專(zhuān)利名稱(chēng)::用于預(yù)防和治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及用于治療動(dòng)物中的癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述的方法包括增加可為動(dòng)物中的靶細(xì)胞或組織利用的1,25-二羥基維生素D的代謝前體量的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述的方法包括將表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因向靶細(xì)胞給藥,以便增加在靶細(xì)胞內(nèi)1,25-二羥基維生素D的產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及一種用于治療動(dòng)物中過(guò)度增殖性細(xì)胞疾病以及鈣和骨骼代謝疾病的方法,該方法包括將表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因向所述動(dòng)物的靶細(xì)胞或組織給藥。相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)定義術(shù)語(yǔ)“維生素D”現(xiàn)已用于文獻(xiàn)當(dāng)中,它通常是指一類(lèi)具有抗佝僂病活性的甾類(lèi)激素,它包括麥角鈣化醇(維生素D2)、膽鈣化醇(維生素D3)、鈣化二醇(25-羥基維生素D)、鈣化三醇(1,25-二羥基維生素D)以及20種或更多種維生素D的其它代謝物。但是,為了與作為本發(fā)明一部分的有用的代謝物區(qū)分,在本文中以其更為嚴(yán)格的含義來(lái)使用術(shù)語(yǔ)“維生素D”,它僅指維生素D2或維生素D3。1,25-二羥基維生素D最具生物活性的維生素D的代謝物為1,25-二羥基維生素D(“1,25(OH)2D”),它又稱(chēng)作鈣化三醇。1,25(OH)2D在動(dòng)物(例如人)中的合成起始于在暴露到陽(yáng)光或紫外光(UV)的照射后、或者在從飲食中得到的來(lái)源于植物和酵母的維生素D2或者來(lái)源于動(dòng)物(通常來(lái)自魚(yú)肝油和魚(yú)油)的維生素D3經(jīng)腸道吸收后維生素D在皮膚中的產(chǎn)生。為了變得具有生物活性,維生素D必須經(jīng)歷兩個(gè)羥基化步驟。參見(jiàn)圖1。第一個(gè)羥基化步驟是在肝臟中通過(guò)在第25個(gè)碳的位置處的羥基化而發(fā)生的,它生成了作為維生素D的主要循環(huán)代謝物的25-羥基維生素D(“25(OH)D”)。第二步羥基化是在腎臟中通過(guò)1α位置處的羥基化而發(fā)生的,它生成了具有激素活性的代謝物1,25(OH)2D。盡管腎臟是1,25(OH)2D的主要來(lái)源,但是將25(OH)D轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D的1α-羥化酶(“1α-OHase”)同樣存在于幾種非腎細(xì)胞中,例如活化的巨噬細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞(Barbour,G.L.等人《英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)雜志》305:440-443(1981);和Bikle,D.D.等人《臨床研究雜志》78:557-566(1986))。但是,迄今尚不知曉1α-OHase存在于前列腺細(xì)胞中。近來(lái),已經(jīng)從小鼠的腎臟、人的腎臟和人的角質(zhì)細(xì)胞中克隆出1α-OHase(Takeyama,K.等人《科學(xué)》277:1827-1829(1997);Fu,G.K.等人《Mol.Endo.》11:1961-1970(1997);Monkawa,T.等人《生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊》239:527-533(1997);Fu,G.K.等人《DNA與細(xì)胞生物學(xué)》16:1499-1507(1997);Shinki,T.等人《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》94:12920-12925(1997);Brenza,H.L.等人《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》95:1387-1391(1998);Murayama,A.等人《生物物理學(xué)生物化學(xué)研究通訊》249:11-16(1998);以及Kong,X.F.等人《骨骼》23(增刊第5期)S186(1998))。對(duì)于人的腎臟和角質(zhì)細(xì)胞中的1α-OHase基因來(lái)說(shuō),發(fā)現(xiàn)其cDNA是相同的(Kitanaka,S.等人《英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)雜志》338:653-661(1998);Fu,G.K.等人《Mol.Endo.》11:1961-1970(1997);以及Fu,G.K.等人《DNA與細(xì)胞生物學(xué)》16:1499-1507(1997))。也從患有維生素D依賴(lài)型Ⅰ型佝僂病(假維生素D缺乏性佝僂病)的病人的皮膚中克隆出了1α-OHase。據(jù)證實(shí)在所述基因中已經(jīng)發(fā)生了若干個(gè)點(diǎn)突變,從而導(dǎo)致1α-OHase的缺陷(Kitanaka,S.等人《英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)雜志》338:653-661(1998))。通過(guò)與稱(chēng)作維生素D受體(VDR)的特異性受體的相互作用,1,25(OH)2D能夠發(fā)揮其大部分的生物作用。VDR存在于負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)鈣和骨骼代謝的包括小腸、腎臟和骨骼在內(nèi)的組織中。另外,各種與鈣和骨骼代謝無(wú)關(guān)的組織和細(xì)胞也含有VDR(Holick,M.F.,《有關(guān)代謝骨骼疾病和無(wú)機(jī)物代謝疾病的初級(jí)讀物》M.J.Favus編輯,第3版,Lippincott-Raven費(fèi)城(1996)第74-81頁(yè))。這些組織尤其包括大腦、心臟、生殖腺、乳房、胰腺、骨骼肌、平滑肌、皮膚、單核細(xì)胞以及活化的T和B淋巴細(xì)胞。另外,幾種腫瘤細(xì)胞系(包括早幼粒白血病細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞以及基底細(xì)胞癌細(xì)胞)都具有VDR(Holick,M.F.《骨骼》17(增刊)107S-111S(1995))。盡管VDR在這些組織和細(xì)胞中確切的功能還沒(méi)有了解透徹,但是據(jù)認(rèn)為一些具有VDR的細(xì)胞通過(guò)降低其增殖活性而對(duì)1,25(OH)2D產(chǎn)生響應(yīng)。另外,還誘導(dǎo)一些細(xì)胞(如角質(zhì)細(xì)胞)進(jìn)行最后的分化。這已經(jīng)導(dǎo)致采用1,25(OH)2D及其類(lèi)似物來(lái)治療過(guò)度增殖性皮膚病(如牛皮癬),并且已經(jīng)暗示出用于治療某些癌癥(如乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌)的可能性(Holick,M.F.《骨骼》17(增刊)107S-111S(1995);Gross,C等人,在《維生素D》中,D.Feldman等人編輯,學(xué)術(shù)出版社紐約(1997)第1125-1139頁(yè))。癌癥的治療癌癥是一類(lèi)其特征在于不正常的細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)和傳播的疾病。一種頻繁發(fā)生的癌癥是前列腺癌,除皮膚癌之外,它是在美國(guó)男性公民中最常診斷出來(lái)的惡性腫瘤。在1996年,在美國(guó)診斷出大約317,000例新的前列腺癌(Parker,S.L.等人《臨床癌癥雜志》46:5-27(1996)),除了皮膚的基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌之外,這占新診斷出的惡性腫瘤的41%。因?yàn)樵谂R床上無(wú)癥狀的前列腺癌是非常普通的,因此實(shí)際上可能低估了這一問(wèn)題。前列腺癌一個(gè)特有的特征為非常流行的在尸體解剖中鑒定出來(lái)的“偶發(fā)的”或者“臨床癥狀不明顯的”病例。尸體解剖的數(shù)據(jù)表明大約有30%年齡在50歲以上的男人患有組織前列腺癌,而在年齡在80歲以上的男人中,這些偶發(fā)癌癥的流行程度高達(dá)60%。從組織學(xué)的角度來(lái)看,這些偶發(fā)癌癥與作為潛在地威脅生命的并且被認(rèn)為是其自然病史中早期階段的前列腺癌之間無(wú)法區(qū)分開(kāi)來(lái)。與前列腺癌的死亡率不同,無(wú)論種族或地理位置的不同,在老年男性中偶發(fā)前列腺癌是普遍存在的。盡管前列腺癌通常是一種緩慢生長(zhǎng)的惡性腫瘤,但是該疾病的死亡率仍是相當(dāng)可觀的,在1996年其占所有癌癥死亡的大約15%,這就使得前列腺癌在美國(guó)男性公民中為第二大導(dǎo)致癌癥死亡的原因(Parker,S.L.等人《臨床癌癥雜志》46:5-27(1996))。結(jié)果,不僅在美國(guó)乃至在全世界,前列腺癌已經(jīng)迅速地成為主要的公共健康所關(guān)注的問(wèn)題。參見(jiàn)Gross,C.等人,在《維生素D》中,D.Feldman等人編輯,學(xué)術(shù)出版社SanDiego,CA(1997),第1125-1139頁(yè)。令人感興趣的是在鄰近的美國(guó),前列腺癌的死亡率與在皮膚中產(chǎn)生維生素D的紫外線(xiàn)(UV)照射的水平成反比。如上所示,現(xiàn)在已知鈣化三醇在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)節(jié)中起到了重要的作用(Walter,M.R.《內(nèi)分泌學(xué)評(píng)論》13:719-764(1992))。例如,已經(jīng)表明1,25(OH)2D可以調(diào)制前列腺細(xì)胞中的細(xì)胞增殖和分化。支持性的證據(jù)包括在人體前列腺細(xì)胞中普遍存在著1,25(OH)2D的受體(維生素D受體,即VDRs),以及1,25(OH)2D在體外和體內(nèi)對(duì)這些細(xì)胞的抗增殖性和預(yù)先分化作用(Schwartz,G.G.《抗癌研究》14:1077-1082(1994))。顯然,1,25(OH)2D保持了前列腺細(xì)胞的分化的表型。因此,低水平的1,25(OH)2D可以增加危及生命的前列腺癌的危險(xiǎn)性。顯而易見(jiàn)的是使1,25(OH)2D可為靶細(xì)胞或器官所利用將會(huì)降低癌癥的危險(xiǎn)性。但是,增加1,25(OH)2D的水平會(huì)遇到多種障礙。首先,正常個(gè)體中1,25(OH)2D的全身水平在代謝方面受到了非常嚴(yán)格的調(diào)節(jié)。全身的1,25(OH)2D水平的增加通常與維生素D或其某些代謝物(包括25(OH)D,1,25(OH)2D直接的代謝前體)全身水平的增加無(wú)關(guān)。因此,通過(guò)紫外線(xiàn)照射或者維生素D能夠?qū)е虑傲邢偌?xì)胞暴露到1,25(OH)2D下的水平增加的機(jī)理以前是不清楚的。盡管已知具有1,25(OH)2D受體,但是以前認(rèn)為前列腺細(xì)胞僅僅受到全身1,25(OH)2D的調(diào)制,其中1,25(OH)2D是在腎臟中產(chǎn)生的并且由腎臟中采用25(OH)D作底物的1α-OHase高度調(diào)節(jié)。由于這種由腎臟高度調(diào)節(jié)的1,25(OH)2D的產(chǎn)生,人們公認(rèn)增加全身的25(OH)D將不會(huì)成比例地產(chǎn)生出全身更高水平的1,25(OH)2D。以前還不知曉的是如何在細(xì)胞水平上提供有效量的1,25(OH)2D,同時(shí)還不冒著對(duì)病人產(chǎn)生不希望有的和潛在不安全副作用的危險(xiǎn)。例如,由于由25(OH)D產(chǎn)生的1,25(OH)2D的調(diào)節(jié),25(OH)D的全身水平可以通過(guò)日光或紫外線(xiàn)照射原位產(chǎn)生維生素D來(lái)增加。因此,盡管長(zhǎng)期暴露在日光下或者進(jìn)行紫外光照射將增加25(OH)D的血清水平,但是1,25(OH)2D的血清水平通常不會(huì)增加到理想的抗增殖的水平上。因此,甚至在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為不安全或過(guò)量的劑量下,已知由暴露到日光或紫外光照射下來(lái)達(dá)到1,25(OH)2D的有益水平仍是不可能的。某些危險(xiǎn)(例如尤其是皮膚癌)與這類(lèi)過(guò)量的日光或紫外光暴露有關(guān)。近來(lái)已經(jīng)有人提議維生素D的食補(bǔ)可能會(huì)降低患前列腺癌的危險(xiǎn)性(Naitoh,J.等人《前列腺癌與前列腺疾病》1:48-53(1997))。但是,由于產(chǎn)生維生素D毒性的危險(xiǎn)性(其負(fù)面的副作用可以包括腎衰竭、高血鈣、昏迷和死亡),因此建議將維生素D作為飲食添加物給藥應(yīng)當(dāng)在醫(yī)師的監(jiān)督下進(jìn)行。考慮到其緩慢地代謝轉(zhuǎn)化為25(OH)D,維生素D補(bǔ)充療法也是不利的。因此采用保守的定量規(guī)定,通過(guò)將補(bǔ)充的維生素D給藥來(lái)達(dá)到有效量的25(OH)D會(huì)花費(fèi)幾周或幾個(gè)月的時(shí)間。相反地,如果所述維生素D的水平太高的話(huà),那么由于維生素D在體內(nèi)脂肪中自然儲(chǔ)存下來(lái),因此在停止給藥或降低維生素D的劑量之后,可能會(huì)花費(fèi)幾個(gè)月的時(shí)間才返回到25(OH)D的正常水平。此外,將1,25(OH)2D自身給藥帶來(lái)了其自身產(chǎn)生高血鈣的危險(xiǎn)性,而這已有許多文獻(xiàn)來(lái)證明。多項(xiàng)研究已經(jīng)表明當(dāng)與1,25(OH)2D一起培養(yǎng)時(shí),幾種具有VDR的癌細(xì)胞系(包括結(jié)腸癌、黑素瘤、前列腺癌以及乳腺癌)降低了增殖(Holick,M.F.《骨骼》17(增刊第2期)107S-111S(1995);Halline,A.G.等人《內(nèi)分泌》134:1710-1717(1994);Konety,B.R.等人《細(xì)胞生長(zhǎng)與分化》7:1563-1570(1996);以及Kivineva,M.等人《甾類(lèi)化合物生物化學(xué)與分子生物學(xué)雜志》66:121-127(1998))。此外,已經(jīng)表明人的皮膚細(xì)胞(Bike,D.D.等人《生物化學(xué)》25:1545-1548(1986))以及正常的前列腺細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞都具有將25(OH)D轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D的能力(Schwartz,GG.等人《CancerEpidemiol.Biomark&Prev.》7:391-395(1998))。因此,據(jù)認(rèn)為當(dāng)將這類(lèi)細(xì)胞暴露在25(OH)D之中時(shí),通過(guò)細(xì)胞的1α-OHase將25(OH)D轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D。然后,內(nèi)部產(chǎn)生的1,25(OH)2D將與細(xì)胞的VDR相互作用以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖活性。如上所述,1,25(OH)2D被認(rèn)為是維生素D的生物活性形式。其基本的生理功能為作用于鈣和骨骼代謝。它刺激鈣在腸內(nèi)的運(yùn)輸并且引發(fā)來(lái)自骨骼的鈣儲(chǔ)存物的代謝。無(wú)法產(chǎn)生1,25(OH)2D的患有腎衰竭的病人發(fā)展成低血鈣、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)和骨骼疾病,腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良。兩種罕見(jiàn)的遺傳疾病也與先天缺陷腎1α-OHase有關(guān)。維生素D依賴(lài)型I型佝僂病是一種先天的存在著缺陷1α-OHase酶的差錯(cuò)。在X連鎖血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病中,存在著對(duì)1α-OHase調(diào)節(jié)的缺陷?;加泄琴|(zhì)疏松癥的老年人在增量調(diào)節(jié)1α-OHase的能力方面具有一定的缺陷(Holick,M.F.,《有關(guān)代謝骨骼疾病和無(wú)機(jī)物代謝疾病的初級(jí)讀物》M.J.Favus編輯,第3版,Lippincott-Raven:費(fèi)城(1996)第74-81頁(yè))。發(fā)明概述迄今尚未描述過(guò)在降低維生素D的毒性和高血鈣的危險(xiǎn)的同時(shí),將維生素D的代謝物和1,25(OH)2D的前體向病人給藥可以預(yù)防細(xì)胞的增殖、侵襲性癌癥或者器官(例如前列腺、結(jié)腸或乳房)的癌癥或腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。迄今也尚未描述過(guò)采用基因治療技術(shù)將1α-OHase基因給藥可以用于治療或預(yù)防癌癥或者其中的1,25(OH)2D3可以影響細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟的任何疾病(包括如牛皮癬或光化性角化病這樣的過(guò)度增殖性皮膚病),或者還未描述過(guò)作為1,25(OH)2D3外源性給藥的一種更加安全的方式,它還可以用于治療鈣和骨骼代謝疾病。另外,以前并沒(méi)有這樣一種公知的方法,該方法通過(guò)測(cè)量細(xì)胞成分(例如維生素D、維生素D的代謝物)在器官中的水平、產(chǎn)生所述代謝物的酶或者所述酶的活性來(lái)確定形成侵襲性癌癥的危險(xiǎn)性,而不是預(yù)測(cè)通過(guò)特殊治療達(dá)到的成功率。通過(guò)如下所述的主題發(fā)明有利地提供了這樣的方法。本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療或測(cè)試某類(lèi)癌癥(特別是前列腺癌)的新的方法,其中利用了維生素D的代謝物、維生素D代謝物的類(lèi)似物或衍生物或者參與維生素D代謝的酶的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種用于在靶器官的細(xì)胞中局部地增加1,25-二羥基維生素D(1,25(OH)2D)的濃度的方法,以便可以向那些細(xì)胞提供1,25(OH)2D的抗增殖、抗侵襲、抗轉(zhuǎn)移和預(yù)先分化的作用。具體地講,本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種通過(guò)將1,25(OH)2D的代謝前體向病人給藥來(lái)增加可為靶器官利用的1,25(OH)2D濃度的方法,其中所述的前體不具有患皮膚癌的副作用或危險(xiǎn)(其中皮膚癌與日光或紫外光(UV)的照射暴露有關(guān)),或者不具有維生素D的毒性的副作用或危險(xiǎn)(其中所述毒性與將高劑量的維生素D或1,25(OH)2D給藥有關(guān))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明包括將有效量的維生素D的代謝物向需要治療或預(yù)防性治療腫瘤或癌癥的病人給藥,其中所述代謝物的給藥向病人提供了比另一種方法實(shí)質(zhì)上更低地患皮膚癌、維生素D毒性或高血鈣的危險(xiǎn),而所述的另一種方法例如為可以導(dǎo)致所述不希望有的副作用的暴露到紫外光的照射之下或者將超劑量的維生素D或1,25(OH)2D給藥。有利的是,本方法可以用于預(yù)防性地或者治療性地治療冒著某些臨床癥狀不明顯的或者有臨床癥狀的癌癥危險(xiǎn)或者患有所述疾病的病人。該方法包括通過(guò)將維生素D或維生素D的代謝物或類(lèi)似物、衍生鹽或者可以通過(guò)代謝轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D或其功能等同物的所述代謝物的功能等同物給藥來(lái)預(yù)防腫瘤或癌細(xì)胞的增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移。該治療優(yōu)選包括將有效量的25(OH)D向患有對(duì)1,25(OH)2D有反應(yīng)的臨床癥狀不明顯的、有臨床癥狀的或者最低殘留癌癥的病人給藥。最低殘留癌癥是指在治療后(例如,前列腺切除手術(shù)后或者放射治療后)的病人中可以檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞,其中已經(jīng)除掉了早期腫瘤或者已經(jīng)從體內(nèi)除去了器官,但是可能已經(jīng)固定化在不同的器官上或者存在于血流中,于是仍可以檢測(cè)到腫瘤或癌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,用于預(yù)防性或治療性治療癌癥的方法包括將有效量的25(OH)D或其類(lèi)似物、衍生物、鹽或功能等同物向患有器官的(即,“靶器官”)臨床癥狀不明顯的、有臨床癥狀的或最低殘留的癌癥的病人給藥,其中靶器官或者來(lái)源于所述靶器官的細(xì)胞可以將25(OH)D或其類(lèi)似物、衍生物、鹽、前體或功能等同物轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D或其功能等同物。具有1α-OHase酶的器官細(xì)胞可以局部地將25(OH)D或其類(lèi)似物轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D或其相應(yīng)的類(lèi)似物。例如,已經(jīng)表明某些前列腺細(xì)胞具有1α-OHase并且有能力將25(OH)D轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D。因此,本方法可以應(yīng)用到患有臨床癥狀不明顯的或者有臨床癥狀疾病的前列腺癌的病人、冒著形成前列腺腫瘤的病人(例如,沒(méi)有前列腺癌臨床證據(jù)的人)或者患有轉(zhuǎn)移性疾病的病人(例如,由癌性前列腺細(xì)胞固定化到其它器官或組織上造成的最低殘留癌癥)當(dāng)中。另一方面,本方法可以用于治療任何器官中的腫瘤,其中所述器官的細(xì)胞可以將25(OH)D的代謝前體轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D或其功能等同物,并且對(duì)1,25(OH)2D或其功能等同物的抗增殖、抗侵襲、抗轉(zhuǎn)移或預(yù)先分化作用是有反應(yīng)的。因此,具有維生素D受體(VDR)并且能夠產(chǎn)生1α-OHase酶的細(xì)胞可以對(duì)這種治療產(chǎn)生響應(yīng)。此外,可以基因過(guò)程改造通常缺陷VDR或1α-OHase的細(xì)胞,例如采用合適的基因或啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因改變細(xì)胞以誘導(dǎo)所述基因的轉(zhuǎn)錄以及結(jié)果蛋白的產(chǎn)生,從而所述的細(xì)胞能夠?qū)Ρ景l(fā)明的治療產(chǎn)生響應(yīng)。本發(fā)明因而提供了一種減少患侵襲性(即,威脅生命的)癌癥(包括侵襲性前列腺癌)危險(xiǎn)性的問(wèn)題的解決辦法。對(duì)于許多處于前列腺癌自然病史的不同階段的男人來(lái)說(shuō),采用25(OH)D或其類(lèi)似物、衍生物、鹽或者功能等同物的治療可能是有用的。這些包括千百萬(wàn)目前患有臨床癥狀不明顯的前列腺癌的男人(處于“需警惕等待”狀態(tài)的男人)、以及已經(jīng)通過(guò)具有治療目的的療法針對(duì)前列腺癌進(jìn)行了治療但在其體內(nèi)仍可能具有前列腺癌細(xì)胞的男人。它對(duì)于未患前列腺癌(或是臨床癥狀不明顯的或是有臨床癥狀的)的男人也可能是有用的,以便降低形成癌癥的危險(xiǎn)性。臨床癥狀不明顯的前列腺癌的一種形式也稱(chēng)作“前列腺上皮內(nèi)瘤形成”或PIN。通過(guò)降低其增殖、通過(guò)向癌細(xì)胞中引入編碼1α-OHase酶的基因并使所述的細(xì)胞在內(nèi)部產(chǎn)生1,25(OH)2D來(lái)抑制含VDR并對(duì)1,25(OH)2D產(chǎn)生響應(yīng)的癌細(xì)胞中細(xì)胞的增殖也應(yīng)當(dāng)是可能的。因此,這種基因治療方法可以用來(lái)治療這些癌癥。此外,如果將編碼VDR的基因與1α-OHase基因共同向缺少VDR的細(xì)胞給藥的話(huà),該方法可以使這類(lèi)細(xì)胞對(duì)1,25(OH)2D3產(chǎn)生響應(yīng),從而使得該方法在治療通常對(duì)1,25(OH)2D3不產(chǎn)生響應(yīng)的癌癥中是有用的。對(duì)該方法來(lái)說(shuō),將會(huì)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如,1,25(OH)2D3及其類(lèi)似物的外源性給藥具有造成高血鈣的可能性(Holick,M.F.,《有關(guān)代謝骨骼疾病和無(wú)機(jī)物代謝疾病的初級(jí)讀物》M.J.Favus編輯,第3版,Lippincott-Raven費(fèi)城(1996)第74-81頁(yè);Holick,M.F.《骨骼》17(增刊第2期)107S-111S(1995);以及Gross,C.等人,在《維生素D》中,D.Feldman等人編輯,學(xué)術(shù)出版社:SanDiego,CA(1997),第1125-1139頁(yè)),而這通過(guò)將1α-OHase基因摻入癌細(xì)胞中并使其在內(nèi)部產(chǎn)生1,25(OH)2D將會(huì)減輕或消除。VDR基因的共同給藥將會(huì)使得或者增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)內(nèi)源產(chǎn)生的1,25(OH)2D抗增殖活性的響應(yīng)。一旦生成,1,25(OH)2D就可能在使用后在細(xì)胞中被降解,從而消除了任何潛在的毒性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了一種抑制動(dòng)物中的腫瘤細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的方法,該方法包括向需要的細(xì)胞中引入含有表達(dá)1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25(OH)2D或其類(lèi)似物并且抑制了所述細(xì)胞的增殖。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明進(jìn)一步包括向腫瘤細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。在這種情況下,表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)維生素D受體的基因可以在同一DNA構(gòu)建體上或者在不同的DNA構(gòu)建體上。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明的這一方面提供了一種用于治療或預(yù)防前列腺癌、乳腺癌、皮膚癌、結(jié)腸癌、肺癌、白血病、淋巴瘤或者其它癌癥的方法,這些癌癥可以對(duì)內(nèi)源產(chǎn)生的1,25(OH)2D或1,25(OH)2D的類(lèi)似物的抗增殖和預(yù)先分化作用產(chǎn)生響應(yīng),其中1,25(OH)2D或其類(lèi)似物是由采用含有1α-OHase基因且含有或者不含VDR基因的DNA構(gòu)建體進(jìn)行基因治療的細(xì)胞提供的。在另一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)本文所述的基因治療醫(yī)治的動(dòng)物也可以基本上同時(shí)采用25(OH)D或其類(lèi)似物、衍生物、鹽或功能等同物來(lái)治療,以便增加對(duì)基因治療的響應(yīng)。另外,本發(fā)明提供了一種測(cè)試病人患癌癥的危險(xiǎn)性的方法。通過(guò)測(cè)量特殊器官中某些細(xì)胞組分的水平(其中被測(cè)的組分參與了維生素D的代謝)、通過(guò)測(cè)量維生素D或其代謝物(例如,25(OH)D或其類(lèi)似物)的水平、通過(guò)測(cè)量能夠?qū)⒕S生素D的代謝物轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D的酶或所述酶的活性,可以確定在該器官中形成威脅生命的癌癥的相應(yīng)的危險(xiǎn)性。例如,1α-OHase酶能夠?qū)?5(OH)D轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D。因此,測(cè)量來(lái)自靶器官(例如,前列腺)的細(xì)胞樣品中1α-OHase的水平或1α-OHase酶的活性可以用于確定在該器官或者含有來(lái)自該器官的癌細(xì)胞的器官中形成癌癥的危險(xiǎn)性。也可以采用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)測(cè)量編碼1α-OHase酶或VDRs的基因中的遺傳多態(tài)性以及在測(cè)試個(gè)體中具有形成腫瘤危險(xiǎn)的相應(yīng)等位基因的不同。本發(fā)明還提供了一種通過(guò)測(cè)定器官(例如,前列腺)中在維生素D代謝途徑中某些細(xì)胞組分(諸如,維生素D或其代謝物)的局部水平或者通過(guò)測(cè)定能夠?qū)⒋x前體轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D的酶(例如,1α-OHase)的水平來(lái)預(yù)測(cè)在病人中治療特殊癌癥的成功率的方法。測(cè)量酶的活性也可以用來(lái)間接地測(cè)量酶的水平,并且因而可以預(yù)測(cè)治療的成功性。本發(fā)明還提供了一種治療動(dòng)物中的過(guò)度增殖性皮膚病的方法,該方法包括向需要的動(dòng)物的皮膚細(xì)胞中引入含有表達(dá)1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25(OH)2D或其類(lèi)似物并且抑制了細(xì)胞的增殖。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中,表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)維生素D受體的基因可以位于構(gòu)建體的同一DNA分子上或者位于所說(shuō)構(gòu)建體的不同DNA分子上。更具體地講,本發(fā)明可以用于治療光化性角化病(即,一種前期皮膚癌)或鱗癬。引入編碼1α-OHase的基因?qū)е录?xì)胞中1,25(OH)2D3的量的增加,從而降低了增殖活性并誘導(dǎo)了所述的細(xì)胞分化為正常的形態(tài)。本發(fā)明的目的還在于一種用于治療過(guò)度增殖性皮膚病(如,牛皮癬)的方法。患有牛皮癬的病人對(duì)局部的和口服的1,25(OH)2D產(chǎn)生響應(yīng)。但是,有關(guān)其潛在的毒性存在著憂(yōu)慮(Holick,M.F.,《有關(guān)代謝骨骼疾病和無(wú)機(jī)物代謝疾病的初級(jí)讀物》M.J.Favus編輯,第3版,Lippincott-Raven費(fèi)城(1996)第74-81頁(yè);以及Holick,M.F.《骨骼》17(增刊第2期)107S-111S(1995))。因此,本發(fā)明是另一種合理的治療牛皮癬的方法,從而誘導(dǎo)細(xì)胞以使得或促進(jìn)1,25(OH)2D3的產(chǎn)生,接下來(lái)1,25(OH)2D3與VDR相互作用并降低了增殖的活性和增強(qiáng)了分化,從而使皮膚細(xì)胞變得正常起來(lái)。該治療方法也可以應(yīng)用到其他過(guò)度增殖性皮膚病(如鱗癬)中。本發(fā)明還提供了一種治療動(dòng)物中的鈣和骨骼代謝疾病的方法,該方法包括向需要的動(dòng)物的細(xì)胞中引入含有表達(dá)1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25(OH)2D或其類(lèi)似物并且治療了疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。在該實(shí)施方案中,表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)維生素D受體的基因可以位于同一DNA構(gòu)建體上或者位于不同的DNA構(gòu)建體上。本發(fā)明的這一實(shí)施方案提供了一種用于治療鈣和骨骼代謝疾病(如腎骨營(yíng)養(yǎng)不良)或骨骼代謝疾病的方法。本發(fā)明還提供了一種治療下列疾病的方法維生素D依賴(lài)型Ⅰ型佝僂病、X連鎖血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病、維生素D依賴(lài)型Ⅱ型佝僂病和骨質(zhì)疏松癥以及由于甲狀旁腺機(jī)能減退導(dǎo)致血清中低血鈣而形成的鈣和骨骼代謝這樣的疾病。本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防動(dòng)物中脫發(fā)的方法,該方法包括向需要的毛細(xì)胞中引入含有表達(dá)1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25(OH)2D或其類(lèi)似物并且治療了脫發(fā)。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。在該實(shí)施方案中,表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)維生素D受體的基因可以位于同一DNA構(gòu)建體上或者位于不同的DNA構(gòu)建體上。因此,本發(fā)明可以用于治療或預(yù)防由某些情況導(dǎo)致的脫發(fā),比如雄核發(fā)育性脫發(fā)、女性方式禿發(fā)以及化療引起的脫發(fā)。本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)動(dòng)物中的傷口愈合的方法,該方法包括向需要的傷口的細(xì)胞中引入含有表達(dá)1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25(OH)2D或其類(lèi)似物并且促進(jìn)了傷口的愈合。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。在該實(shí)施方案中,表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)維生素D受體的基因可以位于同一DNA構(gòu)建體上或者位于不同的DNA構(gòu)建體上。本發(fā)明還提供了一種治療動(dòng)物中的良性前列腺增生的方法,該方法包括向表現(xiàn)出良性前列腺增生的需要的細(xì)胞中引入含有表達(dá)1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25(OH)2D或其類(lèi)似物并且治療了良性的前列腺增生。在該實(shí)施方案中,本發(fā)明可以進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中,表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)維生素D受體的基因可以位于同一DNA構(gòu)建體上或者位于不同的DNA構(gòu)建體上。本發(fā)明還提供了一種治療動(dòng)物中的自身免疫病的方法,該方法包括向需要的動(dòng)物細(xì)胞中引入含有表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25-二羥基維生素D或其類(lèi)似物并且治療了自身免疫病。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明可以進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。在該實(shí)施方案中,表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)維生素D受體的基因可以位于同一DNA構(gòu)建體上或者位于不同的DNA構(gòu)建體上??梢圆捎帽景l(fā)明來(lái)治療自身免疫病,比如Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎。另外,本發(fā)明提供了一種含有1α-OHase調(diào)節(jié)序列或其互補(bǔ)序列的分離的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中,1α-OHase調(diào)節(jié)序列或其互補(bǔ)序列含有選自由下列組成的組中的多核苷酸(a)含有與SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列至少有90%相同的核苷酸序列的多核苷酸;以及(b)在嚴(yán)格條件下與(a)的多核苷酸或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸。在其它的實(shí)施方案中,1α-OHase調(diào)節(jié)序列或其互補(bǔ)序列含有與SEQIDNO.3中所示的序列有95%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列,或者含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種分離的多核苷酸分子,所述分子還含有編碼1α-OHase的與SEQIDNO.1中所示的序列有95%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列,或者一種含有在SEQIDNO.1中所示的核苷酸序列的序列。附圖的簡(jiǎn)要描述圖1顯示出維生素D在體內(nèi)代謝的示意圖。由實(shí)心箭頭顯示出眾所周知的代謝步驟;由空心箭頭顯示出通過(guò)前列腺由25(OH)D合成了1,25(OH)2D。圖2-5顯示出脂質(zhì)提取物的氚活性的高效液相層析的洗脫分布,其中的脂質(zhì)提取物來(lái)自在不存在或者存在P450抑制劑克霉唑的情況下培養(yǎng)的正常人前列腺的原代培養(yǎng)物或者與[3H]-25(OH)D一起培養(yǎng)的BPH培養(yǎng)物。圖2顯示出第二代正常人的前列腺細(xì)胞,該細(xì)胞在不存在克霉唑的情況下在37℃下與非放射性的25(OH)D3(50nM)、[3H]-25(OH)D3(0.91μCi/nmol)以及1,2-二苯胺乙烷(DPPD)(10μM)一起培養(yǎng)了2小時(shí)。圖3顯示出第二代正常人的前列腺細(xì)胞,該細(xì)胞在存在P450酶抑制劑克霉唑(20μM)的情況下在37℃下與非放射性的25(OH)D3(50nM)、[3H]-25(OH)D3(0.91μCi/nmol)以及DPPD(10μM)一起培養(yǎng)了2小時(shí)。圖4顯示出第二代來(lái)源于BPH培養(yǎng)物的前列腺細(xì)胞,該細(xì)胞在不存在克霉唑的情況下在37℃下與非放射性的25(OH)D3(50nM)、[3H]-25(OH)D3(0.91μCi/nmol)以及DPPD(10μM)一起培養(yǎng)了2小時(shí)。圖5顯示出第二代來(lái)源于BPH培養(yǎng)物的前列腺細(xì)胞,該細(xì)胞在存在克霉唑的情況下在37℃下與非放射性的25(OH)D3(50nM)、[3H]-25(OH)D3(0.91μCi/nmol)以及DPPD(10μM)一起培養(yǎng)了2小時(shí)。圖6描繪了這樣一幅附圖,該附圖顯示出25(OH)D3的濃度對(duì)于用1α-OHasecDNA轉(zhuǎn)染的正常人角質(zhì)細(xì)胞的增殖活性的影響。用不同濃度(1nM,10nM,100nM)的25(OH)D3來(lái)培養(yǎng)用含有所述1α-OHasecDNA的載體轉(zhuǎn)染的所培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞18小時(shí)。正如所述的那樣,測(cè)量[3H]胸苷的摻入?!?●將[3H]胸苷摻入到未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中(“對(duì)照”);O-O將[3H]胸苷摻入用含有1α-OHasecDNA的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中(”1α-OHase轉(zhuǎn)染”)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療細(xì)胞增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移的潛在能力或者用于促進(jìn)細(xì)胞分化的新的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于測(cè)試癌癥的方法,以及一種用于預(yù)測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖或癌癥的治療是否成功的方法。將維生素D代謝化合物給藥本發(fā)明一方面包括提高1,25(OH)2D的局部的細(xì)胞水平。具體地講,本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)將有效量的維生素D代謝物給藥來(lái)預(yù)防或治療細(xì)胞增殖、侵入或轉(zhuǎn)移或者促進(jìn)細(xì)胞的分化,其中所述的維生素D代謝物可以通過(guò)代謝由靶細(xì)胞轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D。優(yōu)選地,本發(fā)明所使用的維生素D代謝物并不導(dǎo)致皮膚癌(與日光或紫外(UV)線(xiàn)暴露相比)、產(chǎn)生維生素D毒性(與補(bǔ)充過(guò)量維生素D的給藥相比)的危險(xiǎn)性的增加,并且并不明顯地導(dǎo)致高血鈣(與將1,25(OH)2D給藥相比)。更優(yōu)選地,本發(fā)明包括將有效量的25(OH)D或其類(lèi)似物、衍生物、鹽或功能等同物給藥以預(yù)防在特殊器官中腫瘤或癌細(xì)胞的增殖、侵入或轉(zhuǎn)移,或者促進(jìn)該器官中或者來(lái)源于該器官的細(xì)胞的分化。所述化合物25(OH)D是可以商購(gòu)的。在血清中正常觀察到的25(OH)D的濃度約為20-150nmol/L(8-60ng/ml)。但是,在整個(gè)夏天暴露在日光中之后,在救生員中已經(jīng)正常地觀察到高達(dá)250nmol/L(100ng/ml)25(OH)D的循環(huán)濃度,并且該濃度被認(rèn)為是正常的(Holick,M.F.《營(yíng)養(yǎng)雜志》增刊120:1464-1469(1990))。對(duì)個(gè)人的健康來(lái)說(shuō),大約350nmol/L或者更高的濃度被認(rèn)為是危險(xiǎn)的。維生素D缺乏癥(即,血清中的25(OH)D缺乏)為一種當(dāng)血清的水平降低到低于約25nmol/L(10ng/ml)時(shí)定義的病癥。因此,將有效量的25(OH)D向靶器官給藥可以是當(dāng)給藥時(shí)增加了25(OH)D局部的細(xì)胞水平、但仍保持25(OH)D的血清水平在該“正?!狈秶鷥?nèi)的這樣一種任意的量。優(yōu)選地,在靶器官中增加25(OH)D的水平使之基本上高于25nmol/L、而低于250nmol/L。更優(yōu)選地,增加25(OH)D的水平使之介于大約50和150nmol/L之間。1,25(OH)2D正常的血清水平范圍為大約38-144pmol/L(16-60pg/ml)。于是,另一種確定根據(jù)本發(fā)明的方法將25(OH)D給藥的有效量為將這樣的一種量給藥,即朝著其在靶器官中正常范圍上限的趨勢(shì)增加25(OH)D的水平,但并不使全身的1,25(OH)2D增加到其正常范圍的上限以上。例如,可以?xún)?yōu)選地增加25(OH)D的水平以使器官內(nèi)的水平增加到大約25-150nmol/L,而全身的1,25(OH)2D的水平仍保持低于145pmol/L。更優(yōu)選地,當(dāng)將25(OH)D向靶細(xì)胞、器官或組織給藥時(shí),1,25(OH)2D的水平保持在低于125nmol/L。有用的25(OH)D的類(lèi)似物、衍生物或鹽包括烷基化的、糖基化的、芳基化的、鹵代的或者羥基化的25(OH)D、25(OH)D的原酸酯或25(OH)D的藥物鹽。這些類(lèi)似物、衍生物或鹽可以通過(guò)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的并且易于使用的化學(xué)方法合成或者以別的方式制備。維生素D的類(lèi)似物可以根據(jù)在下列美國(guó)專(zhuān)利中公開(kāi)的方法來(lái)得到US5,508,392,US5,457,217,US5,414,098,US5,384,313,US5,373,004,US5,371,249,US5,430,196,US5,260,290,US5,393,749,US5,395,830,US5,250,523,US5,247,104,US5,397,775,US5,194,431,US5,281,731,US5,254,538,US5,232,836,US5,185,150,US5,321,018,US5,086,191,US5,036,061,US5,030,772,US5,246,925,US4,973,584,US5,354,744,US4,927,815,US4,857,518,US4,851,401,US4,851,400,US4,847,012,US4,755,329,US4,940,700,US4,619,920,US4,594,192,US4,588,716,US4,564,474,US4,552,698,US4,588,528,US4,719,204,US4,719,205,US4,689,180,US4,505,906,US4,769,181,US4,502,991,US4,481,198,US4,448,726,US4,448,721,US4,428,946,US4,411,833,US4,410,515,US4,367,177,US4,336,193,US4,360,472,US4,360,471,US4,307,231,US4,307,025,US4,358,406,US4,305,880,US4,279,826以及US4,248,791。術(shù)語(yǔ)“功能等同物”用來(lái)指這樣的任意化合物,所述化合物可以用作1α-OHase的底物,或者可以被轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D或被轉(zhuǎn)化為可以結(jié)合或激活1,25(OH)2D受體(VDR)從而體現(xiàn)了1,25(OH)2D的任何一種有益特性(即,抑制侵襲力、增殖、轉(zhuǎn)移或者促進(jìn)細(xì)胞的分化)的化合物。例如,參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,167,953,US5,422,099,US5,794,248和US5,395,829。另外據(jù)說(shuō)通過(guò)使用含有1,25(OH)2D代謝前體或其類(lèi)似物或衍生物(例如25(OH)D)以及藥物可接受的載體的藥物組合物,可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明?,F(xiàn)已表明將1,25(OH)2D的代謝前體向病人給藥的所述方法在由前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生1,25(OH)2D方面是有效的。特別是現(xiàn)已表明所述的方法在兩種充分表征的人前列腺癌細(xì)胞系DU145和PC-3中以及在來(lái)源于非癌性人的前列腺的兩種細(xì)胞原代培養(yǎng)物NP96-5和BPH96-11中是有效的。NP96-5培養(yǎng)物來(lái)源于年齡為23歲的器官捐獻(xiàn)者的前列腺;而B(niǎo)PH96-11培養(yǎng)物來(lái)源于年齡為56歲且患有良性前列腺增生(BPH)的捐獻(xiàn)者。所述細(xì)胞系DUl45和PC-3以及所述原代培養(yǎng)物中的兩種可以由其代謝前體25(OH)D合成出1,25(OH)2D。維生素D的代謝物1,25(OH)2D也可以通過(guò)所培養(yǎng)的正常人的角質(zhì)細(xì)胞由25(OH)D合成出來(lái)。所述結(jié)果示于下面的表1中。表1在存在和缺少P450細(xì)胞色素抑制劑克霉唑的情況下1,25(OH)2D的合成n=重復(fù)的次數(shù),誤差為S.E.M.。正如表1所總結(jié)的那樣,DU145和PC-3細(xì)胞系分別產(chǎn)生了0.31±0.06和0.07±0.01pmol的1,25(OH)2D/mg蛋白/小時(shí)。正如根據(jù)眾所周知的步驟由胸腺受體結(jié)合測(cè)定所檢測(cè)的那樣,這些細(xì)胞呈現(xiàn)出1α-OHase的活性。在存在克霉唑(即,一種眾所周知的細(xì)胞色素P450系統(tǒng)的抑制劑,其中1α-OHase為一種公知的組分)的情況下完全抑制了1,25(OH)2D的產(chǎn)生。相反地,在LNCaP細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到1,25(OH)2D,其中所述細(xì)胞并不呈現(xiàn)出1α-OHase的活性。還培養(yǎng)了來(lái)自?xún)蓚€(gè)病人的前列腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)物NP96-5(前列腺正常)和BPH96-11(BPH),并且在存在DPPD以及在存在或缺少克霉唑的情況下測(cè)定其中酶的活性。在存在DPPD和缺少細(xì)胞色素P450抑制劑的情況下,NP96-5和BPH96-11培養(yǎng)物分別產(chǎn)生了3.08±1.56pmol的1,25(OH)2D/mg蛋白/小時(shí)和1.05±0.31pmol的1,25(OH)2D/mg蛋白/小時(shí)。在前列腺細(xì)胞的兩種原代培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的1α-OHase的活性與在正常人的角質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的活性相當(dāng)。正如在兩種細(xì)胞系中出現(xiàn)的那樣,在存在克霉唑的情況下完全抑制了前列腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)物和角質(zhì)細(xì)胞中1,25(OH)2D的產(chǎn)生。在前列腺細(xì)胞原代培養(yǎng)物中檢測(cè)到的酶活性進(jìn)一步得到了高效液相層析分析的支持,在分析中使用了特異性地分離開(kāi)1,25(OH)2D和10-氧代-19-去甲-25(OH)D(即,25(OH)D的另一種代謝物)的溶劑系統(tǒng)。已知這種以顯著的量存在于大鼠和雞的腎組織勻漿中的代謝物與1,25(OH)2D在采用正己烷∶異丙醇(9∶1)這種溶劑系統(tǒng)的正相HPLC中共同遷移。因此,為了確保將1,25(OH)2D與存在的任意的10-氧代-19-去甲-25(OH)D分離開(kāi),采用了二氯甲烷∶異丙醇(19∶1)的正相溶劑系統(tǒng)。另外,通過(guò)使用放射性代謝物[3H]-25(OH)D作底物來(lái)測(cè)定1α-OHase的活性。在圖2-5中闡明了在存在和缺少克霉唑的情況下兩種原代前列腺細(xì)胞培養(yǎng)物典型的HPLC層析圖。在圖2中顯示了第二代正常人的前列腺細(xì)胞,該細(xì)胞在缺少克霉唑(20μM)的情況下在37℃下與非放射性的25(OH)D3(50nM)、[3H]-25(OH)D3(0.91μCi/nmol)以及1,2-二苯胺乙烷(DPPD)(10μM)一起培養(yǎng)了2小時(shí)。在可以檢測(cè)到的水平上合成出活性代謝物1,25(OH)2D。在存在克霉唑(20μM)的情況下(即,存在細(xì)胞色素P450抑制劑(克霉唑)的情況下),同樣將第二代正常人的前列腺細(xì)胞與非放射性的25(OH)D3(50nM)、[3H]-25(OH)D3(0.91μCi/nmol)以及DPPD(10μM)一起在37℃下培養(yǎng)了2小時(shí)。圖3表明1,25(OH)2D的合成受到了明顯的抑制,從而檢測(cè)不到活性代謝物。在缺少克霉唑(20μM)的情況下,將來(lái)源于BPH培養(yǎng)物的第二代前列腺細(xì)胞與非放射性的25(OH)D3(50nM)、[3H]-25(OH)D3(0.91μCi/nmol)以及DPPD(10μM)一起在37℃下培養(yǎng)了2小時(shí)。在沒(méi)有細(xì)胞色素P450抑制劑的情況下,可以檢測(cè)到活性代謝物,產(chǎn)生了導(dǎo)致約500cpm的產(chǎn)物(參見(jiàn)圖4)。與之相反,來(lái)源于BPH培養(yǎng)物的另一種第二代前列腺細(xì)胞顯然表明1,25(OH)2D代謝物水平的下降,測(cè)量其值低于約200cpm(圖5),其中所述細(xì)胞在存在克霉唑(20μM)的情況下在37℃下與非放射性的25(OH)D3(50nM)、[3H]-25(OH)D3(0.91μCi/nmol)以及DPPD(10μM)一起培養(yǎng)了2小時(shí)。非癌性前列腺細(xì)胞的兩種原代培養(yǎng)物都以比所述細(xì)胞系高出10-40倍的水平產(chǎn)生1,25(OH)2D。從來(lái)源于年齡為23歲的器官捐獻(xiàn)者的NP96-5培養(yǎng)物中觀察到非常高水平的1,25(OH)2D。由兩種原代非癌性人的前列腺細(xì)胞產(chǎn)生的1,25(OH)2D的量、即3.08±1.56和1.05±0.31pmol/mg蛋白/小時(shí)(分別為正常的和BPH)與那些在所培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的量(2.1±0.1pmol/mg蛋白/小時(shí)),以及與那些在HEP62)肝癌細(xì)胞系中產(chǎn)生的量(2.3pmol/mg蛋白/小時(shí))和與那些在人T-淋巴營(yíng)養(yǎng)病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生的量(1.6pmol/mg蛋白/小時(shí))相當(dāng)。這些數(shù)值比起那些在其它腎以外的部位中報(bào)道的數(shù)值至少高出10倍,比如人的骨細(xì)胞(0.068pmol/mg蛋白/小時(shí))。在與25(OH)D3一起培養(yǎng)后,DU145和PC-3前列腺癌細(xì)胞系也產(chǎn)生了可以檢測(cè)到的1,25(OH)2D3。由特異性的細(xì)胞色素P450抑制劑克霉唑?qū)?,25(OH)2D產(chǎn)生的100%的抑制表明依賴(lài)于細(xì)胞色素P450的1α-OHase存在于這些前列腺細(xì)胞中。P-450抑制劑的加入基本上抑制了這些細(xì)胞中所有由[3H]-25(OH)D3向[3H]-1,25(OH)2D3的轉(zhuǎn)化。因此,DU145和PC-3這兩種人的前列腺癌細(xì)胞以及來(lái)源于非癌性人的前列腺的兩種原代培養(yǎng)物都具有1α-OHase活性,并且能夠?qū)⒕S生素D3主要的循環(huán)代謝物25(OH)D3轉(zhuǎn)化為具有激素活性的維生素D代謝物1,25(OH)2D3。在前列腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的酶活性與在腎近端小管細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的(5.3-5.6pmol/小時(shí)/mg蛋白)相當(dāng)。由于據(jù)證實(shí)腎臟的1α-OHase為擔(dān)負(fù)著保持1,25(OH)2D的循環(huán)濃度處于正常生理?xiàng)l件之下的主要的酶,因此由前列腺細(xì)胞產(chǎn)生的1,25(OH)2D的量在生理上可以是顯著的,尤其是對(duì)于前列腺細(xì)胞的微環(huán)境而言。低至10-11M的1,25(OH)2D的水平可以通過(guò)由人的羊膜組成的人造基底膜來(lái)明顯地抑制人的前列腺癌細(xì)胞的侵入(Schwartz,G.G.等人《CancerEpidemiol.Biomark.Prev.》6:727-732(1997))。由LNCaP細(xì)胞產(chǎn)生了無(wú)法檢測(cè)到的1,25(OH)2D3。同樣已經(jīng)報(bào)道了24,25-羥化酶的活性在LNCaP中很低或者是檢測(cè)不到的。參見(jiàn)Miller,G.J.《癌癥研究》52:515-520(1992);Skowronski,R.J.《內(nèi)分泌學(xué)評(píng)論》132:1952-1960(1993)。1,25(OH)2D可以通過(guò)前列腺細(xì)胞由25(OH)D合成這一特有的發(fā)現(xiàn)為在癌癥的治療中使用維生素D代謝物提供了關(guān)系,其中所述維生素D的代謝物比起高劑量的維生素D或者包括1,25(OH)2D在內(nèi)的某些其它代謝物具有更低的毒性。包括將維生素D的代謝物向病人給藥的本發(fā)明的方法優(yōu)選用于前列腺癌的化學(xué)預(yù)防當(dāng)中,其中所述的代謝物可以由1α-OHase酶轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D。但是,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)理解到的是鑒于本文所述的原理和步驟,在其它器官或組織中能夠?qū)⒕S生素D的代謝物轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D的癌細(xì)胞可以對(duì)1,25(OH)2D的抗增殖、抗侵入、抗轉(zhuǎn)移或者預(yù)先分化的特性產(chǎn)生響應(yīng)。因此,據(jù)認(rèn)為本發(fā)明可以應(yīng)用于其它的癌細(xì)胞,其中包括結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和淋巴瘤癌細(xì)胞。由給藥的代謝物合成的產(chǎn)物1,25(OH)2D對(duì)正常的和癌性的前列腺細(xì)胞具有抗增殖和預(yù)先分化的作用。此外,生理水平的1,25(OH)2D通過(guò)人造基底膜明顯地抑制了DU145細(xì)胞的侵入,這與Ⅳ型膠原酶(MMP-2和MMP-9)分泌水平的降低有關(guān)。已經(jīng)進(jìn)一步表明1,25(OH)2D對(duì)體內(nèi)前列腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)出抗轉(zhuǎn)移的作用。但是,1,25(OH)2D的給藥由于導(dǎo)致產(chǎn)生了高血鈣的作用,因此具有特別不利之處。因此,由于這種高血鈣的危險(xiǎn),所以本領(lǐng)域技術(shù)人員并不認(rèn)為1,25(OH)2D是安全地用作化學(xué)預(yù)防劑的首選。我們目前的發(fā)現(xiàn)表明通過(guò)增加可利用的底物,例如將25(OH)D向病人給藥或補(bǔ)充,可以實(shí)現(xiàn)由前列腺細(xì)胞局部地合成1,25(OH)2D,從而使得可為前列腺細(xì)胞利用的活性代謝物1,25(OH)2D的水平增加,并因而降低癌性前列腺細(xì)胞的增殖、侵入或轉(zhuǎn)移活性并促進(jìn)其分化。正如本文所述的那樣,25(OH)D及其類(lèi)似物和衍生物在若干臨床狀況下可能是有用的,例如在減緩或預(yù)防在處于“警惕等待”的男人中對(duì)前列腺切除術(shù)或放療的需要和/或減緩或預(yù)防在患有最低殘留疾病的男人中疾病復(fù)發(fā)的過(guò)程中。與維生素D或其它維生素D的更易溶于脂肪的代謝物或類(lèi)似物相比,維生素D的代謝物25(OH)D以更少的比例有利地儲(chǔ)存在身體的脂肪中。此外,25(OH)D省略了肝臟的25-羥基化作用。因此,其作用的起始和抵銷(xiāo)要比維生素D更快。另外在早期膽汁性肝硬變或某些新生兒低血鈣的病例中,當(dāng)存在著維生素D2或D3在肝臟中的25-羥基化作用的折衷方法時(shí),25(OH)D可以是有效的。另外,25(OH)D可能具有一些固有的激動(dòng)劑活性,它可以在缺少腎臟1α-OHase系統(tǒng)的情況下保留一定水平的功效。所述的方法(其中包括將25(OH)D或其類(lèi)似物、衍生物、鹽或功能等同物給藥的優(yōu)選方法)并不限于前列腺細(xì)胞的治療。那些具有1α-OHase的細(xì)胞也可以將25(OH)D轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D,從而增加了1,25(OH)2D最終產(chǎn)品的局部細(xì)胞水平。那些還具有結(jié)合1,25(OH)2D的VDRs或其功能等同物的細(xì)胞可以對(duì)所述化合物產(chǎn)生響應(yīng)并且從其抗增殖、抗侵入、抗轉(zhuǎn)移以及預(yù)先分化的作用中得到了益處。例如,由于其本來(lái)或者通過(guò)采用本領(lǐng)域眾所周知的基因工程技術(shù)具有1α-OHase和VDRs,因此結(jié)腸或者乳腺細(xì)胞可以對(duì)1,25(OH)2D產(chǎn)生響應(yīng)。在以上說(shuō)明中向宿主給藥的劑量將取決于疾病或病癥的特性、涉及的病人的類(lèi)型、其年齡、體重、健康狀況、同時(shí)治療的種類(lèi)(如果有的話(huà))、治療的頻率以及治療比。本發(fā)明的化合物可以根據(jù)用于制備藥物有用的組合物的公知方法來(lái)配制。在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的并且易于得到的許多來(lái)源中詳細(xì)地描述了配制方法。例如,由E.W.Martin編寫(xiě)的《Remington’s藥物科學(xué)》描述了可以在本發(fā)明中使用的制劑。一般說(shuō)來(lái),為了有助于將所述組合物有效地給藥,將這樣配制本發(fā)明的組合物,以便將有效量的生物活性化合物與合適的載體結(jié)合起來(lái)。根據(jù)本發(fā)明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用這樣的藥物組合物,該藥物組合物含有作為活性成分的有效量的一種或多種所述化合物以及一種或多種無(wú)毒的藥物可接受的載體或稀釋劑。另外,所述的藥物組合物可以含有作為第一活性成分的一種或多種所述化合物(例如25(OH)D),再加上第二種活性成分(例如本領(lǐng)域公知的抗炎、抗微生物、抗增殖或抗病毒化合物)。根據(jù)本發(fā)明,將藥物有效量的公知的第二種活性成分和在本發(fā)明中有用的維生素D的代謝物或其類(lèi)似物或衍生物依次或者同時(shí)向病人給藥。最有效的給藥模式和所述化合物的劑量方案將取決于將要治療的疾病的類(lèi)型、所述疾病的嚴(yán)重程度和病程、以前的治療方法、病人的健康狀況、對(duì)維生素D代謝物、類(lèi)似物和衍生物的響應(yīng)以及治療醫(yī)師的判斷??梢詫⑺鼋M合物一次或者在一系列的治療中向病人給藥。優(yōu)選地,將所述的化合物和第二種藥劑依次向病人給藥,其中將第二種藥劑在用所述的化合物或組合物治療之前、治療之后或者在治療前和治療后給藥。依次給藥包括至少在用所述維生素D代謝物治療的同一天里(24小時(shí)之內(nèi))用第二種藥劑治療,并且可以包括在未將所述化合物給藥的時(shí)間用第二種藥劑連續(xù)的治療。與其它用于治療的化合物類(lèi)似,可以采用對(duì)所述化合物或含有所述化合物的藥物組合物而言常規(guī)的給藥模式和標(biāo)準(zhǔn)的劑量方案(參見(jiàn)Gilman,A.G.等人編輯,《治療劑的藥理學(xué)基礎(chǔ)》第697-713頁(yè),1482,1489-91(1980);《醫(yī)師手冊(cè)》1986年版),或者可以對(duì)單個(gè)的病人滴定來(lái)確定。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案,病人可以接受用包含至少一種所述化合物和第二種活性成分的組合物進(jìn)行同時(shí)的治療。例如,局部、組織內(nèi)(或器官)注射25(OH)D或其類(lèi)似物或衍生物是優(yōu)選的,但是可以通過(guò)皮下注射、皮下緩釋植入、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部、肌內(nèi)或口服給藥。在這些治療中使用的組合物也可以是多種形式的。這些包括例如固體、半固體和液體的劑量形式,諸如片劑、丸劑、粉劑、液態(tài)溶液或懸浮液、栓劑、可以注射的和可以輸注的溶液。優(yōu)選的形式取決于計(jì)劃的給藥方式和治療應(yīng)用。所述組合物還優(yōu)選含有為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的常規(guī)的藥物可接受的載體和佐劑。優(yōu)選地,本發(fā)明的組合物呈單位劑量的形式并且通常每天向病人給藥一次或多次?;蛑委煷送?,本發(fā)明可以采用利用分子生物學(xué)的技術(shù)或步驟的基因治療的方法,從而通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法為靶細(xì)胞提供編碼起到結(jié)合1,25(OH)2D的維生素D受體(VDRs)作用的一種或多種蛋白的基因,在遺傳上改變靶細(xì)胞或器官以便對(duì)活性維生素D的代謝物或其類(lèi)似物和衍生物(例如1,25(OH)2D)產(chǎn)生響應(yīng)。另一方面,可以通過(guò)遺傳工程改造靶細(xì)胞以便編碼和產(chǎn)生1α-OHase,該酶公知可以將25(OH)D轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D。采用標(biāo)準(zhǔn)的探針和測(cè)序技術(shù)可以鑒定出感興趣的基因,將該基因克隆或者以別的方式擴(kuò)增、分離并插入到合適的載體中以便轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。另外,可以為靶細(xì)胞提供啟動(dòng)子序列,所述啟動(dòng)子序列激活了靶細(xì)胞基因組中所述合適的基因序列,以便構(gòu)建細(xì)胞以產(chǎn)生所需的蛋白或啟動(dòng)子。本發(fā)明的基因治療方法可以用作一種治療或預(yù)防癌癥的方法。正如本文所使用的那樣,這類(lèi)癌癥包括、但卻不限于霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、維爾姆斯瘤、睪丸癌、軟組織肉瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、原發(fā)性巨球蛋白血癥、膀胱癌、慢性粒細(xì)胞白血病、原發(fā)性腦癌、惡性黑素瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰島瘤、惡性類(lèi)癌、惡性黑瘤、絨毛膜癌、蕈樣肉芽腫、頭頸癌、骨原性肉瘤、胰腺癌、急性粒細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血病、橫紋肌肉瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、泌尿生殖器癌、甲狀腺癌、食管癌、惡性高血鈣癥、腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌。紅細(xì)胞增多癥、自發(fā)性血小板增多、腎上腺皮質(zhì)癌、皮膚癌以及前列腺癌。在本發(fā)明的這一優(yōu)選實(shí)施方案中,可以將1α-OHaseDNA(例如,在SEQIDNO.1中所示的核酸序列)摻入適合于將所述核酸分子引入到接受治療動(dòng)物的細(xì)胞中的多核苷酸構(gòu)建體中,以便形成轉(zhuǎn)染載體。然后采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的多種方法中的任意一種方法,將轉(zhuǎn)染載體在體內(nèi)引入到動(dòng)物細(xì)胞選出的靶組織中。另一方面,可以采用或者不采用陽(yáng)離子脂質(zhì)將未經(jīng)修飾的DNA轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞中。在現(xiàn)有技術(shù)中,用于構(gòu)建含有1α-OHaseDNA的轉(zhuǎn)染載體的技術(shù)是眾所周知的,并且通常在下列文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述《重組DNA》,第2版第28章中的“針對(duì)人類(lèi)基因治療的工作”Watson,J.D.等人編輯,美國(guó)科學(xué)圖書(shū)出版社紐約(1992),第567-581頁(yè);或者Sambrook等人《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》冷泉港,紐約(1989)??梢杂糜谒瓦fVDR和/或1α-OHase基因的基因治療方法包括注射質(zhì)粒DNA(Horton,H.M.等人《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》96(4):1553-1558(1999));采用腺病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)(Waugh,J.M.等人《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》96(3):1065-1070(1999));采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)(Axelrod,J.H.等人《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》87:5173-5177(1990);Drumm,M.L.等人《細(xì)胞》62:1227-1233(1990);Krueger,G.G.等人《皮膚病學(xué)研究雜志》112:233-239(1999);Palmer,T.D.等人《血液》73:438-445(1989);以及Rosenberg,S.A.等人《英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)雜志》323:570-578(1990));以及采用脂質(zhì)體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移(Mason,C.A.E.等人《自然醫(yī)學(xué)》5(2):176-182(1999))。另外,在以上引用的出版物中可以得到出于治療目的的用來(lái)構(gòu)建基因治療載體和將這類(lèi)載體引入哺乳動(dòng)物的常用方法,其中這些出版物公開(kāi)的內(nèi)容具體地插入本文僅供參考。在這樣一種常用的方法中,將含有本發(fā)明1α-OHaseDNA的載體直接引入到接受治療的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或組織中,其中優(yōu)選通過(guò)注射、吸入、攝入、局部施用或者通過(guò)溶液引入到粘膜中。這樣的一種方法通常稱(chēng)作“體內(nèi)”基因治療。另一方面,可以從接受治療的哺乳動(dòng)物中取出細(xì)胞或組織并且根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的方法將它們進(jìn)行培養(yǎng)。然后通過(guò)以上綜述的用于將分離的多核苷酸引入到細(xì)胞或組織中的任意方法,可以將含有1α-OHaseDNA的轉(zhuǎn)染載體或未經(jīng)修飾的DNA引入這些細(xì)胞或組織中。在經(jīng)過(guò)了足夠的時(shí)間以使1α-OHaseDNA摻入后,然后可以將細(xì)胞或組織重新插入到接受治療的哺乳動(dòng)物中。由于1α-OHase基因的引入是在哺乳動(dòng)物的體外進(jìn)行的,因此該方法通常稱(chēng)作“來(lái)自體內(nèi)的”基因治療(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,399,346)??梢圆捎枚喾N方法進(jìn)行通過(guò)轉(zhuǎn)染來(lái)自體內(nèi)的細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移,所述的方法例如包括磷酸鈣沉淀、二乙氨基乙基葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或病毒感染。這類(lèi)方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的(參見(jiàn)例如Sambrook等人)。正如本文就1α-OHase而言所使用的術(shù)語(yǔ)“基因”意指編碼1α-OHase酶的DNA序列。因此,“1α-OHase基因”或“表達(dá)1α-OHase的基因”可以指編碼1α-OHase酶的基因組DNA的區(qū)段或者指編碼1α-OHase酶的cDNA序列。對(duì)于體內(nèi)和來(lái)自體內(nèi)的基因治療兩者而言,可以將本發(fā)明的1α-OHaseDNA可操作地連接到針對(duì)人1α-OHase的調(diào)節(jié)DNA序列或“啟動(dòng)子”上(在SEQIDNO.3中所示)以形成如上所述的遺傳構(gòu)建體。可以將該構(gòu)建體(含有人的1α-OHase啟動(dòng)子和1α-OHaseDNA兩者)亞克隆到合適的載體(如質(zhì)粒、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等)中,并且在體內(nèi)基因治療方法中引入到接受治療的動(dòng)物中,或者在來(lái)自體內(nèi)的方法中引入到哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或組織中。另一方面,可以將本發(fā)明的1α-OHaseDNA可操作地連接到異源調(diào)節(jié)DNA序列或啟動(dòng)子上以形成如上所述的遺傳構(gòu)建體。異源調(diào)節(jié)序列可以是組織特異性的。然后如上所述將含有所述遺傳構(gòu)建體的載體直接引入到接受治療的動(dòng)物或所述動(dòng)物的細(xì)胞或組織中。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”表示調(diào)節(jié)序列(通常為啟動(dòng)子元件,但可以包括增強(qiáng)子元件)與所述基因之間的一種關(guān)系,從而基因的轉(zhuǎn)錄處于調(diào)節(jié)區(qū)的控制之下。術(shù)語(yǔ)“異源”是指在天然的基因組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的DNA序列。即,如果兩個(gè)核酸元件來(lái)源于兩個(gè)不同的基因或者來(lái)源于兩個(gè)不同的物種,那么就說(shuō)這兩個(gè)元件是“異源”的。因此,“異源DNA調(diào)節(jié)序列”表示所述的調(diào)節(jié)序列并不是天然地連接在1α-OHase基因的DNA序列上的。根據(jù)本領(lǐng)域公認(rèn)的含義來(lái)使用術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”。它意指這樣的DNA區(qū)域,該區(qū)域通常位于基因編碼序列的下游,它結(jié)合RNA聚合酶并指導(dǎo)該酶校正轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。一般說(shuō)來(lái),啟動(dòng)子可以在多種組織類(lèi)型以及在生物體的若干不同物種中發(fā)揮作用,或者其功能可以被限制到特定的物種和/或特定的組織。此外,啟動(dòng)子可能在組成上就具有活性,或者在某些條件下(例如,在存在增強(qiáng)子元件的情況下,如果存在的話(huà),其位于含啟動(dòng)子的遺傳構(gòu)建體中)或在生物體某些發(fā)育階段的過(guò)程中(例如,在胎兒中具有活性,而在成人中卻沉默)它可以被某些物質(zhì)(例如,組織特異性因子)選擇性地激活。在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中有用的啟動(dòng)子優(yōu)選是“組織特異性的”一即,它們能夠驅(qū)動(dòng)基因在一種組織中轉(zhuǎn)錄,而在其它的組織類(lèi)型中則大體上保持“沉默”。在下面的表2中提供了組織特異性啟動(dòng)子的例子。<tablesid="table3"num="003"><table>輕神經(jīng)絲(NF-L)大鼠神經(jīng)元36色氨酸羥化酶(TH)人血清素/松果腺37小鼠*38浦肯野細(xì)胞蛋白-2(Pcp-2)小鼠浦肯野細(xì)胞/小腦39L7小鼠小腦浦肯野視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞40Ⅱ型鈉通道大鼠神經(jīng)元41膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)人膽堿能神經(jīng)元42大鼠*43神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)大鼠神經(jīng)元44芳族L-氨基酸脫羧酶(AADC)人兒茶酚胺能/5-HT/D型細(xì)胞45魚(yú)精蛋白1(mPl)小鼠精子細(xì)胞46腦啡肽原人神經(jīng)元的/產(chǎn)生精子的附睪細(xì)胞47大鼠*48礫質(zhì)沙漠(reg)(胰石蛋白)人結(jié)腸與直腸腫瘤,胰,腎49與甲狀旁腺激素相關(guān)的肽(PTHrP)人肝臟與盲腸腫瘤,神經(jīng)鞘瘤,腎,胰,腎上腺50溶基質(zhì)素3人乳腺癌51NSE(參見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng))*小細(xì)胞肺癌,神經(jīng)元52AADC(參見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng))*神經(jīng)外皮層腫瘤53白蛋白*肝癌54c-erbB3*乳腺癌*c-erbB4*乳腺癌與胃癌*甲狀腺球蛋白*甲狀腺癌α-胎蛋白*肝癌55血紅蛋白*紅細(xì)胞56</table></tables>簡(jiǎn)寫(xiě)br,大腦;B,淋巴細(xì)胞;mu,骨骼??;he,心?。籺e,睪丸;β,β細(xì)胞;th,胸腺;lu,肺;Pa,外分泌胰腺;ys,卵黃囊;li,肝;ery,類(lèi)紅細(xì)胞;pit,垂體;以及晶狀體,眼睛的晶狀體。參考文獻(xiàn)(1)Shani,《分子細(xì)胞生物學(xué)》,6:2624(1986);(2)Swift等人.,《細(xì)胞》38:639(1984);(3)Krumlauf等人.,《自然》319:224(1985);(4)Townes等人.,EMBoJ.4:1715(1985);(5)Lacy等人.,《細(xì)胞》34:343(1983):(6)Wagner等人,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》,78:6376(1981);(7)Brinster等人.,《自然》283:499(1980);(8)Rusconi等人.,在“真核細(xì)胞生物學(xué)中基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的影響”J.S.Schell等人編輯,第134-152頁(yè),柏林SpringerVerlag(1984);(9)Behringer等人.,《基因進(jìn)展》2:453(1988);(10)Storb等人.,《自然》310:238(1984);(11)Grosschedl等人.,《細(xì)胞》38:647(1984);(12)Selden等人.,《自然》321:545(1986);(13)Shani,《自然》314:283(1985);(14)Peschon等人.,Ann.N.YorkAcad,Sci.,564:186(1989);(15)Breitman等人.,Dev.106:457(1989);(16)Crenshaw等人.,《基因與發(fā)育》3:959(1989);(17)Tremblay等人.,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》85:8890(1988);(18)Tatsumi等人.,NipponRinsho47:2213(1989);(19)Muller等人.,《細(xì)胞》54:105(1988);(20)Palmiter等人.,遺傳學(xué)年度回顧20:465(1986);(21)Vassar等人.,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》86:8565(1989);(22)McVey等人.,《生物化學(xué)雜志》263:1l(1988);(23)Allison等人.,《分子細(xì)胞生物學(xué)》9:2254(1989);(24)Danciger等人.,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》86:8565(1989);(25)Forss-Petter等人.,《神經(jīng)科學(xué)研究雜志》16:141(1986);(26)Sutcliffe《遺傳學(xué)趨勢(shì)》3:73(1987);(27)Nathans等人.,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》81:4851(1984);(28)BrennerM.等人.,《神經(jīng)科學(xué)雜志》14:1030(1994);(29)Kim,L.S.,等人.,《生物化學(xué)雜志》268:15689(1993);(30)Kaneda,N.,等人.,《神經(jīng)元》6:583(1991);(31)Salbaum,J.M.,等人.,EMBOJ.7:2807(1988);(32)Wirak,D.O.,等人.,EMBOJ.10:289(1990);(33)MercerE.H.,等人.,《神經(jīng)元》7:703(1991);(34)Hcyle,G.W.,等人.,《神經(jīng)科學(xué)雜志》14:2455(1994);(35)Miura,M.,等人.,《基因》75:31(1989);(36)Reeben,M.,等人.,《神經(jīng)科學(xué)研究雜志》40:177(1995);(37)Boularand,S.,等人.,《生物化學(xué)雜志》270:3757(1995);(38)Stoll,J.與Goldman,D.,《神經(jīng)科學(xué)研究雜志》28:457(1991);(39)Vandaele,S.,等人.,《基因與發(fā)育》5:1136(1991);(40)Oberdick,J.,等人.,《科學(xué)》248:223(1990);(41)Maue,R.A.,等人.,《神經(jīng)元》4:223(1990);(42)Hersh,L.B.,等人.,《神經(jīng)化學(xué)雜志》61:306(1993);(43)Ibanex,C.F.與Persson,H.,《歐洲神經(jīng)科學(xué)雜志》3:1309(1991);(44)Forss-Petter,S.,等人.,《神經(jīng)元》5:187(1990);(45)Thai,A.L.V.,等人.,《分子大腦研究》17:227(1993);(46)Peschon,J.J.,等人.,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》84:5316(1987);(47)Borsook,D.,等人.,《分子內(nèi)分泌學(xué)》6:1502(1992);(48)Joshi,J.與Sabol,S.L.,《分子內(nèi)分泌學(xué)》5:1069(1991);(49)Watanabe,T.,等人.,《生物化學(xué)雜志》265:7432(1990);(50)Campos,R.V.,等人.,Mol.Rnfovtinol.6:1642(1992);(51)Basset,P.,等人.,《自然》348:699(1990);(52)Bombardieri,E.等人.,《歐洲癌癥雜志》3lA:184(1995);Koh,T.等人.,Int.J.Cancer60:843(1995);(53)Thai,A.L.V.,等人.,《分子大腦研究》17:227(1993);(54)Huber,B.E.,PNAS88:8099(1991);(55)Zuibel,I.,等人.,《細(xì)胞生理學(xué)雜志》162:36(1995);(56)Watanabe,T.,等人.,《生物化學(xué)雜志》265:7432(1990)。對(duì)于組織特異性啟動(dòng)子的其它例子,參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,834,306和US5,416,027以及其中所引用的參考文獻(xiàn)。除了啟動(dòng)子以外,所述的遺傳構(gòu)建體也可以含有其它遺傳控制元件(比如增強(qiáng)子、阻遏序列和沉默子),它們可以用來(lái)調(diào)節(jié)載體在靶細(xì)胞中的復(fù)制。僅僅需要的是遺傳元件被宿主細(xì)胞中的并且就治療方法而言并非非靶細(xì)胞中的因子所激活、阻抑、增強(qiáng)或者以其它的方式進(jìn)行遺傳上的調(diào)節(jié)。當(dāng)在述及核酸構(gòu)建體的上下文中使用時(shí),“元件”是指具有定義的功能的構(gòu)建體或核酸片段的區(qū)域。例如,本文所使用的增強(qiáng)子元件為這樣一種DNA的區(qū)域,當(dāng)與可操作地連接到啟動(dòng)子上的1α-OHase基因相關(guān)時(shí),該區(qū)域增強(qiáng)了所述基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)在現(xiàn)有技術(shù)中公認(rèn)的含義來(lái)使用術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)子”。它意指在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一種序列,當(dāng)位于其中時(shí)(以任一取向)該序列可以由正在研究的基因增加基因的轉(zhuǎn)錄到高達(dá)幾千個(gè)堿基。當(dāng)位于所述基因的5’一側(cè)(上游)時(shí),這些序列通常起到增強(qiáng)子的作用。但是,當(dāng)位于該基因的3’一側(cè)(下游)時(shí),一些增強(qiáng)子也是具有活性的。在一些情況下,增強(qiáng)子元件可以激活沒(méi)有(具有已知的)啟動(dòng)子的基因的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選的增強(qiáng)子包括DF3乳腺癌特異性增強(qiáng)子以及來(lái)自病毒和甾類(lèi)受體家族的增強(qiáng)子。其它優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括NF1,SP1,AP1和FOS/JUN??梢圆捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的多種方法中的任意一種將本發(fā)明的轉(zhuǎn)染載體引入到選出的靶組織細(xì)胞中。這類(lèi)方法例如包括采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒、痘苗病毒或RNA病毒進(jìn)行的病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(例如Grunhaus與Horowitz《Semin.Virol.》3:237-252(1992);Herz與Gerard《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》90:2812-2816(1993);以及Rosenfeld等人《細(xì)胞》68:143-155(1992));脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Morishita等人《臨床研究雜志》91:2580(1993);Felgner等人,美國(guó)專(zhuān)利US5,703,055(1997)和US5,858,784(1999));將未經(jīng)修飾的DNA直接注射到靶組織中(例如Felgner等人,美國(guó)專(zhuān)利US5,589,466(1996);Wolff等人,美國(guó)專(zhuān)利US5,693,622(1997));以及受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Wu與Wu《生物化學(xué)》27:887-892(1988);Wagner等人《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》87:3410-3414(1990);Curiel等人,美國(guó)專(zhuān)利US5,547,932(1996);以及Beug等人,美國(guó)專(zhuān)利US5,354,844(1994))。在這些方法的任一方法中,當(dāng)可以靶向載體以便選擇性地轉(zhuǎn)染特定的細(xì)胞群體時(shí),據(jù)說(shuō)除了局部給藥(比如可以通過(guò)注射到靶組織中來(lái)實(shí)現(xiàn))之外,還可以在生物相容的溶液或藥物可接受的送遞載體中將所述載體進(jìn)行全身給藥(例如,靜脈內(nèi)給藥)。以這種方式給藥的載體構(gòu)建體可以選擇性地感染靶組織。根據(jù)本發(fā)明,構(gòu)建體中靶組織特異性啟動(dòng)子的存在提供了限制治療基因表達(dá)的獨(dú)立的工具。本發(fā)明基因治療的實(shí)施方案提供了一種治療或預(yù)防許多疾病和病癥的方法。例如,可以采用該實(shí)施方案來(lái)治療或預(yù)防表達(dá)維生素D受體(VDR)的細(xì)胞中的癌癥。將含有編碼1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體引入癌細(xì)胞中,其中該基因隨后被表達(dá),從而產(chǎn)生了有效量的1α-OHase以抑制細(xì)胞的增殖。也可以將編碼VDR的基因(例如,在SEQIDNO.4中所示的核苷酸序列)與1α-OHase的基因共同給藥。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中,如上所述,將VDR基因或者亞克隆到1α-OHase基因的同一多核苷酸構(gòu)建體上,或者亞克隆到不同的多核苷酸構(gòu)建體上。然后將這兩種基因都引入到靶細(xì)胞或組織中,從而所述基因隨后被表達(dá),產(chǎn)生了有效量的1α-OHase和VDR以治療或預(yù)防病癥。采用表達(dá)1α-OHase的基因和任選的表達(dá)VDR的基因進(jìn)行的基因治療基本上可以與維生素D或其類(lèi)似物或衍生物的給藥同時(shí)進(jìn)行。因此,可以在接受基因治療之前、該過(guò)程中或者之后將維生素D或其類(lèi)似物或衍生物向動(dòng)物給藥。具體地講,可以采用本發(fā)明來(lái)治療或預(yù)防前列腺癌、乳腺癌、皮膚癌、結(jié)腸癌、白血病、淋巴瘤和肺癌。本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防其中的1,25(OH)2D3能夠影響細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟的任何疾病的方法,其中包括前期癌癥(如光化性角化病)以及非癌性過(guò)度增殖性疾病(如牛皮癬和鱗癬)。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中,將含有編碼1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體引入到其中的1,25(OH)2D3能夠影響細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟的細(xì)胞中。1α-OHase基因隨后被表達(dá),產(chǎn)生了有效量的1α-OHase以抑制細(xì)胞的增殖。因此,本發(fā)明可以用于光化性角化病的治療中,該疾病為一種前期皮膚癌。采用本發(fā)明將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中1,25(OH)2D3(或其類(lèi)似物或衍生物)量的增加,從而降低了增殖的活性并誘導(dǎo)所述細(xì)胞分化為正常的形態(tài)。此外,本發(fā)明還可以用于治療皮膚的過(guò)度增殖性疾病(如牛皮癬)。該基因治療方法是一種合理的另一種治療牛皮癬的方法,因而細(xì)胞將會(huì)產(chǎn)生或者促進(jìn)其產(chǎn)生1,25(OH)2D3(或其類(lèi)似物或衍生物),而該物質(zhì)接下來(lái)將會(huì)與VDR進(jìn)行相互作用并降低增殖的活性,從而使得皮膚細(xì)胞正常起來(lái)。也可以將這種治療應(yīng)用到其它過(guò)度增殖性皮膚病(如鱗癬)中。本發(fā)明也可以用于治療或預(yù)防鈣和骨骼代謝方面的疾病??梢詫⒑芯幋a1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體再引入到動(dòng)物的一群細(xì)胞中,其中所述基因隨后被表達(dá),從而使得這些細(xì)胞以類(lèi)似于腎臟的方式產(chǎn)生1,25(OH)2D3(或其類(lèi)似物或衍生物)。因此,本發(fā)明可以用來(lái)預(yù)防與腎衰竭有關(guān)的骨骼疾病并且治療維生素D依賴(lài)型Ⅰ型佝僂病、X連鎖血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病、維生素D依賴(lài)型Ⅱ型佝僂病和骨質(zhì)疏松癥、以及由于甲狀旁腺機(jī)能減退導(dǎo)致血清中低血鈣而形成的鈣和骨骼代謝方面的疾病。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種通過(guò)將編碼VDR的基因以及編碼1α-OHase的基因向動(dòng)物的靶細(xì)胞或組織給藥來(lái)治療或預(yù)防上述任何疾病或病癥(包括癌癥在內(nèi))的方法。如上所述,這兩種基因都可以被亞克隆到相同的或不同的多核苷酸構(gòu)建體上,從而被引入到靶細(xì)胞或組織中。1α-OHase基因和VDR基因兩者隨后都被表達(dá),從而產(chǎn)生了有效量的1α-OHase和VDR以便治療或預(yù)防所述的病癥。通過(guò)表達(dá)VDR或者已經(jīng)不表達(dá)VDR的細(xì)胞,可以采用這一具體的實(shí)施方案。在前面的情況下(其中的靶細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)VDR),細(xì)胞將會(huì)產(chǎn)生額外的VDR,而VDR將與細(xì)胞濃度有所增加的1,25(OH)2D(或其類(lèi)似物或衍生物)發(fā)生相互作用。在后面的情況下(其中的細(xì)胞已經(jīng)不表達(dá)VDR了),細(xì)胞將會(huì)變得對(duì)1,25(OH)2D(或其類(lèi)似物或衍生物)有響應(yīng)。例如,根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案,可以治療或缺陷VDR或缺少VDR的癌細(xì)胞。然后,接受治療的細(xì)胞將產(chǎn)生VDR,接下來(lái)VDR將與由1α-OHase產(chǎn)生的1,25(OH)2D(或其類(lèi)似物或衍生物)發(fā)生相互作用。該相互作用導(dǎo)致了生物響應(yīng)(包括抑制了增殖和誘導(dǎo)了最終的分化),從而治療了癌癥、前期癌癥、非癌性過(guò)度增殖性疾病、促進(jìn)了傷口的愈合并且治療和預(yù)防了脫發(fā)。本發(fā)明還提供了一種通過(guò)向呈現(xiàn)出良性前列腺增生的細(xì)胞中引入含有編碼1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體來(lái)治療動(dòng)物中的良性前列腺增生的方法。1α-OHase基因隨后被表達(dá),從而使得所述細(xì)胞產(chǎn)生了有效量的1,25(OH)2D(或其類(lèi)似物)以治療良性前列腺增生。在該實(shí)施方案中,如上所述也可以將編碼VDR的基因與1α-OHase基因共同給藥。表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)VDR的基因可以位于同一DNA構(gòu)建體上或者位于不同的DNA構(gòu)建體上。本發(fā)明還提供了一種通過(guò)向?qū)?huì)產(chǎn)生有益結(jié)果的動(dòng)物的任何細(xì)胞中引入含有編碼1α-OHase的基因的多核苷酸構(gòu)建體來(lái)治療動(dòng)物中的自身免疫病的方法。1α-OHase基因隨后被表達(dá),從而使得所述細(xì)胞產(chǎn)生了有效量的1,25(OH)2D(或其類(lèi)似物)以治療自身免疫病。在該實(shí)施方案中,如上所述也可以將編碼VDR的基因與1α-OHase基因共同給藥。表達(dá)1α-OHase的基因和表達(dá)VDR的基因可以位于同一DNA構(gòu)建體上或者位于不同的DNA構(gòu)建體上??梢圆捎帽景l(fā)明來(lái)治療自身免疫病,比如Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬性關(guān)節(jié)炎。在該實(shí)施方案中,例如通過(guò)將含有1α-OHase基因(和任選的VDR基因)的多核苷酸構(gòu)建體引入到將會(huì)產(chǎn)生有益結(jié)果的動(dòng)物的任何細(xì)胞中(特別是引入胰細(xì)胞中,更為特別的是引入到分泌胰島素的胰細(xì)胞(比如胰島細(xì)胞)中),可以治療Ⅰ型糖尿病。對(duì)于采用本發(fā)明來(lái)治療多發(fā)性硬化病來(lái)說(shuō),可以將含有1α-OHase基因(和任選的VDR基因)的多核苷酸構(gòu)建體具體入到將會(huì)產(chǎn)生有益結(jié)果的任何神經(jīng)細(xì)胞中。類(lèi)似地,對(duì)于采用本發(fā)明來(lái)治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬性關(guān)節(jié)炎來(lái)說(shuō),可以將所述的多核苷酸構(gòu)建體具體地引入到將會(huì)產(chǎn)生有益結(jié)果的任何結(jié)締組織細(xì)胞中或者由所述疾病之一感染的動(dòng)物關(guān)節(jié)之中或附近。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括分離的核酸分子,所述的核酸分子與上述本發(fā)明的分離的核酸分子至少有90%是相同的,并且更優(yōu)選至少有95%、97%、98%或99%是相同的。特別是,本發(fā)明的目的在于與在SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列之間至少有90%、95%、97%、98%或99%相同的分離的核酸分子。兩個(gè)核酸序列之間“同一性%”可以采用帶有缺省參數(shù)的“fastA”計(jì)算機(jī)算法來(lái)確定(Pearson,W.R.&Lipman,D.J.《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》85:2444(1988))。術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸分子”意指一種已經(jīng)從其天然環(huán)境中取出的核酸分子。例如,包含于載體中的重組DNA分子被認(rèn)為是出于本發(fā)明的目的而分離的在異源宿主細(xì)胞中維持的重組DNA分子或者在溶液中(部分或基本上)純化的DNA分子。分離的多核苷酸分子還包括通過(guò)合成產(chǎn)生的這類(lèi)化合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這樣的核酸分子,所述的核酸分子能夠在嚴(yán)格條件下與具有互補(bǔ)于SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中所示核酸序列之一的序列的核酸分子雜交或者與SEQIDNO.1和SEQIDNO.3中所示核酸序列之一直接雜交。“嚴(yán)格條件”意指在42℃下在含有50%甲酰胺、5xSSC(750mMNaCl,15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切鮭精DNA(ssDNA)的溶液中培養(yǎng)過(guò)夜,接下來(lái)在大約65℃下在0.1xSSC中洗滌濾膜。下面為說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的步驟的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)構(gòu)成一種限制。除非另作聲明的以外,所有的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù),并且所有溶劑混合物的比例均為體積比。實(shí)施例1在通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)由25(OH)D細(xì)胞培養(yǎng)合成1,25(OH)2D的過(guò)程中使用的材料和方法(A)細(xì)胞系。DU145,PC-3和LNCaP細(xì)胞系是從馬里蘭州Rockville的美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所中獲得的。測(cè)試了所有的細(xì)胞系并且發(fā)現(xiàn)不含支原體的污染物。(B)培養(yǎng)條件。在體外培養(yǎng)幾代前列腺癌細(xì)胞系。在完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有胎牛血清(10%,HyCloneLabs,LoganUT)和慶大霉素(10μg/ml,生命技術(shù)公司,Gaithersburg,MD)的RPMI1640培養(yǎng)基)中常規(guī)地培養(yǎng)細(xì)胞。在35mm的培養(yǎng)皿(Corning-Costar,Cambridge,MA)中以1X105個(gè)細(xì)胞/平皿的量將細(xì)胞接種在完全培養(yǎng)基中。在加入25(OH)D3之前的24小時(shí)時(shí),將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基(含胰島素(10μg/ml)、運(yùn)鐵蛋白(10μg/ml)和亞硒酸(1ng/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基)。如Lokeshwar等人(《癌癥研究》53:4493-4498(1993))所述,確定并且描述了人的前列腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)物的特征。當(dāng)通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法采用抗細(xì)胞角蛋白抗體CAM5.2(Becton-Dickinson,MountainView,CA)檢測(cè)時(shí),在不合血清的規(guī)定培養(yǎng)基(乳房上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEGM),Clontech,SanDiego,CA)中培養(yǎng)的前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)了腔上皮特異性細(xì)胞角蛋白(細(xì)胞角蛋白8和18)。所述不合血清的培養(yǎng)基含有補(bǔ)充有25ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、0.5μg/ml氫化可的松、1X10-4乙醇胺、5μg/ml胰島素、5μg/ml運(yùn)鐵蛋白和70μg/ml整牛垂體提取物的MCDF170。所使用的前列腺細(xì)胞為其第一代體外培養(yǎng)物,并且在與維生素D代謝物一起培養(yǎng)的過(guò)程中是在不含血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。研究了下列兩種原代培養(yǎng)物由在組織學(xué)方面正常的年齡為23歲的白種人器官捐獻(xiàn)者的前列腺培養(yǎng)出的NP96-5,以及由患有BPH的年齡為56歲的白種人切下的前列腺切除術(shù)樣品培養(yǎng)的BPH96-11。取自用于培養(yǎng)的樣品的鄰近組織切片的組織學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)了它們與正常的或BPH的培養(yǎng)物是一樣的。(C)角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。由于在角質(zhì)細(xì)胞中已經(jīng)明確了1α-OHase的活性,因此采用培養(yǎng)的人的角質(zhì)細(xì)胞與前列腺的培養(yǎng)物進(jìn)行比較。按照Rheinwald和Green方法(《細(xì)胞》6:331-344(1975))的改進(jìn)方法在培養(yǎng)物中培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之,角質(zhì)細(xì)胞是在4℃下通過(guò)胰蛋白酶消化之后從新生兒的包皮中獲得的。將角質(zhì)細(xì)胞平板接種在不合血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)致死照射的3T3成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞之上并且進(jìn)行培養(yǎng),所述的培養(yǎng)基含有0.15mM的鈣并補(bǔ)充有包括牛垂體提取物(3μg/ml)、EGF(25ng/ml)、胰島素(5μg/ml)和前列腺素E1(50ng/ml)在內(nèi)的生長(zhǎng)因子。為了提高平板效率,在最初平板接種原代培養(yǎng)物和接下來(lái)進(jìn)行傳代培養(yǎng)的過(guò)程中,向培養(yǎng)基中添加霍亂毒素(0.1μg/ml)和氫化可的松(200ng/ml)。在沒(méi)有霍亂毒素和氫化可的松的情況下培養(yǎng)和維持細(xì)胞,并且用來(lái)進(jìn)行酶的測(cè)定。(D)25-羥基維生素D-1α-羥化酶(1α-OHase)的測(cè)定。在本文所述的細(xì)胞系和原代培養(yǎng)物的單層培養(yǎng)物中測(cè)定1α-OHase的活性。測(cè)定是在存在作為酶底物的25(OH)D3(50nM)和DPPD(Sigma-Aldrich,Allentown,PA)(一種抗氧化劑和一種公知的產(chǎn)生自由基的抑制劑)的情況下進(jìn)行的。測(cè)定還在存在和缺少細(xì)胞色素P450抑制劑克霉唑(20μM)(Sigma,St.Louis,MO)的情況下進(jìn)行。在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)后,將培養(yǎng)物放置在冰上并且除去培養(yǎng)基。之后立即將1ml甲醇添加到提取的25(OH)D3和1,25(OH)2D3之中。為了計(jì)算回收率,將溶于乙醇的含有1,000cpm放射性的[3H]-1,25(OH)2D3的10μl等分試樣也添加到每個(gè)孔中。在室溫下提取15分鐘后,將甲醇提取物轉(zhuǎn)移到玻璃試管中并且再用0.5ml的甲醇洗滌細(xì)胞。合并提取物和洗滌物,用氮?dú)鈿饬鞲稍?,并且重新溶解?ml乙腈中,接下來(lái)再添加1ml0.4M的K2HPO4,pH10.0。然后將混合物裝入C-18-OH反相柱中。隨后將含有1,25(OH)2D的組分在氮?dú)鈿饬飨赂稍锊⒅匦氯芙庠?00μl的乙醇中。通過(guò)Chen等人所述的胸腺受體結(jié)合測(cè)定(《J.Nutr.Biochem.》1:320-327(1990)),取出兩份40μl的等分試樣進(jìn)行1,25(OH)2D的分析。通過(guò)使用20μg的非放射性25(OH)D3和0.91μCi的[3H]-25(OH)D3、而不是僅僅使用非放射性的25(OH)D3作底物,也可以在前列腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中測(cè)定1α-OHase的活性。培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基、時(shí)間、溫度、提取步驟以及C-18-OH柱層析與胸腺受體方法所描述的都相同,除了從C-18-OH柱中用10%二氯甲烷的己烷溶液洗脫出來(lái)的組分(25(OH)D組分)和用6%異丙醇的正己烷溶液洗脫出來(lái)的組分(1,25(OH)2D和24,25(OH)2D組分)是在氮?dú)庵懈稍锏牟⑶抑匦氯芙庠诙燃淄椤卯惐?19∶1)之中,以便進(jìn)行如下所述的高效液相層析的分析。(E)高效液相層析(HPLC)。將30μl的等分試樣與各10μl標(biāo)準(zhǔn)的非放射性25(OH)D和1,25(OH)2D混合,并裝入Econosphere二氧化硅柱(顆粒大小為5μ,250mmx4.6mm)中,其流速為0.5ml/分鐘并采用二氯甲烷∶異丙醇(19∶1)溶劑系統(tǒng)為流動(dòng)相。從每個(gè)HPLC中以1分鐘的時(shí)間間隔收集30個(gè)組分。用空氣使組分蒸發(fā)至干,接下來(lái)添加閃爍液并用β計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。通過(guò)在裝入未知樣品之前、該過(guò)程中和之后向HPLC柱中裝入標(biāo)準(zhǔn)的25(OH)D3、24,25(OH)2D3和1,25(OH)2D3來(lái)標(biāo)定25(OH)D3、24,25(OH)2D3和1,25(OH)2D3的保留體積。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定每個(gè)35mm培養(yǎng)皿中蛋白的濃度。將酶活性表示為pmol1,25(OH)2D3/mg蛋白/小時(shí)。(F)角質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。在MCDB-153培養(yǎng)基中維持角質(zhì)細(xì)胞。用已被亞克隆到pCR3.1載體(INVITROGEN)中的1mg/ml1α-OHasecDNA轉(zhuǎn)染在24孔平皿中有50%-60%匯合的細(xì)胞。將空載體用作對(duì)照。對(duì)于每次轉(zhuǎn)染來(lái)說(shuō),將1.0μg稀釋到含有6-8μlPlus試劑的100μl培養(yǎng)基中。將該混合物在室溫下培養(yǎng)15分鐘。加入LIPOFECTAMINE(4-6μl),并且將DNA-LIPOFECTAMINE混合物在室溫下再培養(yǎng)15分鐘。將細(xì)胞在DNA-LIPOFECTAMINE混合物中培養(yǎng)3小時(shí),之后更換培養(yǎng)基。然后用不同濃度(1nM,10nM,100nM)的25(OH)D3處理細(xì)胞18個(gè)小時(shí)。將[3H]胸苷添加到培養(yǎng)物中,并且如前所述(Chen,T.C.等人《JNutr.Biochem.》4:49-57(1993))測(cè)量[3H]胸苷向DNA中的摻入(被理解為是對(duì)DNA合成活性、即細(xì)胞增殖的測(cè)量)。實(shí)施例2人的角質(zhì)細(xì)胞1α-OHasecDNA的克隆、測(cè)序和表達(dá)采用逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)從人的角質(zhì)細(xì)胞中克隆出1α-OHasecDNA。2,150個(gè)堿基對(duì)的1α-OHasecDNA(為SEQIDNO.1的一部分)含有一個(gè)1,527bp的開(kāi)放讀框,據(jù)預(yù)測(cè)其編碼508個(gè)氨基酸的蛋白(SEQIDNO.2)。將該cDNA直接亞克隆到pCR3.1-Uni(INVITROGEN)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中。DNA的序列分析表明角質(zhì)細(xì)胞中的cDNA與腎1α-OHase的完全相同。當(dāng)在不能合成1,25(OH)2D3的COS-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染該構(gòu)建體時(shí),通過(guò)高效液相層析(HPLC)證實(shí)了1α-OHase的活性,其中HPLC使得所產(chǎn)生的[3H]-1,25(OH)2D3與酶的底物[3H]-25(OH)D3分離開(kāi)來(lái)。實(shí)施例3人1α-OHase基因的克隆和部分特征確定采用來(lái)自1α-OHasecDNA(SEQIDNO.1)5’區(qū)的700bp片段作探針,通過(guò)噬菌斑雜交來(lái)篩選人的基因組DNA文庫(kù)(CLONTECH)。鑒定出4個(gè)陽(yáng)性克隆。使用限制酶消化4個(gè)基因組克隆,它們分別被命名為P1、P2、P3和P4。(BamHI,Sac-I)P1為13kb,P2為7.5kb。這兩個(gè)克隆包括如PCR鑒定出的5’區(qū)的一些部分。用Sac-Ⅰ消化P1克隆,并產(chǎn)生了長(zhǎng)度為5.5kb、3.5kb、3.0kb和0.7kb的4個(gè)片段。首先將這4個(gè)片段亞克隆到pGem7克隆載體中,并進(jìn)行Southern印跡分析以鑒定出含有5’-側(cè)翼區(qū)的亞克隆。采用T7和Sp6啟動(dòng)子引物的序列分析確定了片段的順序。據(jù)發(fā)現(xiàn)5.5kb的片段編碼內(nèi)含子8到外顯子9。0.7kb的片段編碼外顯子6到內(nèi)含子8,3.5kb的片段編碼外顯子6到5’側(cè)翼區(qū),而3.0kb的亞克隆不能同由1α-OHasecDNA制得的任何探針雜交。實(shí)施例4作為用人1α-OHase基因轉(zhuǎn)染的角質(zhì)細(xì)胞中1,25(OH)2D的函數(shù)的增殖活性為了測(cè)試在用1α-OHase轉(zhuǎn)染后細(xì)胞產(chǎn)生1,25(OH)2D3的能力,如在前面的方法部分中概述的那樣構(gòu)建出含有1α-OHase克隆基因(SEQIDNO.1)的多核苷酸構(gòu)建體,并采用該構(gòu)建體來(lái)轉(zhuǎn)染正常的培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞。將培養(yǎng)的用1α-OHase基因轉(zhuǎn)染的角質(zhì)細(xì)胞與不同濃度的25(OH)D3一起培養(yǎng)。作為一種陰性對(duì)照,將未經(jīng)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞在相同的條件下并以相同的時(shí)間暴露到相同濃度的25(OH)D中。如果用1α-OHase基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增加了細(xì)胞中1α-OHase的活性的話(huà),那么該細(xì)胞在將25(OH)D轉(zhuǎn)化為1,25(OH)2D方面將會(huì)更加有效,隨后就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中的濃度更高,從而對(duì)降低細(xì)胞的增殖活性具有更加顯著的效果。正如可以在圖6中看到的那樣,當(dāng)與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照角質(zhì)細(xì)胞相比時(shí),對(duì)相同濃度的25(OH)D而言,用1α-OHase基因轉(zhuǎn)染的角質(zhì)細(xì)胞具有更顯著的降低增殖活性的作用。這一情況發(fā)生在10-9至10-7M的濃度范圍內(nèi)。當(dāng)與未轉(zhuǎn)染的角質(zhì)細(xì)胞相比時(shí),用1α-OHase基因轉(zhuǎn)染的并且與10-7M的25(OH)D一同培養(yǎng)的細(xì)胞其增殖活性存在著顯著的(p<0.01)下降,所述活性下降了53.7%。應(yīng)當(dāng)理解的是本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅是出于解釋的目的,而據(jù)此的各種改動(dòng)或變化將會(huì)對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員作出暗示并且應(yīng)當(dāng)包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文所引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)以其全文并入本文作為參考。序列表<110>Cutanogen,Inc.Schwartz,GaryG.Lokeshwar,BalakrishnaL.Chen,TaiC.Whitlatch,LymanW.Kong,XiangF.Holick,MichaelF.<120>用于預(yù)防或治療癌癥的方法<130>1539.027PC03<140>待定<141>同此<150>待定<151>1999-03-09<150>待定<151>1999-03-09<150>US60/122,270<151>1999-03-01<150>US60/122,268<151>1999-03-01<150>US09/047,918<151>1998-03-25<160>4<170>patentIn2.0版<210>1<211>2451<212>DNA<213>人<400>aggagggattggctgaggagcttggagagggggcgtcatcacctcacccaaaggttaaat60aggggttgagatatgatgctcaggagaagcgctttctttcgcgagcaccctgaaccagac120catgacccagaccctcaagtacgcctccagagtgttccatcgcgtccgctgggcgcccga180gttgggcgcctccctaggctaccgagagtaccactcagcacgccggagcttggcagacat240cccaggcccctctacgcccagctttctggccgaacttttctgcaagggggggctgtcgag300gctacacgagctgcaggtgcagggcgccgcgcacttcgggccggtgtggctagccagctt360tgggacagtgcgcaccgtgtacgtggctgcccctgcactcgtcgaggagctgctgcgaca420ggagggaccccggcccgagcgctgcagcttctcgccctggacggagcaccgccgctgccg480ccagcgggcttgcggactgctcactgcggaaggcgaagaatggcaaaggctccgcagtct540cctggccccgctcctcctccggcctcaagcggccgcccgctacgccggaaccctgaacaa600cgtagtctgcgaccttgtgcggcgtctgaggcgccagcggggacgtggcacggggccgcc660cgccctggttcgggacgtggcgggggaattttacaagttcggactggaaggcatcgccgc720ggttctgctcggctcgcgcttgggctgcctggaggctcaagtgccacccgacacggagac780cttcatccgcgctgtgggctcggtgtttgtgtccacgctgttgaccatggcgatgcccca840ctggctgcgccaccttgtgcctgggccctggggccgcctctgccgagactgggaccagat900gtttgcatttgctcagaggcacgtggagcggcgagaggcagaggcagccatgaggaacgg960aggacagcccgagaaggacctggagtctggggcgcacctgacccacttcctgttccggga1020agagttgcctgcccagtccatcctgggaaatgtgacagagttgctattggcgggagtgga1080cacggtgtccaacacgctctcttgggctctgtatgagctctcccggcaccccgaagtcca1140gacagcactccactcagagatcacagctgccctgagccctggctccagtgcctacccctc1200agccactgttctgtcccagctgcccctgctgaaggcggtggtcaaggaagtgctaagact1260gtaccctgtggtacctggaaattctcgtgtcccagacaaagacattcatgtgggtgacta1320tattatccccaaaaatacgctggtcactctgtgtcactatgccacttcaagggaccctgc1380ccagttcccagagccaaattcttttcgtccagctcgctggctgggggagggtcccacccc1440ccacccatttgcatctcttccctttggctttggcaagcgcagctgtatggggagacgcct1500ggcagagcttgaattgcaaatggctttggcccagatcctaacacattttgaggtgcagcc1560tgagccaggtgcggccccagttagacccaagacccggactgtcctggtacctgaaaggag1620catcaacctacagtttttggacagatagtcccatggaaagagactgtcatcatcaccctt1680tcattcatcatagggataagattttttgtaggcacaagaccaaggtatacatcttcccct1740aatgcctatctgaccaaactggatagaaccaccatagtgaagtgtgaggcggccctgacc1800aatgtgtgaagtatgcacttggcctgactcaggaagccaggtgagaaaaccatggtctct1860ctgcttgcttggcccttctgatcatgtatgcatcccccaaggatgaaatcagattttaac1920taataatgctggatggcctgaggaaagattcaactgcctctctttttgggctttcatagt1980gttcattgatgctgctggctaagcatttatcaaagcataagctcagtaactgtgcatctg2040gtctgtacctggttggtccttcgtc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quán)利要求17的方法,其中所說(shuō)的同源調(diào)節(jié)序列含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。23.權(quán)利要求15的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有異源調(diào)節(jié)序列。24.權(quán)利要求23的方法,其中所說(shuō)的異源調(diào)節(jié)序列為組織特異性啟動(dòng)子。25.權(quán)利要求15的方法,所述的方法進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。26.權(quán)利要求25的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-lα-羥化酶的基因位于同一DNA構(gòu)建體上。27.權(quán)利要求25的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-lα-羥化酶的基因位于不同的DNA構(gòu)建體上。28.權(quán)利要求15的方法,其中所說(shuō)的腫瘤細(xì)胞選自由前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞所組成的組中。29.一種用于檢測(cè)患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)性的方法,所說(shuō)的方法包括測(cè)量靶器官中維生素D、維生素D的代謝物或維生素D代謝酶的水平;并且將測(cè)量結(jié)果與癌癥風(fēng)險(xiǎn)水平相關(guān)聯(lián)。30.權(quán)利要求29的方法,其中所說(shuō)的維生素D的代謝物為25-羥基維生素D或其類(lèi)似物或衍生物。31.權(quán)利要求29的方法,其中所說(shuō)的維生素D的代謝物為1,25-二羥基維生素D。32.權(quán)利要求29的方法,其中所說(shuō)的維生素D代謝酶為25-羥基維生素D-1α-羥化酶。33.權(quán)利要求32的方法,其中25-羥基維生素D-1α-羥化酶的水平是間接地由其活性測(cè)量的。34.一種用于預(yù)測(cè)癌癥治療是否成功的方法,所說(shuō)的方法包括測(cè)量靶器官中維生素D、維生素D的代謝物或維生素D代謝酶的水平;并且將測(cè)量結(jié)果與癌癥風(fēng)險(xiǎn)水平相關(guān)聯(lián)。35.一種用于抑制癌細(xì)胞增殖、侵入或轉(zhuǎn)移的組合物,所說(shuō)的組合物含有作為1,25-二羥基維生素D代謝前體的維生素D的代謝物以及藥物可接受的載體。36.一種治療動(dòng)物中的良性前列腺增生的方法,所述的方法包括向呈現(xiàn)出良性前列腺增生的需要的細(xì)胞中引入含有表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25-二羥基維生素D或其類(lèi)似物并且治療了所說(shuō)的增生。37.權(quán)利要求36的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有同源調(diào)節(jié)序列。38.權(quán)利要求37的方法,其中所說(shuō)的同源調(diào)節(jié)序列含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。39.權(quán)利要求36的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有異源調(diào)節(jié)序列。40.權(quán)利要求39的方法,其中所說(shuō)的異源調(diào)節(jié)序列為組織特異性啟動(dòng)子。41.權(quán)利要求36的方法,所述的方法進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。42.權(quán)利要求41的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于同一DNA構(gòu)建體上。43.權(quán)利要求41的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于不同的DNA構(gòu)建體上。44.一種治療動(dòng)物中的過(guò)度增殖性皮膚病的方法,該方法包括向需要的動(dòng)物的皮膚細(xì)胞中引入含有表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25-二羥基維生素D或其類(lèi)似物并且抑制了所述細(xì)胞的增殖。45.權(quán)利要求44的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有同源調(diào)節(jié)序列。46.權(quán)利要求45的方法,其中所說(shuō)的同源調(diào)節(jié)序列含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。47.權(quán)利要求44的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有異源調(diào)節(jié)序列。48.權(quán)利要求47的方法,其中所說(shuō)的異源調(diào)節(jié)序列為組織特異性啟動(dòng)子。49.權(quán)利要求44的方法,所述的方法進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。50.權(quán)利要求49的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于同一DNA構(gòu)建體上。51.權(quán)利要求49的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于不同的DNA構(gòu)建體上。52.權(quán)利要求44的方法,其中所說(shuō)的過(guò)度增殖性皮膚病為牛皮癬。53.權(quán)利要求44的方法,其中所說(shuō)的過(guò)度增殖性皮膚病選自由鱗癬和光化性角化病組成的組中。54.一種治療動(dòng)物中的鈣和骨骼代謝疾病的方法,該方法包括向需要的動(dòng)物的細(xì)胞中引入含有表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25-二羥基維生素D或其類(lèi)似物并且治療了所述的疾病。55.權(quán)利要求54的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有同源調(diào)節(jié)序列。56.權(quán)利要求55的方法,其中所說(shuō)的同源調(diào)節(jié)序列含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。57.權(quán)利要求54的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有異源調(diào)節(jié)序列。58.權(quán)利要求57的方法,其中所說(shuō)的異源調(diào)節(jié)序列為組織特異性啟動(dòng)子。59.權(quán)利要求54的方法,所述的方法進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。60.權(quán)利要求59的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于同一DNA構(gòu)建體上。61.權(quán)利要求59的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于不同的DNA構(gòu)建體上。62.權(quán)利要求54的方法,其中所說(shuō)的鈣和骨骼代謝疾病為腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良。63.權(quán)利要求54的方法,其中所說(shuō)的鈣和骨骼代謝疾病為代謝骨骼疾病。64.權(quán)利要求54的方法,其中所說(shuō)的鈣和骨骼代謝疾病選自由維生素D依賴(lài)型Ⅰ型佝僂病、X連鎖血磷酸鹽過(guò)少性佝僂病、維生素D依賴(lài)型Ⅱ型佝僂病和骨質(zhì)疏松癥組成的組中。65.權(quán)利要求54的方法,其中所說(shuō)的鈣和骨骼代謝疾病為由于甲狀旁腺機(jī)能減退導(dǎo)致的血清中的低血鈣。66.一種治療或預(yù)防動(dòng)物中的脫發(fā)的方法,該方法包括向需要的毛細(xì)胞中引入含有表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25-二羥基維生素D或其類(lèi)似物并且治療或預(yù)防了所說(shuō)的脫發(fā)。67.權(quán)利要求66的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有同源調(diào)節(jié)序列。68.權(quán)利要求67的方法,其中所說(shuō)的同源調(diào)節(jié)序列含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。69.權(quán)利要求66的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有異源調(diào)節(jié)序列。70.權(quán)利要求69的方法,其中所說(shuō)的異源調(diào)節(jié)序列為組織特異性啟動(dòng)子。71.權(quán)利要求66的方法,所述的方法進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。72.權(quán)利要求7l的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于同一DNA構(gòu)建體上。73.權(quán)利要求71的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于不同的DNA構(gòu)建體上。74.權(quán)利要求66的方法,其中所說(shuō)的脫發(fā)為選自由雄核發(fā)育性脫發(fā)、女性方式禿發(fā)以及化療引起的脫發(fā)組成的組中之病癥的結(jié)果。75.一種促進(jìn)動(dòng)物中的傷口愈合的方法,該方法包括向需要的傷口的細(xì)胞中引入含有表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25-二羥基維生素D或其類(lèi)似物并且促進(jìn)了所述傷口的愈合。76.權(quán)利要求75的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有同源調(diào)節(jié)序列。77.權(quán)利要求76的方法,其中所說(shuō)的同源調(diào)節(jié)序列含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。78.權(quán)利要求75的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有異源調(diào)節(jié)序列。79.權(quán)利要求78的方法,其中所說(shuō)的異源調(diào)節(jié)序列為組織特異性啟動(dòng)子。80.權(quán)利要求75的方法,所述的方法進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。81.權(quán)利要求80的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于同一DNA構(gòu)建體上。82.權(quán)利要求80的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于不同的DNA構(gòu)建體上。83.一種治療動(dòng)物中的自身免疫病的方法,該方法包括向需要的動(dòng)物的細(xì)胞中引入含有表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因的多核苷酸構(gòu)建體,從而產(chǎn)生了1,25-二羥基維生素D或其類(lèi)似物并且治療了所述的自身免疫病。84.權(quán)利要求83的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有同源調(diào)節(jié)序列。85.權(quán)利要求84的方法,其中所說(shuō)的同源調(diào)節(jié)序列含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。86.權(quán)利要求83的方法,其中所說(shuō)的構(gòu)建體含有異源調(diào)節(jié)序列。87.權(quán)利要求86的方法,其中所說(shuō)的異源調(diào)節(jié)序列為組織特異性啟動(dòng)子。88.權(quán)利要求83的方法,所述的方法進(jìn)一步包括向所說(shuō)的細(xì)胞中引入含有表達(dá)維生素D受體的基因的多核苷酸構(gòu)建體。89.權(quán)利要求88的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于同一DNA構(gòu)建體上。90.權(quán)利要求88的方法,其中所說(shuō)的表達(dá)維生素D受體的基因和所說(shuō)的表達(dá)25-羥基維生素D-1α-羥化酶的基因位于不同的DNA構(gòu)建體上。91.權(quán)利要求83的方法,其中所說(shuō)的自身免疫病選自由Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎組成的組中。92.一種分離的多核苷酸分子,所述的分子含有25-羥基維生素D-1α-羥化酶的調(diào)節(jié)序列或其互補(bǔ)序列。93.根據(jù)權(quán)利要求92的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的調(diào)節(jié)序列含有選自由下列組成的組中的多核苷酸(a)含有與在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列至少有90%相同的核苷酸序列的多核苷酸;以及(b)在嚴(yán)格條件下與(a)的多核苷酸或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸。94.權(quán)利要求93的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的多核苷酸含有與在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列至少有95%相同的核苷酸序列。95.權(quán)利要求93的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的多核苷酸含有與在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列至少有97%相同的核苷酸序列。96.權(quán)利要求93的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的多核苷酸含有與在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列至少有98%相同的核苷酸序列。97.權(quán)利要求93的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的多核苷酸含有與在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列至少有99%相同的核苷酸序列。98.權(quán)利要求93的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的多核苷酸含有在SEQIDNO.3中所示的核苷酸序列。99.根據(jù)權(quán)利要求92的多核苷酸分子,所述的多核苷酸還含有編碼25-羥基維生素D-1α-羥化酶的核苷酸序列。100.根據(jù)權(quán)利要求99的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的編碼25-羥基維生素D-1α-羥化酶的核苷酸序列與在SEQIDNO.1中所示的序列至少有90%是相同的。101.根據(jù)權(quán)利要求99的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的編碼25-羥基維生素D-1α-羥化酶的核苷酸序列與在SEQIDNO.1中所示的序列至少有95%是相同的。102.根據(jù)權(quán)利要求99的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的編碼25-羥基維生素D-1α-羥化酶的核苷酸序列與在SEQIDNO.1中所示的序列至少有97%是相同的。103.根據(jù)權(quán)利要求99的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的編碼25-羥基維生素D-1α-羥化酶的核苷酸序列與在SEQIDNO.1中所示的序列至少有98%是相同的。104.根據(jù)權(quán)利要求99的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的編碼25-羥基維生素D-1α-羥化酶的核苷酸序列與在SEQIDNO.1中所示的序列至少有99%是相同的。105.根據(jù)權(quán)利要求99的多核苷酸分子,其中所說(shuō)的編碼25-羥基維生素D-1α-羥化酶的核苷酸序列含有在SEQIDNO.1中所示的序列。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述的方法包括增加可為靶細(xì)胞利用的1,25-二羥基維生素D(“1,25(OH)文檔編號(hào)A61P17/02GK1301298SQ99806417公開(kāi)日2001年6月27日申請(qǐng)日期1999年3月25日優(yōu)先權(quán)日1998年3月25日發(fā)明者G·G·施瓦茨,B·L·洛凱什瓦,T·C·陳,L·W·懷特拉馳,孔祥福,M·F·霍利克申請(qǐng)人:卡坦諾根公司