專利名稱：作為趨化因子拮抗劑的氨基端截短的mcp－2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基端截短的MCP-2，它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的MCP-2的氨基酸殘基1、1-2、1-3、1-4或1-5的NH2端氨基酸，并具有趨化因子拮抗活性，本發(fā)明還涉及編碼這些MCP-2的cDNA序列，以及它們?cè)谛枰汹吇蜃幼饔棉卓够钚缘募膊≈委熀?或診斷中的應(yīng)用，以及包含它們的藥物組合物。
背景技術(shù)：
趨化因子構(gòu)成了具有白細(xì)胞趨化和活化性能的一個(gè)促炎性細(xì)胞因子小家族。根據(jù)第一個(gè)半胱氨酸的位置，趨化因子家族可以分為C-C、C-X-C和C-X3-C趨化因子(Baggiolini M.等人，1994；Baggiolini M.等人，1997和Taub D.等人，1996)。
許多C-X-C趨化因子，如白細(xì)胞介素-8(IL-8)，對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞有趨化作用，而C-C趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)，則對(duì)包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞在內(nèi)的各種白細(xì)胞有活性。
趨化因子的氨基端區(qū)域參與受體結(jié)合，氨基端的加工可以激活趨化因子或使趨化因子完全沒(méi)有活性。
C-X-C趨化因子血小板堿性蛋白只有在除去氨基端的24個(gè)殘基后才變成一種嗜中性粒細(xì)胞趨化肽(NAP-2)(Walz A.等人，1989和Van Damme J.等人，1990)。
IL-8缺失8個(gè)氨基端殘基導(dǎo)致趨化活性增強(qiáng)，但是位于所有嗜中性粒細(xì)胞趨化性C-X-C趨化因子中第一個(gè)Cys前的Glu-Leu-Arg基序進(jìn)一步斷裂卻導(dǎo)致其完全失去活性(Clark-Lewis I.等人，1991)。
另一個(gè)C-X-C趨化因子粒細(xì)胞趨化蛋白-2(GCP-2)發(fā)生相似的氨基端蛋白水解(解離下8個(gè)氨基酸)卻對(duì)嗜中性粒細(xì)胞趨化活性沒(méi)有影響(Proost P.等人，1993a)。
缺少8到9個(gè)氨基端氨基酸的合成的C-C趨化因子MCP-1、MCP-3和RANTES對(duì)單核細(xì)胞沒(méi)有活性，并被用作受體拮抗劑(Gong J.等人，1996；和Gong J.等人，1995)。
RANTES延伸一個(gè)甲硫氨酸將導(dǎo)致該分子完全失去活性，Met-RANTES表現(xiàn)為真正的RANTES拮抗劑(Proudfoot A.E.等人，1996)。
已經(jīng)用cDNA探針(從刺激的針對(duì)休眠的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)衍生獲得)通過(guò)差示實(shí)驗(yàn)室篩選分離出人MCP-2(單核細(xì)胞引誘蛋白-2)的克隆(它最初稱為“HC14”，Chang H.C.等人，1989)。cDNA衍生的蛋白序列與純化的天然MCP-2相同；然而，還分離出推定的等位基因變體(其中Gln46代替Lys46)(Van Coillie等人，1997)。
還用固相化學(xué)方法合成了MCP-2(Proost P.等人，1995)。
發(fā)明描述本發(fā)明的主要目的是氨基端截短的MCP-2，它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的MCP-2的氨基酸殘基1、1-2、1-3、1-4或1-5的氨基端氨基酸，并具有趨化因子拮抗劑活性。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)目的是MCP-2(6-76)，它是缺少氨基端氨基酸1-5的MCP-2，如

圖1和SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示。
本發(fā)明的這種氨基端截短的MCP-2可以是糖基化形式或非糖基化形式。
術(shù)語(yǔ)“趨化因子拮抗劑”指“成熟的、天然存在的全長(zhǎng)趨化因子的拮抗劑”。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含編碼本發(fā)明氨基端截短的MCP-2的DNA序列的DNA分子，其中所述DNA序列包括基本上相同的核苷酸序列。
“基本上相同的核苷酸序列”包括憑借遺傳密碼的簡(jiǎn)并性也能編碼出給定氨基酸序列的所有其它核酸序列。
本發(fā)明還包括含有上述DNA的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化了該載體的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)將所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在合適培養(yǎng)基中來(lái)制備本發(fā)明這些氨基端截短的MCP-2的方法。
編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列可以插入合適的質(zhì)粒并與其連接。一旦形成表達(dá)載體，就將其導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)載體，產(chǎn)生所需蛋白。
本文提到的任何本發(fā)明重組蛋白的表達(dá)均可用合適的表達(dá)載體在真核細(xì)胞(如酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或原核細(xì)胞中進(jìn)行。本領(lǐng)域中已知的任何方法均可采用。
例如，用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(參見(jiàn)Sambrook等人，1989)將上述任一方法獲得的編碼蛋白的DNA分子插入適當(dāng)構(gòu)建的表達(dá)載體中。利用同聚物加尾、采用合成的DNA接頭的限制性連接或平頭連接技術(shù)，將雙鏈cDNA連接到質(zhì)粒載體中。用DNA連接酶連接DNA分子，通過(guò)堿性磷酸酶處理避免不希望發(fā)生的連接。
為了能表達(dá)所需的蛋白，表達(dá)載體還應(yīng)包含特異的含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信息的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼所需蛋白的DNA連接，從而允許該基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白。首先，為了使基因被轉(zhuǎn)錄，它的前面必須有能被RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與聚合酶結(jié)合，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。可以采用具有不同工作效率的各種啟動(dòng)子(強(qiáng)的和弱的啟動(dòng)子)。
對(duì)于真核宿主，可以采用不同的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，這取決于宿主的性質(zhì)。它們可以來(lái)自病毒，如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等，其中調(diào)控信號(hào)與具有高表達(dá)水平的特定基因相關(guān)聯(lián)。例子是皰疹病毒的TK啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、酵母gal4基因啟動(dòng)子等?？梢赃x擇轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控信號(hào)，使其具有阻遏和激活作用，從而能夠調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。
將包含編碼本發(fā)明蛋白的核苷酸序列的DNA分子插入載體中與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào)操作性相連，該載體能將所需基因序列整合入宿主細(xì)胞中。
還可以通過(guò)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)允許選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的標(biāo)記物，來(lái)選擇被導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。標(biāo)記物還可為營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主提供光營(yíng)養(yǎng)、殺微生物的抗性，例如抗生素，或重金屬如銅等。可選擇的標(biāo)記基因可以和待表達(dá)的DNA基因序列直接連接，或通過(guò)共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入同一細(xì)胞中。為了使本發(fā)明蛋白的合成最優(yōu)，可能還需要額外的元件。
選擇特定質(zhì)?；虿《据d體的重要因素包括從不含載體的受體細(xì)胞中識(shí)別和選出含有載體的受體細(xì)胞的容易程度；特定宿主中所希望的載體拷貝數(shù)；以及是否希望載體能在不同種宿主細(xì)胞之間“穿梭”。
一旦制得了用于表達(dá)的載體或含DNA序列的構(gòu)建物，就可用以下多種合適的方法將該DNA構(gòu)建物導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、偶聯(lián)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。較佳的是真核宿主，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人、猴、小鼠和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，因?yàn)樗鼈優(yōu)榈鞍踪|(zhì)分子提供了翻譯后的修飾，包括正確折疊或在正確位點(diǎn)的糖基化。酵母細(xì)胞也可進(jìn)行包括糖基化的翻譯后肽修飾。有許多重組DNA策略采用了強(qiáng)啟動(dòng)子序列和高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，它們可用來(lái)在酵母中產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。酵母識(shí)別克隆的哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物上的前導(dǎo)序列，并分泌攜帶前導(dǎo)序列的肽(即前肽(pre-peptide))。
在導(dǎo)入載體后，使宿主細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基使含有載體的細(xì)胞選擇性地生長(zhǎng)?？寺〉幕蛐蛄械谋磉_(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的氨基端截短的MCP-2可用本領(lǐng)域中其它熟知的方法來(lái)制備，尤其是已建立的化學(xué)合成方法用自動(dòng)化固相肽合成儀，然后進(jìn)行層析純化。
例如，本發(fā)明的趨化因子可用Fmoc(9-芴甲氧基羰基)、tBoc(叔丁氧羰基)或其它任何類似的化學(xué)合成在不同氨基酸上有或沒(méi)有合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的條件下合成。有或沒(méi)有合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的氨基酸被預(yù)先激活(例如用HBTU/HOBt[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲六氟磷酸/1-羥基苯并三唑)，并偶聯(lián)到生長(zhǎng)的肽鏈上。在加入下一個(gè)殘基之前，從α氨基上除去保護(hù)基團(tuán)(例如Fmoc)。合成后除去所有保護(hù)基團(tuán)，純化完整的全長(zhǎng)肽并用化學(xué)方法或酶法將肽折疊(包括在半胱氨酸之間形成二硫鍵)成本發(fā)明的對(duì)應(yīng)的趨化因子。
天然的、合成的或重組的蛋白可用已知用于純化的任一種方法(即任何常規(guī)方法，包括抽提、沉淀、層析、電泳等(例如參見(jiàn)Proost P.等人，1996))來(lái)進(jìn)行純化。用于純化本發(fā)明蛋白的另一優(yōu)選的純化方法是親和層析，該方法利用的是結(jié)合靶蛋白并產(chǎn)生和固定在柱中所含凝膠基質(zhì)上的單克隆抗體或肝素的親和力。使含有蛋白質(zhì)的不純制備物通過(guò)該柱。蛋白質(zhì)將會(huì)通過(guò)肝素或特異性抗體結(jié)合在柱上，而雜質(zhì)則將通過(guò)柱。洗柱后，通過(guò)改變pH或離子強(qiáng)度將蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來(lái)。
本發(fā)明的氨基端截短的MCP-2可用于治療和/或診斷需要有趨化因子拮抗作用的疾病。這些疾病的例子包括炎性疾病、血管生成和血細(xì)胞生成相關(guān)疾病、腫瘤、傳染病(包括HIV)、自身免疫疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、肺疾病和皮膚病。
因此，本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明的蛋白在生產(chǎn)用于治療上述疾病的藥物中的應(yīng)用。
藥物宜為包含本發(fā)明蛋白以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑的藥物組合物形式。這些藥物組合物形成了本發(fā)明的另一個(gè)方面。
本發(fā)明還有一個(gè)方面是一種治療上述疾病的方法，該方法包括給予處于發(fā)生這些疾病危險(xiǎn)的對(duì)象或已經(jīng)表現(xiàn)出這些病理學(xué)現(xiàn)象的對(duì)象藥學(xué)上活性量的本發(fā)明氨基端截短的MCP-2。
現(xiàn)在將通過(guò)下列實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)被理解成以任何方式限定了本發(fā)明。實(shí)施例將參考下文所述的附圖。
附圖簡(jiǎn)述圖1它顯示了MCP-2以及其已知變體的氨基酸序列。信號(hào)序列用斜體字表示，而C端殘基用粗體表示。箭頭表示本發(fā)明的氨基端截短的MCP-2(6-76)的第一個(gè)氨基酸。下劃線是與MCP-2變體中不同的氨基酸。
圖2氨基端截短的MCP-2(6-76)的SDS-PAGE泳道1天然MCP-2(1-76，100ng/泳道)；泳道2天然MCP-2(1-76，30ng/泳道)；泳道3天然MCP-2(6-76，30ng/泳道)；和泳道4合成的MCP-2(1-76，60ng/泳道)。
凝膠在還原性條件下進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)用銀染色。
圖3它顯示了修飾型MCP-2的趨化效力的比較。
測(cè)試完整的天然(nat)和合成(syn)MCP-2(1-76)、氨基端截短的天然MCP-2(6-76)以及羧基端截短的合成的MCP-2(1-74)在THP-1細(xì)胞上的趨化活性。結(jié)果表示成四次或四次以上單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的CI平均值±SEM。
圖4與MCP-1相比，天然的MCP-2是使單核細(xì)胞中鈣流動(dòng)的較弱的激動(dòng)劑。完整的MCP-2隨劑量的增加(15、50和150ng/ml)而增加THP-1細(xì)胞中的[Ca2+]i。圖中顯示了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
實(shí)施例實(shí)施例1氨基端截短的MCP-2材料和方法趨化因子和免疫試驗(yàn)如前所述的那樣(Proost P.等人，1995)合成和純化MCP-2。
從小鼠獲得特異性抗人MCP-2抗體，并在Sepharose柱(CNBr活化的Sepharose4B，Pharmacia，Uppsala，Sweden)上親和純化，用生產(chǎn)商提供的條件使合成的MCP-2與柱偶聯(lián)。
用親和純化的抗人MCP-2包被ELISA板，并用生物素化的抗-MCP-2作為捕獲性抗體。用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素和TMB進(jìn)行檢測(cè)。MCP-2 ELISA的檢測(cè)極限約為0.1ng/ml。
MCP-2的生產(chǎn)和純化從Antwerp和Leuven輸血中心所得132份獻(xiàn)血員的外周血單核細(xì)胞衍生的條件培養(yǎng)基中純化獲得單核細(xì)胞趨化蛋白(Proost P.等人，1996)。
通過(guò)在羥乙基淀粉(Fresenius AG，Bad Homburg，Germany)中沉淀和在3-乙酰氨基-5-乙酰甲氨基-2，4，6-三碘苯甲酸鈉溶液(sodium metrizoate，Lymphoprep；Nyegaard，Oslo Norway)梯度離心，除去紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。
用10微克/毫升Con A和2微克/毫升LPS培育單核細(xì)胞(60×109細(xì)胞)。48至120小時(shí)后，收集條件培養(yǎng)基并置于-20℃直至純化。
如以前所描述的那樣(Proost P.等人，1996)，用四步純化程序純化天然的MCP-2。
簡(jiǎn)言之，在控制孔徑的玻璃或硅酸上濃縮條件培養(yǎng)基，并在肝素-Sepharose柱(Pharmacia)上親和層析部分純化。
含有MCP-2免疫反應(yīng)性的級(jí)分用Mono S(Pharmacia)陽(yáng)離子交換層析進(jìn)一步純化，并用pH4.0的NaCl梯度洗脫。
在用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的C-8 Aquapore RP-300柱(Perkin Elmer，NorwalkCT)上通過(guò)RP-HPLC將天然的MCP-2純化至均一。蛋白質(zhì)用乙腈梯度洗脫。
用SDS-PAGE、氨基酸序列分析和質(zhì)譜法對(duì)MCP-形式進(jìn)行生物化學(xué)特性分析在還原性條件下、Tris/麥黃酮(tricine)凝膠上用SDS-PAGE檢測(cè)柱級(jí)分的純度(Proost P.等人，1996)。銀染蛋白質(zhì)，并用下列相對(duì)分子量(Mr)標(biāo)記OVA(Mr 45000)，碳酸酐酶(Mr 31000)、大豆胰蛋白酶抑制劑(Mr 21500)、β-乳球蛋白(Mr 18400)、溶菌酶(Mr 14400)以及抑蛋白酶肽(Mr 6500)。
在脈沖液體477A/120A蛋白質(zhì)測(cè)序儀(Perkin Elmer)上，用N-甲基哌啶作為偶聯(lián)堿，用Edman降解法測(cè)定純化的趨化因子的氨基端序列。將封閉的蛋白置于75％甲酸中50小時(shí)，使其在Asp和Pro之間斷裂。不作進(jìn)一步純化就對(duì)甲酸消化物測(cè)序。用基質(zhì)輔助性激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI/TOF-MS)(Micromass TofSpec，Manchester，UK)測(cè)定MCP-2的Mr。分別用α-氰基-4-羥基肉桂酸和細(xì)胞色素C作為基質(zhì)和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
趨化活性的檢測(cè)在Boyden微室中用孔徑5微米的聚乙烯吡咯烷酮處理的聚碳酸膜測(cè)試MCP-2在新鮮純化的單核細(xì)胞(2×106細(xì)胞/毫升)或單核細(xì)胞性THP-1細(xì)胞(0.5×106細(xì)胞/毫升；轉(zhuǎn)種后2天)上的趨化活性。
將樣品和細(xì)胞稀釋在添加了1毫克/毫升人血清白蛋白(Red Cross Belgium)的HBSS(Life technologies/Gibco BRL，Paisley，Scotland)中。37℃培育2小時(shí)后，固定細(xì)胞，用Diff-Quick染色液(Harleco，Gibbstown.NJ)染色，然后用顯微鏡在10個(gè)放大500倍的油浸視野中計(jì)數(shù)遷移通過(guò)膜的細(xì)胞。
根據(jù)遷移到樣品中的細(xì)胞數(shù)與遷移至對(duì)照培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)之比(Van Damme J.等人，1992)，計(jì)算樣品(每個(gè)室中一式三份)的趨化指數(shù)(CI)。
對(duì)于脫敏實(shí)驗(yàn)，在加入Boyden微室的上排孔之前，用無(wú)生物活性的趨化因子變體37℃培育細(xì)胞10分鐘。用HBSS處理的細(xì)胞的CI對(duì)樣品的CI作為參照值，計(jì)算CI的抑制％。
胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測(cè)如以前所述的那樣(Wuyts A.等人，1997)，測(cè)定胞內(nèi)鈣濃度([Ca2+]i)。在含熒光指示劑fura-2(fura-2/AM 2.5μM；Molecular Probes Europe BV，Leiden，The Netherlands)和0.01％Pluronic F-127(Sigma，St Louis MO)的Eagle極限必需培養(yǎng)基(EMEM，Gibco)+0.05％FCS中，培育純化的單核細(xì)胞或THP-1細(xì)胞(107細(xì)胞/毫升)。
37℃放置30分鐘后，洗滌細(xì)胞兩次，并以106細(xì)胞/毫升的濃度重懸于含1mM Ca2+和0.1％FCS的HBSS(用pH7.4的10mM Hepes/NaOH作為緩沖液)中。37℃平衡細(xì)胞10分鐘，然后在LS50B發(fā)光分光光度計(jì)(Perkin Elmer)中測(cè)定fura-2熒光。
在340和380nm處激發(fā)后，在510nm檢測(cè)熒光。用Grynkiewicz方程式(Grynkiewicz等人，1985)計(jì)算[Ca2+]i。為了測(cè)定Rmax，用50μM毛地黃皂苷裂解細(xì)胞。隨后，用20mM Tris調(diào)節(jié)pH至8.5，在裂解的細(xì)胞中加入10mM EGTA，獲得Rmin。所用Kd為224nM。
對(duì)于脫敏實(shí)驗(yàn)，首先用緩沖液、不同濃度的趨化因子或趨化因子拮抗劑刺激單核細(xì)胞或THP-1細(xì)胞。作為第二刺激，MCP-2所用濃度為緩沖液預(yù)先刺激后誘導(dǎo)[Ca2+]i顯著增加的濃度。第二刺激在加入第一刺激后2分鐘施加。比較用趨化因子或趨化因子拮抗劑預(yù)先刺激后的信號(hào)與加入緩沖液后的信號(hào)，計(jì)算對(duì)第二刺激反應(yīng)中[Ca2+]i增加的抑制百分?jǐn)?shù)。
結(jié)果翻譯后修飾型MCP-2的分離用特異的、靈敏的ELISA追蹤檢測(cè)促分裂素和內(nèi)毒素刺激的外周血單核細(xì)胞所產(chǎn)生的不同形式的MCP-2。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的分離方法(Proost P.等人，1996)純化條件培養(yǎng)基，這些方法包括吸附到孔徑控制的玻璃上和肝素Sepharose層析。
隨后，進(jìn)行FPLC mono S陽(yáng)離子交換層析純化，然后采用C-8 RP HPLC作進(jìn)一步純化。用SDS-PAGE和MALDI/TOF-MS測(cè)定分子量。
分離獲得不同形式的MCP-2除了真實(shí)的7.5kDa的MCP-2(1-76)外，用RP-HPLC將缺少5個(gè)殘基的7kDa氨基端截短型MCP-2[MCP-2(6-76)]純化至均一，并用氨基酸序列分析鑒定(圖2)。MALDI/TOF-MS(表I)測(cè)得完整MCP-2的分子量為8881Da(理論上的相對(duì)分子量為8893Da)，而測(cè)得MCP-2(6-76)的分子量為8365Da，這確認(rèn)了有5個(gè)氨基端氨基酸缺失(理論上的相對(duì)分子量為8384Da)。這些天然形式的MCP-2在THP-1趨化試驗(yàn)中的功能比較表明，完整的MCP 2在5ng/ml下仍有活性，而截短的MCP-2(6-76)在0.6-60ng/ml的濃度范圍內(nèi)測(cè)試時(shí)仍沒(méi)有趨化活性(圖3)。還比較了完整的天然MCP-2與合成的MCP-2(1-76)以及缺少2個(gè)殘基的羧基端截短的合成型MCP-2[MCP-2(1-74)](Proost P.等人，1995)的效力。
還發(fā)現(xiàn)這些形式的最低有效趨化濃度為5ng/ml(圖3)。盡管在趨化試驗(yàn)中，天然的完整MCP-1和MCP-2的比活是相當(dāng)?shù)?Van Damme J，等人，1992)，但是MCP-2使鈣遷移的性能仍有待爭(zhēng)論。
然而，在Ca2+遷移實(shí)驗(yàn)中，天然的或合成的MCP-2(1-76)的最低有效劑量比天然的完整的MCP-1(1-76)高10倍(圖4)，而MCP-2(6-76)卻仍沒(méi)有活性。
盡管如此，完整的MCP-2(50ng/ml)卻能使MCP-2(15ng/ml)和MCP-3(10ng/ml)脫敏，使兩者的趨化作用分別受到52％和45％的抑制。
由于MCP-2在Ca2+試驗(yàn)中的比活較低，因此在Boyden微室中進(jìn)行了MCP-2(6-76)對(duì)趨化作用的脫敏。據(jù)報(bào)道，完整的MCP-2在單核細(xì)胞趨化試驗(yàn)中與活性MCP-1、MCP2和MCP3交叉脫敏(Sozzani S.等人，1994)，所以，我們研究天然的無(wú)活性的MCP-2(6-76)是否也能使MCP-1、MCP-2、MCP-3和RANTES脫敏(表II)。用100ng/ml無(wú)活性MCP-2(6-76)預(yù)先培育THP-1細(xì)胞已經(jīng)能明顯抑制10ng/ml MCP-1(63％)、5ng/ml MCP-2(75％)、30ng/ml MCP-3(62％)和100ng/ml RANTES(75％)誘導(dǎo)的趨化作用。另外，濃度低3倍的各MCP所產(chǎn)生的趨化作用被100ng/ml MCP-2(6-76)完全(91-100％)抑制。而且，在低達(dá)10ng/ml的濃度下，MCP-2(6-76)仍然能明顯抑制MCP-1(3ng/ml)、MCP-2(1.5ng/ml)或MCP 3(10ng/ml)以及RANTES(30ng/ml)誘導(dǎo)的趨化活性?？傊?，MCP-2(6-76)是天然產(chǎn)生的、無(wú)活性的化學(xué)引誘劑，并拮抗幾種C-C趨化因子，對(duì)MCP-3的效果最突出。
表I天然型MCP-2的生物化學(xué)特性分析。氨基端氨基酸分析以及C-8 RP-HPLC純化的天然MCP-同種型的實(shí)驗(yàn)(SDS-PAGE和MALDI/TOF-MS)和理論的相對(duì)分子量的比較
表IIMCP-2(6-76)使微室中的MCP-1、MCP-2、MCP-3和RANTES的單核細(xì)胞趨化反應(yīng)脫敏
<p>參考文獻(xiàn)Baggiolini M.等人，Ann.Rev.Immunol.，55，97-179，1994.Baggiolini M.等人，Ann.Rev.Immunol.，15，675-705，1997.Chang H.C.等人，International Immunology，1(4)，388-397，1989.Clark-Lewis I.等人，J.Biol.Chem.，266，23128-23134，1991.De Meester I.等人，J.Immunol.Methods 189，99-10526，1996.Deng H.等人，Nature.，381，661-666，1996.Gong J.等人J.Exp.Med，181，631-640，1995.Gong J.等人，J.Biol.Chem.271，10521-10527，1996.Grynkiewicz G.等人，J.Biol.Chem.，260，3440，1985.Proost P.等人，Biochemistry，32，10170-10177，1993a.Proost P.等人，J.Immunol.，150，1000-1010，1993.Proost P.等人，Cytokine，7，97-104，1995.Proost P.等人，MethodsA companion to Methods in Enzymol.，10，82，1996.Prouddfot A.E.等人，J.Biol.Chem.，271，2599-2603，1996.Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY，1989Schols D.等人，J.Exp.Med.，186，1383-1388，1997.Sozzani S.等人，J.Immunol.，152，3615，1994.Taub D.等人，Cytokine &amp; Growth Factor Reviews，7，335-76，1996.Van Coillie E.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，231，726-730，1997.Van Damme J.等人，Eur.J.Biochem.，181，337-344，1989.Van Damme J.等人，Eur.J.Immunol.，20，2113-8，1990.Van Damme J.等人，J.Exp.Med.，176，59，1992.Walz A.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，159，969-75，1989.Wuyts A.，等人，Biochemistry 36，2716-2723，1997.
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.
(B)街道14 JOHN B.GORSIRAWEG(C)城市CURACAO(E)國(guó)家THE NETHERLANDS ANTILLES(F)郵政編碼沒(méi)有(G)電話639300(H)電傳614129(I)電報(bào)(ii)發(fā)明名稱作為趨化因子拮抗劑的氨基端截短的MCP-2(iii)序列數(shù)目4(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度99氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)沒(méi)有(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..76
(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr-20 -15 -10Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile-5 1 5Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu10 15 20 25Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val30 35 40Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu45 50 55Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn60 65 70Leu Lys Pro75(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度99氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)沒(méi)有(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..76(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr-20 -15 -10Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile-5 1 5Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu10 15 20 25Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val30 35 40Ile Phe Lys Thr Gln Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu45 50 55Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn60 65 70Leu Lys Pro75(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度71氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)沒(méi)有(xi)序列描述SEQ ID NO3Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro1 5 10 15Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro20 25 30Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala35 40 45Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln50 55 60Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro65 70(2)SEQ ID NO4的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度71氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)沒(méi)有(xi)序列描述SEQ ID NO4Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro1 5 10 15Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro20 25 30Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Gln Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala35 40 45Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln50 55 60Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro65 70
權(quán)利要求
1.一種氨基端截短的MCP-2，它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的MCP-2的氨基酸殘基1、1-2、1-3、1-4或1-5的氨基端氨基酸，并具有趨化因子拮抗活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基端截短的MCP-2，它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的MCP-2的氨基酸殘基1-5的氨基端氨基酸，并具有趨化因子拮抗活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基端截短的MCP-2，它具有SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的氨基端截短的MCP-2，它是糖基化的形式。
5.一種DNA分子，它包含編碼前述任一權(quán)利要求所述的本發(fā)明氨基端截短MCP-2的DNA序列，該DNA序列包括基本上相同的核苷酸序列。
6.一種表達(dá)載體，它包含權(quán)利要求5所述的DNA分子。
7.一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體。
8.一種制備權(quán)利要求1至4任一所述的蛋白質(zhì)的重組方法，該方法包括將權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的蛋白作為藥物的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1至4任一所述的蛋白在生產(chǎn)用于治療和/或診斷疾病的藥物中的應(yīng)用，其中該疾病的治療和/或診斷需要有拮抗趨化因子作用的活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，該應(yīng)用用于生產(chǎn)用來(lái)治療炎性疾病、HIV感染、血管生成和血細(xì)胞生成相關(guān)疾病以及腫瘤的藥物。
12.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1至4任一所述的蛋白質(zhì)以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及以氨基端截短的MCP－2,它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的MCP－2的氨基酸殘基1、1—2、1—3、1—4或1—5的NH
文檔編號(hào)A61P37/04GK1271385SQ98809569
公開(kāi)日2000年10月25日 申請(qǐng)日期1998年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者P·皮奧斯特, S·斯特勒伊夫, J·范達(dá)默 申請(qǐng)人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司