專利名稱：編碼能與早老素相互作用的蛋白質(zhì)的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的核苷酸和多肽序列及它們的醫(yī)藥應(yīng)用。具體地講，本發(fā)明涉及編碼能與早老素(Presenilin)相互作用的蛋白質(zhì)的核酸，所述蛋白的制備方法以及含有它們的組合物。
阿爾茨海默氏癥是最普遍的癡呆，其全球發(fā)病率隨年齡而增大，在65歲后為5-10％，到80歲則為20％。
現(xiàn)在還沒有針對性的診療方法，只能給病人一些減輕痛苦的治療。這種病只有經(jīng)死后的腦組織分析才能真正確認(rèn)，因?yàn)槿狈?zhǔn)確的早期診斷方法。
阿爾茨海默氏癥與腦器官性損傷相關(guān)，包括下列組織學(xué)跡象老年斑、神經(jīng)元神經(jīng)纖維變性、皮層神經(jīng)元損失和營養(yǎng)不良。
該病的病因復(fù)雜，其中涉及眾多基因，參與其中的各種病理生理學(xué)機(jī)制仍未完全了解。
已報道在65歲以下的病人中觀察到的腦的解剖學(xué)改變與早老性癡呆相關(guān)?，F(xiàn)在，“阿爾茨海默氏型癡呆”這一術(shù)語包括早老性癡呆(65歲前)及具有相同特征的老年性癡呆(65歲以后)。
該疾病存在兩種形式偶發(fā)性形式，即與遺傳不相關(guān)的；和家族形式。
該病的偶發(fā)形式最常見，涉及60-90％的病人，最常在65歲以后出現(xiàn)。大部分病例中病因未知。但已確認(rèn)，顱腦創(chuàng)傷、炎癥、情感混亂或高應(yīng)激狀態(tài)會增加該病出現(xiàn)的概率(Seubert等，1992)。
該病的家族形式占病例的10-40％。它又分為兩組遲發(fā)形式(65歲后)和早發(fā)形式(65歲前)。在早發(fā)性病例中，該病以顯性特征和常染色體遺傳。
1992年證明在14號染色體上存在AD3基因座，1995年分離出了早老素1(PS-1)基因(開始時該基因被稱為S182)(Sherrington等，1995)。在70％的該病特早發(fā)形式(55歲前)中涉及早老素1基因的突變。很少有早發(fā)形式的病例與位于1號染色體上的早老素2基因的突變相關(guān)(Levy-Lahad等，1995)。該基因與早老素1基因有67％的相同性。
該基因由12個外顯子形成，外顯子3-12編碼所述蛋白。它以遍在方式表達(dá)并產(chǎn)生2.7kb的主要轉(zhuǎn)錄本和7.5kb的次要轉(zhuǎn)錄本(Kovacs，1996)。該蛋白含467個氨基酸，呈膜蛋白結(jié)構(gòu)。它具有至少8個潛在跨膜結(jié)構(gòu)域。相應(yīng)于突變觸及密碼子的氨基酸分布在整個蛋白中，位于疏水區(qū)(TM)，也位于親水環(huán)(BL)中，但有兩個特別區(qū)TM2和BL6。
現(xiàn)在已報道了35個以上的點(diǎn)突變，迄今鑒定的這些突變幾乎都是“錯義”型的(即它們導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列上氨基酸的點(diǎn)變化)。但近來報道了影響絞接的其他類型的突變(Perez-T
r等，1995)，在此突變中由于丟失了外顯子9而改變了基因。
對早老素在正常細(xì)胞中的作用還知之甚少。提出了為數(shù)眾多的假說，其中一種認(rèn)為早老素1(PS-1)可能在細(xì)胞運(yùn)輸中起作用。該假說得到了免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的支持，其中在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中找到了PS-1(Kovacs等，1996)。另外，PS-1可能在細(xì)胞聯(lián)絡(luò)和胞吞機(jī)制及APP的蛋白水解中有作用(Dewji和Singer，1996)。第三種假說認(rèn)為PS-1參與與細(xì)胞骨架、特別是結(jié)合Tau蛋白的微管的相互作用(Lew和Wang，1996)。最后，考慮到其結(jié)構(gòu)，PS-1可能作為與參與信號傳導(dǎo)的蛋白G偶聯(lián)的受體或作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的受體或作為一種離子通道而起作用(Van Broeckhoven，1995)。
對與早老素相互作用的配偶體的研究可能有助于理解早老素的確切作用。
本發(fā)明是基于申請人發(fā)現(xiàn)了編碼能與早老素相互作用之蛋白質(zhì)的核酸。這種核酸的發(fā)現(xiàn)使得可以預(yù)計(jì)制備出可藥用的新的多肽。
因而本發(fā)明的第一個主題是編碼能與早老素相互作用的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
根據(jù)一種具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的核苷酸序列編碼能夠與早老素PS-1的大環(huán)之全部或部分相互作用的蛋白質(zhì)或多肽。
更優(yōu)選的本發(fā)明的核苷酸序列含有SEQ ID No.1或其衍生序列的全部或部分或SEQ ID No.2或其衍生序列的全部或部分。
在本發(fā)明中，衍生的核苷酸序列指因遺傳密碼子的簡并性而與母序列不同、通過一種或多個遺傳和/或化學(xué)修飾而獲得的任何序列，以及與這些序列或其片段雜交并編碼本發(fā)明多肽的任何序列。對于遺傳和/或化學(xué)修飾，可以理解為一個或多個殘基的任何突變、替代、缺失、添加和/或修飾。衍生序列還可以理解為來自其他細(xì)胞來源、尤其是人源細(xì)胞或其他生物細(xì)胞的與母序列同源的序列。這種同源序列可以通過雜交實(shí)驗(yàn)獲得?？梢杂迷蛄谢蚱淦巫鳛樘结樤陔s交的可變條件下對核酸文庫進(jìn)行雜交(Maniatis等，1989)。
本發(fā)明的核苷酸序列可以是或不是人工來源的，可以是基因組序列、cDNA、RNA序列、雜合序列或合成或半合成序列。這些序列通過例如用以上述序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的探針篩選DNA文庫(cDNA文庫、基因組DNA文庫)而獲得。這種文庫可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)常規(guī)方法從各種細(xì)胞制得。本發(fā)明的核苷酸序列還可以通過化學(xué)合成或通過包括對文庫篩選所得序列進(jìn)行化學(xué)或酶修飾的混合方法獲得。一般而言，本發(fā)明的核酸可按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備。
本發(fā)明的另一個主題是能夠與早老素相互作用的蛋白質(zhì)或多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽能夠與早老素PS-1的大環(huán)和/或早老素PS-2的大環(huán)相作用。更優(yōu)選的肽能與早老素PS-1大環(huán)的310-463氨基酸的序列相作用。
在本發(fā)明中，早老素包括早老素PS-1和PS-2本身以及特別相應(yīng)于這些蛋白突變形式的其同源形式。
本發(fā)明還涉及包含選自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2序列或其衍生序列之肽序列全部或部分的多肽。
在本發(fā)明中，衍生的多肽序列指通過一個或多個遺傳和/或化學(xué)修飾獲得的與序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2不同、但具有與早老素相作用之能力的任何多肽序列。對于遺傳和/或化學(xué)修飾可以理解為對一個或多個殘基的任何突變、替代、缺失、添加和/或修飾。
制備這種衍生物的目的多樣，例如提高基因治療效率或降低其付作用，或使其具有新的藥物動力學(xué)和/或生物學(xué)特性。
衍生物還可以理解為來自其他細(xì)胞來源、尤其是人類細(xì)胞或其他生物體細(xì)胞并具有同類活性的與母序列同源的序列。
本發(fā)明還涉及上述肽序列的片段。這些片段可以按不同的方式產(chǎn)生。尤其是在本申請所給出的序列基礎(chǔ)上利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的肽合成儀通過化學(xué)途徑合成這些片段。還可以通過遺傳途徑合成這些片段，例如在細(xì)胞宿主中表達(dá)編碼所希望肽的核苷酸序列。在這種情形中，核苷酸序列可以利用寡核苷酸合成儀在本申請中給出的肽序列和遺傳密碼子基礎(chǔ)上化學(xué)合成制得。這種核苷酸序列還可以從本申請給出的序列出發(fā)通過按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行酶切割、連接、克隆等，或用以這些序列設(shè)計(jì)的探針篩選DNA文庫來制得。
本發(fā)明的另一個主題是本發(fā)明的多肽在減弱、抑制、刺激或調(diào)節(jié)早老素之活性中的應(yīng)用。
實(shí)際上，可以想到利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)早老素的功能，尤其是抑制或減弱突變早老素的活性。
本發(fā)明的另一主題涉及本發(fā)明多肽的制備方法，其中將含有本發(fā)明多核苷酸序列的細(xì)胞在所述序列的表達(dá)條件下培養(yǎng)并回收多肽產(chǎn)物。對此，一般將編碼所述多肽的部分置于允許其在細(xì)胞宿主中表達(dá)的信號控制之下。這些信號(啟動子、終止子、分泌前導(dǎo)序列等)的選擇可根據(jù)所用的細(xì)胞宿主而不同。另外，本發(fā)明的核苷酸序列可構(gòu)成可自主性或整合性復(fù)制的載體的一部分。具體地講，可利用在所選擇的宿主中自主復(fù)制的序列制備自主復(fù)制性載體。對于整合性載體，例如可利用與宿主基因組某些區(qū)域同源的區(qū)域(允許通過同源重組整合在載體中)來制備。
本發(fā)明還涉及用含本發(fā)明核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞宿主?？捎糜谕ㄟ^重組方法產(chǎn)生本發(fā)明肽的細(xì)胞宿主可以是真核宿主也可以是原核宿主。在適用的真核宿主中，可以舉出動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞。具體對酵母而言，可以舉出酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、許旺酵母屬或漢遜酵母屬的酵母。對于動物細(xì)胞，可以舉出COS、CHO、C127、人成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞。在真菌中，尤其可以舉出曲霉屬或木霉菌屬的種類。作為原核宿主，優(yōu)選使用下列細(xì)菌大腸桿菌、芽孢桿菌或鏈霉菌。
根據(jù)一種優(yōu)選方案，這些細(xì)胞宿主有利的代表為用于表達(dá)本發(fā)明核酸并產(chǎn)生由其衍生的蛋白的重組酵母菌株。
優(yōu)選地，細(xì)胞宿主含有選自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的序列的至少一種序列或序列片段，以產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明核酸序列的另一應(yīng)用是制備反義寡核苷酸或可用作藥物的遺傳反義序列。反義序列是與給定基因的編碼鏈互補(bǔ)的小寡核苷酸，因而能夠特異性與轉(zhuǎn)錄的mRNA雜交，抑制其翻譯成蛋白質(zhì)。本發(fā)明因而涉及能夠至少部分抑制能與早老素相作用之蛋白的表達(dá)的反義序列。這種序列可通過上文定義的核苷酸序列全部或部分構(gòu)建，還可以通過斷裂等或通過化學(xué)合成獲得。
本發(fā)明的序列可用于基因治療領(lǐng)域，用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生反義序列或表達(dá)能夠調(diào)節(jié)早老素活性的蛋白質(zhì)或多肽。對此，這些序列可以整合在病毒載體或非病毒載體中，使其在體內(nèi)給藥。載體可以是一種質(zhì)粒，其獲取方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。作為適于本發(fā)明的病毒載體，尤其可以舉出腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒或皰疹病毒類型的載體。本申請的另一主題是含有編碼本發(fā)明多肽的外源核酸序列的缺陷重組病毒。
本發(fā)明還可用于制備能與以上定義的核苷酸序列或相應(yīng)的mRNA雜交、可用于基因治療領(lǐng)域的、合成或非合成的核苷酸探針。這種探針可在體外用作診斷工具，以檢測早老素或顯示遺傳異常(錯誤絞接、多態(tài)性、點(diǎn)突變等)。這種探針還可以用于在其他細(xì)胞來源、特別是人源細(xì)胞中顯示并分離編碼前述定義肽的同源核酸序列。本發(fā)明的探針一般含有至少10個堿基，例如它們可以包含多至前述一種序列或其互補(bǔ)鏈的全部。優(yōu)選地，這些探針在其使用前進(jìn)行標(biāo)記。為此，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)(放射標(biāo)記、酶標(biāo)記等)。
本發(fā)明的另一主題是抗前述所定義多肽的多克隆或單克隆抗體或抗體片段。這種抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制得。具體地講，這些抗體可通過用序列選自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或其片段或衍生序列的多肽免疫動物、然后采血并分離抗體來制備。這些抗體還可以通過按本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備雜交瘤而制得。本發(fā)明的抗體或抗體片段特別可用于抑制和/或顯示早老素與前述定義多肽之間的相互作用。
本發(fā)明的另一主題涉及一種鑒定能調(diào)節(jié)或全部或部分抑制早老素與本發(fā)明多肽間相互作用的化合物的方法。
按以下步驟揭示和/或分離本發(fā)明多肽的調(diào)節(jié)劑或配體—將分子或含有不同分子(可以是身份不明的分子)的混合物與如上定義表達(dá)本發(fā)明多肽的重組細(xì)胞，在所述分子對所述多肽具有親和力時允許所述多肽和所述分子間相互作用的條件下接觸，及—檢測和/或分離與所述本發(fā)明多肽結(jié)合的分子。
在一種具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方法用于揭示和/或分離早老素與本發(fā)明多肽間相互作用的激動劑和拮抗劑。
本發(fā)明的另一主題涉及根據(jù)上述方法鑒定和/或獲得的配體或調(diào)節(jié)劑作為藥物的應(yīng)用。這種配體或調(diào)節(jié)劑可能用于治療某些神經(jīng)疾病。
本發(fā)明還涉及含有至少一種上文定義的多肽作為活性成分的任何藥物組合物。
本發(fā)明還涉及含有至少一種上文定義的抗體和/或抗體片段、和/或反義寡核苷酸作為活性成分的任何藥物組合物，以及含有至少一種上文定義的核苷酸序列作為活性成分的任何藥物組合物。
另外，本發(fā)明還涉及這樣的藥物組合物，其中如上定義的肽、抗體和核苷酸序列或它們的片段之間聯(lián)合或與其他活性成分聯(lián)合。
本發(fā)明還涉及這樣的組合物，其中本發(fā)明的核苷酸序列整合在病毒或非病毒性重組載體中。
本發(fā)明的藥物組合物可用于調(diào)節(jié)早老素的活性。更具體地講，這些組合物用于減弱或至少部分抑制早老素的活性，尤其是突變形式的活性。更優(yōu)選用于治療神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默氏癥和21三體的藥物組合物。


圖1.早老素1和用于雙雜合試驗(yàn)的部分的圖示。圖2.通過對帶有尤其含克隆C(相應(yīng)于SEQ ID No.1)和克隆D(相應(yīng)于SEQ ID No.2)的不同質(zhì)粒之酵母的營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)分離菌株yBM-C和yBM-D。圖3.相應(yīng)于肽C和D的mRNA在人組織中的表達(dá)。圖4.所用哺乳動物表達(dá)載體的圖解。圖5.融合蛋白C和D在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。圖6(a，b，c).主要載體的圖示。
材料和方法1)所用的酵母菌株如下釀酒酵母YCM 79(MATa，ade2，trp1，leu2，lys2，ura3，his3，gal4，gal80，met16∷GAL1/10-URA3 lacZ，HIS3∷GAL7-phleoR).釀酒酵母PCY 2(MATa，Dgal4，Dgal80，ade2，trp1，leu2，lys2，his3 URA3∷GAL1/10-lacZ.釀酒酵母HF7 C(MATa，ura3，his3，ade2，trp1，leu2，lys2，gal4，gal80，canR，URA3∷GAL4結(jié)合位點(diǎn)-CYC1-lacZ，LYS2∷GAL1-HIS3).釀酒酵母L 40(MATa，his3，ade2，trp1，leu2，lys2，URA3 ∷ LexA-lacZ，LYS2 ∷LexA-HIS3).2)所用的細(xì)菌菌株如下大腸桿菌TG1(F’[traD 36，lacIq，lacZ D M15，proA+B+]，supE，thi-1，D(lac-proAB)，D(hsdM-mcrB)5(rK-mK-McrB-).大腸桿菌BL21(DE3)(F-，ompT，hsdSB (rB-mB-)，gal，dcm，(DE3).
3)用于各種菌株的培養(yǎng)基如下用于酵母的完全YPD培養(yǎng)基—Bacto-酵母提取物(10g/l)(Difco)—Bacto-蛋白胨(20g/l)(Difco)—葡萄糖(20g/l)(Merk)該培養(yǎng)基可以通過加入瓊脂(20g/l)固化，在高壓釜中110℃下20分鐘滅菌。
用于酵母的基本YNB培養(yǎng)基—無氨基酸的Bacto-酵母氮源(6.7g/l)(Difco)—葡萄糖(20g/l)(Merk)該培養(yǎng)基可通過加入瓊脂(20g/l)固化，在高壓釜中滅菌。營養(yǎng)缺陷型酵母生成所需的氨基酸或氮源隨后以50mg/l加入。還以100μg/ml加入氨芐青霉素，以避免細(xì)菌污染。
用于細(xì)菌的完全LB培養(yǎng)基—Bacto-酵母提取物(5g/l)(Difco)—Bacto-胰蛋白胨(10g/l)(Difco)—NaCl(5g/l)(Difco)該培養(yǎng)基可通過加入瓊脂(12g/l)固化并在高壓釜中滅菌。加入100μg/ml的氨芐青霉素或卡那霉素以挑選被帶有相應(yīng)抗性標(biāo)志的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。
4)所用的質(zhì)粒如下載體pGBT9(圖6(a))是一種能在細(xì)菌大腸桿菌和酵母中增殖并被挑選的5.5kb的穿梭質(zhì)粒。它具有ColE1復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因(在大腸桿菌中增殖和選擇)以及2mm復(fù)制起點(diǎn)和TRP1基因(其合成色氨酸，用于在trp 1-缺陷型酵母中選擇)。該質(zhì)粒用于在酵母中表達(dá)GAL4的DNA結(jié)合域(DLA)與目的肽的融合蛋白。它在GAL4 DLA區(qū)的下游有一個多克隆位點(diǎn)，所有元件均位于編碼乙醇脫氫酶的ADH1基因的啟動子和終止子之間。GAL4的DLA區(qū)含有一個核定位信號序列。
相應(yīng)于PS-I不同部分的序列插入在EcoR I/Sal I克隆位點(diǎn)中。
載體pGAD10(圖6(a))是一種6.6kb的穿梭質(zhì)粒。它具有ColEl復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因，這使其可在大腸桿菌中增殖和挑選。它還含有酵母復(fù)制起點(diǎn)(2mm)和LEU2選擇基因，用于分離轉(zhuǎn)化的酵母。在ADHl啟動子和終止子之間在GAL4的活化區(qū)(DA)編碼序列下游有一多克隆位點(diǎn)。GAL4的DA區(qū)含有一個核定位信號序列。
該質(zhì)粒已用于制備商業(yè)人腦cDNA文庫(Clontech)。cDNA的序列被插入在EcoR I克隆位點(diǎn)上。
載體pLex9(圖6(b))是一種5kb的穿梭質(zhì)粒。作為pGBT9，它具有ColEl起點(diǎn)、AmpR基因、以及2mm復(fù)制起點(diǎn)和TRPl基因。但編碼DNA結(jié)合域的序列是細(xì)菌阻抑蛋白LexA的。用于融合蛋白表達(dá)的啟動子和終止子還是ADHl基因的。LexA的DLA含有SV40的核定位信號序列。
相應(yīng)于PS-I大環(huán)的序列被插入在EcoR I/Sal I克隆位點(diǎn)上。
載體pGEX-4T1(圖6(b))是一個4.9kb的細(xì)菌質(zhì)粒。它具有pBR322的復(fù)制起點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因、用于抑制β-半乳糖苷酶系統(tǒng)的lac Iq基因。該質(zhì)粒用于在細(xì)菌中表達(dá)谷脫甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和目的肽的融合蛋白。它在GST基因的下游有一個多克隆位點(diǎn)用于插入編碼肽的序列。所有元件都在可被IPTG誘導(dǎo)的高表達(dá)水平啟動子tac的控制之下。產(chǎn)生蛋白后，可通過凝血酶切割將目的肽與GST分離，因?yàn)樵谶@兩個區(qū)之間已引入了該酶識別和切割的序列。
載體pET-29a(圖6(c))是一種5.4kb的細(xì)菌質(zhì)粒。它具有pBR322復(fù)制起點(diǎn)、噬菌體f1的復(fù)制起點(diǎn)、卡那霉素的抗性基因、lac I q基因。該質(zhì)粒用于在細(xì)菌中表達(dá)與S-Tag序列(S蛋白核糖核酸酶的催化部分)和His-Tag序列(10個組氨酸的肽)融合的目的肽，S-Tag和His-Tag序列有助于檢測和純化融合蛋白。在用IPTG誘導(dǎo)后T7轉(zhuǎn)錄啟動子可產(chǎn)生強(qiáng)表達(dá)。被凝血酶識別和切割的序列已引入到S-Tag和His-Tag序列之間。
5)所用的合成寡核苷酸根據(jù)PS-I的序列(Sherrington等，1995)，設(shè)計(jì)了各種寡核苷酸對，以獲得相應(yīng)于PS-I親水區(qū)的DNA片段。這些寡核苷酸使得在PCR擴(kuò)增后在序列的5′引入EcoR I位點(diǎn)，在3′引入Sal I位點(diǎn)。
oligoA CAA GAA TTC TGT CCG AAA GGT CCA CTT(SEQ ID N°3)oligoB CAA GTC GAC TCA GGT TGT GTT CCA GTC TCC(SEQ ID N°4)寡核苷酸A和B用于獲得源自大環(huán)的BL6和BM片段。
oligoC CAA GAA TTC TCA ACA ATG GTG TGG TTG(SEQ ID N°5)oligoD CAA GTC GAC TCA TTC CTC TGG GTC TTC ACC(SEQ ID N°6)寡核苷酸C和D用于獲得源自大環(huán)更短區(qū)域的BR片段。
oligoE CAA GAA TTC ACA TTA TTA CTC CTT GCC(SEQ ID N°7)oligoF CAA GTC GAC TCA GAT ATA AAA TTG ATG CAA(SEQ ID N°8)寡核苷酸E和F用于獲得源自PSI C-末端部分的Ct片段。
oligoG CAA GAA TTC ATG ACA GAG TTA CCT GCA(SEQ ID N°9)oligoH AA GTC GAC TCA ATG CTT GGC GCC ATA TTT(SEQ ID N°10)寡核苷酸G和H用于獲得源自PSI N-末端部分的Nt片段。
寡核苷酸I.J和K用于對質(zhì)測pGBT9和pGAD10的插入片段進(jìn)行擴(kuò)增和測序。它們分別與GAL4的DLA、GAL4的DA和ADH1終止子的序列互補(bǔ)。oligoI GCG ACA TCA TCA TCG GAA GAG AG(SEQ ID N°11)oligoJ CTA TTC GAT GAT GAA GAT ACC CC(SEQ ID N°12)oligoK GGC GAA GAA GTC CAA AGC(SEQ ID N°13)6)分子生物學(xué)方法質(zhì)粒DNA的制備按Maniatis等(1989)中描述的方法進(jìn)行了質(zhì)粒DNA的小量和大量制備。熱穩(wěn)定性Taq聚合酶作用下的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(或PCR)PCR可以在熱穩(wěn)定性酶作用下擴(kuò)增作為引物的寡核苷酸(約20bp)結(jié)合的兩個已知區(qū)域之間的DNA序列。這些反應(yīng)在100μl的終體積中進(jìn)行，其中存在DNA模板(50ng)、dNTP(0.2mM)、PCR緩沖液(10mMTrisHCl pH8.5、lmM MgCl2、5mM KCl、0.01％明膠)、兩種寡核苷酸(每種500ng)和2.5IU Ampli Taq DNA聚合酶。將此混合物用2滴石蠟油覆蓋以限制樣品蒸發(fā)。
所用的程序包括32個循環(huán)一個循環(huán)的模板變性(95℃5分鐘)、30個循環(huán)(95℃變性1分鐘、50℃下寡核苷酸與DNA模板雜交1分鐘、72℃Taq聚合酶下延伸1分鐘)，最后為一個循環(huán)的延伸(72℃5分鐘)。
PCR可以在指數(shù)生長期的細(xì)菌或酵母培養(yǎng)物中直接進(jìn)行。熒光測序所用的測序技術(shù)來自Sanger等(1977)的方法，并經(jīng)改變適于Applied Biosystems開發(fā)的熒光測序。所用的操作是該系統(tǒng)的設(shè)計(jì)者描述的那些(Perkin Elmer，1995)。通過連接在質(zhì)粒中插入DNA片段將來自質(zhì)粒DNA或PCR反應(yīng)的插入片段和質(zhì)粒載體在其各自的緩沖液(Biolabs)中以1U/μg DNA用限制酶消化1小時。根據(jù)克隆位點(diǎn)選擇酶，以將插入片段引入與載體其他結(jié)構(gòu)域相同的讀框中。
在0.8％瓊脂糖的“制備性”凝膠上電泳按大小分離消化產(chǎn)生的片段，在含0.5μg/ml BET的TBE(90mM Tris，90mM硼酸鹽，2mM EDTA，pH8)中進(jìn)行。在上樣于凝膠上分子量標(biāo)志(1kb階梯，Gibco BRL)旁之前，向樣品中加入上樣藍(lán)顏料(體積比1/10)。在TBE中在90伏/cm的恒壓下進(jìn)行遷移。
通過插入在堿基間的BET的熒光在紫外線下顯示DNA。用解剖刀切下含有所希望大小DNA片段(載體和插入片段)的凝膠塊，放在含TBE的透析袋中，在100伏下電泳15分鐘。然后回收凝膠的DNA提取物，用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(isoamylate)(25/24/1)處理，在0.25MNaCl存在下用3體積的無水乙醇沉淀，用70％乙醇洗一次，干燥并最后溶在20μl水中。
在凝膠上估測載體和插入片段各自的量以后，將其以1/1的比例在40IU T4 DNA連接酶、1X最終連接緩沖液(50mM TrisHCl pH7.5，10mMMgCl2，10mM DTT，1mM ATP)存在下混合在20μl總體積中。在20℃下連接至少一小時。質(zhì)粒對細(xì)菌的轉(zhuǎn)化1)稱為“TSB”的方法(根據(jù)Chung和Miller，N.A.R，第16卷，1988)為經(jīng)DMSO處理使細(xì)菌細(xì)胞壁脆化，允許DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。其效率為106轉(zhuǎn)化子/μg DNA。在LB培養(yǎng)液中攪拌下培養(yǎng)細(xì)菌約3小時(至A600＝0.6)。以3000rpm離心培養(yǎng)物10分鐘，將沉淀用1/10原體積的TSB(LB培養(yǎng)液，10％PEG4000，5％DMSO，10mM MgCl2，10mM MgSO4)溶解，在4℃保溫15分鐘。向100μl感受態(tài)細(xì)菌中加入約50ng DNA(對連接產(chǎn)物為10μl)，然后將混合物在4℃保溫30分鐘。加入TSBglu(TSB，20mM葡萄糖)并于37℃保溫45分鐘后，將細(xì)菌鋪在含有質(zhì)粒所帶抗性基因相應(yīng)的抗生素的LB培養(yǎng)基上。
2)電穿孔是效率為TSB方法的1000倍的一種技術(shù)，當(dāng)只有很少量DNA時(如提取酵母中所含質(zhì)粒后)使用這種方法。它是通過電擊使細(xì)菌細(xì)胞壁脆化以在細(xì)胞中引入DNA。
將細(xì)菌在LB液體培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)至A600＝0.6。將4℃下預(yù)保溫15分鐘的該培養(yǎng)物以3000rpm離心10分鐘，沉淀依次用1體積冰水、1/2體積冰水和1/5體積冰冷的10％甘油洗滌。在每次洗滌間，將細(xì)菌以3000rpm離心10分鐘，最后收集在1/1000體積的冰冷的10％甘油中。在電穿孔杯中混合40μl該細(xì)菌懸液和1μl DNA。將此杯置于GenePulser BioRad中以使細(xì)菌經(jīng)受電擊(25mF，2.5kV，200W)。37℃培養(yǎng)45分鐘后，將細(xì)菌鋪在含有用于選擇的抗生素的LB培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)移至膜上后mRNA的雜交(或Northern印跡)所用的膜是商業(yè)硝基纖維素膜Clontech，其中已轉(zhuǎn)移并固定了源自人各種組織的mRNA。
放射活性DNA探針按以下方法制備“Rediprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)”Amersham。該方法可以在37℃保溫10分鐘后獲得DNA片段中大于55％的[32P]dCTP(50mCi)摻入率，在雜交2小時后可以檢測到相應(yīng)于0.5pg的RNA帶，在雜交過夜后可進(jìn)行放射自顯影。
將膜于42℃攪拌下與8ml雜交溶液(1M NaCl，10mM NaH2PO4pH7.4；10mg/ml Ficoll，10mg/ml聚乙烯吡咯烷酮，10mg/ml BSA，100mg/ml鮭魚精子DNA，2％SDS)預(yù)雜交約2小時，然后在42℃攪拌下與混合在8ml雜交溶液中的2×106cpm/ml的探針雜交24小時，然后用洗滌溶液1(0.3M NaCl，30mM檸檬酸鈉pH7，0.05％SDS)沖洗多次，在此相同溶液中洗滌40分鐘，50℃下在洗滌溶液2(15mM NaCl，1.5mM檸檬酸鈉pH7，0.1％SDS)中保溫40分鐘，最后進(jìn)行放射自顯影。
7)雙雜合系統(tǒng)的方法系統(tǒng)原理由Song和Fields從1989年開發(fā)的雙雜合系統(tǒng)是一種通過體內(nèi)相互作用進(jìn)行的釀酒酵母中的克隆技術(shù)。它是基于這樣的事實(shí)某些反式激活性真核細(xì)胞只需要兩個功能域即可起作用DNA結(jié)合功能域(DLA)(其與特異性序列結(jié)合)和活化功能域(DA)(它動員轉(zhuǎn)錄機(jī)器，RNA polII)。當(dāng)這兩個功能域被分離時，DA不能正確定位，不能誘發(fā)轉(zhuǎn)錄。
在該系統(tǒng)中，DLA與蛋白X融合，DA與蛋白Y融合。如果蛋白X和Y能相互作用，則形成功能性反式激活復(fù)合物，并誘導(dǎo)置于DLA所識別序列下游的報道基因的表達(dá)。該基因的表達(dá)可間接揭示兩種蛋白間的相互作用。一個或兩個不同質(zhì)粒對酵母的轉(zhuǎn)化按Gietz(Gietz等，1995)描述的方法用LiAc/PEG處理使酵母轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)。
酵母在YPD固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)過夜，然后重懸在1ml無菌溶液I(0.1M LiAc，10mM TrisHCl，1mM EDTA pH7.5)中，以3000rpm離心1分鐘，再次重懸在1ml溶液I中。然后將50μl懸液與5μg鮭魚精子DNA(引導(dǎo)DNA)、1-5μg質(zhì)粒DNA和300μl無菌溶液II(0.1MLiAc，10mM TrisHCl，1mM EDTA pH7.5，50％PEG4000)混合。將混合物28℃保溫30分鐘，然后在42℃熱處理20分鐘。以3000rpm離心1分鐘后，用無菌水洗滌細(xì)胞一次，重懸在100μl無菌水中。然后將酵母鋪在加有其生長所需氨基酸和氮源的瓊脂固化的YNB培養(yǎng)基上。為了能選擇轉(zhuǎn)化的酵母，不加入相應(yīng)于選擇標(biāo)志的氨基酸和氮源。將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫箱中3天。cDNA文庫對酵母的轉(zhuǎn)化所用的文庫為商業(yè)文庫(Clontech)，從一個正常人(37歲男子，腦創(chuàng)傷后死亡)腦的mRNA構(gòu)建而成。這些cDNA已克隆在質(zhì)粒pGAD10中GAL4的DA區(qū)下游的EcoR I位點(diǎn)上。插入片段的平均大小為1.4kb，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1kb。文庫在大腸桿菌DH5a中擴(kuò)增一次，獲得1.2×106個獨(dú)立克隆，其中80％含有一個插入片段。
為了保持文庫的良好代表性，需要有2-10倍于構(gòu)建文庫時所獲獨(dú)立克隆數(shù)的轉(zhuǎn)化子數(shù)目。因此我們采用了能獲得良好轉(zhuǎn)化效率(約107個轉(zhuǎn)化子/100μg DNA)的操作方法。
以含PS-I一個區(qū)相應(yīng)序列的質(zhì)粒pGBT9預(yù)轉(zhuǎn)化的酵母YCM79在50ml培養(yǎng)基YNB+His+Lys+Ade+Met+Leu+Ura中28℃振蕩培養(yǎng)過夜。測定該預(yù)培養(yǎng)物的光密度，以評價每毫升中的細(xì)胞數(shù)，從而計(jì)算在250ml YPD培養(yǎng)液中的接種體積，以在28℃振蕩培養(yǎng)過夜后獲得107細(xì)胞/ml的培養(yǎng)物(約A600＝0.8)。
然后以3000rpm離心10分鐘收集細(xì)胞，用100ml無菌水洗2次，重懸在10ml轉(zhuǎn)化溶液I中。將此懸液以3000rpm離心10分鐘，將細(xì)胞重懸在2.5ml同樣的溶液中。取部分懸液(200μl)一半用作未轉(zhuǎn)化的陰性對照，另一半將用已知轉(zhuǎn)化效率的對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。剩余的懸液與100μl 1mg/ml的cDNA質(zhì)粒文庫和20ml溶液II混合。該混合物于28℃振蕩培養(yǎng)1小時，然后42℃20分鐘，再以3000rpm離心15分鐘。細(xì)胞沉淀用水洗一次，用PBS洗2次，以徹底去除對酵母有毒性的PEG，然后收集在2.5ml無菌PBS中(50mM Na2HPO4，10mM KCl，1mMMgSO4，pH7)。
用該懸液接種250ml培養(yǎng)基YNB+His+Lys+Ade+Met+Ura，28℃振蕩培養(yǎng)4小時，讓雜合蛋白表達(dá)、可能的話它們相互作用、及報道基因URA3表達(dá)。但該步驟會造成陽性克隆數(shù)目的擴(kuò)大。為了評價菌落數(shù)目的擴(kuò)增率，在該培養(yǎng)前后各取1ml培養(yǎng)液，將各種稀釋液鋪在瓊脂固化的培養(yǎng)基YNB+His+Lys+Ade+Met+Ura上。生長后，測定Leu+Trp+克隆的數(shù)目，以評價培養(yǎng)期前后的轉(zhuǎn)化頻率及從中推定的擴(kuò)增率。
然后將細(xì)胞以3000rpm離心10分鐘，用無菌水洗兩次，重懸在10ml YNB中并鋪在10個435cm2的培養(yǎng)皿中，每個含有200ml選擇培養(yǎng)基YNB+His+Lys+Ade+Met。將這些培養(yǎng)皿置于28℃恒溫箱中3天。酵母質(zhì)粒DNA的提取該技術(shù)不但可提取質(zhì)粒，還可以提取酵母中所含的基因組DNA。為了分離質(zhì)粒，只需轉(zhuǎn)化僅質(zhì)粒DNA可在其中復(fù)制的細(xì)菌，分析小量制備后的每個克隆。含有質(zhì)粒的酵母在選擇性YNB固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)過夜。然后重懸在200ml裂解溶液中(2％Triton X100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tris pH8，1mM EDTA)，其中存在玻璃珠(直徑450μm)和200ml苯酚/氯仿。將混合物渦旋振蕩15分鐘，然后以14000rpm離心2分鐘。水相在膜上透析1小時。該溶液可用于電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)菌。β-半乳糖苷酶活性的揭示該試驗(yàn)?zāi)茯?yàn)證轉(zhuǎn)化的醇母中編碼β-半乳糖苷酶的報道基因LacI的表達(dá)。
將一張硝酸纖維素膜放在這些單個的酵母克隆上。將該復(fù)制片浸在液氮中3次30秒鐘，以破壞酵母并能觸及β-半乳糖苷酶的底物。然后將該膜菌落朝上置于一張浸有即時配制的PBS/Xgal溶液(100μl 40mg/ml的底物Xgal的二甲基甲酰胺溶液于5ml PBS中)的Whatman濾紙上，然后置于所測酶活性的最佳溫度37℃下。
出現(xiàn)揭示β-gal活性的藍(lán)色的時間差異很大，從幾分鐘到幾小時不等。該試驗(yàn)在陽性作用對照(迅速變藍(lán)色)和陰性對照(保持白色)存在下進(jìn)行。液滴試驗(yàn)該試驗(yàn)可以分析酵母菌株的表型。將一滴(約5ml)稍混濁的酵母懸液置于各種瓊脂化的選擇性或非選擇性培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2天后觀察酵母的生長。質(zhì)粒的分離這是在轉(zhuǎn)化酵母的表型與質(zhì)粒的存在良好相關(guān)時的質(zhì)粒分離試驗(yàn)。
將酵母在YPD完全培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)過夜。這種非選擇性培養(yǎng)基允許細(xì)胞分裂后保留或不保留質(zhì)粒的酵母生長。將該培養(yǎng)物的不同稀釋液鋪在YPD培養(yǎng)基上，以在28℃培養(yǎng)過夜后獲得50-100個克隆/培養(yǎng)皿。然后通過用絲絨在各種選擇性培養(yǎng)基上復(fù)制測定克隆的表型，可在28℃培養(yǎng)2天后估測不含質(zhì)粒之細(xì)胞的幾率。
8)體外相互作用試驗(yàn)的方法試驗(yàn)原理這是利用親和層析的生化技術(shù)驗(yàn)證兩種蛋白間的相互作用。將含有某蛋白的推測配偶體的細(xì)胞提取物加至預(yù)先固定了誘餌蛋白的載體中。如果存在該蛋白與其可能配偶體之間的相互作用，該配偶體本身也將保留在載體上。大腸桿菌中融合蛋白的表達(dá)融合蛋白是在大腸桿菌BL21(DE3)中借助于表達(dá)載體和可被IPTG誘導(dǎo)的pGEX(Studier，1991)而制得。
預(yù)先用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌BL21(DE3)在含選擇用抗生素(對pGEX為氨芐青霉素，對pET為卡那霉素，100μg/ml)的LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)過夜。將5ml該預(yù)培養(yǎng)物接種在45ml LB培養(yǎng)基+抗生素中，以在37℃振蕩1小時后獲得A600＝0.6的培養(yǎng)液。加入0.1mM IPTG誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生，將細(xì)菌置于37℃振蕩下1-4小時。以6000rpm離心5分鐘收集表達(dá)蛋白的細(xì)胞。沉淀物于-20℃保存。細(xì)菌中所產(chǎn)生蛋白的提取和分析將含有融合蛋白的細(xì)菌沉淀重懸在5ml TE中(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA)。用終濃度為0.1mg/ml的溶菌酶和1％Triton X-100溶解細(xì)胞。30℃保溫15分鐘，然后放在冰上進(jìn)行超聲處理直到細(xì)菌懸液變成液體。以10000rpm 4℃離心細(xì)菌溶解液15分鐘。含有可溶性融合蛋白的上清液可在-20℃下保存。
在此階段，在變性凝膠(SDS PAGE)上電泳分析所得到的各個部分。取60μl離心前的細(xì)菌懸液(全樣)、60μl上清液(可溶部分)及60μl重懸于5ml TE中的沉淀(不溶部分)。將各部分中所含蛋白在1/4體積的上樣藍(lán)(0.2M TrisHCl pH6.8，5％SDS，5％甘油，0.5％α-巰基乙醇，溴酚藍(lán))存在下95℃變性10分鐘，上樣于12％SDS聚丙烯酰胺凝膠上，通過電泳按分子量分離蛋白。在125伏/厘米下遷移后，通過考馬斯藍(lán)對凝膠染色檢測蛋白。蛋白的溶解當(dāng)外源基因在大腸桿菌中表達(dá)時可能出現(xiàn)外源蛋白的聚集物，形成包涵體。這樣易于通過離心純化重組蛋白，但蛋白經(jīng)常難以溶解。
將處于不溶性部分中的蛋白用6M脲和10mM DTT 37℃變性10分鐘，然后相繼在三個緩沖液中透析來復(fù)性(5mM TrisHCl pH8/2M脲；5mM TrisHCl，pH8/1M脲；5mM TrisHCl，pH8)，每次至少6小時。以10000rpm離心15分鐘后，約5-10％的蛋白見于上清液中，于-20℃保存。親和層析為了在良好條件下進(jìn)行蛋白的保留，樣品的蛋白濃度應(yīng)大于40mg/ml。該濃度可用比色法(如Bradford反應(yīng))測定。
將含有非融合GST或GST-BM(早老素1的突變環(huán))的可溶部分200μl在300μl“谷脫甘肽樹脂”存在下20℃保溫2分鐘。除去未保留在樹脂珠上的部分。用洗滌緩沖液(20mM TrisHCl pH8，150mM NaCl，0.1％Triton X100)洗樹脂4次，以除去因非特異性吸附而固定的蛋白質(zhì)。將連有GST或GST-BM的樹脂150μl在4℃下與600μl含STag或STag-Pep126的可溶部分振蕩保溫1小時。然后以3000rpm離心瓊脂糖珠粒1分鐘，在去除非保留部分后用洗滌緩沖液洗4次。
將每個部分(可溶、被珠粒保留和不保留的部分)的試樣在上樣藍(lán)存在下上樣于95℃變性后的SDS PAGE凝膠上，電泳分離。然后將這些蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，膜用麗春紅(Ponceau)(20μg/ml)染色以驗(yàn)證蛋白已被良好轉(zhuǎn)移。
為了特異性檢測與S-tag融合的蛋白，將硝基纖維素膜用TBST(10mM TrisHCl pH8，150mM NaCl，0.1％Tween 20)中的1％明膠飽和15分鐘，并與連有堿性磷酸酶的蛋白S一起保溫。用TBST洗滌4次后，按Novagen的方法加入含NBT和BCIP的1X PA緩沖液揭示堿性磷酸酶的活性。
9)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白的方法哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建為了在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，按常規(guī)方法將序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2亞克隆到一載體中，處于強(qiáng)病毒啟動子(CMV)控制之下。細(xì)胞的轉(zhuǎn)染對COS1細(xì)胞或CHO細(xì)胞建立的方法是，以與DNA 1比8的比例(重量/重量)使用一種脂轉(zhuǎn)染劑和相同比例的一種合成多肽(H1)以優(yōu)化DNA的緊密度和轉(zhuǎn)染效率。該方法尤其依賴于DNA中磷酸根的電荷被脂轉(zhuǎn)染劑正電荷的中和。
COS1細(xì)胞在含4.5g/l葡萄糖并補(bǔ)有3％L-谷氨酰胺、1％青鏈霉素和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium)中在95％濕度和5％CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。
在轉(zhuǎn)染的前一天夜，以2.5×106細(xì)胞/100mm培養(yǎng)皿的密度接種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，細(xì)胞用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗2次，用OptiMEM(專利組合物，Gibco-BRL)洗一次以在孵箱中適應(yīng)至少15分鐘。
對100mm培養(yǎng)皿而言，向300μl OptiMEM和64μg合成肽(H1)中共加入8μg質(zhì)粒DNA。在劇烈渦旋10秒鐘后，等5分鐘再向上述混合物中加入稀釋在300μl OptiMEM中的脂轉(zhuǎn)染胺(32μl，即64μg)。將混合物再次劇烈渦旋，然后靜置30分鐘。每管加入5mlOptiMEM，渦旋后的混合物置于細(xì)胞上(其上已預(yù)先加了培養(yǎng)基)。然后將細(xì)胞置于孵箱中4小時，其間用完全培養(yǎng)基置換其中的混合物。細(xì)胞溶解和蛋白的測定細(xì)胞通常在轉(zhuǎn)染后48小時進(jìn)行溶解(一般表達(dá)水平最高)。裂解緩沖液含有10mM Tris pH7.5，1mM EDTA，1％Triton X100，1％NP40和混合蛋白酶抑制劑(Complete，Boebringer-Mannheim)。在用PBS清洗后，向每板中加入800μl冷緩沖液。然后對裂解液進(jìn)行超聲處理，再于4℃下磁棒攪拌過夜。以15000xg離心30分鐘分離沉淀和上清液。
然后按BCA試劑盒(Pierce)測定可溶性蛋白，以便為以后的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。免疫轉(zhuǎn)移樣品(細(xì)胞裂解液)在等體積的上樣緩沖液(125mM Tris pH6.8，4％m/v SDS，20％甘油，0.02％溴酚藍(lán)，50mM二硫蘇糖醇)中95℃變性5分鐘。為了分析早老素的表達(dá)，樣品在8M脲存在下變性，以避免95℃下早老素自身的聚集。
將樣品點(diǎn)在Tris-甘氨酸凝膠(Novex)上，其中丙烯酰胺的百分比根據(jù)待分辨的分子量而不同。分子量標(biāo)記也點(diǎn)在膠上(Broad Range，BioRad)。在100伏恒壓下在1X最終SDS緩沖液(Novex)中遷移2小時。然后在恒定150mA下凝膠向硝基纖維素膜或PVDF膜上轉(zhuǎn)移約2小時(1X最終轉(zhuǎn)移緩沖液(Novex)加10％甲醇)。
轉(zhuǎn)移后，膜在含2％脫脂奶粉(Merck)的50ml PBS-T(PBS加0.5％Tween)中室溫封閉2小時。加入第一抗體(用有或無2％脫脂奶粉的PBS-T稀釋至1/1000至1/5000的最佳濃度)后，4℃放置一夜。用PBS-T簡單沖洗后，將膜在第二抗體(與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠或抗兔IgG，視情況而定)存在下保溫45分鐘，第二抗體在稱為“ECL”的緩沖液(20mM Tris，150mM NaCl，0.1％Tween)中稀釋至1/5000。
然后將膜在“ECL”緩沖液中沖洗4次15分鐘。通過ECL反應(yīng)(Amersham)，即以等體積即刻混合兩種緩沖液來顯示。對不同的照相底片進(jìn)行曝光，然后沖印。實(shí)施例實(shí)施例1通過篩選大腦cDNA融合文庫分離PS1的特異性配偶體為了分離PS1蛋白的特異性配偶體，利用雙雜合技術(shù)篩選了人腦cDNA文庫。使用了與GAL4的DA融合的cDNA文庫，將PS-I的親水區(qū)與GAL4的DLA融合構(gòu)建了各種誘餌蛋白。1.1構(gòu)建GAL4的DLA與PS1親水區(qū)融合蛋白的表達(dá)載體利用pGBT9載體制備了5種融合蛋白，在該載體中在GAL4的DLA序列相同讀框中引入了相應(yīng)于PS1不同親水區(qū)的序列。選擇它來鑒定能與蛋白的N-末端區(qū)(Nt，密碼子1-81)、大環(huán)(BL6，密碼子263-407)、帶有L286V突變的大環(huán)(BM)、大環(huán)的短區(qū)(BR，密碼子290-376)及最后C-末端部分(Ct，密碼子421-467)相互作用的蛋白質(zhì)。
通過PCR從PS1 cDNA的全序列獲得了相應(yīng)于這些不同區(qū)的DNA片段。所用的不同寡核苷酸使得可以在每個擴(kuò)增序列的末端引入EcoRI和Sal I位點(diǎn)。因此，這些PCR片段可被插入在pGBT9的多克隆位點(diǎn)的EcoR I和Sal I位點(diǎn)間，位于GAL4的DLA下游并在同一讀框中。通過DNA測序證實(shí)了所得的各種構(gòu)建物，pGBT-Nt、pGBT-BL6、pGBT-BM、pGBT-BR和pGBT-Ct。這種驗(yàn)證表明，這些片段不帶有由PCR造成的任何突變，并與GAL4的DLA序列完全處在同一個開放讀碼框架中。1.2獲得表達(dá)GAL4 DLA與PS1親水區(qū)融合蛋白的酵母菌株由于酵母被兩個不同質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化是比被僅一個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化概率低的事件，使用了預(yù)先用編碼誘餌蛋白的載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株，以在篩選cDNA文庫時具有可能最好的效率。
為此，用pGBT-Nt、pGBT-BL6、pGBT-BM、pGBT-BR和pGBT-Ct中每一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株YCM79。含有這些質(zhì)粒的酵母在不含有色氨酸的培養(yǎng)基上選擇具有Trp+表型的含這些質(zhì)粒的酵母，并分別稱為yNt、yBL6、yBM、yBR和yCt。利用位于插入片段5′和3′的DLA和tADH1序列的互補(bǔ)寡核苷酸對酵母直接進(jìn)行PCR來驗(yàn)證每個菌株中存在各種質(zhì)粒。所得PCR片段的大小可用于區(qū)別各種菌株，但yBL6和yBM除外。1.3含PS1親水區(qū)的融合蛋白的反式激活活性和與GAL4 DA相作用的試驗(yàn)如果融合蛋白具有反式激活作用或如果它與GAL4的DA相作用，它不能用作雙雜合系統(tǒng)中的誘餌蛋白，因?yàn)樗谌魏蔚鞍?蛋白相互作用之外產(chǎn)生系統(tǒng)性陽性反應(yīng)。
因而第一個試驗(yàn)是驗(yàn)證PS-I的各親水區(qū)當(dāng)與GAL4的DLA融合時不具有反式激活作用，該作用為其自身能引起報道基因的轉(zhuǎn)錄。這種活性例如與融合蛋白中酸性結(jié)構(gòu)域的存在有關(guān)。
為此，直接檢測了菌株yNt、yBL6、yBM、yBR和yCt中報道基因LacZ和URA3的表達(dá)。
第二種試驗(yàn)是確定融合蛋白與GAL4的DA間無相互作用。為此，具有Trp+Leu+表型的菌株yNt、yBL6、yBM、yBR和yCt用編碼GAL4的DA的質(zhì)粒pGAD424(與pGAD10相當(dāng))轉(zhuǎn)化。在不含色氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上選擇酵母，對所得克隆測定報道基因LacZ和URA3的表達(dá)，這可監(jiān)控所述相互作用。
兩種情況下，β-半乳糖苷酶活性試驗(yàn)和無尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上液滴試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性。
含有PS-I親水部分的融合蛋白因而不具有內(nèi)在的反式激活特性，不能與GAL4的活化域相互作用。它們因而可用作文庫篩選的誘餌蛋白。1.4 cDNA融合文庫對各種酵母菌株的轉(zhuǎn)化融合文庫的篩選可以鑒定表達(dá)與誘餌蛋白相作用之GAL4 DA融合肽的克隆。如果存在這種相互作用，它應(yīng)能重建功能性反式激活蛋白，誘導(dǎo)含誘餌蛋白的菌株中報道基因URA3和LacZ的表達(dá)。
為了使篩選具有代表性，需要每個含有文庫的獨(dú)立質(zhì)粒含于至少一個轉(zhuǎn)化后的酵母中。為此，使用了理論上可使轉(zhuǎn)化子數(shù)目大于文庫獨(dú)立質(zhì)粒數(shù)目的方法(參見材料和方法)。
表型為His-、Lys-、Ade-、Met-、Ura-、Leu-的5個菌株yNt、yBL6、yBM、yBR和yCt相繼用100μg融合文庫質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在YNB+His+Lys+Ade+Met培養(yǎng)基上挑選。
第一次挑選后我們得到了32個Ura+表型的yNt菌株的克隆，450個Ura+表型的yBL6克隆，126個yBM、250個yBR和67個yCt克隆。對這些轉(zhuǎn)化子進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性試驗(yàn)，以驗(yàn)證第二個報道基因LacZ的表達(dá)。共有6個克隆具有Ura+、β-gal+雙重表型一個yNt克隆，一個yBL6克隆，yBM和yBR菌株各2個克隆，yCt菌株沒有。這些克隆分別稱為yNt.A、yBL6.B、yBM.C、yBM.D。實(shí)施例2文庫質(zhì)粒的分離為了鑒定能與PS1的突變環(huán)或短環(huán)相作用的蛋白，提取了酵母yBM.C和yBM.D中所含的質(zhì)粒。DNA制備物中的這些質(zhì)粒用于通過電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)菌。
從所獲細(xì)菌克隆提取的質(zhì)粒用不同的酶消化。這種分析揭示了5種不同的限制酶切方式。
從酶母yBM.C和yBM.D所提取質(zhì)粒的消化與質(zhì)粒pGBT-BM有共同的模式，而含有2900bp SEQ ID No.1相應(yīng)插入片段(來自菌株yBM.C的pGAD-C)和1400bp SEQ ID No.2相應(yīng)插入片段(來自菌株yBM.D的pGAD-D)的質(zhì)粒pGAD10具有兩種不同的模式。2.1檢驗(yàn)經(jīng)轉(zhuǎn)化不同酵母菌株所分離的質(zhì)粒當(dāng)由腦文庫的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母時，有可能多個不同質(zhì)粒被引入同一個細(xì)胞中。為了證實(shí)相互作用的結(jié)果確是由于所方離的質(zhì)粒存在而引起的，而不是由于多余的質(zhì)粒，我們又在菌株YCM79中而且在菌株HF7C和PCY2中試驗(yàn)了對PS-I不同親水區(qū)篩選文庫得到的融合蛋白。
HF7C具有兩個報道基因HIS3和LacZ。LacZ基因具有不同于菌株YCM79中的啟動子環(huán)境，這使得可以驗(yàn)證β-gal+克隆的獲得與特定的啟動子環(huán)境無關(guān)，而與所試驗(yàn)蛋白質(zhì)間的相互作用相關(guān)。PCY2的優(yōu)點(diǎn)是只有一個報道基因LacZ，其表達(dá)在反式激活蛋白GAL4有功能時在該菌株中比在其他兩個菌株中要強(qiáng)。
我們用不同的質(zhì)粒對pGBT-X/pGAD-Y(X代表Nt、B16、BM、BR或Ct；Y代表C或D)、pGBT9/pGAD424(陰性相互作用對照)和pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65(陽性相互作用對照)(Russo等，1995)轉(zhuǎn)化了三個酵母菌株YCM79、HF7C和PCY2。我們試驗(yàn)了每次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的3-5個克隆的營養(yǎng)缺陷型和β-gal活性。培養(yǎng)皿的結(jié)果示于圖2中。
考慮到試驗(yàn)敏感性的差異，當(dāng)轉(zhuǎn)化的酵母YCM79和HF7C在無尿嘧啶或無組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長就可證實(shí)相互作用，即它們確實(shí)表達(dá)其至少一種報道基因。
反應(yīng)的強(qiáng)度(菌落藍(lán)色的強(qiáng)弱，生長的多少)假設(shè)與報道基因的表達(dá)率成比例。表達(dá)率的差異可以按不同的方式解釋。低表達(dá)率可能是由于重建反式激活蛋白GAL4的蛋白間相互作用弱造成的。這也可能是由于使復(fù)合物的形成不穩(wěn)定的第三種蛋白的參與，或由于融合蛋白在酵母中不穩(wěn)定，或由于酵母的狀態(tài)造成的。這些酵母可能處于弱轉(zhuǎn)錄活性的狀態(tài)，例如與外源蛋白的毒性問題有關(guān)。
已分離的腦文庫融合蛋白不與PS1的N-末端部分和C-末端部分相作用。但這些蛋白看來都與親水區(qū)BL6、突變的親水區(qū)BL6(BM)以及該區(qū)的截短形式(BR)相作用。2.2文庫融合蛋白與不含PS1環(huán)的蛋白間相互作用的試驗(yàn)該試驗(yàn)可以確定來自文庫的融合蛋白是否通過其結(jié)構(gòu)、電荷、疏水性非特異性地與誘餌蛋白(III型假陽性)或GAL4的DLA相作用(II型假陽性)。
我們用下列質(zhì)粒對轉(zhuǎn)化了菌株YCM79、HF7C和PCY2pGBT9/pGAD-Y(Y代表C或D)、pGBT-LAM/PGAD-Y、pGBT9/pGAD424(陰性對照)和pGBT-CtAPP/pGAD-Fe65(陰性對照)。pGBT9只編碼GAL4的DLA，而由Clontech提供的pGBT-LAM編碼GAL4 DLA與核纖層蛋白的融合蛋白，后者非特異性地與其它蛋白的疏水區(qū)相作用。
其結(jié)果是如此轉(zhuǎn)化的酵母無一能夠表達(dá)其報道基因。例如，酵母YCM79具有Ura-、β-gal-表型，酵母HF7C均為His-、β-gal-表型，酵母PCY2為β-gal-表型。
這些結(jié)果提示如此分離的文庫融合蛋白特異性地與PS-I的親水BL6區(qū)相作用，不與核纖層蛋白或GAL4的DLA結(jié)合。2.3含PS1環(huán)編碼區(qū)的載體pLex9所轉(zhuǎn)化酵母的相互作用試驗(yàn)該試驗(yàn)保證蛋白的相互作用不是由于BL6各種片段在與GAL4 DLA融合時才采取的結(jié)構(gòu)的結(jié)果。
為了證實(shí)這一點(diǎn)，將BL6和BM片段與另一DLA融合，即細(xì)菌阻抑蛋白LexA的DLA。制備了兩種補(bǔ)充的質(zhì)粒構(gòu)建體(pLex-BS和pLex-BM)，其中親水環(huán)BL6和其突變形式在質(zhì)粒pLex9的EcoR I/Sal I位點(diǎn)與LexA基因融合。
然后轉(zhuǎn)化酵母L40，其中通過在LexA的操縱子位點(diǎn)上結(jié)合DLA-LexA/DA-GAL4復(fù)合物而誘導(dǎo)報道基因HIS3和LacZ的表達(dá)。測試了與下列質(zhì)粒對的相互作用pLex-BL6/pGAD-Y(Y為C或D)、pLex-BM/pGAD-Y、pLex-RAS/pGAD-RAF(相互作用陽性對照)(Vojtek等，1993)如pLex-RAS/pGAD424、pLex-BL6/pGAD424、pLex-BL6/pGAD-RAF、pLex-BM/pGAD424、pLex-BM/pGAD-RAF(相互作用陰性對照)。
無組氨酸選擇性培養(yǎng)基上液滴試驗(yàn)的結(jié)果和β-gal活性試驗(yàn)的結(jié)果對于含pLex-BL6質(zhì)粒的菌株為陽性，與所試驗(yàn)的pGAD-Y質(zhì)粒一樣。對于含pLex-BM的菌株也是如此，與試驗(yàn)的pGAD-Y質(zhì)粒一樣。該試驗(yàn)表明所觀察到的相互作用與PS-I BL6區(qū)與GAL4 DNA結(jié)合域融合時采取的特定構(gòu)象無關(guān)。實(shí)施例3鑒定所篩得質(zhì)粒的插入片段3.1質(zhì)粒pGAD-C和pGAD-D插入片段的測序?qū)|(zhì)粒pGAD-C和pGAD-D的插入片段進(jìn)行了全部測序。我們利用GAL4的DA及tADH1的互補(bǔ)寡核苷酸開始測序，以便揭示每個插入片段頭尾的序列。然后，我們從每個序列的末端構(gòu)建了合成寡核苷酸，從而得以在兩條鏈上向序列中前進(jìn)。以此方式，我們測出了插入片段D的共1400bp的序列，相應(yīng)于SEQ ID No.2的序列。而對于2900bp的插入片段C(SEQ ID No.1的序列)，需要建立限制性圖譜，然后將各片段克亞隆，以獲得總序列。
插入片段D在其總序列上為一開放讀碼框架(SEQ ID No.2)。而插入片段C在序列末端含有一終止密碼子(SEQ ID No.1)。
它們的肽序列顯示出偏親水性的形象，這與篩選方法的選擇一致，該方法更適用于親水性蛋白質(zhì)。3.2序列比較該比較應(yīng)能得知這些插入片段是否編碼功能已知的肽結(jié)構(gòu)域。
將插入片段的核酸序列及肽序列與數(shù)據(jù)庫“Gen Bank”和“EMBL”(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)中的序列進(jìn)行了比較。在這些插入片段和這些數(shù)據(jù)庫中登記的基因(或蛋白質(zhì))間沒有發(fā)現(xiàn)任何顯著的相似性。
還在插入序列之間進(jìn)行了比較，它們沒有任何相似性。
另外，還研究了可能帶來插入片段所編碼肽之功能信號的肽基元的存在。發(fā)現(xiàn)了幾個潛在的糖基化、磷酸化和十四烷基化位點(diǎn)，但這不足以提出關(guān)于這些肽可能功能的假說。3.3所選肽相應(yīng)的mRNA在各種人組織中的表達(dá)為了證實(shí)體內(nèi)存在這些肽與PS1相互作用的觀點(diǎn)，現(xiàn)證明從文庫所分離肽mRNA的表達(dá)與PS1 mRNA的表達(dá)處于相同的組織中。研究了含所分離序列的基因在特定組織中的表達(dá)，用Northern印跡法分析了插入片段C和D相應(yīng)mRNA在各種人組織中的表達(dá)率。
從插入片段C(SEQ ID No.1)制備的放射活性探針與在腦中特異性表達(dá)的9.5kb mRNA雜交，該mRNA更特別是在大腦皮層、額葉和顳葉中表達(dá)(參見圖3)。該mRNA的大小提示所翻譯的蛋白分子量大。實(shí)施例4體外相互作用試驗(yàn)從該試驗(yàn)可知這種相互作用與酵母環(huán)境無關(guān)。功能性反式激活蛋白GAL4的重建不總是由于兩種蛋白質(zhì)間的直接相互作用，也可能是在融合蛋白與一種或多種酵母內(nèi)源性蛋白間形成蛋白復(fù)合物的結(jié)果。例如，相互作用只有存在來自酵母的中間蛋白時才存在，在此環(huán)境之外則不存在。
因此決定在一無細(xì)胞系統(tǒng)中證實(shí)PS1的親水區(qū)BL6和分別稱為PepC和PepD的所分離肽間的相互作用。
在大腸桿菌BL21(DE3)中產(chǎn)生這些蛋白以大量獲得。兩種分離的肽已與用于檢測和與支持物結(jié)合的肽標(biāo)簽融合。為此，選擇將GST蛋白(其與谷胱甘肽結(jié)合)與各種形式的BL6融合，將S-tag肽(被S蛋白特異性識別)與所分離肽融合(試驗(yàn)原理參見材料和方法部分)。4.1 S-tag與cDNA文庫篩選分離的肽間融合蛋白的產(chǎn)生為了構(gòu)建S-tag與兩種肽PepC和PepD間的融合蛋白，來自質(zhì)粒pGAD-C和pGAD-D的各EcoR I/EcoR I片段被插入在載體pET-29a中S-tag序列的同一讀碼框架中。
在此步中得到了含PepD相應(yīng)插入片段的質(zhì)粒(pET-D)。質(zhì)粒的部分測序表明已在所希望的讀框中實(shí)現(xiàn)了插入。
用此質(zhì)?？色@得相應(yīng)于STag-PepD融合蛋白的52kDa的蛋白質(zhì)。在細(xì)菌BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生了蛋白STag-PepD。4.2 GST和PS1親水環(huán)間融合蛋白的產(chǎn)生為了將GST與PS1親水區(qū)BL6三種形式之一融合，使用了載體pGEX-4T1，向其中引入來自質(zhì)粒pGBT-BL6、pGBT-BM和pGBT-BR的EcoRI/Sal I片段。
獲得了相應(yīng)于PS-I突變環(huán)的質(zhì)粒pGEX-BM。測序表明插入是發(fā)生在GST序列的讀碼框架中。
用此質(zhì)粒得以在細(xì)菌BL21(DE3)中在IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生42kDa的融合蛋白GST-BM。4.3融合蛋白GST-BM的溶解在細(xì)菌溶解后，蛋白GST-BM完全保留在不溶部分，而STag肽以及蛋白STag、PepD和GST部分處于可溶部分。
融合蛋白的溶解對于實(shí)現(xiàn)親和層析是絕對必要的。首先將蛋白GST-BM特異性結(jié)合在谷胱甘肽(其以共價方式與瓊脂糖珠粒偶聯(lián))樹脂上，以便隨后測定GST-BM與融合在STag上的PS1的肽配偶體間的相互作用(參見材料和方法)。如果蛋白不能被溶解，在無任何特異性結(jié)合的情況下與珠粒一起沉淀。
融合蛋白GST-BM溶解后，按材料和方法部分第8段描述的條件進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)施例5PS-I特異性配偶體在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)5.1適宜表達(dá)載體的構(gòu)建該試驗(yàn)用于證實(shí)在酵母中揭示的蛋白相互作用是否也能在哺乳動物細(xì)胞環(huán)境中檢測到，其中插入的PS1全蛋白在其膜環(huán)境中。將配偶體的序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2亞克隆在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pCDNA3中，其還帶有5′端的表位myc相應(yīng)序列和允許與配偶體序列同框亞克隆的限制位點(diǎn)EcoR I(圖4)。
分離pGAD-D的1400bp EcoR I限制性片段并同框亞克隆在表達(dá)載體的EcoR I位點(diǎn)中。通過限制酶分析選擇了以正確取向含有cDNA的構(gòu)建物。
對于克隆C，首先分離了pGAD-C的EcoR I(1)-HindIII(391)片段。然后通過部分消化分離了第二個片段HindIII(392)-Msc I(2892)(該后一游離末端位點(diǎn)位于載體pGAD10中克隆C的編碼區(qū)下游)。將片段EcoR I(1)-HindIII(391)和HindIII(392)-Msc I(2892)與經(jīng)EcoRI和EcoRV(后一位點(diǎn)為游離末端)消化的表達(dá)載體連接在一起。通過限制酶分析確定了含有全部C編碼序列的正確構(gòu)建體。
這些構(gòu)建體可用于產(chǎn)生含有myc表位和分別相應(yīng)于序列SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2的肽的融合蛋白。5.2哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)按標(biāo)準(zhǔn)方法將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到COS1細(xì)胞中。細(xì)胞溶解后，通過免疫轉(zhuǎn)移和抗myc抗體的顯示分析樣品。通過利用抗Myc抗體9E10的免疫轉(zhuǎn)移檢測到了配偶體的表達(dá)(圖5)。我們還檢測到對pepC所預(yù)期的很強(qiáng)的120kDa帶，表明為強(qiáng)表達(dá)(泳道C)。對于D，檢測到的條帶強(qiáng)度不總是一致的。在CHO細(xì)胞中的表達(dá)可以檢測到。在該類型的細(xì)胞中，D可能稍穩(wěn)定些，顯示為遷移至80kDa的蛋白(泳道D)。
因此，這兩種蛋白可以在哺乳動物細(xì)胞中被表達(dá)并檢測到。
序列表(1)一般信息(1)申請人(A)名稱RHONE-POULENC RORER(B)街道Raymon Aron大街20號(C)城市Antony(E)國家法國(F)郵編92165(G)電話0155716922(H)傳真0155717291(ii)發(fā)明名稱編碼能與早老素相互作用的蛋白質(zhì)的核酸(iii)序列數(shù)目2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作程序PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)長度2892堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬非(iv)反義非(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..2736(xi)序列描述SEQ ID No.1CGG ATG ATT CCC ATC TTT CAT GAC ATG ATG GAC TGG GAG CAG AGA AAA48Arg Met Ile Pro Ile Phe His Asp Met Met Asp Trp Glu Gln Arg Lys1 5 10 15AAT GGC AAC TTC AAA CAG GTG GAG GCC GAG TTG ATT GAC AAG CTG GAC96Asn Gly Asn Phe Lys Gln Val Glu Ala Glu Leu Ile Asp Lys Leu Asp20 25 30AGC ATG GTG TCA GAA GGG AAA GGT GAC GAG AGC TAC AGG GAG CTC TTC144Ser Met Val Ser Glu Gly Lys Gly Asp Glu Ser Tyr Arg Glu Leu Phe35 40 45AGC CTA CTA ACC CAG CTG TTT GGG CCC TAC CCC AGC CTG CTG GAG AAG192Ser Leu Leu Thr Gln Leu Phe Gly Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Lys50 55 60GTT GAA CAA GAA ACA TGG CGC GAG ACC GGC ATT TCC TTT GTG ACC TCA240Val Glu Gln Glu Thr Trp Arg Glu Thr Gly Ile Ser Phe Val Thr Ser65 70 75 80GTC ACC CGC CTC ATG GAA CGT CTT CTT GAC TAC AGG GAC TGC ATG AAA288Val Thr Arg Leu Met Glu Arg Leu Leu Asp Tyr Arg Asp Cys Met Lys85 90 95GGA GAG GAA ACA GAG AAT AAG AAG ATA GGC TGC ACT GTT AAC CTG ATG336Gly Glu Glu Thr Glu Asn Lys Lys Ile Gly Cys Thr Val Asn Leu Met100 105 110AAT TTT TAC AAA TCT GAG ATT AAC AAG GAA GAA ATG TAT ATC CGC TAC384Asn Phe Tyr Lys Ser Glu Ile Asn Lys Glu Glu Met Tyr Ile Arg Tyr115 120 125ATC CAT AAG CTT TGT GAC ATG CAC TTG CAG GCC GAA AAC TAC ACA GAG432Ile His Lys Leu Cys Asp Met His Leu Gln Ala Glu Asn Tyr Thr Glu130 135 140GCC GCA TTT ACC CTG CTC CTT TAC TGT GAG CTG CTG CAG TGG GAG GAC480Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Tyr Cys Glu Leu Leu Gln Trp Glu Asp145 150 155 160CGG CCA CTA CGG GAA TTC CTC CAC TAC CCA TCG CAG ACA GAG TGG CAG528Arg Pro Leu Arg Glu Phe Leu His Tyr Pro Ser Gln Thr Glu Trp Gln165 170 175CGG AAG GAG GGA CTG TGC CGG AAG ATC ATT CAC TAC TTC AAC AAA GGC576Arg Lys Glu Gly Leu Cys Arg Lys Ile Ile His Tyr Phe Asn Lys Gly180 185 190AAG AGC TGG GAG TTT GGG ATC CCA CTG TGC AGG GAG CTG GCG TGT CAG624Lys Ser Trp Glu Phe Gly Ile Pro Leu Cys Arg Glu Leu Ala Cys Gln195 200 205TAC GAG AGC CTC TAT GAT TAC CAG AGC CTC AGC TGG ATT CGG AAA ATG672Tyr Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Gln Ser Leu Ser Trp Ile Arg Lys Met210 215 220GAG GCC AGC TAC TAT GAC AAC ATT ATG GAG CAG CAA CGC CTG GAG CCT720Glu Ala Ser Tyr Tyr Asp Asn Ile Met Glu Gln Gln Arg Leu Glu Pro225 230 235 240GAG TTC TTT CGG GTC GGC TTC TAT GGC AGG AAG TTT CCT TTC TTT CTT768Glu Phe Phe Arg Val Gly Phe Tyr Gly Arg Lys Phe Pro Phe Phe Leu245 250 255CGG AAC AAA GAA TAC GTG TGC CGT GGC CAT GAC TAC GAG AGG CTG GAG816Arg Asn Lys Glu Tyr Val Cys Arg Gly His Asp Tyr Glu Arg Leu Glu260 GCT GTC GCC ATG864Ala Phe Gln Gln Arg Met Leu Ser Glu Phe Pro Gln Ala Val Ala Met275 280 285CAG CAC CCC AAC CAT CCT GAT GAC GCC ATC CTA CAG TGC GAT GCC CAG912Gln His Pro Asn His Pro Asp Asp Ala Ile Leu Gln Cys Asp Ala Gln290 295 265 270GCC TTC CAG CAG AGG ATG CTC AGT GAG TTT CCG CAG 60; 300TAC TTG CAG ATC TAT GCA GTG ACG CCC ATT CCA GAT TAT GTG GAT GTT960Tyr Leu Gln Ile Tyr Ala Val Thr Pro Ile Pro Asp Tyr Val Asp Val305 310 315 320CTG CAG ATG GAT AGG GTA CCA GAT CGA GTC AAG AGC TTC TAT CGC GTC1008Leu Gln Met Asp Arg Val Pro Asp Arg Val Lys Ser Phe Tyr Arg Val325 330 335AAC AAT GTG AGG AAG TTC CGG TAT GAC AGG CCT TTT CAC AAA GGC CCC1056Asn Asn Val Arg Lys Phe Arg Tyr Asp Arg Pro Phe His Lys Gly Pro340 345 350AAG GAC AAG GAG AAT GAA TTC AAG AGC CTG TGG ATT GAA CGT ACC ACA1104Lys Asp Lys Glu Asn Glu Phe Lys Ser Leu Trp Ile Glu Arg Thr Thr355 360 365CTG ACC CTG ACC CAC AGC TTG CCT GGC ATC TCT CGG TGG TTT GAA GTG1152Leu Thr Leu Thr His Ser Leu Pro Gly Ile Ser Arg Trp Phe Glu Val370 375 380GAG AGG AGG GAA CTG GTG GAG GTG AGC CCT CTG GAG AAT GCC ATC CAA1200Glu Arg Arg Glu Leu Val Glu Val Ser Pro Leu Glu Asn Ala Ile Gln385 390 395 400GTG GTT GAG AAT AAG AAC CAG GAG CTA CGC TCC CTG ATC AGC CAG TAT1248Val Val Glu Asn Lys Asn Gln Glu Leu Arg Ser Leu Ile Ser Gln Tyr405 410 415CAA CAC AAG CAG GTG CAT GGC AAC ATT AAC CTG CTA AGC ATG TGC CTG1296Gln His Lys Gln Val His Gly Asn Ile Asn Leu Leu Ser Met Cys Leu420 425 430AAT GGT GTC ATT GAT GCA GCT GTC AAT GGA GGC ATT GCA CGC TAT CAG344Asn Gly Val Ile Asp Ala Ala Val Asn Gly Gly Ile Ala Arg Tyr Gln435 440 445GAG GCC TTC TTT GAT AAA GAT TAC ATC AAC AAG CAC CCA GGA GAT GCT 1392Glu Ala Phe Phe Asp Lys Asp Tyr Ile Asn Lys His Pro Gly Asp Ala450 455 460GAG AAG ATC ACC CAG CTC AAG GAG CTT ATG CAG GAG CAG GTT CAT GTC 1440Glu Lys Ile Thr Gln Leu Lys Glu Leu Met Gln Glu Gln Val His Val465 470 475 480CTT GGA GTT GGG CTA GCA GTT CAT GAG AAG TTT GTG CAC CCA GAA ATG 488Leu Gly Val Gly Leu Ala Val His Glu Lys Phe Val His Pro Glu Met485 490 495CGG CCT CTG CAT AAG AAG CTA ATT GAT CAG TTC CAG ATG ATG CGG GCC 1536Arg Pro Leu His Lys Lys Leu Ile Asp Gln Phe Gln Met Met Arg Ala500 505 510AGT CTC TAC CAT GAG TTT CCA GGT TTG GAT AAG CTA AGT CCT GCA TGT 1584Ser Leu Tyr His Glu Phe Pro Gly Leu Asp Lys Leu Ser Pro Ala Cys515 520 525TCA GGC ACC AGC ACC CCA CGG GGA AAT GTT CTG GCA TCC CAT AGC CCC 1632Ser Gly Thr Ser Thr Pro Arg Gly Asn Val Leu Ala Ser His Ser Pro530 535 540ATG AGT CCG GAG AGC ATC AAG ATG ACC CAC CGG CAC AGC CCC ATG AAC 1680Met Ser Pro Glu Ser Ile Lys Met Thr His Arg His Ser Pro Met Asn545 550 555 560TTG ATG GGC ACA GGC CGC CAT TCA TCA TCC TCT CTC TCC TCA CAT GCG 1728Leu Met Gly Thr Gly Arg His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser His Ala565 570 575TCT AGT GAA GCA GGA AAC ATG GTG ATG CTG GGT GAC GGC TCC ATG GGT 1776Ser Ser Glu Ala Gly Asn Met Val Met Leu Gly Asp Gly Ser Met Gly580 585 590GAT GCT CCT GAG GAC CTG TAC CAC CAC ATG CAG CTC GCG TAT CCC AAC 1824Asp Ala Pro Glu Asp Leu Tyr His His Met Gln Leu Ala Tyr Pro Asn595 600 605CCC AGG TAC CAA GGC TCA GTC ACC AAC GTC TCT GTT CTG TCC TCG TCC 1872Pro Arg Tyr Gln Gly Ser Val Thr Asn Val Ser Val Leu Ser Ser Ser610 615 620CAG GCA AGC CCT TCT TCC TCC AGC CTG AGT TCC ACT CAC TCA GCA CCA 1920Gln Ala Ser Pro Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Thr His Ser Ala Pro625 630 635 640TCC CAG ATG ATT ACC TCT GCC CCT TCC AGT GCC CGA GAT AAG TAC CGC 1968Ser Gln Met Ile Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ala Arg Asp Lys Tyr Arg
645 650 655CAT GCC CGT GAA ATG ATG TTG TTG CTG CCC ACA TAC CGG GAC CGC CCA 2016His Ala Arg Glu Met Met Leu Leu Leu Pro Thr Tyr Arg Asp Arg Pro660 665 670AGC AGT GCC ATG TAT CCA GCA GCC ATC CTG GAG AAC GGA CAG CCG CCG 2064Ser Ser Ala Met Tyr Pro Ala Ala Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Pro675 680 685AAT TTC CAG CGA GCC CTG TTC CAG CAA GTG GTC GGA GCC TGC AAA CCC 2112Asn Phe Gln Arg Ala Leu Phe Gln Gln Val Val Gly Ala Cys Lys Pro690 695 700TGC AGT GAT CCC AAT CTG TCT GTG GCT GAA AAA GGT CAT TAC TCC CTA 2160Cys Ser Asp Pro Asn Leu Ser Val Ala Glu Lys Gly His Tyr Ser Leu705 710 715 720CAC TTT GAC GCC TTC CAC CAC CCT CTG GGT GAT ACC CCC CCA GCC CTC 2208His Phe Asp Ala Phe His His Pro Leu Gly Asp Thr Pro Pro Ala Leu725 730 735CCT GCC CGG ACC CTG CGC AAG TCT CCT CTC CAC CCT ATC CCA GCC TCC 2256Pro Ala Arg Thr Leu Arg Lys Ser Pro Leu His Pro Ile Pro Ala Ser740 745 750CCC ACA AGC CCC CAG TCA GGT CTG GAC GGC AGC AAC TCT ACG CTG TCC 2304Pro Thr Ser Pro Gln Ser Gly Leu Asp Gly Ser Asn Ser Thr Leu Ser755 760 765GGC AGT GCC AGC AGC GGC GTG TCC TCC TTG AGT GAG AGT AAC TTT GGG 2352Gly Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Leu Ser Glu Ser Asn Phe Gly770 775 780CAC TCC TCG GAG GCC CCA CCT CGC ACT GAC ACC ATG GAC TCC ATG CCA 2400His Ser Ser Glu Ala Pro Pro Arg Thr Asp Thr Met Asp Ser Met Pro785 790 795 800AGT CAG GCC TGG AAT GCT GAC GAA GAT CTT GAG CCA CCC TAC CTC CCT 2448Ser Gln Ala Trp Asn Ala Asp Glu Asp Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro805 810 815GTC CAC TAC AGC CTC TCT GAG TCT GCC GTC CTG GAC TCC ATC AAG GCC 2496Val His Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Ala Val Leu Asp Ser Ile Lys Ala820 825 830CAG CCA TGC CGA AGC CAC TCA GCC CCA GGG TGC GTC ATC CCT CAG GAC 2544Gln Pro Cys Arg Ser His Ser Ala Pro Gly Cys Val Ile Pro Gln Asp835 840 845CCC ATG GAC CCG CCT GCG CTG CCG CCC AAG CCC TAC CAC CCC CGC CTG 2592Pro Met Asp Pro Pro Ala Leu Pro Pro Lys Pro Tyr His Pro Arg Leu850 855 860CCG GCC CTG GAG CAC GAT GAG GGG GTG CTG CTG CGT GAA GAG ACT GAG 2640Pro Ala Leu Glu His Asp Glu Gly Val Leu Leu Arg Glu Glu Thr Glu865 870 875 880AGG CCT CGA GGC CTG CAC CGC AAG GCT CCA TTG CCT CCT GGG AGC GCT 2688Arg Pro Arg Gly Leu His Arg Lys Ala Pro Leu Pro Pro Gly Ser Ala885 890 895AAG GAG GAG CAG GCC CGC ATG GCC TGG GAG CAC GGC CGA GGG GAG CAG 2736Lys Glu Glu Gln Ala Arg Met Ala Trp Glu His Gly Arg Gly Glu Gln900 905 910TGAGGGGCAA CGAGGCGGCT GGGATGCCGC CCTCAGTAAG CAGCTTGCCA ATCACTCCAG2796GTCTGAAAAG CAAGTCCCCC AGCCCCACCC CAGGGAGCCA GAGAGGCTTG CACTCAGGAG2856AGAACCACCC CCAAGTCTCC GTTCTACTGC CGCCCG2892(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)長度1363堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬非(iv)反義非(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..1363(xi)序列描述SEQ ID No.2GAA TTC CGG GGT TGT GTG AAG ATG GAG TTT CCC GGA GGA AAT GAC AAT 48Glu Phe Arg Gly Cys Val Lys Met Glu Phe Pro Gly Gly Asn Asp Asn915 920 925TAC CTG ACG ATC ACA GGG CCT TCG CAC CCC TTC CTG TCA GGG GCC GAG 96Tyr Leu Thr Ile Thr Gly Pro Ser His Pro Phe Leu Ser Gly Ala Glu930 935 940ACA TTC CAT ACA CCA AGC TTG GGT GAT GAG GAA TTT GAA ATC CCA CCT144Thr Phe His Thr Pro Ser Leu Gly Asp Glu Glu Phe Glu Ile Pro Pro945 950 955 960ATC TCC TTG GAT TCT GAT CCC TCA TTG GCT GTC TCA GAT GTG GTT GGC192Ile Ser Leu Asp Ser Asp Pro Ser Leu Ala Val Ser Asp Val Val Gly965 970 975CAC TTT GAT GAC CTG GCA GAC CCT TCC TCT TCA CAG GAT GGC AGT TTT240His Phe Asp Asp Leu Ala Asp Pro Ser Ser Ser Gln Asp Gly Ser Phe980 985 990TCA GCC CAG TAT GGG GTC CAG ACA TTG GAC ATG CCT GTG GGC ATG ACC288Ser Ala Gln Tyr Gly Val Gln Thr Leu Asp Met Pro Val Gly Met Thr995 10001005CAT GGC TTG ATG GAG CAG GGC GGG GGG CTC CTG AGT GGG GGC TTG ACC336His Gly Leu Met Glu Gln Gly Gly Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu Thr101010151020ATG GAC TTG GAC CAC TCT ATA GGA ACT CAG TAT AGT GCC AAC CCA CCT384Met Asp Leu Asp His Ser Ile Gly Thr Gln Tyr Ser Ala Asn Pro Pro1025103010351040GTT ACA ATT GAT GTA CCA ATG ACA GAC ATG ACA TCT GGC TTG ATG GGG 432Val Thr Ile Asp Val Pro Met Thr Asp Met Thr Ser Gly Leu Met Gly104510501055CAT AGC CAG TTG ACC ACC ATT GAT CAG TCA GAA CTG AGT TCC CAG CTG 480His Ser Gln Leu Thr Thr Ile Asp Gln Ser Glu Leu Ser Ser Gln Leu10601065 1070GGT TTG AGC CTA GGG GGT GGC ACC ATC CTG CCA CCT GCC CAG TCA CCT 528Gly Leu Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ile Leu Pro Pro Ala Gln Ser Pro107510801085GAA GAT CGT CTT TCA ACC ACC CCT TCA CCT ACT AGT TCA CTT CAC GAA 576Glu Asp Arg Leu Ser Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Ser Leu His Glu109010951100GAT GGT GTT GAG GAT TTC CGG AGG CAA CTT CCC AGC CAG AAG ACA GTC 624Asp Gly Val Glu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Pro Ser Gln Lys Thr Val1105111011151120GTG GTG GAA GCA GGG AAA AAG CAG AAG GCC CCA AAG AAG AGA AAA AAG 672Val Val Glu Ala Gly Lys Lys Gln Lys Ala Pro Lys Lys Arg Lys Lys112511301135AAA GAT CCT AAT GAA CCT CAG AAA CCA GTT TCA GCA TAT GCT TTA TTC 720Lys Asp Pro Asn Glu Pro Gln Lys Pro Val Ser Ala Tyr Ala Leu Phe114011451150TTT CGT GAT ACA CAG GCT GCC ATC AAG GGA CAG AAT CCT AAT GCC ACT 768Phe Arg Asp Thr Gln Ala Ala Ile Lys G1y Gln Asn Pro Asn Ala Thr115511601165TTT GGT GAG GTT TCA AAA ATT GTG GCC TCC ATG TGG GAT AGT CTT GGA 816Phe Gly Glu Val Ser Lys Ile Val Ala Ser Met Trp Asp Ser Leu Gly117011751180GAG GAG CAA AAA CAG GTA TAT AAG AGG AAA ACT GAG GCT GCC AAG AAA 864Glu Glu Gln Lys Gln Val Tyr Lys Arg Lys Thr Glu Ala Ala Lys Lys1185119011951200GAG TAT CTG AAG GCA CTG GCT GCT TAC AAA GAC AAC CAG GAG TGT CAG 912Glu Tyr Leu Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Lys Asp Asn Gln Glu Cys Gln120512101215GCC ACT GTG GAA ACA GTG GAA TTG GAT CCA GCA CCA CCA TCA CAA ACT 960Ala Thr Val Glu Thr Val Glu Leu Asp Pro Ala Pro Pro Set Gln Thr12201225 1230CCT TCT CCA CCT CCT ATG GCT ACT GTT GAC CCA GCA TCT CCA GCA CCA 1008Pro Ser Pro Pro Pro Met Ala Thr Val Asp Pro Ala Ser Pro Ala Pro123512401245GCT TCA ATA GAG CCC CCT GCC CTG TCC CCA TCC ATT GTT GTT AAC TCC 1056Ala Ser Ile Glu Pro Pro Ala Leu Ser Pro Ser Ile Val Val Asn Ser125012551260ACC CTT TCA TCC TAT GTG GCA AAC CAG GCA TCT TCT GGA GCT GGG GGT 1104Thr Leu Ser Ser Tyr Val Ala Asn Gln Ala Ser Ser Gly Ala Gly Gly126512701275 1280CAG CCC AAT ATC ACC AAG TTG ATT ATT ACC AAA CAA ATG TTG CCC TCT 1152Gln Pro Asn Ile Thr Lys Leu Ile Ile Thr Lys Gln Met Leu Pro Ser128512901295TCT ATT ACT ATG TCT CAA GGA GGG ATG GTT ACT GTT ATC CCA GCC ACA 1200Ser Ile Thr Met Ser Gln Gly Gly Met Val Thr Val Ile Pro Ala Thr130013051310GTG GTG ACC TCC CGG GGG CTC CAA CTA GGC CAA ACC AGT ACA GCT ACT 1248Val Val Thr Ser Arg Gly Leu Gln Leu Gly Gln Thr Ser Thr Ala Thr131513201325ATC CAG CCC AGT CAA CAA GCC CAG ATT GTC ACT CGG TCA GTG TTG CAG 1296Ile Gln Pro Ser Gln Gln Ala Gln Ile Val Thr Arg Ser Val Leu Gln133013351340GCA GCA GCA GCT GCT GCT GCT GCT GCT TCT ATG CAA CTG CCT CCA CCC 1344Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Met Gln Leu Pro Pro Pro1345135013551360CGA GTA CAG CCC GGA ATT C 1363Arg Val Gln Pro Gly Ile136權(quán)利要求
1.編碼一種能與早老素相互作用的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，其特征在于它編碼一種能與早老素PS-1大環(huán)的全部或部分相作用的多肽或蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核苷酸序列，其特征在于它含有序列SEQ ID No.1或其衍生序列的全部或部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核苷酸序列，其特征在于它含有序列SEQ ID No.2或其衍生序列的全部或部分。
5.一種多肽，其特征在于它能夠與早老素相互作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，其特征在于它能夠與早老素PS-1的大環(huán)相作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的多肽，其特征在于它能夠與早老素PS-1大環(huán)的310-463氨基酸序列相作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，其特征在于它能夠與早老素PS-2的大環(huán)相作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8之一的多肽，其特征在于它包含多肽序列SEQ ID No.1或其衍生序列的全部或部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-8之一的多肽，其特征在于它包含多肽序列SEQ ID No.2或其衍生序列的全部或部分。
11.權(quán)利要求5-10的多肽在制備用于減緩、刺激或調(diào)節(jié)早老素活性的藥物中的應(yīng)用。
12.制備權(quán)利要求5-10之一的多肽的方法，其特征在于將含有權(quán)利要求1-4之一的核苷酸序列的細(xì)胞在所述序列的表達(dá)條件下培養(yǎng)，并回收產(chǎn)生的多肽。
13.用于生產(chǎn)權(quán)利要求5-10之一的多肽的細(xì)胞宿主，其特征在于它已用含有權(quán)利要求1-4之一的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化。
14.權(quán)利要求3或4的序列的反義寡核苷酸。
15.能與權(quán)利要求1-4之一的核苷酸序列或相應(yīng)的mRNA雜交的核苷酸探針。
16.抗權(quán)利要求5-10之一的多肽的抗體或抗體片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的抗體或抗體片段，其特征在它針對選自多肽序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或其衍生序列的一種序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的抗體或抗體片段，其特征在于它具有抑制和/或揭示早老素與權(quán)利要求5-10之一的多肽間相互作用的特性。
19.揭示或分離能調(diào)節(jié)或抑制早老素與權(quán)利要求5-10中所定義多肽間相互作用的化合物的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行a.將可能不明身份的分子或不同分子的混合物與如上所定義表達(dá)本發(fā)明多肽的重組細(xì)胞，在所述分子對所述多肽具有親和力時允許所述多肽和所述分子間相互作用的條件下接觸，及b.檢測和/或分離與所述多肽結(jié)合的分子。
20.可按權(quán)利要求19的方法獲得的如權(quán)利要求5-10定義的多肽配體。
21.權(quán)利要求20的配體在制備用于治療神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
22.含有編碼權(quán)利要求5-10之一的多肽之核苷酸序列的缺陷重組腺病毒。
23.含有權(quán)利要求1-4之一的核苷酸序列的載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的載體，其特征在于它是一種質(zhì)粒載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的載體，其特征在于它是一種病毒載體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的載體，其特征在于它是一種復(fù)制缺陷型病毒。
27.含有權(quán)利要求23-26之一的一種或多種載體的藥物組合物。
28.含有至少一種權(quán)利要求5-10之一的多肽作為活性成分的藥物組合物。
29.含有至少一種權(quán)利要求16-18之一的抗體或抗體片段、和/或權(quán)利要求14的寡核苷酸和/或按權(quán)利要求19制備的化合物作為活性成分的藥物組合物。
30.權(quán)利要求27-29之一的組合物，其用于調(diào)節(jié)、減緩或抑制早老素或其突變形式的活性。
31.權(quán)利要求27-29之一的組合物，其用于治療神經(jīng)變性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的核苷酸及肽序列和它們的醫(yī)藥應(yīng)用。更具體地,本發(fā)明涉及編碼能與早老素相作用的蛋白質(zhì)的核酸。
文檔編號A61K31/711GK1272139SQ9880961
公開日2000年11月1日 申請日期1998年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月1日
發(fā)明者A·方尼爾, L·默克肯, L·普拉迪爾, M－F·保羅 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司