專利名稱：突變型單純皰疹病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及突變型單純皰疹病毒，它們具有使其表現(xiàn)非致病性的失活突變。本發(fā)明也涉及這些突變型單純皰疹病毒在基因療法和測定析基因功能的方法上的用途。
背景技術(shù)：
皰疹單純病毒(HSV)已經(jīng)由于其神經(jīng)營養(yǎng)的生活方式和其細(xì)胞終生維持在神經(jīng)元中的能力而常常被建議作為一種合適的神經(jīng)系統(tǒng)載體。然而，野生型的HSV是高度病原性的且與大多數(shù)病毒載體一樣必需在某些方面被失去能力。HPV的病原性作用起因于病毒的裂解性感染，因此HSV作為一種載體的用途需要攜帶突變型株系的發(fā)展，這些突變可以中斷裂解周期，同時允許無癥狀的潛在性感染的建立。
HSV載體以前已經(jīng)產(chǎn)生并在體內(nèi)通過刪除必要的立即早期(IE)基因ICP4進(jìn)行測試(Dobson等，1990和Chiocca等，1990)，為了在培養(yǎng)基中生長，ICP4必需是被互補(bǔ)的。ICP4在裂解性感染的病毒早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄活化中是必需的。因此，缺少該基因的病毒可以迅速感染細(xì)胞但不能裂解性生長。另一種必需的基因是ICP27，其基因產(chǎn)物具高度細(xì)胞毒性，可能是由于其在阻止前-mRNA剪接(有助于從基本上未剪接的皰疹RNA轉(zhuǎn)錄)上的二級作用。已經(jīng)產(chǎn)生刪除ICP27(單獨刪除ICP27(如Reef Hardy和Sandri-Goldin，1994及Rice和Knipe，1990)、或者與ICP4結(jié)合(如US-A-5，658，724))的HSV株系。
已經(jīng)在非必需的基因上進(jìn)行了突變，這些基因如IE基因ICP0、IE基因ICP6、酪氨酸激酶(TK)、US5或VMW65，所有這些基因在體內(nèi)的完全致病性上是必需的，但對于在培養(yǎng)基中的生長不是必要的(由Coffin和Latchman回顧，1996)。這些類型的突變提供了附加的優(yōu)點，即該刪除對于在培養(yǎng)基中生長的不必被互補(bǔ)，這些突變以前已經(jīng)顯示偶爾會在生長時通過病毒和細(xì)胞系互補(bǔ)序列之間的同源重組導(dǎo)致從非致病型表型退回到野生型表型。然而，在這些中的每種情況下，由于高效價的接種將克服體內(nèi)對復(fù)制的阻斷，因而非必需的基因的突變沒有完全阻止病毒的復(fù)制。
ICP34.5，所謂的神經(jīng)毒力因子，是體內(nèi)神經(jīng)毒力絕對需要的，但對于在培養(yǎng)基中的生長是非必需的(Chou等，1990)。在ICP34.5上的突變提供了一個敏感的機(jī)制，HSV可以通過該機(jī)制被失去能力。ICP34.5被認(rèn)為可以在神經(jīng)元中阻止對生產(chǎn)性感染的的通常宿主反應(yīng)，該反應(yīng)導(dǎo)致(在ICP34.5缺乏的情況下)細(xì)胞死亡以及因此對初期被感染細(xì)胞感染的局限性。ICP34.5被認(rèn)為可以越過的這一應(yīng)答并允許完全的裂解性復(fù)制的發(fā)生。因此在ICP34.5缺乏的情況下，無論何種原因，如果失去能力的病毒曾被恢復(fù)生產(chǎn)性感染，則ICP34.5的突變將確保保護(hù)性宿主應(yīng)答將病毒復(fù)制局限在少數(shù)細(xì)胞中。
然而，攜帶單個缺陷的病毒不太可能會被認(rèn)為對最終的人體使用是絕對安全的。必需的IE基因提供了對復(fù)制的完全阻斷(以及因此其在培養(yǎng)基中必需被互補(bǔ))，通過失活該必需的IE基因和失活一種非必需的基因可以達(dá)到附加的安全和較高效價接種的可能性。
發(fā)明概述目前我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少在ICP4和ICP34.5中攜帶失活突變(選擇性地在VMW65和(或)vhs上攜帶失活突變)的單純皰疹病毒，相對于僅攜帶單個ICP34.5突變、ICP34.5及VMW65突變、或ICP34.5及VMW65和vhs突變型病毒株系呈現(xiàn)出毒性水平降低。它們比僅刪除ICP4的病毒較安全。然而這些高度突變型株系仍然可以有效地在培養(yǎng)基中生長，其中使用一種ICP4互補(bǔ)的細(xì)胞系，允許了病毒原種的制備。此外，本發(fā)明中的這些HSV株系已經(jīng)被顯示是將異源基因傳遞到哺乳動物細(xì)胞中的合適的載體。
因此本發(fā)明提供了一種具有功能ICP27基因的單純皰疹病毒(HSV)，其缺少至少一個功能ICP4基因和一個功能ICP34.5基因。所述病毒優(yōu)選的是進(jìn)一步缺少一個或多個所述ICP34.5基因之外的功能非必需基因。例如，該病毒可以進(jìn)一步缺少一個或多個選自VMW65、vhs、ICP0、ICP6和TK的功能性非必需基因。這些非必需基因中的兩種甚至三種可以因此被失活。
特別地，為了降低在體內(nèi)的毒性，我們已經(jīng)在本發(fā)明的HSV的非必需基因VMW65上插入了一種失活突變以降低立即早期(IE)基因的表達(dá)，以及因此這些基因的表達(dá)水平也受這些蛋白的調(diào)控。此外，我們也已經(jīng)生產(chǎn)出在編碼病毒體宿主關(guān)閉蛋白(vhs)基因上有缺失的單純皰疹病毒。Vhs是一種在病毒體中攜帶的蛋白，是使mRNA不穩(wěn)定和因此降低了有助于從更迅速生產(chǎn)的病毒RNA(其伴隨著一種野生型病毒的感染)的翻譯的宿主蛋白合成的原因。
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中的HSV也缺乏一個功能vhs基因和/或一個功能VMW65基因(由于在所述VMW65基因上的一處突變，該突變廢除了其轉(zhuǎn)錄活化的活性)。所以本發(fā)明中一種尤其優(yōu)選的病毒缺乏一個功能ICP4基因、一個功能ICP34.5基因、一個功能vhs基因和一個功能VMW65基因由于在所述VMW65基因上的一處突變，該基因廢除了其轉(zhuǎn)錄活化的活性。
本發(fā)明中的單純皰疹病毒可以被用于例如在治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷(包括帕金森病、脊柱損傷或中風(fēng)、或眼睛、心臟或骨骼肌的疾病、或惡性腫瘤)的方法上傳遞治療基因。本發(fā)明也涉及到在哺乳動物細(xì)胞中研究基因功能的方法，例如在鑒定互補(bǔ)細(xì)胞機(jī)能障礙的基因上，或者研究突變型基因在野生型或突變型哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的效果。本發(fā)明中的方法尤其可以用于對涉及疾病的基因的功能的研究。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明中的一種攜帶有一個異源基因的HSV。術(shù)語異源基因用來包括任何在HSV基因組中沒有發(fā)現(xiàn)的基因。異源基因可以是一種野生型基因的任何等位基因的變體，或者它可以是一種突變型基因。異源基因優(yōu)選的是與一段控制序列操作性連接以允許所述異源基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，優(yōu)選的細(xì)胞是中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞、或眼睛、心臟或骨骼肌的細(xì)胞，更優(yōu)選的細(xì)胞是中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。本發(fā)明中的HSV因此可以被用作將一種異源基因傳遞到哺乳動物細(xì)胞中，該基因?qū)⒃谠撎幈磉_(dá)。這種載體在許多應(yīng)用中都是有用的，例如，在基因治療、或體外分析方法或HSV基因調(diào)控的研究中。
異源基因優(yōu)選編碼一種具有治療作用的多肽，包括具細(xì)胞毒性或能夠?qū)⑺幬锴绑w的前體物轉(zhuǎn)換成一種具細(xì)胞毒性化合物的多肽類。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了單純本發(fā)明中的皰疹病毒，其帶有一種用于人類和動物的治療的異源基因。例如，這些病毒可以被用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或損傷，包括帕金森病、脊柱損傷或中風(fēng)、或眼睛、心臟或骨骼肌的疾病、或惡性腫瘤。
本發(fā)明中的HSV也可以被用于研究基因在哺乳動物的細(xì)胞中功能的方法中，例如在鑒定與細(xì)胞功能紊亂互補(bǔ)的基因中，或者研究突變型基因在野生型或突變型哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的效果。本發(fā)明中的方法尤其可以用于涉及疾病的基因的功能研究。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明中的一種單純皰疹病毒的方法，所述方法包括修飾一種單純皰疹病毒的ICP34.5和ICP4基因(以及任意VMW65和(或)vhs基因)，以使所述基因在功能上失活，條件是ICP27基因保持完整和(或)具有功能。
發(fā)明詳述A．病毒株系本發(fā)明中的單純皰疹病毒可以來自，例如，HSV1或HSV2株系、或它們的衍生物，優(yōu)選的是HSV1。衍生物包括含有來自HSV1和HSV2株系的DNA的中間型重組體。衍生物優(yōu)選地具有至少與HSV1或HSV2基因組有70％同源的序列，較優(yōu)選的是至少有80％，更為優(yōu)選的是至少有90或95％?？梢员皇褂靡缘玫奖景l(fā)明中的病毒的其它的衍生物包括已經(jīng)在ICP4、ICP34.5、VMW65或vhs中的任一上具有突變型的株系，例如株系1716(MacLean等，1991)、株系R3616和R4009(Chou和Roizman，1992)和R930(Chou等，1994)，所有這些在ICP34.5上具有突變，株系d120上ICP4被刪除(DeLuca等，1985)。這些株系的使用將減少生產(chǎn)本發(fā)明中突變型HSV株系所需的步驟數(shù)目。
用于描述各種HSV基因的術(shù)語如Coffin和Latchman在1996中所見。
B．互補(bǔ)細(xì)胞系本發(fā)明中的病毒在表達(dá)ICP4的細(xì)胞系中增殖，例如E5細(xì)胞(DeLuca等，1985)或B4細(xì)胞(見實施例1)，優(yōu)選的是B4細(xì)胞。
表達(dá)ICP4的細(xì)胞系可以通過共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞來生產(chǎn)，例如非洲綠猴腎細(xì)胞株系或BHK細(xì)胞，其中用一種載體，優(yōu)選的是一種質(zhì)粒載體、它含有一種可以在所述細(xì)胞中表達(dá)的功能HSV ICP4基因；以及一種載體，優(yōu)選的是質(zhì)粒載體、它可編碼一種選擇標(biāo)記，例如新霉素抗性。然后篩選帶有選擇標(biāo)記的克隆以進(jìn)一步確定哪個克隆也表達(dá)功能ICP4，例如基于它們支持ICP4-HSV株系生長的能力、使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法進(jìn)行。
不允許一種ICP4-突變型HSV株系退回到具有功能ICP4株系的細(xì)胞系如以上所描述的進(jìn)行生產(chǎn)，確保含有一個功能ICP4基因的載體不含有與保留在ICP4-突變型病毒中的序列重疊(即與之同源)的序列。
C．突變方法可以通過幾種本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)致使ICP4、ICP34.5、vhs和其它HSV基因功能性失活。例如，可以通過刪除、替代或插入使其功能性失活，優(yōu)選的是通過刪除。刪除可以除去基因的部分或整個基因。例如，可以僅刪除一個核苷酸，導(dǎo)致框架轉(zhuǎn)移。然而，優(yōu)選的是刪除較大部分，例如占總編碼和非編碼序列(或可選地，以絕對的術(shù)語，至少10個核苷酸，更優(yōu)選的是至少100個核苷酸，最優(yōu)選的是至少1000個核苷酸)的至少25％、更優(yōu)選的是至少50％。尤其優(yōu)選的是除去整個基因和一些側(cè)翼序列。插入的序列可以包括以下所描述的異源基因。特別地，優(yōu)選的是將異源基因插入到ICP4上。至于VMW65基因，不刪除其整個基因，因為它編碼一種必需的結(jié)構(gòu)蛋白，但進(jìn)行一個小的失活插入，其廢除了VMW65活化轉(zhuǎn)錄的IE基因的能力(如在Ace等，1989，Smiley和Duncan，1997中，或其它導(dǎo)致類似結(jié)果的突變)。
在單純皰疹病毒中通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的同源重組的方法制造突變，或者可選地，通過直接連接到線性HSV基因組DNA上，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知或開發(fā)的任何其它的方法。例如，HSV基因組DNA與一種載體(優(yōu)選的是一種質(zhì)粒載體，包括同源的HSV序列在其側(cè)面的突變序列)一起轉(zhuǎn)染。突變的序列可以包括刪除、插入或替代，所有這些可以通過常規(guī)的技術(shù)構(gòu)建。插入可以包括選擇性標(biāo)記基因，例如lacZ，以通過如β-半乳糖苷酶活性篩選重組體病毒。
D．異源基因和啟動子本發(fā)明中突變的型HSV株系可以被修飾以攜帶一種異源基因，也就是存在于HSV基因組中基因之外的一種基因。術(shù)語“異源基因”包括除了存在于HSV基因組中的基因以外的任何基因。異源基因可以是某一野生型基因的等位基因的變體，或者其可以是一個突變型基因。術(shù)語“基因”用來涵蓋至少可以被轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。因此編碼mRNA、tRNA和rRNA的序列包括在該定義內(nèi)。核酸可以是，例如，核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或它們的相似體。關(guān)于啟動子，這些序列可以為有義*或反義定向。反義構(gòu)建物可以依據(jù)熟知的技術(shù)被用于抑制某一基因在一種細(xì)胞中的表達(dá)。編碼mRNA的序列將選擇性地包括一些或全部的5’和(或)3’端天然被轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的側(cè)翼序列或者與被翻譯的編碼序列聯(lián)合。其可以選擇性地進(jìn)一步包括正常地與被轉(zhuǎn)錄的序列連接的聯(lián)合轉(zhuǎn)錄控制序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信號、多聚腺苷位點和下游增強(qiáng)子元件。
異源基因可以通過HSV株系與例如帶有異源基因(側(cè)面伴隨有HSV序列)的質(zhì)粒載體的同源重組而被插入到HSV基因組中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的克隆技術(shù)將異源基因引入到一種合適的、含有HSV序列的質(zhì)粒載體上。異源基因可以在任何位置插入到HSV基因組中，只要該病毒仍然可以增殖。優(yōu)選的是該異源基因被插入到必需的基因ICP4上。
異源基因的轉(zhuǎn)錄序列優(yōu)選地是與允許該異源基因在哺乳動物細(xì)胞(優(yōu)選的是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞)中表達(dá)的控制序列操作性連接。術(shù)語“操作性連接”是指毗鄰地定位，其中所描述的組分之間的關(guān)系允許它們以其預(yù)定的方式發(fā)揮功能。“操作性地連接”有一段編碼序列的一段控制序列以這樣一種方式連接，即該編碼序列的表達(dá)是在控制序列兼容的條件下達(dá)到的。
控制序列包含一個允許異源基因表達(dá)的啟動子和一段終止轉(zhuǎn)錄的信號。該啟動子選自在哺乳動物、尤其是在人類的細(xì)胞中起作用的啟動子。啟動子可以源自于真核基因的啟動子序列。例如，其可以是源自于該異源基因?qū)⒃谄渲斜磉_(dá)的細(xì)胞基因組的啟動子，優(yōu)選的是哺乳動物中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。至于真核啟動子，它們可以是以普遍存在的方式起作用的啟動子(如β-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)，或者，可選地，以組織特異性方式作用的啟動子(如丙酮酸激酶基因的啟動子)。它們也可以是響應(yīng)特定刺激的啟動子，例如結(jié)合類固醇激素受體的啟動子。也可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠類白血病毒長末端重復(fù)序列(MMLV LRT)啟動子或HSV基因的啟動子。
HSV LAT啟動子和包含LAT啟動子區(qū)域上的元件的啟動子可以是尤其優(yōu)選的，因為在潛伏期中存在達(dá)到異源基因長期表達(dá)的可能性。特別地，組成必需的LAT P2區(qū)域的一個表達(dá)彈夾，其本身不充當(dāng)啟動子，與一個啟動子和一個異源基因以該次序連接，它是尤其優(yōu)選的(WO98/30707)。
術(shù)語“長期表達(dá)”是用來表示一個異源基因在一種用本發(fā)明中的某一單純皰疹病毒感染的細(xì)胞中的表達(dá)，表達(dá)甚至是在該單純皰疹病毒進(jìn)入潛伏期之后。優(yōu)選地，這至少持續(xù)兩周，較優(yōu)選地在感染之后的至少一或兩個月，更為優(yōu)選的是持續(xù)細(xì)胞的生存期。
表達(dá)彈夾可以進(jìn)一步包括第二個啟動子和第二個異源基因，其在與第一個啟動子和第一個異源基因相反的定向上與所述HSV LAT P2區(qū)域以該次序操作性連接，其中所述第二個啟動子和第二個異源基因與第一個啟動子和第一個異源基因相同或不同。因此以相反的定向與允許異源基因?qū)﹂L期表達(dá)的單個LAT P2區(qū)域毗鄰的一對啟動子/異源基因構(gòu)建物，其可以相同或不同，受相同或不同的啟動子驅(qū)動。此外，在合適的生理條件下，第一個異源基因的產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)第二個異源基因的表達(dá)(或反之亦然)。
表達(dá)彈夾可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆技術(shù)的途徑進(jìn)行構(gòu)建(見，例如，Sambrook等，1989，《分子克隆-實驗室手冊》(Molecular Cloning-a laboratory manual)；Cold Spring HarborPress)。此外，含有這種表達(dá)彈夾的特定HSV株系的構(gòu)建在實施例中被描述。
此處LAT P2區(qū)域在HSV株系17+、該區(qū)域的片段或衍生物(包括HSV2和其它HSV1株系的同源區(qū)域)中被定義為HSV1核苷酸118866-120219(GenBank HELCG來自PstⅠ-BstⅪ位點)，其能夠為與之連接的啟動子提供長期表達(dá)。
也對啟動子有利的是可誘導(dǎo)性，以至異源基因的表達(dá)水平在細(xì)胞的生存期中可以被調(diào)控?？烧T導(dǎo)是表示使用啟動子獲得的表達(dá)水平可以被調(diào)控。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，其中將一種以上的異源基因插入到HSV基因組中，在HSV基因組中相同的位點上或是在不同的位點上，一個插入的啟動子將包含一個響應(yīng)以前所報導(dǎo)的tet阻抑物/VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合蛋白(Gossen和Buiard，1992，Gossen等，1995)并驅(qū)動異源基因表達(dá)(其表達(dá)受調(diào)控)的啟動子。第二個插入的啟動子將包括一個驅(qū)動tet阻抑物/VP16融合蛋白表達(dá)的強(qiáng)啟動子(如CMV IE啟動子)。因此，在該實施例中，第一個異源基因的表達(dá)將依賴于四環(huán)素的存在或不存在。一種以上的啟動子/異源基因(其表達(dá)水平受調(diào)控)彈夾將在本發(fā)明的實施方案中被插入到HSV基因組中，以允許多個基因的表達(dá)水平將受調(diào)控，如受四環(huán)素或其它來自使用中的可控制的啟動子的可以調(diào)節(jié)表達(dá)水平的物質(zhì)控制。
另外，任何這些啟動子可以通過加入另外的調(diào)控序列進(jìn)行修飾，例如增強(qiáng)子序列(包括LAT區(qū)域的元件)。也可以使用嵌合啟動子，其包括來自兩個或更多以上所描述的不同啟動子的序列元件，例如一種MMLV LTR/LAT融合啟動子(Lokensgard等，1994)或包含LAT區(qū)域元件的啟動子(見上文)。
該異源基因可以編碼例如涉及細(xì)胞分裂調(diào)控的蛋白，如促進(jìn)有絲分裂的生長因子包括神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(如腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、NGF、NT3、NT4和NT5、GAP43)、細(xì)胞因子(如α-、β-或γ-干擾素，白細(xì)胞介素包括ⅠL-1、ⅠL-2，腫瘤壞死因子，或胰島素樣生長因子Ⅰ或Ⅱ)、蛋白激酶(如MAP激酶)、蛋白質(zhì)磷酸酶和以上任何因子的細(xì)胞受體。該異源基因也可以編碼涉及細(xì)胞代謝途徑的酶，如涉及氨基酸生物合成或降解(如酪氨酸羥化酶)、嘌呤或嘧啶生物合成或降解、以及神經(jīng)遞質(zhì)(如多巴胺)的生物合成或降解的酶，或者是涉及這些途徑的調(diào)控的蛋白，例如蛋白激酶和磷酸酶。該異源基因也可以編碼涉及它們的調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白，例如Brn3族的成員(包括Brn3a、Brn3b和Brn3c)或Rb族的小型蛋白(如Rb或p107)、膜蛋白(如視紫紅質(zhì))、結(jié)構(gòu)蛋白(如肌營養(yǎng)不良蛋白)或熱激蛋白(如hsp27、hsp65、hsp70、和hsp90)。
優(yōu)選地，該異源基因編碼一種具有治療作用的多肽，或者其功能或功能的缺乏在疾病的過程中可能是重要的。例如，以上所描述的蛋白中，酪氨酸羥化酶可以被用于治療帕金森病，視紫紅質(zhì)可以被用于治療眼部病癥，肌營養(yǎng)不良蛋白可以被用于治療肌營養(yǎng)不良，以及熱激蛋白可以被用于治療與局部缺血應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的心臟或腦病癥。具有治療作用的多肽也可以包括細(xì)胞毒素多肽，如蓖麻毒蛋白，或可以將前導(dǎo)的藥物前體轉(zhuǎn)化為一種具細(xì)胞毒性化合物的酶(以用于，例如，病毒指導(dǎo)的酶藥物前體治療或基因指導(dǎo)的酶藥物前體治療的方法中)。在后一情況下，希望的是確保該酶具有一段合適的指導(dǎo)其到達(dá)細(xì)胞表面的信號序列，優(yōu)選的是允許酶暴露在細(xì)胞表面外部同時保持錨定在細(xì)胞膜上的信號序列。合適的酶包括細(xì)菌硝基還原酶(如WO93/08288中所公開的大腸桿菌硝基還原酶)或羧肽酶，尤其是如WO88/07378中所公開的羧肽酶CPG2。其它酶可以參照EP-A-415731中找到。合適的藥物前體包括氮芥藥物前體和其它如WO88/07378、WO089/10140、WO090/02729和WO93/08288(其作為參照結(jié)合在本文中)中所描述的化合物。
異源基因也可以編碼作為疫苗使用的抗原多肽。優(yōu)選的是這些抗原多肽來自于致病生物體，如細(xì)菌或病毒，或來自腫瘤。
異源基因也可以包括標(biāo)記基因(例如編碼β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白)或其產(chǎn)物調(diào)節(jié)其它基因表達(dá)的基因(例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包括以上所描述的tet阻抑物/VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合蛋白)。
基因治療和其它治療上的應(yīng)用有充分理由可以需要施用多個基因。多個基因的表達(dá)可能會有利于治療許多種疾病-如使用多個神經(jīng)營養(yǎng)因子。HSV是唯一適當(dāng)?shù)模驗槠洳痪哂衅渌《据d體系統(tǒng)的有限包裝能力。因此多個異源基因可以容納在其基因組中。舉例來說，有至少兩種途徑可以達(dá)到這一點。例如，一種以上的異源基因和相聯(lián)的控制序列可以被引入到一個特定的HSV株系中。也有可能使用以相反定向面對的成對的啟動子(相同或不同的啟動子)，其遠(yuǎn)離位于中央的LAT P2元件，這些啟動子每種驅(qū)動以上所描述的一個異源基因(相同或不同的異源基因)的表達(dá)?？蛇x擇地，異源基因可以被插入到HSV基因組中的多個位點上。
E．給藥本發(fā)明中突變型單純皰疹病毒因此可以被用于將治療基因傳遞到人類或動物中以應(yīng)治療的需要。使用本發(fā)明中突變型單純皰疹病毒傳遞治療基因可以治療例如帕金森病、神經(jīng)系統(tǒng)的病癥、脊柱損傷、中風(fēng)或惡性腫瘤(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤)。
一種被施用的基因治療的方法包括將治療基因插入到本發(fā)明中突變型單純皰疹病毒上，如以上所描述的，然后將所得到的重組體病毒與一種藥理上可接受的載體或稀釋劑混合，以得到一種藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲的鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。該組合物可以配制適于胃腸外、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)或經(jīng)皮給藥。
該藥物組合物以這樣一種方式給藥，即含有用于基因治療的治療基因的突變病毒可以在適當(dāng)?shù)奈恢媒Y(jié)合到細(xì)胞內(nèi)。例如，當(dāng)基因治療的目標(biāo)是中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)時，該組合物可以在突觸末梢所在的位置施用。該藥物組合物典型地是通過立體定位接種給藥到腦。當(dāng)該藥物組合物被給藥到眼部時，視網(wǎng)膜下注射是典型使用的技術(shù)。
所施用病毒劑量的變化范圍是從104到1010pfu(噬斑形成單位)，優(yōu)選的是從105到108pfu，更優(yōu)選的是約從106到107pfu。當(dāng)被注射時，一般給予的是在一種藥理上可接受的合適的載體或稀釋劑中1到10個病毒。
所描述的給藥途徑和劑量僅作為一個指導(dǎo)，因為一個熟練的醫(yī)師將可以容易地確定對于任何特定的病人和疾病最適宜的給藥途徑和劑量。
F．分析方法本發(fā)明中突變型單純皰疹病毒也可以用于科學(xué)研究的方法上。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及到在哺乳動物細(xì)胞中分析基因功能的方法，在體外或在體內(nèi)。某一異源基因的功能的確定可以通過的方法包括下列步驟(a)將上述異源基因引入到本發(fā)明的某一突變型單純皰疹病毒中；(b)將所得到的病毒引入到某一哺乳動物細(xì)胞系中；以及(c)確定所述異源基因在所述哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)效果。
例如，該細(xì)胞系可能在細(xì)胞分裂中存在溫度敏感的缺陷。當(dāng)含有依據(jù)本發(fā)明的異源基因的某一HSV株系被引入到該缺陷的細(xì)胞系和在限定性溫度下生長的細(xì)胞系中時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠很容易地確定該異源基因是否可以與細(xì)胞分裂中的缺陷互補(bǔ)。類似地，其它已知的技術(shù)可以被用于確定該異源基因的表達(dá)是否可以糾正哺乳動物細(xì)胞系中明顯的突變表型。
這一過程也可以被用于實現(xiàn)某一異源基因的體系誘變，以確定該基因編碼的蛋白的哪一部分涉及突變表型的恢復(fù)。
該方法也可以被用于動物中，例如小鼠，攜帶所謂“基因剔除”?？梢允褂帽景l(fā)明的一個突變型HSV株系將一種野生型的異源基因引入到動物中，使用各種本領(lǐng)域已知的行為學(xué)的、組織化學(xué)的或生物化學(xué)的方法來確定對動物影響?？蛇x擇地，某一突變型異源基因可以被引入到野生型的或“基因剔除型”的動物體內(nèi)，以確定是否誘導(dǎo)了與疾病相關(guān)的病狀。其中一個例子是使用編碼朊病毒的基因誘導(dǎo)嚙齒類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的Creutzfeld-Jacob和其它朊病毒型的疾病。其它疾病模型可以包括阿爾茨海默病、運動神經(jīng)元疾病或帕金森病的模型。
既然有可能由于HSV基因組的大容量而可以將至少兩種不同的異源基因引入到一個細(xì)胞中，也將有可能研究兩個或更多個基因產(chǎn)物之間的相互作用。
因此，本發(fā)明中的方法尤其可以用于涉及疾病的基因的功能研究。
本發(fā)明將從參考以下實施例進(jìn)行描述，這些實施例僅用做說明性的而不具限制性。
實施例實施例1-突變病毒的產(chǎn)生病毒具有致使VMW65轉(zhuǎn)錄激活活性功能性失活的突變的ICP34.5刪除的突變體，其產(chǎn)生是通過含有ICP34.5的兩個拷貝均被刪除的1716株系(MacLean等，1991)與含有一個功能性失活的VMW65基因的1814株系(Ace等，1989)的共同培養(yǎng)(在BHK細(xì)胞中，3mM HMBA)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(限制性消化已純化的基因組DNA及DNA印跡)分析所得到的噬菌斑的基因組結(jié)構(gòu)，含有1814及1716中的突變型病毒進(jìn)一步被噬斑純化五次，得到病毒株系1764。含有1814中的突變或其它影響VMW65轉(zhuǎn)激活活性的突變(如在Smiley和Duncan，1997中)的病毒生長的增強(qiáng)可以在病毒生長時通過使用含有六亞甲基二乙酰胺的培養(yǎng)基(McFarlene等，1992)而達(dá)到。
Vhs/ICP34.5/VMW65刪除的突變體的生產(chǎn)是通過質(zhì)粒pR15和HSV株系1764 DNA的同源重組以產(chǎn)生病毒1764/pR15，其ICP34.5、VMW65和vhs被刪除，具有一個受插入到vhs的編碼區(qū)域的莫洛尼鼠類白血病毒的長末端重復(fù)序列(MMLV LTR)的啟動子驅(qū)動的lacZ基因。質(zhì)粒pR15的構(gòu)建是通過將一段MMLVLTR/lacZ/pA彈夾插入到vhs基因中獨特的Nrul位點上。因此來自HSV1株系17+基因組的限制片段KpnⅠ-i克隆到質(zhì)粒pAT153的PstⅠ位點上(Northumbria Biologicals Ltd)。
ICP4的兩個拷貝均從株系1716和株系1764/pR15中被除去。這是通過純化的株系1716或株系1762/pR15的基因組DNA與質(zhì)粒pΔ4/GFP的同源重組達(dá)到的。pΔ4/GFP的構(gòu)建使用了ICP4側(cè)翼序列(nts123，459-126，774[Sau3aⅠ-Sau3aⅠ]和nts131，730-134-792[SphⅠ-KpnⅠ]，通過來自pSP72[Promega]的XbaⅠ和SalⅠ位點分離，構(gòu)建物在該處制造)。一段含有ICP34.5的編碼區(qū)域的大約0.8kb的NotⅠ片段(nts124，945-125，723)也被除去，以阻止在與株系1716或株系1764/pR15同源重組的過程中對ICP34.5刪除的修復(fù)。然后將一段CMV/GFP/pA彈夾插入到所得到的pΔ4/GFP的獨特的XbaⅠ位點上。首先從pEGFPN1(Clontech)中用AgeⅠ和NotⅠ切除CMV基因，然后將其插入到pcDNA3(Invitrogen)的EcoRⅠ和NotⅠ位點之間以得到pcDNA3GFP。然后可以將CMV/GFP/pA彈夾從pcDNA3GFP中切除以通過NruⅠ和BbsⅠ插入到ICP4側(cè)翼區(qū)域中。接著通過如以前的同源重組將pΔ4/GFP引入到株系1716和株系1764/pR15中，GFP表達(dá)斑通過熒光顯微鏡檢術(shù)和對B4細(xì)胞進(jìn)行噬斑純化(以下所描述)鑒定，得到病毒株系1716/Δ4和病毒株系1764/pR15Δ4。噬斑純化的病毒不能對不表達(dá)ICP4的BHK細(xì)胞形成生產(chǎn)性感染。
病毒株系17+/Δ4的制備如以上，除了使用株系17+基因組DNA和一種含有ICP4側(cè)翼區(qū)域的質(zhì)粒(ICP34.5基因沒有通過除去NotⅠ片段從其中被刪除)。
核苷數(shù)目參照HSV1株系17+序列(Genbank no.HEICG)。使用互補(bǔ)細(xì)胞系的突變型HSV株系的生長允許ICP4刪除的病毒生長的一種互補(bǔ)細(xì)胞系(B4)的產(chǎn)生是通過質(zhì)粒pICP4 DNA和編碼新霉素抗性質(zhì)粒pMamNeo(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞中和選擇新霉素抗性克隆達(dá)到的。質(zhì)粒pICP4含有來自HSV1基因組的DdeⅠ-SphⅠ片段[nts126，764-131，730]，其包括從pSP72(Promega)的EcoRV和SphⅠ位點之間克隆出來的ICP4的編碼區(qū)域和啟動子。
選擇高度允許HSV1 ICP4刪除型突變體(B4)生長的克隆以適應(yīng)病毒生長。
實施例2-使用本發(fā)明中的HSV1株系在體外感染非神經(jīng)元細(xì)胞。
使用類似于Samaniego等，1998的方法，在非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞中以高感染復(fù)數(shù)(MOI)測試本發(fā)明中的HSV株系在細(xì)胞培養(yǎng)物中的存活率。病毒基因組的存活率，基因表達(dá)可以從中被再激活，提供了病毒對細(xì)胞的細(xì)胞毒性程度的指示。此處非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞在24孔平板上以每個株系(1764/pR15Δ4、1716/Δ4和17+/Δ4)的MOI值為20被感染。然后在34℃/5％ CO2下溫育細(xì)胞以進(jìn)行剩下的實驗。隨時間觀察GFP的熒光，在不同的時間(2天、1周、2周和1個月)以HSV株系zΔMN+(其包含一個插入到ICP27基因中的lacZ；Howard等，1998)的MOI值為20超感染細(xì)胞培養(yǎng)物。
這些實驗顯示在使用每種病毒的2天之后，在每種培養(yǎng)物中＞95％的細(xì)胞內(nèi)均可觀察到強(qiáng)熒光，雖然在被1716/Δ4和17+/Δ4感染的培養(yǎng)物中細(xì)胞毒性的信號很明顯(可以觀察到一些正常細(xì)胞形態(tài)的丟失)。用1764/pR15Δ4感染的細(xì)胞顯示出與未感染的對照細(xì)胞完全相同的細(xì)胞形態(tài)，這顯示該病毒的毒性降低，雖然可以觀察到細(xì)胞分裂的速度短暫地降低。在感染之后的1周以及隨后達(dá)到一個月的時間點時，非超感染的細(xì)胞在每種情況下顯示出GFP熒光的減小。然而，在某種程度上的所有情況下，當(dāng)在一周時這種熒光可以被病毒zΔMN+的轉(zhuǎn)染再激活，在2周和1個月的時間點時，GFP熒光僅可以在最初被1764/pR15Δ4感染的細(xì)胞內(nèi)被明顯地再激活，又一次證明了該病毒的毒性降低。
實施例3-在體外使用本發(fā)明中的HSV1株系感染初級神經(jīng)元細(xì)胞在體外使用腸神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物(來自7天齡的Sprague-Dawley大鼠的腸-Saffrey等，1991)測試本發(fā)明中的HSV株系的毒性。與1716、1764、17+/Δ4或1764/pR15相比，在96孔的微量滴定平板上用2x106pfu/孔的1764/pR15Δ4處理培養(yǎng)物3天之后，這些培養(yǎng)物顯示出成活率(如錐蟲藍(lán)染色評定)和神經(jīng)元形態(tài)的維持提高很大。因此用1764/pR15Δ4處理3天之后，80％的細(xì)胞維持神經(jīng)元突起，相比之下1764/pR15大約為20％，17+/Δ4為35％。
使用1764/pR15Δ4、17+/Δ4或1764/pR15，大于90％的存活細(xì)胞顯示出標(biāo)記基因活性(lacZ和(或)GFP依賴于使用的病毒)，從而在體外使用病毒載體顯示出有效的基因轉(zhuǎn)染。相比于其它所使用的病毒，當(dāng)該病毒在體內(nèi)作為載體使用時，尤其是在需要長期基因表達(dá)的位置上，1764/pR15Δ4大大降低的毒性可能是有利的。
與ICP4一起除去ICP34.5提供了一種與單獨刪除ICP4相比其安全特性大大提高的病毒。這是因為ICP34.6基因?qū)τ诓《驹谂囵B(yǎng)基中的生長是不需要被互補(bǔ)的，因此該突變在病毒的生長過程中絕對不會被修復(fù)。因此即使ICP4在病毒生長時被再結(jié)合修復(fù)，所得到的病毒將仍然是被刪除ICP34.5的，以及因此在體內(nèi)作為載體使用將仍然是安全的。當(dāng)體內(nèi)注射到實驗動物腦部時，僅刪除ICP34.5的病毒不具有神經(jīng)毒力(見Chou等，1990)。在VMW65和vhs上的進(jìn)一步失活突變進(jìn)一步降低了毒性。
實施例4-體內(nèi)的基因傳遞立體定位接種Sprague-Dawley大鼠的紋狀體，使用5x10exp7pfu/ml的每種病毒原種5微升，在10分鐘的時間內(nèi)接種，使用了一種與哈密頓注射器連接的UltraMicroPump(World PrecisionInstruments)并采用一種MicroFil針(World PrecisionInstruments)進(jìn)行注射，之后評定株系1764/pR15Δ4、1716/Δ4和17+/Δ4在體內(nèi)的基因傳遞效率。在接種的兩天、兩周和一個月后成對處死大鼠，通過在磷酸鹽緩沖液中灌注2％中甲醛固定、解剖、通過熒光顯微鏡檢術(shù)測定GFP的表達(dá)，之后進(jìn)行基因傳遞的評定。
兩天以后，在所有病毒接種的位點周圍的大量細(xì)胞中，可以看到GFP高水平表達(dá)。因此最初的基因傳遞效率在僅刪除ICP4和刪除ICP4及ICP34.5的病毒之間是可以比較的。因此刪除ICP34.5不降低ICP4被刪除的病毒作為載體的效率，即使這種病毒具有相對于僅刪除ICP4的病毒安全性提高的優(yōu)點。然而兩周以后，在被1716Δ4和17+/Δ4接種的動物體內(nèi)僅可以觀察到相對較小數(shù)目的GFP+ve細(xì)胞，在經(jīng)1764/pRl5Δ4接種的動物體內(nèi)可以觀察到明顯較大數(shù)目的GFP+ve細(xì)胞，這進(jìn)一步證明了該病毒毒性的降低。一個月時，經(jīng)1716Δ4和17+/Δ4接種的動物體內(nèi)沒有觀察到GFP+ve細(xì)胞，一些GFP+ve細(xì)胞保留在經(jīng)1764/pRl5Δ4接種的動物體內(nèi)(GFP此處受CMV IE啟動子的驅(qū)動)，再次進(jìn)一步證明了這一點。當(dāng)用X-gal染色時，來源于經(jīng)1764/pRl5Δ4接種的動物的腦切片在一個月時顯示出比GFP+ve細(xì)胞明顯較多的染成藍(lán)色的細(xì)胞(指示lacZ活性)，可能反映了此處用于驅(qū)動lacZ的啟動子的活性，其與以前在體內(nèi)顯示在HSV的潛伏期引起基因表達(dá)的啟動子十分類似(Lokensgard等，1994)。
參考文獻(xiàn)Coffin RS，Latchman DS.“以單純皰疹病毒為基礎(chǔ)的載體”(Herpes simplex virus-based vectors.)在Latchman DS(編輯)?！渡窠?jīng)系統(tǒng)的遺傳操作》(Genetic manipulation of the nervoussystem.)Academic PressLondon，1996，第99-114頁。
MacLean AR等?！皢渭儼捳睥裥筒《救笔ё凅w1714和1716確認(rèn)立即早期基因Ⅰ與‘a(chǎn)’序列之間格拉斯哥株系17+中的神經(jīng)毒力相關(guān)序列”(Herpes simplex virus type Ⅰ deletion variants 1714 and1716 pinpoint neuroviruience related sequences in Glasgowstrain 17+between immediate early gene Ⅰ and the’a’sequence.)《遺傳病毒學(xué)雜志》(J Gen Virol)1991；72632-639。
Shinnick TM等“莫洛泥鼠類白血病毒的核苷酸序列”(Nucleotide sequence of Moloney murine leukaemia virus.)《自然》(Nature)1981；293543-548。
Morgenstern JP和Land H.“一系列哺乳動物表達(dá)載體及其在穩(wěn)定和暫時轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)報道基因的特征記述”(A series ofmammalian expression vectors and characterisation of theirexpression of a reporter gene in stably and transientlytransfected cells.)NAR 1990.；181068。
Ace C等“不能輸運誘導(dǎo)立即早期基因表達(dá)的單純皰疹Ⅰ型病毒突變體的構(gòu)建和特征記述”(Construction and characterisation ofa herpes simplex virus type Ⅰ mutant unable to transinduceimmediate early gene expression.)《病毒學(xué)雜志》(J Virol)1989；632260-2269。
McFarlane M，Daksis JI，Preston CM.“在沒有VMW65輸運誘導(dǎo)的情況下文亞甲基二乙酰胺刺激單純皰疹病毒立即早期基因的表達(dá)”(Hexamethylene bisacetamide stimulates herpes-simplexvirus immediate early gene-expression in the absence oftrans-induction by VMW65.)《遺傳病毒學(xué)雜志》(J Gen Virol)1992；73285-292。
Reef Hardy，W和Sandri-Goldin RM.“單純皰疹病毒抑制宿住細(xì)胞剪接和要求調(diào)節(jié)蛋白ICP27有這種作用”(Herpes simplex virusinhibits host cell splicing and regulatory protein ICP27 isrequired for this effect)《病毒學(xué)雜志》(J.Virol)1994；687790-7799。
Dobson，AT等“一種潛伏的非致病HSVI衍生的載體穩(wěn)定表達(dá)小鼠神經(jīng)元中的β-半乳糖苷酶”(A latent，non-pathogenic HSVI-derived vector stably expresses β-galactosidase in mouseneurons.)《神經(jīng)元》(Neuron)1990；5353-360。
Chou，J.，Kem，ER，Whtley，RJ和Roizman，B.“單純皰疹Ⅰ型病毒神經(jīng)毒力對培養(yǎng)基中生長非必需基因CY34.5的作圖”(Mappingof herpes simplex virus-lneurovirulence to(134.5，a genenonessential for growth in culture.)《科學(xué)》(Science)1990；2501262-1266。
Chiocca，AE等“鼠腦神經(jīng)元中由單純皰疹病毒突變體轉(zhuǎn)移和表達(dá)LacZ基因”(Transfer and expression of the lacZ gene in ratbrain neurons by herpes simplex virus mutants.)《新編生物學(xué)》(New Biol.)1990；2739-736。
Chou.J.和Roizman，B.“單純皰疹Ⅰ型病毒的(γ134.5基因使成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞不能引發(fā)以神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)程序性細(xì)胞死亡為特征的全部蛋白質(zhì)合成的停止”(The(γ134.5 gene of herpes simplexvirus Ⅰ precludes neuroblastoma cells from triggering totalshutoff of protein synthesis characteristic of programmedcell death in neuronal cells.)PNAS 1992；893266-3270。
Chou，J.，Poon，A.PW，Johnson，J.和Roizman B.“人體細(xì)胞對單純皰疹病毒(134.5基因中缺失和終止密碼子的差示反應(yīng)”(Differential response of human cells to deletions and stopcodons in the(134.5 gene of herpes simplex virus.)《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)1994；688304-8311。
DeLuca NA等《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)1985；56558-570。
Lokensgard JR等《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)1994；687148-7158。
Saffrey等，《細(xì)胞和組織培養(yǎng)研究》(Cell and Tissue CultureResearch.)1991；265527-534Smiley JR和Duncan J，《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)1997；716191-6193。
Howard MK等《基因療法》(Gene Therapy)1998；51137-1147。
Samaniego LA等《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)1998；723307-3320。
權(quán)利要求
1．一種具有一個功能ICP27基因的單純皰疹病毒(HSV)，其缺乏至少一個功能ICP4基因和一個功能ICP34.5基因。
2．一種根據(jù)權(quán)利要求1中所述的病毒，其進(jìn)一步缺乏一個或多個除ICP34.5基因外的功能性非必需的基因。
3．一種根據(jù)權(quán)利要求2中所述的病毒，其缺乏一個功能vhs基因。
4．一種根據(jù)權(quán)利要求2或3中所述的病毒，其缺乏一個功能VMW65基因，這是由于所述基因中的一個突變廢除了其轉(zhuǎn)錄激活的活性。
5．一種根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項所述的病毒，其中ICP4、ICP34.5和(或)非必需基因的缺乏是由于所述基因內(nèi)的刪除或在其中的插入。
6．一種具有一個功能ICP27基因的單純皰疹病毒，其缺乏一個功能ICP4基因、一個功能ICP34.5基因、一個功能vhs基因和一個功能VMW65基因，這是由于在上述VMW65基因上的突變廢除了其轉(zhuǎn)錄激活的活性。
7．一種根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項所述的病毒，其選自一種HSV1株系、一種HSV2株系或它們的衍生物。
8．一種根據(jù)權(quán)利要求7中所述的病毒，其是一種HSV1株系。
9．一種根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項所述的病毒，其帶有至少一個異源基因。
10．一種根據(jù)權(quán)利要求9中所述的病毒，其中所述異源基因與一段允許所述異源基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的操縱序列操作性連接。
11．一種根據(jù)權(quán)利要求10中所述的病毒，其中所述哺乳動物細(xì)胞是某一哺乳動物的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。
12．一種根據(jù)權(quán)利要求10中所述的病毒，其中所述哺乳動物細(xì)胞是某一哺乳動物的眼部、心臟或骨骼肌的細(xì)胞。
13．一種根據(jù)權(quán)利要求9到12中任意一項所述的病毒，其中所述異源基因編碼一種具有治療作用的多肽。
14．一種根據(jù)權(quán)利要求13中所述的病毒，其中所述基因編碼的多肽具細(xì)胞毒性。
15．一種根據(jù)權(quán)利要求13中所述的病毒，其中上述基因編碼的多肽可以將一種藥物前體的前體物轉(zhuǎn)化成一種細(xì)胞毒性化合物。
16．一種根據(jù)權(quán)利要求10到13中任意一項所述的病毒，其中的異源基因是選自編碼涉及細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)的蛋白、涉及代謝途徑的酶、轉(zhuǎn)錄因子和熱激蛋白的基因。
17．一種根據(jù)權(quán)利要求10中所述的病毒，其是用于將所述異源基因傳遞到某一哺乳動物細(xì)胞內(nèi)。
18．一種根據(jù)權(quán)利要求10到17中任意一項所述的，用于治療人類或動物身體的方法的病毒。
19．一種根據(jù)權(quán)利要求18中所述的用于治療某一哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂或損傷的病毒。
20．一種根據(jù)權(quán)利要求10到17中任意一項所述的單純皰疹病毒在制造用于治療人類或動物體的藥物上的用途。
21．權(quán)利要求20中所述的單純皰疹病毒在治療某一哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂或損傷上的用途。
22．一種含有權(quán)利要求10到17中任意一項中所述的一種HSV株系以及一種藥理上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
23．一種研究某一異源基因在哺乳動物細(xì)胞中的功能的方法，該方法包括下列步驟(a)將所述異源基因引入到權(quán)利要求1到8中任意一項中所述的單純皰疹病毒內(nèi)；(b)將所得到的單純皰疹病毒引入到所述哺乳動物細(xì)胞內(nèi)；以及(c)測定所述異源基因在所述哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的效果。
24．一種根據(jù)權(quán)利要求23中所述的方法，其中所述異源基因是一種涉及引起疾病的野生型或突變型基因。
25．一種根據(jù)權(quán)利要求23或24中所述的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是功能紊亂的，所述基因是野生型的，以及所述異源基因的表達(dá)效果由細(xì)胞功能的分析來確定。
26．一種根據(jù)權(quán)利要求23或24中所述的方法，其中所述哺乳動物的細(xì)胞含有一個或多個被突變失活的內(nèi)源基因。
27．一種生產(chǎn)權(quán)利要求1中所述的單純皰疹病毒的方法，所述方法包括修飾某一單純皰疹病毒的至少ICP4和ICP34.5基因，以使所述基因功能性失活，條件是所述ICP27基因保持完整性和(或)功能性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種皰疹單純病毒,其具有一個功能ICP27基因并缺少至少一個功能ICP4基因和一個功能ICP34.5基因。本發(fā)明還提供了一種缺少至少一個功能ICP4基因和一個功能ICP34.5基因的單純皰疹病毒株系在治療哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的失調(diào)、或損傷上的用途。
文檔編號A61K35/76GK1295612SQ9980460
公開日2001年5月16日 申請日期1999年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月29日
發(fā)明者R·S·科芬, D·S·拉特克曼, N·J·芬尼 申請人:拜奧維克斯有限公司