姆407是聚氧化乙烯和聚氧化丙烯以重量比7∶3的嵌段共聚物，其平均分子量為12500。該嵌段共聚物的一個(gè)重要特征是形成熱可逆凝膠的性能。由低溫下的液態(tài)在體溫下轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)(相變溫度部分取決于凝膠的濃度、離子強(qiáng)度和混合的溶劑)能夠?qū)崿F(xiàn)許多令人感興趣的臨床應(yīng)用，其中包括局部應(yīng)用。這種特征是至關(guān)重要的，因?yàn)楫?dāng)以流體狀態(tài)局部涂敷在粘膜上時(shí)，該凝膠制劑應(yīng)能夠在涂敷期間和凝膠達(dá)到體溫后的較長時(shí)間內(nèi)較好地滲透到皮膚和/或粘膜的不規(guī)則內(nèi)。由于本發(fā)明的凝膠制劑毒性和刺激性極輕，它們是局部給藥體系的有利途徑。下文將提供制備該凝膠制劑的詳細(xì)內(nèi)容。本發(fā)明包括任何適當(dāng)濃度的，更具體是約10-35％(w/w)的泊洛沙姆407的凝膠制劑。本發(fā)明還涉及任何其他成膜成分、凝膠、霜劑、軟膏或熱可逆物質(zhì)，其中包括其他泊洛沙姆類物質(zhì)、聚胺或化合物。藥物任何可有效預(yù)防或治療粘膜和/或皮膚由病原體和/或疾病引起的感染和/或異常情況的殺微生物藥、殺菌劑、抗病毒藥、化療劑、抗炎劑、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)劑或它們的組合物屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍還包括任何可以破壞病原體膜的洗滌劑，可以提高藥物和/或藥物載體滲透至粘膜和/或皮膚內(nèi)的透皮促進(jìn)劑，任何可以防止病原體進(jìn)入靶細(xì)胞的微生物吸附抑制劑，任何可以刺激免疫應(yīng)答以抵抗病原體感染的細(xì)胞因子或抗原。本發(fā)明還包括任何局部制劑和/或藥物的組合物。用于預(yù)防感染的本發(fā)明凝膠制劑的實(shí)例下列實(shí)施例用來證明本發(fā)明凝膠制劑能有效預(yù)防由任意病原體和/或疾病引起的粘膜和/或皮膚的感染和/或異常情況，但這些實(shí)施例不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。凝膠制劑的制備所述凝膠制劑是通過向泊洛沙姆407中加入適當(dāng)體積的蒸餾水、緩沖液或任何其他適用水溶液達(dá)到預(yù)定濃度來制備。隨后向泊洛沙姆的粉末或溶液中加入適當(dāng)量的藥物達(dá)到預(yù)定濃度。該凝膠制劑的pH可以調(diào)至符合各個(gè)被本發(fā)明制劑涂敷的靶向組織的要求，如果用制劑涂敷在陰道粘膜上，采用pH約4.0-4.5的酸性溶液。聚合物的百分比可以根據(jù)獲得適當(dāng)?shù)囊簯B(tài)向固態(tài)的轉(zhuǎn)變溫度來調(diào)整。這些調(diào)整是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知和有能力完成的。
雖然本發(fā)明的說明書僅僅局限于特定情況，但任何成膜成分和/或藥物和/或脂質(zhì)體(或其他藥物載體)或任何其組合物都是開發(fā)這些局部制劑的潛在候選物質(zhì)并且屬于本發(fā)明的范圍。制劑還包括任何成膜成分和/或藥物和/或脂質(zhì)體(或其他藥物載體)或這些產(chǎn)品在任意適當(dāng)濃度的任何組合物。用SLS或DS預(yù)處理的皰疹病毒的體外感染力評估SLS或DS對不同菌株皰疹病毒的預(yù)處理對這些病毒對于敏感細(xì)胞的感染力的影響。簡單而言，將細(xì)胞接種在24孔平板(Costar,Montreal,QC，加拿大)。感染之前，將病毒懸浮在培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，或用在PBS中濃度不同的SLS在37℃溫育1小時(shí)。在融合時(shí)，用病毒混懸液通過離心平板(750xg 45分鐘，20℃下)培養(yǎng)細(xì)胞以吸附病毒。除去病毒，隨后用0.5ml在適當(dāng)培養(yǎng)基中制備的0.6％瓊脂糖Seaplaque(Marine Colloids,Rockland,MA)鋪蓋在細(xì)胞層上。將平板在37℃下溫育2天。隨后將細(xì)胞用10％存在于PBS中的甲醛固定20分鐘，用去離子水洗滌并且用0.05％亞甲藍(lán)染色。利用噬斑形成單位(PFU)測定法來評估病毒的感染力。
表1表示用SLS在37℃下預(yù)處理不同的HSV-1和HSV-2菌株1小時(shí)可以以濃度依賴方式降低菌株對非洲綠猴腎細(xì)胞的感染力。當(dāng)病毒顆粒用25μM SLS預(yù)處理時(shí)，HSV-1(菌株F)的感染力降低到21％。在用25μM SLS預(yù)培養(yǎng)后，HSV-2菌株的感染力為50-70％。所有試驗(yàn)菌株在病毒經(jīng)50μM SLS預(yù)處理后徹底喪失了感染力。在用HSV-1(菌株F)感染之前，用6.25-100μM濃度的SLS在37℃下預(yù)培養(yǎng)非洲綠猴腎細(xì)胞1小時(shí)沒有使病毒喪失感染力(未給出數(shù)據(jù))。這些結(jié)果表明SLS直接對病毒而不是細(xì)胞起作用。
表1用不同濃度的SLS在37℃下預(yù)處理1小時(shí)的多種HSV-1和HSV-2菌株的感染力。
a野生型菌株b耐無環(huán)鳥苷菌株c耐磷卡萘菌株圖1表示用不同濃度的SLS或Ds預(yù)處理HSV-1(菌株F)對其感染非洲綠猴腎細(xì)胞的影響。當(dāng)在感染后即刻加入SLS時(shí)，病毒感染力的喪失率大大低于用相同濃度SLS在37℃下預(yù)處理1小時(shí)的病毒所獲得的結(jié)果。預(yù)處理后，在201μM下觀察到病毒的感染力比在751μM濃度下病毒未經(jīng)處理時(shí)喪失了50％。此外，盡管在用50μM SLS預(yù)培養(yǎng)后能夠徹底抑制了病毒的感染力，但抑制作用在100μM SLS未預(yù)處理下無法達(dá)到完全。同樣地，用SLS預(yù)處理HSV-2(菌株333)也影響該菌株的感染力(未給出數(shù)據(jù))。另一方面，Ds不依賴于病毒是否用Ds預(yù)處理來降低病毒的感染力。在這種情況中，在濃度約1nM下可以觀察到病毒的感染力喪失了50％。
利用MTS實(shí)驗(yàn)還對非洲綠猴腎細(xì)胞在37℃下接觸如圖1和表1相同濃度的SLS或Ds下1小時(shí)的存活力。在所用的濃度范圍內(nèi)證實(shí)沒有細(xì)胞毒性的跡象(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖2表示不同濃度的SLS(A組)或Ds(B組)在非洲綠猴腎細(xì)胞中對抗HSV-1(菌株F)的效能。簡單而言，在37℃下用病毒感染細(xì)胞2小時(shí)。此后，除去上清液，用0．5ml的含有0．6％瓊脂糖seaplaque和預(yù)定濃度SLS或DS的EMEM+2％FBS覆蓋在細(xì)胞上。隨后將平板在37℃下和5％CO2中溫育2天。細(xì)胞用10％存在于PBS中的甲醛固定20分鐘，用去離子水洗滌和用0.05％亞甲藍(lán)染色。利用PFU測定后評估病毒的感染力。結(jié)果表明，SLS和DS都以濃度依賴方式降低病毒相同途徑的復(fù)制(repication)，SLS和DS分別在100μM和20nM時(shí)具有完全效能。不受任何機(jī)理的限制，上述結(jié)果揭示SLS具有微生物粘附抑制劑的作用。用SLS預(yù)處理的HIV-1的體外感染力現(xiàn)評估SLS對HIV-1(菌株NL4-3)的預(yù)處理對該病毒對于1G5細(xì)胞、Jurkat E6-1衍生物的感染力的影響，該Jurkat E6-1衍生物在HIV-1SF2LTR的控制下錨合有兩個(gè)由熒光素酶基因組成的穩(wěn)定整合結(jié)構(gòu)。簡單而言，感染之前，病毒用培養(yǎng)基或500μM SLS在37℃下溫育1小時(shí)。隨后細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)用HIV-1菌株NL4-3(10ng的P24)在37℃的5％CO2氣氛下溫育2小時(shí)。以后，洗滌細(xì)胞，重新懸浮在200μl的完全培養(yǎng)基中并且轉(zhuǎn)移至96孔的平底組織培養(yǎng)平板(Microtest Ⅲ,Falcon；Becton Dickinson,Lincoln Park,NJ)中。在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)后，溶解細(xì)胞，經(jīng)過一個(gè)凍融循環(huán)并且用微量平板發(fā)光計(jì)(MLX；Dynex Technologies,Chantilly,VA)監(jiān)測熒光素酶的活性。得自該組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚地顯示，用500μM SLS在37℃下預(yù)處理HIV-1(菌株NL4-3)1小時(shí)幾乎徹底抑制了HIV-1對1G5細(xì)胞的感染力(圖3)。感染用SLS預(yù)處理的HSV-1(菌株F)的非洲綠猴腎細(xì)胞的電子顯微鏡學(xué)利用電子顯微鏡評估非洲綠猴腎細(xì)胞中經(jīng)不同SLS濃度(50,75和100μM)在37℃預(yù)處理1小時(shí)的HSV-1(菌株F)的外觀。簡單而言，細(xì)胞(80-90％融合)用病毒(約70PFU/ml,14ml)在37℃的5％CO2氣氛中感染48小時(shí)。由培養(yǎng)皿中刮得細(xì)胞并且重新懸浮在培養(yǎng)基中。將細(xì)胞離心(515xg,10分鐘，4℃)和棄去上清液，將細(xì)胞重新懸浮在約500μl培養(yǎng)基中。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至微量離心管內(nèi)并且離心(10,000xg,5分鐘，4℃下)。再將該沉淀懸浮在約200μl的20％牛血清白蛋白(BSA)中。向該混合物中加入數(shù)滴25％戊二醛并且立刻將樣本置于冰浴中以使BSA聚合。隨后將沉淀切成1mm3的樣本，以后將其在2％存在于PBS中的戊二醛中固定1小時(shí)，在1％存在于PBS中的OsO4內(nèi)固定1小時(shí)，隨后用O.1％存在于PBS中的鞣酸處理30分鐘。每步操作之間將樣本在PBS中漂洗5分鐘共3次。樣本用存在于10％乙醇中的2％醋酸雙氧鈾染色30分鐘。將樣本脫水并且按照常規(guī)方法包埋在Epon中。將切片(約75nm厚)裝在銅框(200目)上。標(biāo)本用醋酸雙氧鈾染色，用檸檬酸鉛復(fù)染，用JEOL 1010電子顯微鏡(JEOL Canada Inc.,St-Hubert,QC，加拿大)觀察。
圖4(A組)表示病毒在非洲綠猴腎細(xì)胞核中的正常外觀。病毒顆粒由殼體組成，形狀為六角形，并且含有電子致密的DNA核。在多數(shù)細(xì)胞的胞漿中還發(fā)現(xiàn)，完整的病毒顆粒是由包有被膜的核殼構(gòu)成。在感染了用50(B組)，75(C組)和100(D組)μM SLS預(yù)處理的病毒的非洲綠猴腎細(xì)胞中，病毒顆粒可以在細(xì)胞核中恢復(fù)，但不能在細(xì)胞漿中恢復(fù)。在細(xì)胞核中觀察不到成熟的核殼，而病毒顆粒是由含有離散積聚的電子致密的物質(zhì)的殼體構(gòu)成。在感染了經(jīng)SLS預(yù)處理的病毒的細(xì)胞核中觀察到，空殼體數(shù)量隨著預(yù)處理藥物所用濃度的增加而降低。在感染了用100μM SLS預(yù)處理的病毒的細(xì)胞中，在核中只能檢測出少量帶有空殼體的細(xì)胞，這個(gè)結(jié)果解釋了皰疹病毒在SLS存在下喪失感染力的原因。對HSV糖蛋白D基因的定量在非洲綠猴腎細(xì)胞中評估經(jīng)SLS預(yù)處理的HSV-1(菌株F)的糖蛋白D基因的量，目的是測定感染細(xì)胞中存在的病毒DNA。簡單而言，HSV-1(菌株F)用不同濃度的SLS(12.5,25,50,75和100μM)在EMEM+2％FBS中37℃下預(yù)處理1小時(shí)。非洲綠猴腎細(xì)胞(80-90％融合)用病毒(100PFU/ml,20ml)在37℃的5％CO2氣氛中感染48小時(shí)。除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞層用1×HBSS洗滌二次，從培養(yǎng)皿上刮下細(xì)胞，并且再懸浮在EMEM+2％FBS中。用標(biāo)準(zhǔn)苯酚/氯仿法提取全部DNA。利用Burton法獲得DNA總量。該試驗(yàn)所用的探針對應(yīng)于HSV-2(菌株333)的一部分糖蛋白D，通過PCR技術(shù)用下列引物來生成P1(5’-GCCACCATGGGGCGTTTGACC-3’)和P2(5’-AAACTCAGTTATCTAGTCCTCGGGGTC-3’)并且通過隨機(jī)引發(fā)來標(biāo)記[32P]。雜交是在0.25M Na2HPO4(pH6.8和正磷酸)和7％SDS中在65℃下進(jìn)行。在40mM Na2HPO4(pH6.8和正磷酸)和1％SDS洗滌20分鐘，隨后在25℃下洗滌20分鐘。
圖5(A組)表示非洲綠猴腎細(xì)胞中用不同濃度SLS預(yù)處理的HSV-1(菌株F)的糖蛋白D基因的定量。在培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞并且提取全部DNA。A組顯示，BglⅡ片段的DNA試樣(325ng)加入0.8％瓊脂糖凝膠，轉(zhuǎn)移至尼龍膜，并且用糖蛋白D探針雜交。B組表示，通過放射自顯影圖的掃描顯微測密法、利用α成像儀定量測定獲得HSV-1的DNA水平。在經(jīng)12.5、25和50μM SLS預(yù)處理的HSV-1(菌株F)感染的細(xì)胞中可以觀察到，病毒糖蛋白D基因的表達(dá)和對照物對比沒有巨大改變。通過放射自顯影圖的掃描顯微測密法定量測得的HSV-1DNA水平相似(B組)。但是，當(dāng)用較高濃度的SLS(75和100μM)預(yù)處理病毒時(shí)，可以觀察到糖蛋白D基因的表達(dá)明顯降低，并且DNA水平分別減少至對照值的65.1％和34.9％。這些數(shù)據(jù)表明SLS可以通過降低病毒成熟率或通過擾亂DNA包被在病毒殼體內(nèi)來干擾病毒核殼的成熟。用SLS預(yù)處理皰疹病毒的體內(nèi)感染力(鼻內(nèi)模型)在鼻內(nèi)感染的鼠模型中評估SLS對HSV-2(菌株22)的預(yù)處理對病毒感染力的影響。簡單而言，整個(gè)研究中采用四周齡雌性Balb/c小鼠(Charles Ricer Breeding Laboratories Inc.,St-Constant,QC,Canada)。感染之前，用PBS或用不同濃度的SLS(6.25、25或100μM)在37℃下培養(yǎng)HSV-2(菌株22)1小時(shí)使最終的病毒接種物為2000PFU/20μl。用Aerrane_(異氟烷，USP；Janssen,North York,ON,Canada)輕度麻醉小鼠并且將病毒混懸液(總體積20μl)涂敷在小鼠左鼻孔外側(cè)。隨后令小鼠返回其籠中并且每天評估其存活。
圖6表示被未處理病毒感染小鼠在第9至11天內(nèi)全部死于腦炎。相反，67％的經(jīng)6.25和25μM SLS預(yù)處理的病毒接種物感染的小鼠在感染中幸存下來。特別值得注意的是，經(jīng)100μM SLS預(yù)處理的病毒混懸液感染的小鼠在感染中全部幸存下來并且證明沒有任何患病跡象。用SLS或DS預(yù)處理皰疹病毒的體內(nèi)感染力(皮膚模型)在皮膚感染的鼠科模型中評估SLS對HSV-1(菌株F)的預(yù)處理對于該病毒感染力的影響。簡單而言，整個(gè)研究中采用5-6周齡的雌性無毛小鼠(SKH1；Charles River Breeding Laboratories Inc.,St-Constant,QC，加拿大)。感染之前，用PBS、用6.25、25或100μM的SLS，或用0.25,1或10nM的DS在37℃下培養(yǎng)HSV-1(菌株F)1小時(shí)以獲得3×105PFU/50μl的病毒接種物。腹膜內(nèi)注射含有70mg/kg鹽酸氯胺酮(Rogarsetic*注射劑USP；Rogar/STB Inc.,Montreal,QC，加拿大)和11.5mg/kg的賽拉嗪(Rompun_；Miles Canada Inc.,Etobicoke,ON，加拿大)的混合液麻醉小鼠。將病毒接種在鼠體外側(cè)的左腰皮膚區(qū)域內(nèi)。用27規(guī)格的針垂直方向以交叉方式刮擦該皮膚6次。病毒混懸液(50μl)沉積在劃痕區(qū)域上并且用棉簽施用器磨擦10-15秒，該施用器用EMEM+2％FBS或SLS或DS溶液飽和。劃痕區(qū)域用棉墊(corn cushion)保護(hù)起來，并且該棉墊用外科繃帶固定在小鼠身體上。在用來防止吸收藥物之前，棉墊縫隙的多孔內(nèi)壁用組織粘合劑粘合至不滲透。棉墊的縫隙也用外科繃帶封閉。隨后令小鼠返回籠中并且每天觀察2次。
圖7表示經(jīng)不同濃度SLS或DS在37℃預(yù)處理1小時(shí)的HSV-1(菌株F)皮膚感染的無毛小鼠的平均損傷評分隨時(shí)間的進(jìn)展情況。按照表2提供的標(biāo)準(zhǔn)評定損害評分。在未處理的感染小鼠中，在感染后前4天中沒有觀察到皮膚感染的病理征兆，并且劃痕區(qū)域仍很明顯。第5天，在一些小鼠中開始出現(xiàn)皰疹損傷，在遠(yuǎn)離接種位置形成小水庖。第6天，幾乎全部未處理小鼠出現(xiàn)皰疹皮膚損傷，自脊柱至腹中線的感染皮區(qū)形成4-5mm寬的類似于帶狀皰疹樣感染帶區(qū)。在第8天時(shí)觀察最大平均損傷評分。此后從第11天至15天內(nèi)平均損傷評分降低，因?yàn)樵谀承┬∈笾衅つw損傷自發(fā)退化。經(jīng)6.25和25μM SLS預(yù)處理的病毒感染的小鼠無法證明其平均損傷評分顯著降低。然而，經(jīng)100μMSLS預(yù)處理的病毒感染的小鼠沒有表現(xiàn)出任何皮膚損傷的征兆。首要的是，所有感染了用100μM SLS預(yù)處理的病毒的小鼠在感染中幸存(未給出數(shù)據(jù))。另一方面，經(jīng)0.25nM DS預(yù)處理的病毒感染的小鼠表現(xiàn)出其平均損傷評分部分降低，而經(jīng)1或10nM DS預(yù)處理的病毒感染的小鼠提供了良好的抗皰疹損傷惡化的防護(hù)作用。表2用于評估皰疹皮膚損傷的標(biāo)準(zhǔn)評分 損傷的外觀0 無可見的感染1 僅僅在接種位置、劃痕區(qū)域可以觀察到感染2 僅僅在接種位置出現(xiàn)感染，腫脹、痂和紅斑3 在接種位置感染，但在遠(yuǎn)離接種位置處形成分散的損傷4 在半個(gè)身體四周形成可見的皮疹，但皮疹未匯合5 皮疹匯合但未壞死或潰爛6 全身皮疹，壞死或潰爛，后肢麻痹，發(fā)脹，死亡含有或不含有SLS的泊洛沙姆制劑的體內(nèi)預(yù)防作用(皮膚模型)現(xiàn)評估單用泊洛沙姆或含5％SLS的泊洛沙姆在預(yù)防小鼠皮膚損傷惡化中的效能。整個(gè)研究采用雌性無毛小鼠(5-6周齡)。簡單而言，腹膜內(nèi)注射含有70mg/kg鹽酸氯胺酮和11.5mg/kg賽拉嗪的混合液麻醉小鼠。在左腰皮膚區(qū)域身體外側(cè)局部施用制劑。給藥5分鐘和1小時(shí)后，將1滴的病毒接種物(3.15×108PFU/ml)沉淀在皮膚上并且用27G針將該液滴刮擦以模擬可能發(fā)生在保健工作者中的意外事件。在這個(gè)模型中，需要較高濃度的病毒接種物以便在幾乎全部動物中獲得完全帶狀皰疹皮疹。然而，與感染有關(guān)的死亡率降低并且不能用作評估治療功效的標(biāo)準(zhǔn)。劃痕區(qū)域用棉墊保護(hù)起來，并且用外科繃帶保持在小鼠身體上。棉墊的縫隙用外科繃帶封閉。隨后令小鼠返回籠中并且每天觀察2次。
圖8表示未處理感染小鼠和在用HSV-1(菌株F)經(jīng)皮感染之前用泊洛沙姆單獨(dú)或含5％SLS的泊洛沙姆預(yù)處理5分鐘或1小時(shí)的小鼠的平均損傷評分隨時(shí)間的進(jìn)展情況。結(jié)果表明，用凝膠在感染前單獨(dú)預(yù)處理5分鐘或1小時(shí)的小鼠僅僅產(chǎn)生中等的抗皮膚損傷惡化的防護(hù)作用。特別令人感興趣的是，在用含5％SLS的泊洛沙姆預(yù)處理5分鐘或1小時(shí)的小鼠中，觀察到完全的抗皮膚損傷惡化的防護(hù)作用。這些結(jié)果顯示，我們的制劑在預(yù)防病原體感染的預(yù)防途徑中極其有效。這種工具可以真正地保護(hù)保健工作者不受到意外感染。凝膠制劑抗皰疹病毒所致感染的體內(nèi)效能(陰道內(nèi)模型)現(xiàn)在陰道內(nèi)感染的鼠模型中評估凝膠制劑預(yù)防生殖傳播HSV-2的效能。簡單而言，本研究中采用4周齡的雌性Balb/c小鼠。為了提高小鼠對皰疹的敏感性，在接種HSV-2前7天和前1天，皮下給各個(gè)小鼠施用2.5mg孕酮(Depo-Provera)。用藻酸鈣細(xì)尖藥簽擦拭陰道后，給麻醉小鼠接種5μl的2.4×107pfu/ml的HSV-2(菌株333)。為了測試凝膠制劑阻斷皰疹感染的效能，在接種前數(shù)分鐘，用吸管尖將15μl的凝膠給藥至陰道內(nèi)。將吸管尖取出和插入4次以刺激性交的活動，同時(shí)注意不要引起任何出血。
圖9表示未處理小鼠和在被HSV-2(菌株333)感染之前陰道內(nèi)經(jīng)凝膠單獨(dú)預(yù)處理的小鼠的平均損傷評估。感染4天后，未處理感染小鼠出現(xiàn)會陰水腫和紅色，并且在6-12天時(shí)這些動物幾乎全部死于腦炎。重要的是，所有經(jīng)凝膠單獨(dú)預(yù)處理的小鼠在感染中幸存下來并且在感染后16天后證明沒有任何疾病跡象。所以凝膠的單獨(dú)存在可以消除HSV-2感染。
圖10表示未處理感染小鼠和在被HSV-2(菌株333)感染之前陰道內(nèi)經(jīng)2.5％SLS或含有2.5％SLS的凝膠預(yù)處理的小鼠的存活率。感染4天后，未處理感染動物出現(xiàn)會陰水腫和紅色，并且在6-12天時(shí)這些動物幾乎全部死于腦炎。重要的是，所有經(jīng)2.5％SLS單獨(dú)或含有2.5％SLS的凝膠預(yù)處理的小鼠在感染中幸存下來并且在感染后16天后證明沒有任何疾病跡象?？傊?，這些結(jié)果顯然表明，應(yīng)用本發(fā)明凝膠是減少性傳播皰疹、HIV和其他引起STD病原體的創(chuàng)造性預(yù)防方式。
圖11表示未處理感染小鼠和在被HSV-2(菌株333)感染之前陰道內(nèi)經(jīng)含不同化合物的凝膠預(yù)處理的小鼠的存活率。所述化合物選自其他硫酸化和非硫酸化的具有或不具有洗滌性的化合物。它們也可以是不同的離子(陰離子和陽離子)和非離子化合物。這種篩選方式的目的是發(fā)現(xiàn)其他有效的殺微生物活性物質(zhì)。結(jié)果表明，含有2.5％月桂酰肌氨酸的凝膠制劑產(chǎn)生完全的抗感染防護(hù)作用(100％存活)。另一方面，含有2.5％苯扎氯銨、5％聚氧化乙烯40硬脂酸酯和5％胍的凝膠制劑分別使小鼠存活60％、60％和30％。我們的初步結(jié)果表明，月桂酰肌氨酸具有作為殺微生物候選物的良好功效，實(shí)際上目前我們正在加以開發(fā)。而且，其他表現(xiàn)出不完全殺微生物功效的化合物如苯扎氯銨、聚氧化乙烯40硬脂酸酯和胍也可以通過最佳化其濃度來開發(fā)出其良好效能。另外，如果彼此匹配，這些化合物的組合物也可以提供優(yōu)化的功效。不受任何理論的約束，可以想象，洗滌劑和離液劑的組合可以提供如同或甚至優(yōu)于SLS的良好功效。這些是有效殺微生物藥的特定實(shí)例，但它們不以任何方式限定其范圍。用于制劑陰道/肛門直腸給藥的施用器的設(shè)計(jì)如上所述，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供預(yù)防粘膜和/或皮膚由任何病原體和/或任意疾病引起的感染和/或異常情況的制劑。為了陰道給藥，任何局部制劑應(yīng)利用施用器給藥，該施用器能夠令內(nèi)含物均勻分配在整個(gè)陰道(側(cè)面給藥)和子宮頸(正面給藥)上以達(dá)到最大功效。所以，我們設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的施用器，該施用器可以使其內(nèi)含物約360°分配在陰道內(nèi)并且遠(yuǎn)及子宮頸，它是對現(xiàn)有常規(guī)陰道施用器僅將內(nèi)容物給藥至正前方(子宮頸區(qū)域)的極大改進(jìn)。本發(fā)明獨(dú)特施用器施用局部制劑的多個(gè)目標(biāo)和主要特征包括a)令局部制劑作為液體或凝膠均勻分配在整個(gè)陰道/子宮頸；b)有效且快速施用其內(nèi)含物；c)耐受溫度變化(-40℃至60℃)；d)施用器的聚合物和凝膠制劑相容；
e)易于滅菌；f)無滲漏；g)易于操作和插入；h)耐破損，耐內(nèi)含物的膨脹并且耐運(yùn)輸所致震蕩；i)與試劑和/或環(huán)境條件匹配。技術(shù)背景和策略用于阻斷引起STD的病原體性傳播的制劑的效能取決于ⅰ)給藥制劑的性質(zhì)和ⅱ)其覆蓋整個(gè)陰道/子宮頸區(qū)域的性能。與其他產(chǎn)品不同的是，我們的特有制劑具有以液體形式給藥的熱可逆性質(zhì)，以保證制劑較好地滲透至陰道和/或子宮頸粘膜細(xì)小不規(guī)則處。為了使防護(hù)作用達(dá)到最大，所述制劑應(yīng)覆蓋在整個(gè)陰道/子宮頸上。然而，現(xiàn)有的常規(guī)陰道施用器只是在其頂端帶有一個(gè)孔以便將內(nèi)含物給藥至子宮頸區(qū)域，但不包括陰道，由此限制了其功效。本發(fā)明的獨(dú)特陰道施用器具有多個(gè)孔和/或縫(在頂端和側(cè)面)以施用本發(fā)明制劑或任何其他成膜成分、凝膠、霜劑、軟膏和/或殺微生物藥、殺菌劑、抗病毒藥、化療劑、抗炎藥、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)劑、洗滌劑、微生物吸收抑制劑、透皮促進(jìn)劑、細(xì)胞因子、抗原、疫苗或其可以治療或預(yù)防STD、癌癥或任何其他疾病的組合物，令它們均勻覆蓋在陰道和子宮頸處以達(dá)到最大的防護(hù)作用。文獻(xiàn)檢索表明，市場上尚無設(shè)計(jì)為令內(nèi)含物給藥至整個(gè)陰道/子宮頸的施用器或類似產(chǎn)品。本發(fā)明施用器的特征現(xiàn)有所有用于凝膠/霜劑形式的制劑給藥的陰道施用器都存在無法覆蓋整個(gè)陰道/子宮頸區(qū)域的缺點(diǎn)。另一方面，本發(fā)明制劑具有至關(guān)重要的熱可逆性質(zhì)，它在室溫下為液體而在體溫下膠凝。當(dāng)作為液態(tài)給藥時(shí)，本發(fā)明制劑能夠覆蓋在整個(gè)陰道/子宮頸上并且滲透至陰道和子宮頸粘膜內(nèi)細(xì)小不規(guī)則處。對于可以治療或預(yù)防STD、癌癥或任何其他疾病的本發(fā)明的獨(dú)特制劑或任何其他成膜成分、凝膠、霜劑、軟膏和/或殺微生物藥、殺菌劑、抗病毒藥、化療劑、抗炎藥、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)劑、洗滌劑、微生物吸收抑制劑、透皮促進(jìn)劑、細(xì)胞因子、抗原、疫苗或其組合物，我們需要一種可以從末端和側(cè)面給藥的獨(dú)特施用器以覆蓋整個(gè)陰道/子宮頸，這是提供最大的抗致STD病原體保護(hù)作用的關(guān)鍵因素。本發(fā)明施用器的主要特征如下所述(參見表3)a)令局部制劑作為液體或凝膠均勻分配在整個(gè)陰道/子宮頸施用器必須能夠?qū)⒅苿┚鶆蚪o藥并且必須廣泛在整個(gè)陰道/子宮頸區(qū)域，這是通過頂端和側(cè)面的孔給藥。此外，施用器應(yīng)提供足夠量的制劑以同時(shí)覆蓋子宮頸和陰道。這使個(gè)體對致STD病原體具有最大的防護(hù)作用。b)有效且快速施用其內(nèi)含物多數(shù)現(xiàn)存陰道施用器僅能施用部分其內(nèi)含物，由此限制了制劑的功效。所以，施用器必須可以施用其全部內(nèi)含物而在儲庫內(nèi)無殘留物，或可以施用充分覆蓋所有靶向粘膜所需要的量。這可以通過對儲庫的設(shè)計(jì)和計(jì)算手指在釋放內(nèi)含物所施加的平均作用力來實(shí)現(xiàn)。給藥時(shí)間應(yīng)根據(jù)給藥內(nèi)含物是否是液體、半粘性體或凝膠來改變。但是，施用器內(nèi)含物的給藥必須迅速。c)耐受溫度變化(-40℃至60℃)施用器必須耐受溫度變化，因?yàn)楸２睾瓦\(yùn)輸環(huán)境將因國家的不同而差別很大。施用器和制劑應(yīng)設(shè)計(jì)為在-40℃至60℃的溫度條件下保持不變。d)施用器的聚合物和凝膠制劑相容開發(fā)陰道施用器所用的聚合物應(yīng)不影響凝膠制劑的性質(zhì)(穩(wěn)定性、粘度參數(shù)、無細(xì)胞毒性、阻斷病原體的功效等)。e)易于滅菌施用器設(shè)計(jì)和材料必須確保它可以利用適當(dāng)方法滅菌并且不導(dǎo)致其自身或其內(nèi)含物特性的改變。f)無滲漏施用器必須在保藏和運(yùn)輸條件下不滲漏。如果包裝箱相互堆放，施用器應(yīng)不泄漏出其內(nèi)含物。g)易于操作和插入施用器必須被使用者認(rèn)同，易于操作和易于插入，不引起用戶的任何不適感。而且，它應(yīng)對使用者有吸引力。h)耐破損，耐內(nèi)含物的膨脹并且耐運(yùn)輸所致震蕩；如果從用戶手中跌落或在運(yùn)輸中搬運(yùn)時(shí)，施用器應(yīng)耐破損。它還應(yīng)該可以耐受內(nèi)含物的膨脹。而且，施用器應(yīng)保持穩(wěn)定并且在運(yùn)輸期間耐受震蕩。i)與試劑和/或環(huán)境條件匹配。
施用器應(yīng)可以耐受試劑和/或不同環(huán)境條件。另外，它應(yīng)不受陰道酸性pH、陰道排出物或其他類似情況的影響。
表3施用器的預(yù)期功能和目標(biāo)值
下列實(shí)施例是某些不同概念的實(shí)例，這些概念描述了施用器的一些常規(guī)設(shè)計(jì)可行性，但不以任何方式限制其范圍。重要的是，施用器的最終形狀可以不同于在此提供的實(shí)施例。據(jù)信這種設(shè)計(jì)可以改進(jìn)為適合肛門直腸給藥。
圖12-15舉例說明按照本發(fā)明一個(gè)方面的施用器的特定實(shí)例。下文描述了4種施用器的實(shí)施方案，如圖所述。
總之，本發(fā)明施用器設(shè)計(jì)為將上述液體、半粘性體、凝膠、霜劑、軟膏或任何其他成膜成分的制劑均勻施用至粘膜腔，而殘留在施用器內(nèi)的殘余量極小。本發(fā)明施用器包括縱向延伸的主體，該主體具有近端和遠(yuǎn)端。近端定位于接近進(jìn)入患者體內(nèi)的粘膜腔的外側(cè)位置。該主體帶有外穿孔，形成一系列的狹縫和孔，以便將上述任何制劑均勻分配至患者粘膜腔中。由于需要插入施用器并且將制劑排放至粘膜腔中，在經(jīng)穿孔排出之前，含在儲庫中的制劑應(yīng)適合通過具有小體積的擴(kuò)散道。事實(shí)上，這使制劑能夠快速排出并且在排放后制劑在該施用器中的殘留量很少。
所述擴(kuò)散道是在組成上述主體的兩壁之間形成的自由空間。第一管壁是該主體的外壁并且?guī)в锌紫?。無穿孔的第二內(nèi)壁位于第一管壁內(nèi)部形成擴(kuò)散道。內(nèi)壁的結(jié)構(gòu)和尺寸應(yīng)使其能夠滑動插入至第一管壁內(nèi)。另外，較小于第一管壁的內(nèi)壁在整體上和主體的外壁模合。
內(nèi)壁具有一個(gè)近端，它是制劑進(jìn)入擴(kuò)散道的進(jìn)料端。定向部件還可以使制劑直接進(jìn)入擴(kuò)散道的進(jìn)料端。所以，定向部件防止制劑進(jìn)入擴(kuò)散道以外的另一個(gè)腔室內(nèi)。
能夠容納制劑的儲庫也成為施用器的一部分。儲庫可以位于近施用器主體處或主體內(nèi)部。儲庫可操作地與排放部件相連。所述排放部件本身通過連接部件連接于主體近端。患者可以啟動該排放部件。在受到擠壓、拉伸或按壓作用時(shí)，排放部件釋放出儲庫的內(nèi)含物，它與擴(kuò)散道的進(jìn)口近端接觸。所以，制劑移動至擴(kuò)散道內(nèi)進(jìn)入粘膜腔，經(jīng)穿孔排放制劑。
參見附圖12a-12d，它們描述了按照本發(fā)明一個(gè)方面的第一施用器實(shí)施方案。附圖12b表示第一施用器的部件分解圖。該施用器的主體外壁(1)帶有多個(gè)穿孔(2)(只圖示一個(gè)穿孔)，自主體的一側(cè)不間斷地通過外壁(1)遠(yuǎn)端延伸至對側(cè)，形成一個(gè)狹縫。因此，縱向狹縫規(guī)定了側(cè)孔和末端孔。在本實(shí)施方案中，儲庫和排放部件是一個(gè)單一部件(3)，它由可壓材料構(gòu)成。制劑含在儲庫內(nèi)，通過用手指按壓可以將儲庫的內(nèi)含物排出。該儲庫末端是一個(gè)對壓縮低抗性的膜(4)。由于儲庫也是排放部件，它通過連接部件(5)相連于主體的近端，該連接部件為可螺旋或撥入的連接部件。在這個(gè)具體實(shí)施方案中，主體的內(nèi)壁(6)作為尺寸小于外壁的分離部件提供。內(nèi)壁近端的末端是突套環(huán)，它壓制在外壁近端處形成的連接部件上。內(nèi)壁的近端包括密閉部件(7)，它將內(nèi)壁形成的內(nèi)腔密封。該密閉部分可以具有圓盤的形狀。另外，內(nèi)壁的近端可以和后者整體模合以直接密封。與該密閉部件同心的是一個(gè)同心開放部件(8)，它位于該密閉部件的外周。這些部件提供了一個(gè)總體定向部件，它使制劑定向進(jìn)入內(nèi)壁和外壁間形成的擴(kuò)散道內(nèi)并且離開內(nèi)壁(6)的內(nèi)表面。圖12c還表示錐形部件(9)，它位于定向裝置的中心，作用是在施加了足夠的壓力時(shí)將膜(4)穿破。
圖13舉例說明了所述施用器的第二種實(shí)施方案。該施用器采用了和附圖12中相同的外壁和內(nèi)壁。但是，在外壁中提供了多個(gè)彼此規(guī)則間隔開的狹縫。在本特定實(shí)施方案中，排放部件和儲庫也是一個(gè)單一部件。然而，排放部件不是一個(gè)可壓縮儲庫。它是活塞形構(gòu)造(10)，它將給藥制劑含在囊袋(11)中。在本實(shí)施方案中，連接部件(5)在活塞形構(gòu)造(10)內(nèi)可以伸縮方式插入。該囊袋是由對壓縮低抗性的材料制成。為了打破此膜，在內(nèi)壁的近端提供一個(gè)錐形部件。圖13表示此錐形部件(9)，它是帶有尖端的圓盤。該圓盤位于內(nèi)壁的近端處，尖端面向囊袋(11)。在使用中，使用者壓縮活塞形結(jié)構(gòu)(10)，由此該膜被該尖端刺破，制劑被迫穿過擴(kuò)散道并且經(jīng)穿孔排出。
附圖14舉例描述了本發(fā)明施用器的第三實(shí)施方案。雖然上述兩個(gè)實(shí)施方案中儲庫接近擴(kuò)散道的近端，第三實(shí)施方案表示儲庫(12)遠(yuǎn)離擴(kuò)散道的近端。在這種情況中，提供了位于遠(yuǎn)離儲庫處的基座(13)。該基座可操作地連接于活塞(14)，該活塞位于近儲庫(12)處。使用者拉活塞并且壓縮儲庫，其內(nèi)含物進(jìn)入擴(kuò)散道的進(jìn)料近端。制劑經(jīng)施用器主體外壁中的穿孔排出，在附圖14所示的多個(gè)孔(2)。這些孔可以令制劑均勻分配在粘膜腔內(nèi)的方式間隔開。這些孔位于外壁的縱向部分及其遠(yuǎn)端。附圖14還表示，施用器主體的內(nèi)壁和外壁可以形成整體。另外，內(nèi)壁也可以是如附圖12和13所示的一種形狀，不需要錐形部件。該儲庫可以包括對壓縮低抗性的膜，其方式是當(dāng)受到拉動活塞(14)的壓縮時(shí)，該膜破裂且將其內(nèi)含物排放至擴(kuò)散道內(nèi)。在施用器的這種實(shí)施方案中，定向部件是由擴(kuò)散道的進(jìn)口近端和此時(shí)位于主體近端的密封部件構(gòu)成(未圖示)。
圖15表示按照本發(fā)明一方面的施用器的第四實(shí)施方案。在本實(shí)施方案中，儲庫和排放部件是一個(gè)元件。低阻力的膜(4)位于接近主體(1)的近端。施用器的外壁包括多個(gè)狹縫，它們在使用中為多個(gè)開槽。內(nèi)壁(6)和外壁形成整體。該內(nèi)壁近端帶有錐形部件(15)。儲庫/活塞(16)的直徑略大于內(nèi)壁的外徑，但小于施用器主體內(nèi)壁的內(nèi)徑。使用中，儲庫滑動進(jìn)入兩壁之間，膜被刺破，內(nèi)含物被迫進(jìn)入擴(kuò)散道并且進(jìn)入位于外壁側(cè)面和末端的穿孔。
應(yīng)注意，所有上述實(shí)施方案中，定向部件可以和主體內(nèi)壁的近端形成整體，或作為密封部件或圓盤提供以阻斷制劑進(jìn)入由內(nèi)壁形成的內(nèi)腔的通道且使制劑定向流入擴(kuò)散道。
此外，為了便于使用，在一些實(shí)施方案中可以提供抓握部件以便有助于用戶在啟動排放部件的同時(shí)將施用器保持在一定位置。具體而言，在第二實(shí)施方案中，抓握部件是在連接部件(5)外周形成的套環(huán)。該套環(huán)的外部厚度可以提供足夠的空間使用戶在指間抓握該套環(huán)遠(yuǎn)端并且用另一手指拉動活塞。在第三實(shí)施方案中，抓握部件位于活塞的遠(yuǎn)端(參見數(shù)字18)。主體的外壁的截面比活塞的大，用戶可以用一只手握住施用器主體的近端，同時(shí)用另一只手拉動活塞。最后，在第四實(shí)施方案中，抓握部件是作為橢圓形把柄(19)，它位于施用器主體的近端并且環(huán)繞在連接部分的周圍。該把柄可以握在兩個(gè)手指之間，同時(shí)用另一手指推動活塞。用于治療感染的本發(fā)明泊洛沙姆的制劑實(shí)例為了試驗(yàn)本發(fā)明凝膠制劑在經(jīng)皮HSV-1感染鼠模型中的效能，在磷酸鹽緩沖液(0.2M,pH6)中制備和皮膚pH相容的溶液。磷卡萘、無環(huán)鳥苷的局部制劑和Zoriax軟膏在小鼠中對HSV-1皮膚損害的功效的比較在皮膚感染HSV-1的鼠模型中評估不同的本發(fā)明局部制劑的效能。簡單而言，腹膜內(nèi)注射含有70mg/kg鹽酸氯胺酮和11.5mg/kg賽拉嗪的混合液麻醉5-7周齡的雌性無毛小鼠(SKH1；Charles RiverBreeding Laboratories Inc.,St-Constant,QC,加拿大)。將病毒接種在鼠體左腰身體外側(cè)的皮膚區(qū)域內(nèi)。用27規(guī)格的針垂直方向以交叉方式刮擦該皮膚6次。用棉簽在10-15秒內(nèi)將50μl的病毒混懸液(HSV-1菌株，1.5×106噬斑形成單位(PFU)/ml)擦涂在皮膚的劃痕區(qū)域，該棉簽用培養(yǎng)基[最低必需培養(yǎng)基(MEM)，補(bǔ)加有100U/ml青霉素-鏈霉素，2mM L-谷酰胺和2％胎牛血清(MEM-E+2％FBS)]飽和。劃痕區(qū)域用棉墊保護(hù)起來，并且該棉墊用外科繃帶保持在小鼠身體上。在用來防止吸收藥物之前，用組織粘合劑使棉墊縫隙處的多孔內(nèi)壁粘合至不滲透。棉墊的縫隙也用外科繃帶封閉。隨后令小鼠返回籠中并且每天觀察2次。
本研究對多種治療方案進(jìn)行了評估。簡單地說，取下封閉在棉墊縫隙處的繃帶，劃痕區(qū)域用用冷水飽和的棉簽清潔。在劃痕區(qū)域涂敷上15μl的不同制劑。用手術(shù)繃帶封閉棉墊的縫隙以避免藥物被小鼠迅速去除。該方法也可以防止因舔食被治療損傷可能引起的意外全身治療。利用損傷評分和存活力來評估不同制劑的功效。
圖16(A組)表示未處理感染小鼠或用磷卡萘溶液或混合在泊洛沙姆中的磷卡萘處理的小鼠的平均損傷評分隨時(shí)間的進(jìn)展情況。治療是在感染24小時(shí)后開始并且每天重復(fù)3次共4天。在單獨(dú)用泊洛沙姆處理的小鼠中，我們觀察到一個(gè)與未處理小鼠極其相似的模式，但后一動物組的皮膚損傷退化得更快。在用0.5％磷卡萘溶液處理的小鼠中，我們觀察到平均損傷評分大大降低，這在藥物與泊洛沙姆制劑聯(lián)用時(shí)變得更明顯。圖16(B組)表明未處理感染小鼠和用藥物制劑處理的小鼠的相應(yīng)存活性。75％的未處理感染小鼠在第7至8天內(nèi)死于腦炎。死亡率和用泊洛沙姆單獨(dú)處理的小鼠相類似并且發(fā)生在第8至10內(nèi)。半數(shù)經(jīng)磷卡萘溶液處理的小鼠經(jīng)感染后幸存。令人感興趣的是，75％的用磷卡萘的泊洛沙姆制劑處理的小鼠經(jīng)感染后幸存(p＜0.05)。
圖17(A組)表示未處理感染小鼠和感染24小時(shí)后用單劑量含5％無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆或Zovirax_軟膏處理的小鼠的平均損傷評分隨時(shí)間的進(jìn)展情況。含5％無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆制劑表現(xiàn)出對抗小鼠中皮膚損傷惡化的良好效能，而Zovirax_軟膏僅僅表現(xiàn)出中等程度的作用。然而，混合在泊洛沙姆中的無環(huán)鳥苷明顯降低了致死率(p＜0.05)，但Zovirax_軟膏(B組)無此作用。無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆制劑具有比市售Zovirax_軟膏高的功效顯然揭示了泊洛沙姆將是該藥物局部給藥的良好賦形劑。
圖18(A組)表示對照小鼠和每天處理3次共4天且在感染5天后開始單獨(dú)用泊洛沙姆、用含5％無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆或Zovirax_軟膏處理的小鼠的平均損傷評分隨時(shí)間的進(jìn)展。在接受泊洛沙姆單獨(dú)處理的小鼠中，觀察到平均損傷評分比未處理感染小鼠的低。采用Zovirax_軟膏的處理僅僅表現(xiàn)出中度作用。然而，在用含有5％無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆制劑處理的小鼠中觀察到平均損傷評分比未處理感染小鼠顯著降低。重要的是，所有用含5％無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆處理的小鼠經(jīng)感染后幸存(p＜0.001)(圖18,B組)。采用Zovirax_軟膏的處理較小程度地提高了感染小鼠的存活力(p＜0.05)?？共《緞┑捏w內(nèi)皮膚滲透作用圖19表示局部涂敷24小時(shí)后磷卡萘和無環(huán)鳥苷在未感染小鼠(A、C、E組)和感染小鼠(B、D、F組)的皮膚組織中的分布，磷卡萘和無環(huán)鳥苷存在于磷酸鹽緩沖液中或存在于泊洛沙姆基質(zhì)中。磷卡萘的兩種制劑和無環(huán)鳥苷的緩沖溶液在未感染小鼠和感染小鼠的角質(zhì)層條帶中的分布相類似。相反，將無環(huán)鳥苷混合在泊洛沙姆中可以顯著提高覆蓋在未感染小鼠和感染小鼠的角質(zhì)層中的藥物量；在感染小鼠中藥物的滲透作用明顯增強(qiáng)。與給藥所用載體無關(guān)的是，在未感染小鼠的下表皮和真皮中發(fā)現(xiàn)不存在或存在可忽略量的磷卡萘。當(dāng)藥物被混合在泊洛沙姆中時(shí)，磷卡萘在感染小鼠的表皮和真皮中的濃度明顯增高。在未感染小鼠和感染小鼠的表皮和真皮中，無環(huán)鳥苷的濃度高于磷卡萘的濃度，這與所用載體無關(guān)?；旌显诓绰迳衬分械臒o環(huán)鳥苷在未感染小鼠表皮中的濃度比存在于緩沖溶液中的該藥物高6.1倍。小鼠的感染沒有使表皮中的無環(huán)鳥苷量明顯增高。當(dāng)藥物在泊洛沙姆基質(zhì)中給藥時(shí)，感染小鼠真皮中的無環(huán)鳥苷濃度比未感染小鼠中的高7.9倍。
圖20表示局部給藥24小時(shí)后無環(huán)鳥苷在未感染小鼠和感染小鼠血漿中的濃度，無環(huán)鳥苷或存在于磷酸鹽緩沖液，或存在于泊洛沙姆基質(zhì)中。發(fā)現(xiàn)兩種制劑在未感染小鼠的血漿中具有類似的無環(huán)鳥苷濃度。小鼠的感染使血漿中無環(huán)鳥苷濃度明顯增高，尤其是當(dāng)藥物混合在泊洛沙姆基質(zhì)中時(shí)，此時(shí)濃度升高達(dá)4倍。當(dāng)藥物混合在泊洛沙姆基質(zhì)中時(shí)，無環(huán)鳥苷在感染小鼠血漿中的濃度提高了2.1倍。SLS在小鼠中對含磷卡萘或無環(huán)鳥苷的泊洛沙姆制劑抗HSV-1皮膚感染的效能的影響在小鼠中評估SLS對含磷卡萘的泊洛沙姆制劑抗HSV-1感染的效能的影響。圖21(A組)表示未處理感染小鼠和用泊洛沙姆單獨(dú)、含3％磷卡萘的泊洛沙姆制劑、含5％SLS的泊洛沙姆或含3％磷卡萘+5％SLS的泊洛沙姆單劑量給藥(感染24小時(shí)后)處理的感染小鼠的平均損傷評分隨時(shí)間的進(jìn)展情況。單用泊洛沙姆不產(chǎn)生任何抗感染防護(hù)作用。此外，在用含5％SLS或含3％磷卡萘的泊洛沙姆制劑處理的小鼠中觀察到其平均損傷評分比未處理感染小鼠適度降低。重要的是，在經(jīng)含3％磷卡萘和5％SLS的泊洛沙姆制劑處理的小鼠中，我們觀察到其平均損傷評分比未處理感染小鼠的明顯降低(p＜0.05)。B組提供了相同處理組的相應(yīng)存活率，其結(jié)論支持了所得的平均損傷評分結(jié)果。SLS的透皮促進(jìn)特性結(jié)合其改變病毒感染力的性能可以用來解釋磷卡萘制劑的這種高效能。HSV-1對磷卡萘和SLS組合物的體外敏感性在非洲綠猴腎細(xì)胞中研究SLS對磷卡萘抗HSV-1(菌株F)功效的影響。簡單而言，將細(xì)胞接種在24孔平板(Costar,Montreal,QC，加拿大)并且在37℃下用HSV-1菌株F(約100PFU/ml)培養(yǎng)2小時(shí)以吸附病毒。此后，除去病毒且用0.5ml含有不同濃度磷卡萘、SLS或這兩種化合物組合物的0.6％瓊脂糖Seaplaque(Marine Colloids,Rockland,MA)覆蓋細(xì)胞。令平板在37℃下溫育2天。隨后用10％存在于PBS中的甲醛固定20分鐘，用去離子水洗滌并且用0.05％亞甲藍(lán)染色。通過測定的PFU來評估病毒的敏感性。圖22表示對于非洲綠猴腎細(xì)胞來說HSV-1菌株F對不同濃度的磷卡萘和SLS的組合物的敏感性。結(jié)果表明SLS的存在提高了磷卡萘在非洲綠猴腎細(xì)胞中的抗HSV-1(菌株F)的效能。有效用途本文的實(shí)施例是本發(fā)明局部制劑的特定有效用途，但不以任何方式限制其范圍。如上述結(jié)果所示，本發(fā)明的凝膠制劑可以用來預(yù)防皮膚和/或粘膜的感染，特別是用于預(yù)防HSV和HIV。此外，本發(fā)明的結(jié)果顯示，本發(fā)明凝膠制劑可以用作預(yù)防保健工作者意外感染的預(yù)防性藥物。上述結(jié)果還證明，本發(fā)明的凝膠制劑可以用來治療和預(yù)防皮膚和/或粘膜的感染癥狀，特別是治療和預(yù)防皰疹損害。除了上述用途以外，其它有效用途是應(yīng)用本發(fā)明的凝膠制劑來ⅰ)愈合和/或治療燙傷和預(yù)防繼發(fā)感染和ⅱ)治療和/或預(yù)防眼科感染。在上述實(shí)施例中，本發(fā)明凝膠制劑可以含有任何殺微生物藥、殺菌劑、抗病毒藥、化療劑、抗炎藥、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)劑或任何其它可以有效治療和/或預(yù)防粘膜和/或皮膚由任何病原體和/或任意疾病引起的感染和/或異常情況的藥物或它們的組合物。
本文的實(shí)施例是本發(fā)明獨(dú)特施用器的特定有效用途，但不以任何方式限制其范圍。如上所述，本發(fā)明的施用器可用于將任何局部制劑給藥覆蓋在子宮頸/陰道/肛門直腸粘膜以治療和/或預(yù)防粘膜的感染和異常情況。本發(fā)明的施用器還可以用于施用ⅰ)任何可以預(yù)防引起STD的病原體的性傳播的局部制劑，ⅱ)陰道避孕制劑，ⅲ)治療特定疾病的局部殺微生物制劑，ⅳ)任何殺微生物藥、殺菌劑、抗病毒藥、化療劑、抗炎藥、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)劑、洗滌劑、微生物吸附抑制劑、透皮促進(jìn)劑、細(xì)胞因子、抗原、疫苗或其組合物。
權(quán)利要求
1．能夠干擾靶向細(xì)胞、組織或微生物中蛋白質(zhì)相互作用或破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象的試劑在制備用于治療或預(yù)防感染患者粘膜或皮膚的疾病，或用于預(yù)防外源性物質(zhì)如精子或微生物侵入的局部制劑中的應(yīng)用，條件是該試劑不是壬苯醇醚-9。
2．一種局部制劑，其中含有適當(dāng)量的成膜成分和有效量的試劑，所述成膜成分能夠在患者粘膜或皮膚上鋪展并形成保護(hù)層，所述試劑可以在靶向細(xì)胞、組織或微生物中干擾蛋白質(zhì)相互作用或破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象，條件是該試劑不是壬苯醇醚-9。
3．如權(quán)利要求1或2所述的局部制劑，其中所述試劑可以干擾微生物外蛋白質(zhì)與宿主受體的結(jié)合。
4．如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的局部制劑，其中所述試劑是微生物粘附抑制劑，或是可以破壞蛋白質(zhì)完整性的洗滌劑或離液劑。
5．如權(quán)利要求4所述的局部制劑，其中所述微生物粘附抑制劑是葡聚糖硫酸鹽。
6．如權(quán)利要求4所述的局部制劑，其中所述洗滌劑選自十二烷基硫酸鈉、苯扎氯銨、月桂酰肌氨酸、聚氧化乙烯脂肪酰衍生物和聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酰酯衍生物。
7．如權(quán)利要求4所述的局部制劑，其中所述離液劑是十二烷基硫酸鈉或胍。
8．如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的局部制劑，其中所述試劑是十二烷基硫酸鈉。
9．如權(quán)利要求8所述的局部制劑，其中所述試劑是濃度約為1至15％(w/v)的十二烷基硫酸鈉。
10．如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的局部制劑，其中所述成膜成分是泊洛沙姆407。
11．如權(quán)利要求10所述的局部制劑，其中泊洛沙姆407在使用中濃度為15至35％(w/v)。
12．如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的局部制劑，其中還包括可以有效對抗感染皮膚或粘膜的或通過皮膚或粘膜傳播的疾病的藥物。
13．如權(quán)利要求12所述的局部制劑，其中所述藥物是一種或多種選自下列的藥物殺微生物藥、殺精子劑、殺菌劑、抗病毒藥、化療劑、抗炎藥、抗腫瘤藥、免疫調(diào)節(jié)劑或任何其它試劑。
14．如權(quán)利要求13所述的局部制劑，其中含有抗病毒藥。
15．如權(quán)利要求14所述的局部制劑，其中所述抗病毒藥是無環(huán)鳥苷或磷卡萘。
16．如權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的局部制劑，其中還含有透皮促進(jìn)劑。
17．一種用于將液體至半固體制劑給藥至患者粘膜腔內(nèi)的施用器，其中包括-具有近端和遠(yuǎn)端、具有穿孔的縱向延伸外壁和縱向延伸內(nèi)壁的主體，所述內(nèi)壁在構(gòu)造和大小上與所述外壁隔開以在兩者之間形成擴(kuò)散道；該擴(kuò)散道具有進(jìn)料近端；-能夠容納任何制劑的儲庫；-排放部件，它可操作地和所述儲庫相連并且可由患者啟動以將任意制劑自所述儲庫內(nèi)排放至所述擴(kuò)散道內(nèi)；由此，當(dāng)啟動時(shí)，該排放部件迫使所述儲庫內(nèi)的制劑通過其進(jìn)料近端進(jìn)入所述擴(kuò)散道，并且該制劑經(jīng)所述穿孔施用至粘膜腔中。
18．如權(quán)利要求17所述的施用器，還包括-連接部件，用于將所述排放部件和所述主體的近端相連；和-位于所述主體近端的定向部件，用于將任意制劑定向施用至所述擴(kuò)散道的進(jìn)料近端。
19．如權(quán)利要求17所述的施用器，其中該外壁的穿孔包括縱向穿孔和末端穿孔。
20．如權(quán)利要求17所述的施用器，其中所述排放部件和所述儲庫是一個(gè)單一部件。
21．如權(quán)利要求20所述的施用器，其中所述排放部件是通過壓縮啟動的撓性部件。
22．如權(quán)利要求20所述的施用器，其中所述排放部件是由患者啟動的活塞。
23．如權(quán)利要求17所述的施用器，其中所述排放部件包括由患者啟動的活塞。
24．如權(quán)利要求23所述的施用器，其中所述排放部件還包括一個(gè)基座，它位于遠(yuǎn)離儲庫的由所述內(nèi)壁形成的腔室中，該基座可操作地和接近儲庫的活塞相連；由此，當(dāng)患者拉動該活塞時(shí)，所述基座壓縮該儲庫將制劑排放至擴(kuò)散道內(nèi)。
25．如權(quán)利要求23所述的施用器，其中所述活塞具有直徑大于所述內(nèi)壁外徑但小于該主體外壁內(nèi)徑的外壁，并且該活塞可以由患者通過在所述內(nèi)壁和所述主體外壁之間滑動該外壁來啟動。
26．如權(quán)利要求17-23和25任一項(xiàng)所述的施用器，其中所述定向部件包括密閉部件，它用來密封由所述主體內(nèi)壁形成的內(nèi)腔室。
27．如權(quán)利要求26所述的施用器，其中所述定向部件還包括和密閉部件同心的開放部件，該開放部件開向所述擴(kuò)散道的進(jìn)料近端，通過該開放部件制劑在排放部件啟動時(shí)受壓。
28．如權(quán)利要求26或27所述的施用器，其中所述定向部件與所述主體的內(nèi)壁近端形成整體。
29．如權(quán)利要求24所述的施用器，其中所述定向部件是由鄰近入口通道和所述主體近端中提供的密閉部件形成。
30．如權(quán)利要求17至29任一項(xiàng)所述的施用器，在儲庫和所述主體的近端之間還包括低抗性膜。
31．如權(quán)利要求30所述的施用器，還包括一個(gè)錐形部件以刺破所述膜，該錐形部件位于所述定向部件的近端。
32．如權(quán)利要求17-31任一項(xiàng)所述的施用器，其中所述穿孔是由至少兩個(gè)基本等距離縱向隔開的狹縫和一個(gè)末端穿孔構(gòu)成。
33．如權(quán)利要求32所述的施用器，其中所述狹縫和末端穿孔是連續(xù)的。
34．如權(quán)利要求17-31任一項(xiàng)所述的施用器，其中所述穿孔是由多個(gè)孔構(gòu)成，這些孔以使制劑基本均勻給藥至粘膜腔內(nèi)的方式隔開。
35．如權(quán)利要求17-34任一項(xiàng)所述的施用器，其中還包括位于連接部件外周的抓握部件。
36．如權(quán)利要求17-34任一項(xiàng)所述的施用器，其中還包括和所述連接部件形成整體的抓握部件。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防由任何病原體和/或任意疾病引起的粘膜和/或皮膚的感染和/或異常情況,更具體是用于預(yù)防性傳播感染HIV和HSV的制劑。本發(fā)明還涉及用于治療皮膚和/或粘膜的感染和/或異常情況,特別是治療皰疹損害的制劑。所述制劑可以作為預(yù)防性試劑來預(yù)防保健工作者的意外感染。該制劑可以用來愈合和/或治療燙傷和預(yù)防繼發(fā)感染。本發(fā)明還涉及開發(fā)獨(dú)特的陰道/肛門直腸施用器以將治療和/或預(yù)防由任何病原體和/或疾病引起的粘膜腔的感染和/或異常情況的局部制劑均勻給藥。
文檔編號A61M31/00GK1302215SQ99806466
公開日2001年7月4日 申請日期1999年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月21日
發(fā)明者M·G·伯格隆, A·迪索邁奧克斯, R·F·歐瑪, J·朱哈茲 申請人:瑞克爾科感染公司