專利名稱：：生理活性物質(zhì)的搜尋方法、生產(chǎn)該物質(zhì)的方法以及用搜尋方法找到的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及搜尋各種新的生理活性物質(zhì)的方法、生產(chǎn)該物質(zhì)的方法以及用該搜尋方法找到的藥物。相關(guān)技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中，搜尋未知的生理活性物質(zhì)涉及分析體液或組織中存在的組分，鑒定并分離出新物質(zhì)，以及研究所發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)的生理活性。上述現(xiàn)有技術(shù)的方法包括分析體內(nèi)的組分，尋找新物質(zhì)并研究它們的生理活性。然而，體內(nèi)存在的組分?jǐn)?shù)量非常多，而生理活性物質(zhì)通常僅以低濃度存在，因此尋找新物質(zhì)是一項(xiàng)困難的任務(wù)。另外，由于體內(nèi)發(fā)生了數(shù)量眾多的生理反應(yīng)，因此，尋找新發(fā)現(xiàn)物質(zhì)所具有的生理活性特征也很困難。因此，用現(xiàn)有技術(shù)的方法尋找新的生理活性物質(zhì)是一項(xiàng)困難的任務(wù)。本發(fā)明揭示因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種搜尋新的生理活性物質(zhì)，具有一定可預(yù)測性的更有效的方法。另外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法找到的生理活性物質(zhì)的生產(chǎn)方法。另外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于用本發(fā)明上述方法找到的治療糖尿病的新藥，胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，胃酸分泌調(diào)節(jié)劑和生長激素分泌調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)明了一種能以一定的可預(yù)測性來搜尋新的生理活性物質(zhì)的更有效的方法，并提交了專利申請(專利待公開出版物平10-109997)。該方法基于這樣的發(fā)現(xiàn)在物質(zhì)的受體(其中在體內(nèi)存在對該受體有拮抗作用的物質(zhì)或細(xì)胞)，或物質(zhì)A的受體(在體內(nèi)存在對響應(yīng)所述物質(zhì)A的細(xì)胞有拮抗作用的細(xì)胞或物質(zhì))中，當(dāng)相同受體有兩種或多種大小時(shí)，則缺失的部分，即已被剪切的氨基酸序列部分，具有與所述受體有關(guān)的生理活性。在進(jìn)行先前申請專利中的上述搜尋方法中，當(dāng)受體存在兩個(gè)或多個(gè)cDNA序列時(shí)，也可根據(jù)其cDNA堿基序列來推定受體的氨基酸序列，而且該方法不局限于基于已知實(shí)際存在的受體氨基酸序列的方法，在實(shí)際確認(rèn)了這些觀點(diǎn)后，發(fā)明者完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供了一種搜尋生理活性物質(zhì)的方法，該方法包括通過比較受體的cDNA序列，確定對于同一受體具有兩種或多種大小氨基酸序列的肽，其中受體是對體內(nèi)存在物質(zhì)產(chǎn)生拮抗劑的細(xì)胞的受體，或是對細(xì)胞本身產(chǎn)生拮抗劑的細(xì)胞的受體；然后通過比較上述cDNA的序列，確定較短受體中缺失了較長受體的哪些區(qū)域。另外，本發(fā)明還提供了生理活性肽的生產(chǎn)方法，即生產(chǎn)用本發(fā)明上述方法確定的缺失區(qū)域或其衍生物。另外，本發(fā)明提供了用于治療糖尿病的藥物，該藥物含有一種肽作為活性組分，該肽具有促進(jìn)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的作用，所述肽是用本發(fā)明上述方法成功尋找并找到的那些肽，并具有序列表中SEQIDNO1或5所示的氨基酸序列，或具有所述序列(SEQIDNO1或5)經(jīng)內(nèi)部置換、缺失、插入或加入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸所獲得的氨基酸序列。另外，本發(fā)明提供了胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，它含有一種肽作為活性組分，該肽具有調(diào)節(jié)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的作用，所述肽具有序列表中SEQIDNO2所示的氨基酸序列，或具有所述序列(SEQIDNO2)經(jīng)內(nèi)部置換、缺失、插入或加入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列。另外，本發(fā)明提供了胃酸分泌調(diào)節(jié)劑，它含有一種肽作為活性組分，該肽具有調(diào)節(jié)胃酸分泌的作用，所述肽具有序列表中SEQIDNO3或4所示的氨基酸序列，或具有所述序列(SEQIDNO3或4)經(jīng)內(nèi)部置換、缺失、插入或加入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列。本發(fā)明提供了生長激素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，它含有一種肽作為活性組分，該肽具有調(diào)節(jié)激素產(chǎn)生的作用，具有序列表中SEQIDNO6所示的氨基酸序列，或具有所述序列(SEQIDNO6)經(jīng)內(nèi)部置換、缺失、插入或加入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列。本發(fā)明提供了一種根據(jù)cDNA堿基序列、以一定可預(yù)測性來有效搜尋新的生理活性物質(zhì)的方法。在本發(fā)明的方法中，通過檢查參與拮抗作用的物質(zhì)的受體，可以找到新的生物活性物質(zhì)，因此不必象現(xiàn)有技術(shù)那些需要從含有許多組分的生物樣品中分離出微量存在的生理活性物質(zhì)。另外，所搜尋到的生理活性物質(zhì)的生理活性就是參與上述拮抗作用的活性，因此，搜尋其生理活性也比現(xiàn)有技術(shù)容易得多。因此，根據(jù)本發(fā)明方法來搜尋新的生理活性物質(zhì)，其效率比現(xiàn)有技術(shù)要高得多。另外，本發(fā)明還提供用于治療糖尿病的新藥，該藥具有很好的增加胰島素產(chǎn)生的作用。另外，還提供了新的胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑、胃酸分泌調(diào)節(jié)劑和生長激素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑。發(fā)明較佳實(shí)施方案在本發(fā)明的搜尋生理活性物質(zhì)的方法中，在對體內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生拮抗劑的細(xì)胞的受體之中，或在對所述細(xì)胞本身產(chǎn)生拮抗劑的細(xì)胞的受體之中，通過比較受體的cDNA序列，來檢查對于同一受體有兩種或多種大小的氨基酸序列，然后通過比較上述cDNA的序列或成熟mRNA的序列，檢查出較短受體中缺少了較長受體的哪些區(qū)域。即，本發(fā)明方法涉及根據(jù)成熟mRNA堿基序列中的不同而產(chǎn)生大小不同的兩種或多種受體的情況。換句話說，本發(fā)明方法搜尋的是mRNA水平的剪接差異。除了滅活基因表達(dá)外，還不完全了解mRNA水平的剪接差異(通常不會(huì)發(fā)生)所產(chǎn)生的剪接的作用。存在這樣的情況有些序列最初應(yīng)被翻譯而后來沒有被翻譯，相反，也有些序列不應(yīng)被翻譯卻被表達(dá)。在大多數(shù)情況下，由于剪接沒有合適地進(jìn)行，甚至不能表達(dá)出氨基酸，但是在其他情況下，實(shí)際情況卻是剪接產(chǎn)生的氨基酸序列或被缺失的那些氨基酸序列能有效地起作用。本發(fā)明的方法包括搜尋這些在mRNA水平的剪接差異。本發(fā)明方法涉及檢查上述受體cDNA的堿基序列，并尋找相同受體的cDNA以不同大小存在的那些受體。該工作可這樣進(jìn)行，測定所述受體cDNA的堿基序列及其大小數(shù)次，或者如果該信息在文獻(xiàn)中有報(bào)道，則利用該信息。胰高血糖素受體、FGF受體和GIP受體是同一受體存在大小不同的兩種或多種cDNA的受體例子?？赏ㄟ^產(chǎn)生與已認(rèn)為有生理活性的序列缺失區(qū)域相同的肽，來獲得生理活性物質(zhì)。在大多數(shù)情況下，缺失區(qū)域由較短的肽組成，因此在這些情況下，所述生理活性物質(zhì)可用市售的肽合成儀通過化學(xué)合成輕易制得?；蛘撸鼈兛捎帽绢I(lǐng)域的基因工程技術(shù)制得。所得生理活性物質(zhì)的生理活性參與上述拮抗作用，因此很容易用滿足各種拮抗作用的合適方法來確認(rèn)。另外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，一般來說，在具有生理活性的肽中，即使少數(shù)氨基酸被其他氨基酸置換、加入少數(shù)氨基酸或缺失少數(shù)氨基酸，其生理活性也能維持。因此，以下物質(zhì)的生產(chǎn)也在本發(fā)明范圍內(nèi)，該物質(zhì)具有由上述缺失區(qū)域組成的生理活性物質(zhì)的生理活性，且在構(gòu)成上述缺失區(qū)域的氨基酸中有少數(shù)氨基酸被其他氨基酸置換、加入了少數(shù)氨基酸或缺失少數(shù)氨基酸(在本發(fā)明專利申請中，這些物質(zhì)稱為上述缺失區(qū)域的“衍生物”)。這些衍生物與上述缺失區(qū)域的同源性宜在70％以上，更佳的為90％。本發(fā)明者利用上述的本發(fā)明搜尋方法發(fā)現(xiàn)了一種肽，它具有促進(jìn)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的作用。由于該肽具有促進(jìn)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的作用，因此它可有效地作為治療糖尿病的藥物，即如下文實(shí)施方案所述的，在公眾域內(nèi)的文獻(xiàn)中提到了胰高血糖素受體存在幾種大小不同的cDNA，通過比較這些cDNA的堿基序列，檢查編碼較短氨基酸序列的堿基序列缺失了編碼較長氨基酸序列的堿基序列中的哪些區(qū)域，并推斷出缺失區(qū)域的氨基酸序列(SEQIDNO1)。然后，化學(xué)合成具有SEQIDNO1所示氨基酸序列的肽，當(dāng)將該肽給予胰島素產(chǎn)生細(xì)胞，所述細(xì)胞的胰島素產(chǎn)生顯著增加。這樣就知道，具有SEQIDNO1所示氨基酸序列的肽可有效作為治療糖尿病的藥物。另外，具有SEQIDNO1的氨基酸序列且序列中一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被置換、缺失、插入或加入、并且具有促進(jìn)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素作用的肽，也在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些肽的實(shí)際例子是具有SEQIDNO5所示氨基酸序列的肽，該肽是根據(jù)本發(fā)明方法通過比較大鼠胰高血糖素受體cDNA發(fā)現(xiàn)的。此外，除了具有SEQIDNO1或5所示氨基酸序列的肽以外，具有增加胰島素產(chǎn)生作用的肽與SEQIDNO1或5所示序列的同源性宜在70％以上，更佳的為90％。另外，盡管這些肽的氨基酸數(shù)目沒有明確限制，但是從易于合成和抗原性角度出發(fā)，較佳的數(shù)目約為7至20，更佳的約7至10。本發(fā)明上述治療糖尿病藥物的給藥途徑宜采用非口服給藥，如靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射或腸內(nèi)給藥。另外，盡管可根據(jù)患者病情以及活性成分的分子量適當(dāng)?shù)卮_定劑量，但每日每千克體重用0.01至1.0毫克通常是較佳的。另外，藥物可用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的方法合適地制得，并能以溶于生理鹽水溶液(濃度例如在30至3000毫克/升之間)的形式使用。另外，與上文類似，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)節(jié)胰島素產(chǎn)生(抑制或刺激產(chǎn)生)的肽。SEQIDNO2顯示了其氨基酸序列。該序列是根據(jù)本發(fā)明上述搜尋方法，通過比較葡萄糖依賴型促胰島多肽受體的cDNA序列而發(fā)現(xiàn)的。和上文類似，在刺激胰島素產(chǎn)生時(shí)，它可有效作為治療糖尿病的藥物。在抑制胰島素產(chǎn)生時(shí)，它可有效地作為治療低血糖的藥物。有效作為胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑的肽并不局限于具有SEQIDNO2之氨基酸序列的肽，具有SEQIDNO2之氨基酸序列，且序列中置換、缺失、插入或增加了一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，并且具有調(diào)節(jié)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的作用的肽，也在本發(fā)明范圍內(nèi)。在這些情況下，這些肽與SEQIDNO2所示序列的同源性宜在70％以上，更佳的為90％。而且，盡管這些肽的氨基酸數(shù)目沒有特別限制，但是從易于合成和抗原性角度出發(fā)，較佳的數(shù)目大約為25至50，更佳的約28至35。本發(fā)明上述的胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑的給藥途徑宜為非口服給藥，如靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射或腸內(nèi)給藥。另外，盡管劑量可根據(jù)患者病情以及活性成分的分子量來適當(dāng)確定，但每日每千克體重用0.01至1.0毫克通常是較佳的。另外，藥物可用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的方法合適地制得，并能以溶于生理鹽水溶液(濃度例如在30至3000毫克/升之間)的形式使用。另外，與上文類似，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)胃酸分泌(抑制或刺激分泌)的肽。SEQIDNO3和4顯示了它們的氨基酸序列。這些序列是根據(jù)本發(fā)明上述搜尋方法，通過比較胃泌素受體的cDNA序列而發(fā)現(xiàn)的。因?yàn)檫@些肽調(diào)節(jié)胃酸分泌，因此它們可有效地作為治療胃潰瘍和十二指腸潰瘍(抑制分泌的情況)的藥物，或作為治療胃酸分泌不足(刺激分泌的情況)的藥物。有效作為胃酸分泌調(diào)節(jié)劑的肽不局限于具有SEQIDNO3或4所示氨基酸序列的肽，具有SEQIDNO3或4所示氨基酸序列、且序列中置換、缺失、插入或增加了一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸、并且具有調(diào)節(jié)胃酸分泌作用的肽，也在本發(fā)明范圍內(nèi)。在這些情況下，這些肽與SEQIDNO3或4所示序列的同源性宜在70％以上，更佳的為90％。而且，盡管這些肽的氨基酸數(shù)目沒有特別限制，但是從易于合成和抗原性角度出發(fā)，在SEQIDNO3所示序列情況下，較佳的約為5至20，更佳的約為5至8；在SEQIDNO4所示序列的情況下，較佳的約11至30，更佳的約11至20。本發(fā)明上述胃酸分泌調(diào)節(jié)劑的給藥途徑宜為非口服給藥，如靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射或腸內(nèi)給藥。另外，盡管劑量可根據(jù)患者病情以及活性成分的分子量來適當(dāng)確定的，但每日每千克體重用0.01至1.0毫克通常是較佳的。另外，藥物可用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的方法合適地制得，并能以溶于生理鹽水溶液(濃度例如在30至3000毫克/升之間)的形式使用。另外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)生長激素產(chǎn)生(刺激產(chǎn)生或抑制產(chǎn)生)的肽。SEQIDNO6顯示了其氨基酸序列。因該肽能調(diào)節(jié)生長激素產(chǎn)生，因此它可有效地作為治療侏儒癥(刺激產(chǎn)生的情況)的藥物，或作為治療巨人癥(抑制產(chǎn)生的情況)的藥物。有效作為生長激素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑的肽不局限于具有SEQIDNO6所示氨基酸序列的肽，具有SEQIDNO6之氨基酸序列、序列中置換、缺失、插入或增加了一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸、并且具有刺激生長激素分泌作用的肽也在本發(fā)明范圍內(nèi)。在這種情況下，這些肽與SEQIDNO6所示序列的同源性宜在70％以上，更佳的為90％。而且，盡管這些肽的氨基酸數(shù)目沒有特別限制，但是從易于合成和抗原性角度出發(fā)，在SEQIDNO6所示序列的情況下，較佳的數(shù)目約為12至30，更佳的約為12至20。本發(fā)明上述的生長激素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑的給藥途徑宜為非口服給藥，如靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射或腸內(nèi)給藥。另外，盡管劑量是根據(jù)患者病情以及活性成分的分子量來適當(dāng)確定的，但每日每千克體重用0.01至1.0毫克通常是較佳的。另外，藥物可用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的方法合適地制得，并能溶于生理鹽水溶液(濃度例如在30至3000毫克/升之間)使用。實(shí)施例在下列實(shí)施例中將實(shí)際說明本發(fā)明。顯然本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1從胰高血糖素受體預(yù)測生理活性肽已經(jīng)研究了FEBSLetters351(1994)271-275中描述的大鼠胰高血糖素受體的氨基酸序列。根據(jù)cDNA堿基序列的報(bào)道，胰高血糖素受體具有四種cDNA長度，而且也已清楚其中兩種能翻譯成氨基酸。這些是翻譯后剪接差異的結(jié)果，其模式與例如降鈣素受體的翻譯后剪接不同。然而，本發(fā)明者預(yù)計(jì)翻譯后剪接的差別所產(chǎn)生的氨基酸部分也具有某種活性。此氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO1所示。實(shí)施例2肽的生產(chǎn)用市售的肽合成儀合成具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的肽。實(shí)施例3對胰島素分泌的刺激作用將BxPC-3細(xì)胞(一種衍生自人胰的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞)(來源DainipponPharmaceuticalCo.Ltd.)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在濕潤的培養(yǎng)箱中5％二氧化碳?xì)怏w下37℃生長。用胰蛋白酶處理細(xì)胞，然后以1×105/孔的密度接種；當(dāng)它們達(dá)到匯合時(shí)，加入實(shí)施例2中合成的本發(fā)明肽、肽A和肽B(它們與本發(fā)明無關(guān)且其活性未知)以及對照(生理鹽水)，每孔0.01毫克。培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。然后，用胰島素測定試劑盒(來源ShigayagiCo.，Ltd.)通過比色法測定上清液中的胰島素濃度。結(jié)果顯示在下表1中。表1從表1可以清楚地看出，用本發(fā)明方法尋找到的上述肽加速了產(chǎn)生胰島素的BxPC-3細(xì)胞產(chǎn)生胰島素。因此，認(rèn)為該肽能通過其胰島素合成作用對糖尿病患者起有效作用。實(shí)施例4肽的生產(chǎn)用市售的肽合成儀，合成具有根據(jù)人胰高血糖素受體cDNA序列而預(yù)計(jì)的SEQIDNO1和5所示氨基酸序列的肽。實(shí)施例5對胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的胰島素產(chǎn)生的刺激作用將HIT細(xì)胞(產(chǎn)生胰島素的倉鼠胰細(xì)胞)和BxPC-3細(xì)胞(人胰細(xì)胞)(來源DaiNipponSeiyaku)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(來源DaiNipponSeiyaku)中，在潤濕的培養(yǎng)箱中5％二氧化碳?xì)怏w下37℃生長。用胰蛋白酶處理細(xì)胞，以1×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板；在細(xì)胞達(dá)到匯合后，將培養(yǎng)基換成F12無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞8小時(shí)。然后，將實(shí)施例4制得的本發(fā)明肽溶于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中；將各種劑量的SEQIDNO1所示的肽(用于HIT細(xì)胞)和各種劑量的SEQIDNO5所示的肽(用于BxPC-3細(xì)胞)加入孔內(nèi)，再維持培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)后，用胰島素免疫試驗(yàn)測定本發(fā)明肽對細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的刺激作用，以尋找與未處理組相比對產(chǎn)生有刺激作用的肽。另外，胰島素免疫試驗(yàn)、胰島素產(chǎn)生刺激率的計(jì)算實(shí)際如下進(jìn)行。將細(xì)胞培養(yǎng)基上清液的各種稀釋液加入包被了固定化抗胰島素抗體的孔內(nèi)，按照Shigayagi(Ltd．)出售的胰島素測定試劑盒的方法與抗胰島素抗體溶液反應(yīng)。檢測方法是，使生物素標(biāo)記的抗體與偶聯(lián)鏈親和素的過氧化物酶反應(yīng)，然后測定由過氧化物酶催化的顯色反應(yīng)。根據(jù)胰島素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出胰島素濃度。在測定加入不同劑量的組中對胰島素產(chǎn)生的刺激率時(shí)，以沒有加入物質(zhì)的參照組中對胰島素產(chǎn)生的刺激率作為100％，獲得下列結(jié)果。結(jié)果顯示在下表2中。表2從表2明顯看出，上述用本發(fā)明方法尋找到的肽對衍生自倉鼠和人的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞有刺激胰島素產(chǎn)生的作用。因此，認(rèn)為這些肽能導(dǎo)致血糖濃度降低，從而可用來治療糖尿病。實(shí)施例6肽的生產(chǎn)用市售的肽合成儀，合成具有根據(jù)胃泌素受體的cDNA序列預(yù)計(jì)的SEQIDNO3和4所示氨基酸序列的肽。實(shí)施例7對大鼠中胃酸分泌的抑制作用采用大鼠來評(píng)價(jià)對胃酸分泌的抑制作用，將實(shí)施例6合成的肽以及胃泌素(一種胃酸分泌的刺激物)溶于生理鹽水中，皮下注射該溶液，10分鐘后測定胃酸分泌。胃泌素給藥量為4微克/千克，本發(fā)明肽給藥量為10微克/千克。將大鼠固定在固定器上，將一探針通過其口插入胃中，對大鼠胃液取樣，測定pH來評(píng)價(jià)胃酸的分泌。在未給予物質(zhì)的參照組和給藥組之間比較胃酸分泌，獲得下列抑制胃酸分泌的結(jié)果。結(jié)果顯示在下表3內(nèi)。表3從表3明顯看出，上述用本發(fā)明方法尋找到的肽具有抑制大鼠胃酸分泌的作用。因此，這些肽可用作抑制胃酸分泌的胃潰瘍藥和十二指腸潰瘍藥。實(shí)施例8肽的生產(chǎn)用市售的肽合成儀，合成具有通過比較抑生長素受體氨基酸序列而預(yù)計(jì)的SEQIDNO6所示氨基酸序列的肽。實(shí)施例9對生長激素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生生長激素的刺激衍生自倉鼠的GH3細(xì)胞(產(chǎn)生生長激素的垂體細(xì)胞)(來源IFO，保藏號(hào)No.50105)生長在含15％胎牛血清的F12培養(yǎng)基(來源DaiNipponSeiyaku)中，在濕潤的培養(yǎng)箱中5％二氧化碳?xì)怏w下37℃生長。用胰蛋白酶處理細(xì)胞，以1×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板；當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合后，將培養(yǎng)基換成15％血清F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞12小時(shí)。然后，將實(shí)施例7制得的本發(fā)明肽溶于15％血清F12培養(yǎng)基中，將不同劑量的肽加入孔內(nèi)，再維持培養(yǎng)3天。完成培養(yǎng)后，用生長激素免疫試驗(yàn)測定這些肽對細(xì)胞產(chǎn)生生長激素的刺激作用，以測定與未處理組相比對產(chǎn)生的刺激作用。另外，用本領(lǐng)域已知的方法(夾心ELISA)進(jìn)行生長激素免疫試驗(yàn)，即，將細(xì)胞培養(yǎng)基上清液的不同稀釋液加入包被了固定化的抗生長激素抗體的孔內(nèi)，室溫反應(yīng)180分鐘，洗滌。然后再加入標(biāo)記了過氧化物酶的抗生長激素抗體，室溫反應(yīng)60分鐘。洗滌后，通過測定吸光度來測定過氧化物酶催化的顯色反應(yīng)。根據(jù)用濃度已知的生長激素進(jìn)行同樣的夾心ELISA所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定生長激素的濃度。在測定加入不同劑量的組中對生長激素產(chǎn)生的刺激率時(shí)，以未加入肽的參照組中對生長激素產(chǎn)生的刺激率作為100％，獲得下列結(jié)果。結(jié)果顯示在下表4中。表4<tablesid="table2"num="003"><table>肽的加入量(微克/孔)對生長激素產(chǎn)生的刺激率(％)0100.00.01101.20.1124.11175.610190.4</table></tables>從表4明顯看出，實(shí)施例8合成的肽具有刺激生長激素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生生長激素的作用。因此，認(rèn)為這些肽導(dǎo)致刺激生長，因此可用作治療侏儒癥的藥物。序列表<110>坂本賢二和名越秀夫<120>生理活性物質(zhì)的搜尋方法、生產(chǎn)該物質(zhì)的方法以及用搜尋方法找到的藥物<130>99599<160>6<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<223>對胰島素產(chǎn)生有抑制作用的多肽<400>1ProLysAlaProSerAlaGln15<210>2<211>28<212>PRT<213>人工序列<223>對胰島素產(chǎn)生有調(diào)節(jié)作用的多肽<400>2ValGlyArgAspProAlaAlaAlaProAlaLeuTrpArgArgArgGly151015ThrAlaProProLeuSarAlalleValSerGlnVal2025<210>3<211>5<212>PRT<213>人工序列<223>對胃酸分泌有抑制作用的多肽<400>3GlyGlyAlaGlyPro15<210>4<211>11<212>PRT<213>人工序列<223>對胃酸分泌有抑制作用的多肽<400>4MetSerValGlyGlyAsnMetLeullelleVal1510<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<223>對胰島素產(chǎn)生有抑制作用的多肽<400>5ProGlnValProSerAlaGln15<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<223>對生長激素分泌有促進(jìn)作用的多肽<400>6ProSerCysGlnTrpValGlnAlaProAlaCysGln1510權(quán)利要求1．一種搜尋生理活性物質(zhì)的方法，該方法包括通過比較受體的cDNA序列，檢查同一受體有兩種或多種大小氨基酸序列的受體，其中受體是對體內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生拮抗劑的細(xì)胞的受體，或是對所述細(xì)胞本身產(chǎn)生拮抗劑的細(xì)胞的受體；然后通過比較cDNA序列檢查較短受體缺失了較長受體的哪些區(qū)域。2．一種生產(chǎn)生理活性肽的方法，其特征在于，生產(chǎn)的是權(quán)利要求1所述的方法確定的缺失區(qū)域或其衍生物。3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中生產(chǎn)的是缺失區(qū)域。4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中用化學(xué)合成方法來合成缺失區(qū)域。5．一種治療糖尿病的藥物，它包含肽作為活性組分，該肽具有促進(jìn)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的作用，該肽具有序列表中SEQIDNO1或5所示的氨基酸序列，或具有所述序列經(jīng)內(nèi)部置換、缺失、插入或加入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸所獲得的氨基酸序列。6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療糖尿病的藥物，它包含具有序列表中SEQIDNO1所述氨基酸序列的肽作為活性組分。7．根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療糖尿病的藥物，它包含具有序列表中SEQIDNO5所示氨基酸序列的肽作為活性組分。8．一種胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，它含有肽作為活性組分，該肽具有調(diào)節(jié)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的作用，該肽具有序列表中SEQIDNO2所示的氨基酸序列，或具有所述序列經(jīng)內(nèi)部置換、缺失、插入或增加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸所獲得的氨基酸序列。9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，它包含具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的肽作為活性組分。10．根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑是胰島素產(chǎn)生抑制劑。11．根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，胰島產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑是治療糖尿病的藥物。12．一種胃酸分泌調(diào)節(jié)劑，它含有肽作為活性組分，該肽具有調(diào)節(jié)胃酸分泌的作用，該肽具有序列表中SEQIDNO3或4所示的氨基酸序列，或具有所述序列經(jīng)內(nèi)部置換、缺失、插入或增加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸所獲得的氨基酸序列。13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的胃酸分泌調(diào)節(jié)劑，它包含具有序列表中SEQIDNO3或4所示氨基酸序列的肽作為活性組分。14．根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的胃酸分泌調(diào)節(jié)劑，胃酸分泌調(diào)節(jié)劑是胃酸分泌抑制劑。15．一種生長激素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，它含有肽作為活性組分，該肽具有調(diào)節(jié)生長激素產(chǎn)生的作用，該肽具有序列表中SEQIDNO6所示的氨基酸序列，或具有所述序列經(jīng)內(nèi)部置換、缺失、插入或增加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸所獲得的氨基酸序列。16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的生長激素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，它包含具有序列表中SEQIDNO6所示氨基酸序列的肽作為活性組分。17．根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的生長激素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑，生長激素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑是生長激素產(chǎn)生的刺激劑。全文摘要一種以一定的可預(yù)測性有效地搜尋新的生理活性物質(zhì)的方法。該搜尋方法包括,在對體內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生桔抗劑的細(xì)胞的受體或?qū)?xì)胞本身產(chǎn)生括抗劑的細(xì)胞的受體中,通過比較所述受體的cDNA序列,尋找有兩種或多種大小氨基酸序列的受體;然后通過比較上述cDNA序列確定較短受體缺失了較長受體的哪些區(qū)域。利用該方法,提供了包含具有SEQIDNO:1或5所示氨基酸序列的肽的治療糖尿病的藥物、包含具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的肽的胰島素產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑、以及包含具有SEQIDNO:3或4所示氨基酸序列的肽的胃酸分泌抑制劑。文檔編號(hào)A61K38/00GK1295577SQ9980475公開日2001年5月16日申請日期1999年4月5日優(yōu)先權(quán)日1998年4月4日發(fā)明者坂本賢二申請人:坂本賢二,名越秀夫