專利名稱：千金藤素用于制備抗單純皰疹病毒Ⅱ型的藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及千金藤素的新用途，尤其是涉及千金藤素用于制備抗單純皰疹病毒II型的藥物的用途。
背景技術：
千金藤素(cepharanthine)系雙芐基異喹啉類生物堿，從防己科千金藤Stephaniajaponiaca(Thunb 1)Miers中提取而得。千金藤素的作用是能促進骨髓組織增生，從而升高白細胞。臨床上主要用于白細胞減少癥。另外有研究發(fā)現(xiàn)千金藤素能抑制NF-κ逆轉MDR，促進耐藥細胞凋亡。國外研究發(fā)現(xiàn)該類生物堿中有許多具有較強的抗炎、抗病毒、抗溶血、抗腫瘤作用，能刺激網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)，活化造血組織，促進骨髓增生。
生殖器皰疹又稱陰部皰疹，是由單純皰疹病毒(Herps Simplex Virus，HSV)引起的性傳播性疾病。生殖器皰疹的發(fā)病率在性病中僅次于淋病和梅毒，居性病發(fā)病率的第三位，在由病毒所引起的性傳播疾病中占第一位。
單純皰疹病毒為RNA病毒，從免疫抗原性及生物學特性將病毒區(qū)分為I型和II型。I型病毒主要是通過呼吸道、皮膚和粘膜的密切接觸傳播，感染腰以上部位的皮膚粘膜和器官，如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼結膜、咽喉部的炎癥及皰疹，口和口周圍發(fā)生的皰疹，99％是由I型皰疹病毒感染引起的。II型病毒感染生殖器，主要通過性生活傳播，是引起生殖器發(fā)炎和皰疹的主要原因，與宮頸癌關系密切。據(jù)有關統(tǒng)計資料顯示，生殖器皰疹的病原體90％為II型皰疹病毒。臨床上，必須針對不同的感染部位甄別所感染不同的病毒，然后用藥施治。目前，采用通用的抗病毒合成類藥物，如無環(huán)鳥苷(ACV)、阿糖腺苷(Ara-A)等來治療HSV-I和HSV-II所引發(fā)的感染。這些藥物雖然有一定療效，但毒副作用較顯著，并易引起病毒耐藥。目前尚缺乏對這兩種病毒有針對性療效的抗病毒藥物。而且，由于I型和II型的差異，其抗病毒藥物的研究也必須分別進行篩選和試驗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供千金藤素(Cepharanthine)用于制備抗單純皰疹病毒II型的藥物的用途。
本發(fā)明以單純皰疹病毒II型(HSV-H)毒株和Vero細胞為實驗對象，觀察千金藤素的對抗單純皰疹病毒II型的活性。結果證明(1)千金藤素對HSV-II感染的細胞具有預防作用；(2)千金藤素對HSV-II感染的細胞具有治療作用；(3)千金藤素可降低HSV-II對Vero細胞的感染性；(4)千金藤素對HSV-II具有直接殺傷作用，使HSV-II感染的Vero細胞的活性下降?；谏鲜鲅芯拷Y果，本發(fā)明證實了千金藤素具有預防和治療單純皰疹病毒II型感染引起的疾病的新用途，可用于制備抗單純皰疹病毒II型的藥物。
本發(fā)明提供了抗單純皰疹病毒II型的藥物組合物，包括有效治療劑量的作為活性成分的千金藤素，以及藥物學上可接受的載體。
本發(fā)明所述的抗單純皰疹病毒II型的藥物組合物，由千金藤素與相應載體制備的藥物劑型包括片劑、膠囊、口服液、針劑或粉針劑。
由于千金藤素是一種已知的中藥提取物，其組成、結構、性質是已知技術，片劑、膠囊、口服液、針劑或粉針劑等藥物劑型的制備也是本領域的常規(guī)知識，因此，在千金藤素的新用途已經(jīng)能夠確認的前提下，由千金藤素與相應載體制備的各種藥物劑型也能夠由本領域技術人員容易實現(xiàn)。
本發(fā)明提供了千金藤素用于制備治療生殖器皰疹的藥物的用途。
本發(fā)明提供了用于治療生殖器皰疹的藥物組合物，包括有效治療劑量的作為活性成分的千金藤素，以及藥物學上可接受的載體。
本發(fā)明所述的治療生殖器皰疹的藥物組合物，由千金藤素與相應載體制備的藥物劑型包括片劑、膠囊、口服液、針劑或粉針劑。
由于千金藤素是一種已知的中藥提取物，其組成、結構、性質是已知技術，片劑、膠囊、口服液、針劑或粉針劑等藥物劑型的制備也是本領域的常規(guī)知識，因此，在千金藤素的新用途已經(jīng)能夠確認的前提下，由千金藤素與相應載體制備的各種藥物劑型也能夠由本領域技術人員容易實現(xiàn)。
本發(fā)明的有益效果在于千金藤素對HSV-II感染的細胞具有預防和治療作用。千金藤素可降低HSV-II對Vero細胞的感染性。千金藤素對HSV-II具有直接殺傷作用，使HSV-II感染的Vero細胞的活性下降。將千金藤素用于制備抗單純皰疹病毒II型的藥物，尤其是用于制備治療生殖器皰疹的藥物，對于由單純皰疹病毒II型感染而引起的疾病，尤其是生殖器皰疹，具有重要的開發(fā)與應用前景。


圖1為正常細胞對照組的顯微鏡圖(10×10倍)；圖2為病毒對照組的顯微鏡圖(10×10倍)；圖3為千金藤素實驗組顯微鏡圖(10×10倍)。
具體實施例方式
(一)材料1、器材進口96孔培養(yǎng)板(平底)、倒置顯微鏡、CO2細胞培養(yǎng)箱、微量可調加樣器、培養(yǎng)基為DMEM(含青鏈雙抗各250U/ml)，除菌過濾前用碳酸氫鈉調pH至7.0-7.2、小牛血清經(jīng) 56℃30min滅活補體，除菌分裝；消化液為5％胰蛋白酶5ml+1％EDTA 2ml+0.01mol/L(pH7.2)PBS 93ml，除菌分裝，低溫保存。
2、病毒和細胞株單純皰疹病毒II型毒株是來源于武漢大學病毒研究所的HSV-II333株，由申請人所在的實驗室保存。Vero細胞購于美國ATCC公司，由申請人所在的實驗室保存。Vero細胞用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基連續(xù)傳代3次保持在對數(shù)生長期，供實驗用，維持液為含2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
Vero細胞是由非洲綠猴腎細胞建立的傳代細胞系，屬于上皮細胞系，是皰疹病毒敏感細胞。
3、藥物千金藤素40mg先加入3.8ml去離子水和35ul的4mol/L HCl完全溶解后再加入165ul去離子水，配成10mg/ml的千金藤素母液，pH7.0，用0.22um濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。陽性對照藥無環(huán)鳥苷(ACV)為湖北科益藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，臨用前用DMEM維持液稀釋。
(二)千金藤素對細胞的保護作用千金藤素1600倍稀釋后，再倍比稀釋，如下1ul千金藤素母液加入1號瓶的1599ulDMEM維持液中，充分混勻后再取其中的500ul加入到2號瓶的500ulDMEM維持液中，如此稀釋下去，一共設定7個濃度，濃度依次為6.25ul/ml、3.12ul/ml、1.56ul/ml、0.78ul/ml、0.39ul/ml、0.20ul/ml、0.1ul/ml。
陽性對照藥ACV經(jīng)50倍稀釋后，再倍比稀釋，如下20ulACV加入1號瓶的980ulDMEM維持液中，充分混勻后再取其中的500ul加入到2號瓶的500ulDMEM維持液中，如此稀釋下去，一共設定7個濃度，濃度依次為100ul/ml、50ul/ml、25ul/ml、12.5ul/ml、6.25ul/ml、3.12ul/ml、1.56ul/ml。
分別以不同濃度的千金藤素維持液和ACV維持液各50ul/孔加到單層Vero細胞孔，每個濃度設3個復孔，培養(yǎng)1小時后，接種100TCID50 HSV-II病毒液50ul/孔，置于5％CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時，觀察藥物處理后的細胞對HSV-II感染的影響，同時設定單用病毒感染時的病毒對照組、正常細胞對照組，實驗重復3次。
試驗分析方法不同濃度的千金藤素維持液和ACV維持液加到單層Vero細胞孵育1小時后，再接種HSV-II病毒，當病毒對照組的細胞完全病變時(即++++時)觀察實驗組的細胞的病變情況(CPE)，光鏡下估測千金藤素對HSV-II的感染有無預防作用，是否能阻止HSV-II進入細胞。
結果顯示在3.12μg/ml濃度時，細胞均只產(chǎn)生一半病變，即千金藤素藥物對預防HSV-II感染的半數(shù)有效劑量(IC50)為3.12ug/ml，與現(xiàn)有治療HSV-II藥物無環(huán)鳥苷(3.12ug/ml)作用相當。
預防HSV-II感染的半數(shù)有效劑量的測定方法是記錄實驗結果，按Reed-muench法(中國醫(yī)學科學院流行病防治研究所編常見病毒病實驗技術北京科學出版社，197834～37)計算半數(shù)有效濃度(IC50)——產(chǎn)生50％病變抑制的藥物濃度。
(三)對HSV-II增殖的影響千金藤素稀釋1600倍后，再倍比稀釋，如下1ul千金藤素母液加入1號瓶的1599ulDMEM維持液中，充分混勻后再取其中的500ul加入到2號瓶的500ulDMEM維持液中，如此稀釋下去，一共設定7個濃度，濃度依次為6.25ul/ml、3.12ul/ml、1.56ul/ml、0.78ul/ml、0.39ul/ml、0.20ul/ml、0.1ul/ml。
陽性對照藥ACV經(jīng)50倍稀釋后，再倍比稀釋，如下20ulACV加入1號瓶的980ulDMEM維持液中，充分混勻后再取其中的500ul加入到2號瓶的500ulDMEM維持液中，如此稀釋下去，一共設定7個濃度，濃度依次為100ul/ml、50ul/ml、25ul/ml、12.5ul/ml、6.25ul/ml、3.12ul/ml、1.56ul/ml。
先接種100TCID50的HSV-II于單層Vero細胞上，在37℃、CO2細胞培養(yǎng)箱吸附1小時，再加入含稀釋好的相應濃度千金藤素維持液和ACV的維持液各50ul/孔，每個濃度設定3個復孔，置于5％CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時，觀察藥物對HSV-II增殖的影響。同時設單用病毒感染時的病毒對照組、正常細胞對照組，實驗重復3次。
試驗分析方法當病毒對照組的細胞完全病變時(即++++時)觀察實驗組的細胞的病變情況(CPE)，光鏡下估測千金藤素對細胞內HSV-II有無殺傷作用，即千金藤素對HSV-II的治療作用。
結果顯示在6.25μg/ml濃度時，千金藤素使細胞只產(chǎn)生一半病變，陽性藥物ACV是1.56μg/ml。
(四)對HSV-II感染細胞的綜合作用千金藤素1600倍稀釋后，再倍比稀釋，如下1ul千金藤素母液加入1號瓶的1599ulDMEM維持液中，充分混勻后再取其中的500ul加入到2號瓶的500ulDMEM維持液中，如此稀釋下去，一共設定7個濃度，濃度依次為6.25ul/ml、3.12ul/ml、1.56ul/ml、0.78ul/ml、0.39ul/ml、0.20ul/ml、0.1ul/ml。
陽性對照藥ACV經(jīng)50倍稀釋后，再倍比稀釋，如下20ulACV加入1號瓶的980ulDMEM維持液中，充分混勻后再取其中的500ul加入到2號瓶的500ulDMEM維持液中，如此稀釋下去，一共設定7個濃度，濃度依次為100ul/ml、50ul/ml、25ul/ml、12.5ul/ml、6.25ul/ml、3.12ul/ml、1.56ul/ml。
不同濃度千金藤素維持液和病毒各200ul混合后，50ul/孔直接加到單層Vero細胞上，每個濃度設定3個復孔，置于5％CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，觀察藥物對HSV-II感染細胞的綜合作用。同時設單用病毒感染時的病毒對照組、正常細胞對照組，實驗重復3次。
試驗分析方法不同濃度千金藤素維持液和病毒各200ul混合后直接加到單層Vero細胞上，當病毒對照組的細胞完全病變時(即++++時)觀察實驗組的細胞的病變情況(CPE)，光鏡下估測千金藤素對HSV-II有無綜合殺傷作用。
結果顯示在1.56μg/ml濃度時，細胞均只產(chǎn)生一半病變，即千金藤素藥物對預防HSV-II感染的半數(shù)有效劑量(IC50)為1.56ug/ml，比現(xiàn)有治療HSV-II藥物無環(huán)鳥苷(3.12ug/ml)作用更好。
(五)對HSV-II的直接殺傷作用千金藤素1600倍稀釋后，再倍比稀釋，如下1ul千金藤素母液加入1號瓶的1599ulDMEM維持液中，充分混勻后再取其中的500ul加入到2號瓶的500ulDMEM維持液中，如此稀釋下去，一共設定7個濃度，濃度依次為6.25ul/ml、3.12ul/ml、1.56ul/ml、0.78ul/ml、0.39ul/ml、0.20ul/ml、0.1ul/ml。
陽性對照藥ACV經(jīng)50倍稀釋后，再倍比稀釋，如下20ulACV加入1號瓶的980ulDMEM維持液中，充分混勻后再取其中的500ul加入到2號瓶的500ulDMEM維持液中，如此稀釋下去，一共設定7個濃度，濃度依次為100ul/ml、50ul/ml、25ul/ml、12.5ul/ml、6.25ul/ml、3.12ul/ml、1.56ul/ml。
含不同濃度千金藤素的維持液與病毒液各200ul混合后，置37℃作用2小時后，將孵育液加入單層Vero細胞孔中，100ul/孔，37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，觀察藥物對HSV-II的直接殺傷作用。同時設單用病毒感染時的病毒對照組1、正常細胞對照組和病毒先在37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中放置1小時的病毒對照組2，實驗重復3次。
試驗分析方法當病毒對照組的細胞完全病變時(即++++時)觀察實驗組的細胞的病變情況(CPE)，光鏡下估測千金藤素對HSV-II有無直接殺傷作用。
結果分析設定病毒對照組2是病毒先在37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中放置1小時的病毒對照組，病毒對照組1是直接加入細胞的，當病毒對照組1的細胞完全病變時，病毒對照組2的細胞病變只達到了++，說明病毒先在37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中放置1小時的病毒感染細胞的活力下降，而并非是藥物抑制病毒活性的作用。因此該組實驗數(shù)據(jù)沒有意義。
上述實驗中，用光鏡觀察的照片見圖1至圖3。
如圖1所示，正常Vero細胞貼壁生長，具有貼壁細胞的一般特性，細胞之間的空隙小。
如圖2所示，Vero細胞被HSV-II病毒感染后，細胞從壁上脫落，細胞破裂。
如圖3所示，在被HSV-II病毒感染的Vero細胞中加入千金藤素后，僅有部分細胞從壁上脫落，大部分細胞的形態(tài)與正常細胞相同。
實驗(二)至(五)的綜合結果分析見下表
表一不同濃度的千金藤素抗單純皰疹病毒II型(HSV-II)的活性實驗結果

HSV-II對照組++++，細胞對照組-注“ND”為沒設的濃度；CPE等級0～25％為+，26％～50％為++，51％～75％為+++，76％～100％為++++，無CPE為-。
CPE(cytopathic effect，細胞病變效應)，是指常規(guī)于倒置顯微鏡下觀察試驗細胞病變狀態(tài)。
結論(1)千金藤素對HSV-II感染的細胞具有預防作用。
(2)千金藤素對HSV-II感染的細胞具有治療作用。
(3)千金藤素可降低HSV-II對Vero細胞的感染性不同濃度的千金藤素藥物與HSV-II病毒等量混合后直接加到單層細胞上，千金藤素藥物和ACV在1.56ug/ml時均能減輕感染細胞的CPE程度，即降低HSV-II對Vero細胞的感染性。
(4)千金藤素對HSV-II具有直接殺傷作用，使HSV-II感染的Vero細胞的活性下降。
權利要求
1.千金藤素用于制備抗單純皰疹病毒II型的藥物的用途。
2.抗單純皰疹病毒II型的藥物組合物，其特征在于包括有效治療劑量的作為活性成分的千金藤素，以及藥物學上可接受的載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的抗單純皰疹病毒II型的藥物組合物，其特征在于由千金藤素與相應載體制備的藥物劑型包括片劑、膠囊、口服液、針劑或粉針劑。
4.千金藤素用于制備治療生殖器皰疹的藥物的用途。
5.用于治療生殖器皰疹的藥物組合物，其特征在于包括有效治療劑量的作為活性成分的千金藤素，以及藥物學上可接受的載體。
6.根據(jù)權利要求5所述的治療生殖器皰疹的藥物組合物，其特征在于由千金藤素與相應載體制備的藥物劑型包括片劑、膠囊、口服液、針劑或粉針劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及千金藤素的新用途，尤其是涉及千金藤素用于制備抗單純皰疹病毒II型的藥物的用途。本發(fā)明證明千金藤素對HSV－II感染的細胞具有預防和治療作用；千金藤素可降低HSV－II對Vero細胞的感染性；千金藤素對HSV－II具有直接殺傷作用，使HSV－II感染的Vero細胞的活性下降。將千金藤素用于制備抗單純皰疹病毒II型的藥物，尤其是用于制備治療生殖器皰疹的藥物，對于由單純皰疹病毒II型感染而引起的疾病，尤其是生殖器皰疹，具有重要的開發(fā)與應用前景。
文檔編號A61K31/4745GK1709254SQ20051003497
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月1日 優(yōu)先權日2005年6月1日
發(fā)明者王一飛, 王慶端, 楊崇仁 申請人:廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司