專(zhuān)利名稱：檢測(cè)單純皰疹病毒I型抗體IgM的免疫膠體金試劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)抗體的免疫膠體金試劑，還涉及該試劑的制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有用于檢測(cè)單純皰疹病毒I型抗體IgM的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附、放射免疫試驗(yàn)、免疫膠體金滲濾法、免疫印跡試驗(yàn)(WBA)等。酶聯(lián)免疫吸附(EIA)方法的缺陷是需要專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備如酶標(biāo)儀來(lái)配合使用；檢測(cè)操作人員需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)；操作過(guò)程相對(duì)比較復(fù)雜，檢測(cè)所需時(shí)間比較長(zhǎng)；檢測(cè)所需費(fèi)用較高，不能實(shí)現(xiàn)單人份檢測(cè)。免疫膠體金滲濾法的缺陷是操作過(guò)程相對(duì)比較復(fù)雜，不能實(shí)現(xiàn)一步操作；試劑需要低溫保存；檢測(cè)所需費(fèi)用較高；檢測(cè)所需時(shí)間比膠體金免疫層析法要長(zhǎng)。放射免疫試驗(yàn)的缺陷是操作人員需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)；操作過(guò)程復(fù)雜，要求高；試劑需要低溫保存；由于試驗(yàn)涉及到放射性同位素，試驗(yàn)不是很安全，所以很少采用；檢測(cè)費(fèi)用較高；檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)。免疫印跡試驗(yàn)(WBA)的缺陷是操作人員需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)；操作過(guò)程復(fù)雜，要求高；試劑需要低溫保存；目前尚無(wú)商品化的HSV血清抗體的蛋白印跡檢測(cè)試劑盒面世，這種方法僅限于某些專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行；檢測(cè)費(fèi)用高；檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服當(dāng)前技術(shù)在推廣使用中存在的缺陷，提供一種不需要特定儀器設(shè)備輔助的檢測(cè)試劑，并且能有效地降低檢測(cè)成本，減輕需檢測(cè)人員的負(fù)擔(dān)。同時(shí)提供該試劑的制備方法。
檢測(cè)單純皰疹病毒I型抗體IgM的免疫膠體金試劑包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊，其特征在于結(jié)合墊包被了抗u鏈單克隆抗體—膠體金的結(jié)合物，硝酸纖維素膜上包被了單純皰疹病毒I型特異性表面膜抗原和羊(或兔)抗鼠IgG。
該試劑的制備方法包括以下步驟(1)制備單克隆抗體取雜交瘤細(xì)胞株在體外常規(guī)培養(yǎng)、傳代，用人源性的u鏈注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以親和層析法提純抗u鏈單克隆抗體；(2)制備多克隆抗體用人源性的u鏈多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG；(3)制備膠體金用檸檬酸三鈉等還原劑將氯金酸還原成20nm～40nm的膠體金顆粒；(4)制備抗u鏈單克隆抗體膠體金標(biāo)記物將膠體金與單克隆抗體按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混勻，使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過(guò)純化濃縮形成抗u鏈單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物；(4)將抗u鏈單克隆抗體膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將抗單純皰疹病毒I型特異性表面膜抗原和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)，充分干燥。
本發(fā)明的積極效果在于價(jià)格低廉，生產(chǎn)流程簡(jiǎn)單，成本低，檢測(cè)的費(fèi)用比使用其它檢測(cè)方法要便宜得多；檢測(cè)速度快，全過(guò)程只需30分鐘，可以實(shí)現(xiàn)自我檢測(cè)；可以現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好；操作簡(jiǎn)便，快速定性，結(jié)果準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需沖洗過(guò)程和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可分批或單個(gè)樣品及時(shí)檢測(cè)；易于推廣使用，操作人員無(wú)需專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，按說(shuō)明書(shū)即可完成操作。
具體實(shí)施例方式
將PVC背襯一端依次粘附樣品墊、包被了抗u鏈單克隆抗體和膠體金結(jié)合物的結(jié)合墊，中間粘附包被了單純皰疹病毒I型特異性表面膜抗原和羊(或兔)抗鼠IgG的硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。
按以下步驟制備(1)制備單克隆抗體取雜交瘤細(xì)胞株在體外常規(guī)培養(yǎng)、傳代，用人源性的u鏈注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以親和層析法提純抗u鏈單克隆抗體；(2)制備多克隆抗體用人源性的u鏈多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG；(3)制備膠體金將100ml 0.01％氯化金用0.9ml 1％檸檬酸三鈉還原成40nm大小的顆粒；(4)制備抗u鏈單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用0.1mol/LK2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至8.2左右，將膠體金溶液與單克隆抗體按100ml膠體金溶液中加入1mg單克隆抗體的比例混合均勻，使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的膠體金復(fù)合物，再通過(guò)多次離心、棄上清、清洗，通過(guò)純化濃縮形成抗u鏈單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物，冷藏備用；(5)用Biodot點(diǎn)膜機(jī)將抗u鏈單克隆抗體膠體金標(biāo)記物噴涂在膠體金結(jié)合墊上，將抗單純皰疹病毒I型特異性表面膜抗原和羊(兔)抗鼠IgG噴涂在硝酸纖維素膜上，充分干燥；(6)將硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊等依次粘在PVC背襯上；(7)將粘好的PVC材料切成一定寬度的試劑條，即制成檢測(cè)單純皰疹病毒I型抗體IgM的免疫膠體金試劑。
在檢測(cè)前先將樣本和試劑條(板)放在室溫條件下放置一段時(shí)間(10分鐘)，使其恢復(fù)至室溫；從鋁箔袋中取出檢測(cè)試劑條，按MARK線下箭頭所示的方向?qū)⒃噭l浸入樣本溶液中，液面不得超過(guò)MARK線，5秒～8秒后取出，平放在操作臺(tái)上；如果是試劑板從鋁箔袋中取出檢測(cè)試劑板，平放在操作臺(tái)上，往加樣孔中滴加3滴(約120ul)樣品溶液(血清)；3分鐘～15分鐘內(nèi)即可判斷結(jié)果，30分鐘后判斷的結(jié)果為無(wú)效。
結(jié)果判斷如果樣品中有要檢測(cè)的“單純皰疹病毒I型抗體IgM”存在，則檢測(cè)線處出現(xiàn)紅色條帶，同時(shí)質(zhì)控線上也出現(xiàn)紅色條帶，此時(shí)結(jié)果為陽(yáng)性；如果樣品中沒(méi)有要檢測(cè)的“單純皰疹病毒I型抗體IgM”存在，則檢測(cè)線處無(wú)條帶出現(xiàn)，但質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，此時(shí)結(jié)果為陰性。如果質(zhì)控線上沒(méi)有紅色條帶出現(xiàn)，則產(chǎn)品無(wú)效。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)單純皰疹病毒I型抗體IgM的免疫膠體金試劑及制備方法，該試劑包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊，其特征在于結(jié)合墊包被了抗u鏈單克隆抗體-膠體金的結(jié)合物，硝酸纖維素膜上包被了單純皰疹病毒I型特異性表面膜抗原和羊(或兔)抗鼠IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)單純皰疹病毒I型抗體IgM的免疫膠體金試劑及制備方法，其特征在于該試劑的制備方法包括以下步驟(1)制備單克隆抗體取雜交瘤細(xì)胞株在體外常規(guī)培養(yǎng)、傳代，用人源性的u鏈注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以親和層析法提純抗u鏈單克隆抗體；(2)制備多克隆抗體用人源性的u鏈多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG；(3)制備膠體金用檸檬酸三鈉等還原劑將氯金酸還原成20nm～40nm的膠體金顆粒；(4)制備抗u鏈單克隆抗體膠體金標(biāo)記物將膠體金與單克隆抗體按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混勻，使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過(guò)純化濃縮形成抗u鏈單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物；(4)將抗u鏈單克隆抗體膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將抗單純皰疹病毒I型特異性表面膜抗原和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)，充分干燥。
全文摘要
檢測(cè)單純皰疹病毒I型抗體IgM的免疫膠體金試劑及制備方法，該試劑將PVC背襯一端依次粘附樣品墊、包被了抗u鏈單克隆抗體和膠體金結(jié)合物的結(jié)合墊，中間粘附包被了單純皰疹病毒I型特異性表面膜抗原和羊(或兔)抗鼠IgG的硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。該試劑是一種特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)易快速、費(fèi)用低廉、能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，全過(guò)程只需30分鐘，操作人員無(wú)需專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，按說(shuō)明書(shū)即可完成操作。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1431505SQ0311513
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2003年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者張少恩 申請(qǐng)人:湖州瑞澤生物技術(shù)有限公司