專利名稱：作為趨化因子拮抗劑的氨基端截短的rantes的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以氨基端截短的RANTES，它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的RANTES的氨基酸殘基1、1-2、1-3或1-4的NH2端氨基酸并具有趨化因子拮抗活性，本發(fā)明還涉及編碼這些RANTES的cDNA序列，以及它們?cè)谛枰修卓冠吇蜃幼饔没钚缘募膊〉闹委熀?或診斷中的應(yīng)用，以及包含它們的藥物組合物。
背景技術(shù)：
趨化因子構(gòu)成了具有白細(xì)胞趨化和活化性能的促炎性細(xì)胞因子小家族。根據(jù)第一個(gè)半胱氨酸的位置，趨化因子家族可以分為C-C、C-X-C和C-X3-C趨化因子(Baggiolini M.等人，1994；Baggiolini M.等人，1997和Taub D.等人，1996)。
許多C-X-C趨化因子，如白細(xì)胞介素-8(IL-8)，對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞有趨化作用，而C-C趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)，則對(duì)包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞在內(nèi)的各種白細(xì)胞有活性。
趨化因子的氨基端區(qū)域參與受體結(jié)合，氨基端的加工可以激活趨化因子，減少趨化因子活性或使趨化因子完全沒(méi)有活性。
C-X-C趨化因子血小板堿性蛋白只有在除去氨基端的24個(gè)殘基后才變成一種嗜中性粒細(xì)胞趨化肽(NAP-2)(Walz A.等人，1989和Van Damme J.等人，1990)。
IL-8缺失8個(gè)氨基端殘基導(dǎo)致趨化活性增強(qiáng)，但是位于所有嗜中性粒細(xì)胞趨化性C-X-C趨化因子中第一個(gè)Cys前的Glu-Leu-Arg基序進(jìn)一步斷裂卻導(dǎo)致其完全失去活性(Clark-Lewis I.等人，1991)。
另一個(gè)C-X-C趨化因子粒細(xì)胞趨化蛋白-2(GCP-2)所發(fā)生的相似的氨基端蛋白水解(解離下8個(gè)氨基酸)卻對(duì)嗜中性粒細(xì)胞趨化活性沒(méi)有影響(Proost P.等人，1993a)。
RANTES(是“Regulated upon Activation，Normally T Expressed，and presumbalySecreted(活化后可調(diào)節(jié)的、正常T細(xì)胞表達(dá)并可能分泌的因子)”的首字母縮略語(yǔ))是一種C-C趨化因子，其cDNA克隆已經(jīng)從T細(xì)胞特異性序列富集的cDNA文庫(kù)中分離出來(lái)(Schall T.J.等人，1988)。
缺少8到9個(gè)氨基端氨基酸的合成的C-C趨化因子MCP-1、MCP-3和RANTES對(duì)單核細(xì)胞沒(méi)有活性，并被用作受體拮抗劑(Gong J.等人，1996；和Gong J.等人，1995)。
RANTES延伸一個(gè)甲硫氨酸將導(dǎo)致該分子完全失活，Met-RANTES表現(xiàn)為真正的RANTES拮抗劑(Proudfoot A.E.等人，1996)。
發(fā)明描述本發(fā)明的主要目的是氨基端截短的RANTES，它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的RANTES的氨基酸殘基1、1-2、1-3或1-4的氨基端氨基酸，并具有趨化因子拮抗劑活性。
本發(fā)明的一個(gè)具體的目的是RANTES(3-68)，它是缺少前兩個(gè)氨基酸的RANTES，如

圖1和SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明的氨基端截短的RANTES可以是糖基化形式或非糖基化形式。
術(shù)語(yǔ)“趨化因子拮抗劑”指“成熟的、天然存在的全長(zhǎng)趨化因子的拮抗劑”。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含編碼本發(fā)明氨基端截短的RANTES的DNA序列的DNA分子，它包括基本上相同的核苷酸序列。完整RANTES的cDNA序列公開(kāi)在Schall T.J.等人(1988)中，截短的RANTES的cDNA很容易推導(dǎo)出來(lái)。
“基本上相同的核苷酸序列”包括憑借遺傳密碼的簡(jiǎn)并性也能編碼出給定氨基酸序列的所有其它核酸序列。
本發(fā)明還包括含有上述DNA的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化了該載體的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)將所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)在合適培養(yǎng)基中來(lái)制備本發(fā)明這些氨基端截短的RANTES的方法。
編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列可以插入合適的質(zhì)粒并與其連接。一旦形成表達(dá)載體，就將其導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)該載體，產(chǎn)生所需蛋白。
本文提到的任何本發(fā)明重組蛋白的表達(dá)均可用合適的表達(dá)載體在真核細(xì)胞(如酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或原核細(xì)胞中進(jìn)行。本領(lǐng)域中已知的任何方法均可采用。
例如，用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(參見(jiàn)Sambrook等人，1989)將上述任一方法獲得的編碼蛋白的DNA分子插入適當(dāng)構(gòu)建的表達(dá)載體中。利用同聚物加尾、采用合成的DNA接頭的限制性連接或平頭連接技術(shù)，將雙鏈cDNA連接到質(zhì)粒載體中。用DNA連接酶連接DNA分子，通過(guò)堿性磷酸酶處理避免不希望發(fā)生的連接。
為了能表達(dá)所需的蛋白，表達(dá)載體還應(yīng)包含特異的含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信息的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼所需蛋白的DNA連接，從而允許該基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白。首先，為了使基因被轉(zhuǎn)錄，它的前面必須有能被RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與聚合酶結(jié)合，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。可以采用具有不同工作效率的各種啟動(dòng)子(強(qiáng)的和弱的啟動(dòng)子)。
對(duì)于真核宿主，可以采用不同的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，這取決于宿主的性質(zhì)。它們可以來(lái)自病毒，如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等，其中調(diào)控信號(hào)與具有高表達(dá)水平的特定基因相關(guān)聯(lián)。例子是皰疹病毒的TK啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、酵母gal4基因啟動(dòng)子等?？梢赃x擇轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控信號(hào)，使其具有阻遏和激活作用，從而能夠調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。
將包含編碼本發(fā)明蛋白的核苷酸序列的DNA分子插入載體中與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào)操作性相連，該載體能將所需基因序列整合入宿主細(xì)胞中。
還可以通過(guò)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)允許選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的標(biāo)記物，來(lái)選擇被導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。標(biāo)記物還可為營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主提供光營(yíng)養(yǎng)、殺微生物的抗性，例如抗生素，或重金屬如銅等?？蛇x擇的標(biāo)記基因可以和待表達(dá)的DNA基因序列直接連接，或通過(guò)共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入同一細(xì)胞中。為了使本發(fā)明蛋白的合成最優(yōu)，可能還需要額外的元件。
選擇特定質(zhì)粒或病毒載體的重要因素包括從不含載體的受體細(xì)胞中識(shí)別和選出含有載體的受體細(xì)胞的容易程度；特定宿主中所希望的載體拷貝數(shù)；以及是否希望載體能在不同種宿主細(xì)胞之間“穿梭”。
一旦制得了用于表達(dá)的載體或含DNA序列的構(gòu)建物，就可用以下多種合適的方法將該DNA構(gòu)建物導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、偶聯(lián)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。較佳的是真核宿主，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人、猴、小鼠和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，因?yàn)樗鼈優(yōu)榈鞍踪|(zhì)分子提供了翻譯后的修飾，包括正確折疊或在正確位點(diǎn)的糖基化。酵母細(xì)胞也可進(jìn)行包括糖基化的翻譯后肽修飾。有許多重組DNA策略采用了強(qiáng)啟動(dòng)子序列和高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，它們可用來(lái)在酵母中產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。酵母識(shí)別克隆的哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物上的前導(dǎo)序列，并分泌攜帶前導(dǎo)序列的肽(即前肽(pre-peptide))。
在導(dǎo)入載體后，使宿主細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基使含有載體的細(xì)胞選擇性地生長(zhǎng)?？寺〉幕蛐蛄械谋磉_(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的氨基端截短的RANTES可用本領(lǐng)域中其它熟知的方法來(lái)制備，尤其是已建立的化學(xué)合成方法用自動(dòng)化固相肽合成儀，然后進(jìn)行層析純化。
例如，本發(fā)明的趨化因子可用Fmoc(9-芴甲氧基羰基)、tBoc(叔丁氧羰基)或其它任何類似的化學(xué)合成在不同氨基酸上有或沒(méi)有合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的條件下合成。有或沒(méi)有合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的氨基酸被預(yù)先激活(例如用HBTU/HOBt[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲六氟磷酸/1-羥基苯并三唑)，并偶聯(lián)到生長(zhǎng)的肽鏈上。在加入下一個(gè)殘基之前，從α氨基上除去保護(hù)基團(tuán)(例如Fmoc)。合成后除去所有保護(hù)基團(tuán)，純化完整的全長(zhǎng)肽并用化學(xué)方法或酶法將肽折疊(包括在半胱氨酸之間形成二硫鍵)成本發(fā)明相應(yīng)的趨化因子。
天然的、合成的或重組的蛋白可用已知用于純化的任一種方法(即任何常規(guī)方法，包括抽提、沉淀、層析、電泳等(例如參見(jiàn)Proost P.等人，1996))來(lái)進(jìn)行純化。用于純化本發(fā)明蛋白的另一優(yōu)選的純化方法是親和層析，該方法利用的是結(jié)合靶蛋白并產(chǎn)生和固定在柱中所含凝膠基質(zhì)上的單克隆抗體或肝素的親和力。使含有蛋白質(zhì)的不純制備物通過(guò)該柱。蛋白質(zhì)將會(huì)通過(guò)特異性抗體結(jié)合在柱上，而雜質(zhì)則將通過(guò)柱。洗柱后，通過(guò)改變pH或離子強(qiáng)度將蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來(lái)。
本發(fā)明的氨基端截短的RANTES可用于治療和/或診斷需要有拮抗趨化因子作用的活性的疾病。這些疾病的例子包括炎性疾病、血管生成和血細(xì)胞生成相關(guān)疾病、腫瘤、傳染病(包括HIV)、自身免疫疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、肺疾病和皮膚病。較佳的用途是用于HIV-感染場(chǎng)合。
因此，本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明的蛋白在生產(chǎn)用于治療上述疾病的藥物中的應(yīng)用。
藥物宜為包含本發(fā)明蛋白以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑的藥物組合物形式。這些藥物組合物形成了本發(fā)明的另一個(gè)方面。
本發(fā)明還有一個(gè)方面是一種治療上述疾病的方法，該方法包括給予處于發(fā)生這些疾病危險(xiǎn)的對(duì)象或已經(jīng)表現(xiàn)出這些病理學(xué)現(xiàn)象的對(duì)象藥學(xué)上活性量的本發(fā)明氨基端截短的RANTES。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CD26/DPP IV能在體外產(chǎn)生氨基端截短的RANTES。RANTES是據(jù)報(bào)道生物活性能被CD26/DPP IV修飾的第一個(gè)細(xì)胞因子。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是用CD26/DPP IV來(lái)治療和/或診斷需要有拮抗細(xì)胞因子作用活性的疾病，特別是炎性、免疫和傳染性疾病。
由于這代表的是內(nèi)源性調(diào)節(jié)的趨化因子變成拮抗劑的已確定機(jī)制的第一個(gè)例子，但相似的生理性加工還可由其它因子(蛋白酶)介導(dǎo)。本發(fā)明也包括用這些因子(蛋白酶)來(lái)治療和/或診斷上述疾病。
現(xiàn)在將通過(guò)下列實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)被理解成以任何方式限定了本發(fā)明。實(shí)施例將參考下文所述的附圖。
附圖簡(jiǎn)述圖1它顯示了RANTES的氨基酸序列。信號(hào)序列用斜體字表示，而C端殘基用粗體表示。箭頭表示本發(fā)明的氨基端截短的RANTES(也稱為RANTES(3-68))的第一個(gè)氨基酸。
圖2在Boyden微室試驗(yàn)中比較完整的和氨基端截短的天然或重組RANTES對(duì)單核細(xì)胞性THP-1細(xì)胞的趨化效力天然RANTES(1-68)(△)，天然的截短的RANTES(3-68)(□)，完整的重組RANTES(1-68)(▲)和CD26/DPP IV斷裂的重組RANTES(3-68)(■)。結(jié)果表示成四個(gè)或四個(gè)以上單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均趨化指數(shù)±SEM。
圖3天然RANTES(3-68)(□)，天然RANTES(1-68)(△)，重組RANTES(1-68)(▲)和CD26/DPP IV處理的重組RANTES(3-68)(■)對(duì)于THP-1細(xì)胞中[Ca2+]i的影響。結(jié)果表示成3次或3次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的[Ca2+]i增加平均值±SEM。
圖4它顯示了RANTES(3-68)對(duì)完整的recRANTES(1-68)的Ca2+遷移活性的脫敏作用。首先，用緩沖液或不同濃度的重組RANTES(1-68)或RANTES(3-68)刺激THP-1細(xì)胞。結(jié)果表示成對(duì)作為第二刺激的30ng/ml完整的重組RANTES反應(yīng)中[Ca2+]i增加的平均值(三次或三次以上獨(dú)立的實(shí)驗(yàn))±SEM。
圖5截短的RANTES(3-68)和完整的RANTES(1-68)的趨化效力的比較。在微室試驗(yàn)中，測(cè)定了天然(nat)和重組(rec)截短的RANTES、完整的RANTES和合成的MCP-3的嗜酸性粒細(xì)胞趨化活性。結(jié)果表示成兩次或兩次以上的獨(dú)立試驗(yàn)(每一次進(jìn)行一式三份)的平均趨化指數(shù)(CI)±SEM。
圖6在CCR轉(zhuǎn)染體中用完整的RANTES使鈣遷移脫敏。鈣遷移實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染了CD4和CC趨化因子受體CCR1或CCR5的HOS細(xì)胞中進(jìn)行。首先用不同濃度的完整或截短的RANTES刺激細(xì)胞，然后用100ng/ml完整的RANTES刺激。圖中顯示了第二刺激誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加的抑制百分?jǐn)?shù)。通過(guò)在加入RANTES(1-68)或RANTES(3-68)后將100ng/ml完整RANTES的反應(yīng)與用緩沖液(100％)刺激后的反應(yīng)相比較，計(jì)算出該百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表示成兩次或兩次以上實(shí)驗(yàn)的平均抑制百分?jǐn)?shù)±SEM。
圖7RANTES(3-68)對(duì)HIV-1感染單核細(xì)胞有強(qiáng)效抑制效果。在不同濃度的RANTES(1-68)或RANTES(3-68)(在感染時(shí)加入0-1000ng/m1)存在下，用親M的HIV-1Ba-L病毒株感染PHA激活的PBMC。10天后，用p-24 Ag ELISA監(jiān)測(cè)細(xì)胞上清液中的病毒產(chǎn)量(圖中示出了四個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)典型實(shí)驗(yàn))。
圖8RANTES(1-68)和RANTES(3-68)對(duì)PHA-激活的PBMC中HIV-1 SF162病毒株感染的效果。感染后10天用p24 Ag ELISA監(jiān)測(cè)細(xì)胞上清液的病毒產(chǎn)量。圖中示出了三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。*表示在p24 Ag ELISA的檢測(cè)極限下(＜5pg/ml)。
圖9CD26在HOS.CD4.CCR5細(xì)胞、U87.CD4.CCR5細(xì)胞和新分離的PBMC上的表達(dá)。CD26陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(％)顯示在各柱狀圖中。
圖10RANTES(1-68)、RANTES(1-68)加上sCD26(50U/L)、以及RANTES(3-68)對(duì)HOS.CD4.CCR5細(xì)胞被HIV-1 BaL毒株感染的效果。感染后8天用p24Ag ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中的病毒產(chǎn)量。圖中示出了三個(gè)實(shí)驗(yàn)中一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
實(shí)施例實(shí)施例1氨基端截短的RANTES材料和方法試劑天然的人RANTES由人Malavu肝肉瘤細(xì)胞、MG-63骨肉瘤細(xì)胞或外周血白細(xì)胞(Antwerp和Leuven的輸血中心)產(chǎn)生，并如前所述的那樣(Proost P.等人，1996和Proost P.等人，1993)純化。用Fmoc化學(xué)方法(Proost P.等人，1995和Wuyts A.等人，1997)合成MCP-2、MCP-3和GCP-2，重組人RANTES購(gòu)自Peprotech(Rocky Hill，NJ)，重組MCP-1由J.J.Oppenheim博士(NCI-NIH，F(xiàn)rederick，MD)贈(zèng)與。
用CD4和CC趨化因子受體CCR1、CCR3或CCR5(Deng H.，等人，1996)之一轉(zhuǎn)染人骨肉瘤(HOS)細(xì)胞在含谷氨酸鹽(glutamax)的DMEM中生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素(1微克/毫升)作為選擇劑。所有生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Gibco BRL/Life Technologies，Paisley，UK)增添10％FCS。
人CD26/DPP IV從前列腺小體(prostasomes)(前列腺衍生的細(xì)胞器，在精清中游離存在)獲得。如前所述(De Meester I.等人，1996)，用離子交換然后腺苷脫氨酶親和層析，將此酶純化至均一。
用CD26/DPP IV培育趨化因子并檢測(cè)蛋白水解加工使100至1000摩爾過(guò)量的趨化因子在100mM Tris/HCl pH7.7中和CD26/DPP IV培育過(guò)夜。如前所述(Proost P.等人，1996)，用SDS-PAGE在Tris/Tricine凝膠系統(tǒng)上從CD26/DPP IV中分離出趨化因子。
將蛋白質(zhì)電泳印跡到PVDF(聚偏氟乙烯)膜(Problott，Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA)上，并用考馬斯亮藍(lán)R250染色。脫色后，用超純水洗膜至少5次(Milli Q；Millipore，Bedford，MA)。
為了獲得足量的純的截短的趨化因子用于生物試驗(yàn)，用CD26/DPP IV處理約50微克重組趨化因子，用0.1％三氟乙酸(TFA)酸化斷裂產(chǎn)物。加入吐溫20(0.01％)以防趨化因子粘在管上。
在C-8 Aquapore RP-300柱(1×50cm)(Perkin Elmer)上以乙腈梯度從CD26/DPP IV中分離趨化因子。用上述的SDS-PAGE和銀染法分析含該蛋白質(zhì)的各級(jí)分。
在脈沖液相477A/120A蛋白質(zhì)測(cè)序儀(Perkin Elmer)上用N-甲基哌啶作為偶聯(lián)堿，用Edman降解法對(duì)CD26/DPP IV處理的、RP-HPLC純化或從PVDF印跡上切下的趨化因子的氨基端進(jìn)行測(cè)序。
趨化活性的檢測(cè)在Boyden微室中(Proost P.等人，1996和Proost P.等人，1993)測(cè)試趨化因子在新鮮分離的外周血嗜中性粒細(xì)胞(106細(xì)胞/毫升)或培養(yǎng)的單核細(xì)胞性THP-1細(xì)胞(0.5×106細(xì)胞/毫升)上的趨化活性。
37℃培育45分鐘(粒細(xì)胞)或2小時(shí)(THP-1細(xì)胞)后，固定細(xì)胞并染色。然后用顯微鏡計(jì)數(shù)10個(gè)油浸視野中遷移通過(guò)孔徑5微米的聚碳酸酯膜的細(xì)胞。
將遷移到測(cè)試樣品中的細(xì)胞數(shù)除以遷移至對(duì)照培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算樣品(每個(gè)室中一式三份)的趨化指數(shù)(CI)。在脫敏實(shí)驗(yàn)中，在轉(zhuǎn)移至小室前，用無(wú)生物活性的趨化因子變體37℃培育細(xì)胞10分鐘。
計(jì)算用HBSS處理的對(duì)照細(xì)胞脫敏獲得的CI抑制百分?jǐn)?shù)，以評(píng)價(jià)趨化脫敏。
胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測(cè)如以前所述的那樣(Wuyts A.等人，1997)，測(cè)定了胞內(nèi)鈣濃度([Ca2+]i)。簡(jiǎn)言之，使純化的細(xì)胞和熒光指示劑fura-2(fura-2/AM 2.5μM；Molecular Probes Europe BV，Leiden，The Netherlands)和0.01％Pluronic F-127(Sigma，St Louis MO)一起培育。
30分鐘后，洗滌細(xì)胞兩次，并重懸于含1mM Ca2+的HBSS中，37℃培育細(xì)胞10分鐘，然后在LS50B發(fā)光分光光度計(jì)(Perkin Elmer)中測(cè)定fura-2熒光。在340和380nm處激發(fā)后，在510nm檢測(cè)熒光。用Grynkiewicz方程式(Grynkiewicz等人，1985)計(jì)算[Ca2+]i。
為了測(cè)定Rmax，用50μM毛地黃皂苷裂解細(xì)胞。隨后，用20mM Tris調(diào)節(jié)pH至8.5，在裂解的細(xì)胞中加入10mM EGTA，獲得Rmin。用于標(biāo)定的Kd為224nM。
對(duì)于脫敏實(shí)驗(yàn)，首先用緩沖液或不同濃度的趨化因子刺激細(xì)胞。作為第二刺激，加入的趨化因子濃度為緩沖液預(yù)先刺激后誘導(dǎo)[Ca2+]i顯著增加的濃度。計(jì)算預(yù)先刺激細(xì)胞后對(duì)第二刺激反應(yīng)的[Ca2+]i增加的抑制百分?jǐn)?shù)。
HIV-1感染的抑制從MRC AIDS試劑方案(Herts，UK)獲得HIV-1的M向性病毒株BaL和SF162。用密度梯度離心(5，23)從健康獻(xiàn)血員中分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)，并用1微克/毫升PHA(Sigma，Bomem，Belgium)37℃刺激3天。用PBS洗滌激活細(xì)胞(PHA刺激的母細(xì)胞)三次，如前所述(Schols D.等人，1997)用病毒感染。將HIV-1感染的或模擬感染的PHA-刺激的母細(xì)胞培育在25U/毫升IL-2和不同濃度的RANTES(1-68)或RANTES(3-68)中。在第10天收集細(xì)胞上清，用p-24 Ag ELISA試劑盒(DuPont/NENLife Sciene Products，Brussels，Belgium)分析上清液中的HIV-1核心抗原。
結(jié)果天然的氨基端截短的RANTES的鑒定和生物學(xué)特性分析以前已經(jīng)分離了不同形式的氨基端截短的人GCP-2(Proost P.等人，1993)。截去最少的GCP-2類型在倒數(shù)第二個(gè)位置的Pro前斷裂[GCP-2(3-75)]。用相似的標(biāo)準(zhǔn)純化程序，從外周血白細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞純化獲得C-C趨化因子RANTES(Proost P.等人，1996)。
具體地說(shuō)，將細(xì)胞因子混合物誘導(dǎo)的MG-63或Malavu肉瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基分級(jí)，以分離天然的趨化因子變體。隨后用抗體或肝素親和層析、陽(yáng)離子交換層析(mono S FPLC)和RP-HPLC純化趨化因子，用特異性趨化因子ELISA檢測(cè)免疫活性形式。在陽(yáng)離子交換柱上，發(fā)現(xiàn)IL-8的洗脫與RANTES的洗脫非常靠近(在0.7和0.75M NaCl之間)。然而，用RP-HPLC可將兩種趨化因子相互分離(RANTES和IL-8分別在27.5％和30％乙腈處洗脫)。純蛋白的氨基酸序列分析確認(rèn)IL-8以不同的氨基端截短形式出現(xiàn)，這在以前已經(jīng)根據(jù)它們的趨化活性作了分離(Van Damme J.等人，1989)。然而，對(duì)于RANTES卻只分離出一種形式，它與完整的RANTES相比缺少兩個(gè)氨基端殘基。鑒于它的存在占多數(shù)，因此更詳細(xì)地分析該RANTES(3-68)以驗(yàn)證其對(duì)單核細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞的趨化活性。具體地說(shuō)，測(cè)試RANTES(3-68)的趨化活性和/或胞內(nèi)Ca2+釋放活性，并將其生物效力和各完整的趨化因子相比較。
RANTES的氨基端缺失兩個(gè)殘基導(dǎo)致單核細(xì)胞趨化活性以及Ca2+釋放活性大大降低。與完整的天然RANTES(最低效應(yīng)劑量為3-10ng/ml)相比，天然RANTES(3-68)在高達(dá)300ng/ml的濃度下在Boyden微室中測(cè)試時(shí)總地來(lái)說(shuō)沒(méi)有活性(圖2)。另外，與RANTES(1-68)相比，需要濃度高10倍的天然RANTES(3-68)才能獲得相似的Ca2+-反應(yīng)(圖3)。
CD26/DPP IV除去了趨化因子的氨基端二肽為了研究氨基肽酶CD26/DPP IV是否導(dǎo)致RANTES的氨基端截短，使完整的趨化因子和CD26/DPP IV培育過(guò)夜，印跡到PVDF膜上，用考馬斯藍(lán)染色，并進(jìn)行自動(dòng)的Edman降解。用CD26/DPP IV處理RANTES將導(dǎo)致除去氨基端的兩個(gè)肽。用不含CD26/DPP IV的緩沖液并行培育趨化因子沒(méi)有作用。
由于其它趨化因子含有CD26/DPP IV斷裂的共有序列，且MCP的氨基端表現(xiàn)出對(duì)于生物活性是關(guān)鍵的(Gong J.等人，1996和Gong J.等人，1995)，因此還使MCP-1、MCP-2和MCP-3與CD26/DPP IV一起培育。
處理后，將MCP印跡到PVDF膜上，用考馬斯藍(lán)染色來(lái)確認(rèn)回收了足量蛋白質(zhì)用于Edman降解。
然而，沒(méi)有檢測(cè)到氨基端序列，這表明CD26/DPP IV不改變MCP的氨基端，該氨基端對(duì)于焦谷氨酸的Edman降解被阻斷。
比較完整的和CD26/DPP IV處理的RANTES的生物學(xué)活性與天然RANTES(3-68)相似，C-8 RP-HPLC純化的、CD26/DPP IV處理的重組RANTES在Boyden微室趨化實(shí)驗(yàn)中、當(dāng)所用濃度高達(dá)1微克/毫升時(shí)沒(méi)有活性，而完整的重組RANTES從30到100ng/ml以上卻檢測(cè)到有顯著的單核細(xì)胞趨化反應(yīng)(圖2)。
當(dāng)在Ca2+遷移試驗(yàn)中測(cè)試截短效應(yīng)時(shí)，RANTES(3-68)在100ng/ml下誘導(dǎo)了低而顯著的增加。然而，完整的RANTES在10ng/ml下就已經(jīng)有活性(圖3)。結(jié)論是，盡管只除去了兩個(gè)氨基端殘基，RANTES的單核細(xì)胞趨化性和Ca2+遷移效力減少了10-100倍。
RANTES(3-68)是完整RANTES的天然的趨化拮抗劑。
鑒于RANTES(3-68)在單核細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有活性，所以我們測(cè)試該截短的RANTES是否可能起拮抗劑的作用。1微克/毫升的RANTES(3-68)就幾乎完全(82％)使100ng/ml完整RANTES的趨化效應(yīng)脫敏(表I)。
當(dāng)在上排孔中加入3倍過(guò)量的RANTES(3-68)后，THP-1細(xì)胞向完整RANTES的趨化受到約50-70％的抑制。300ng/ml的RANTES(3-68)仍能使向相同濃度的完整RANTES的趨化反應(yīng)受到約30％的抑制。
在THP-1細(xì)胞的Ca2+遷移實(shí)驗(yàn)中(圖4)，30ng/ml的完整RANTES能使30ng/ml的完整RANTES的效應(yīng)脫敏39±5％。RANTES(3-68)要獲得相同程度的脫敏則需要大約高10倍的濃度。然而，在300ng/ml下，RANTES(3-68)本身引起了明顯的Ca2+反應(yīng)。該Ca2+反應(yīng)與用30ng/ml完整RANTES獲得的反應(yīng)相當(dāng)。
表IRANTES(3-68)使RANTES(1-68)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化脫敏1
1結(jié)果表示為四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(A-D)的趨化指數(shù)(C.I.)(包括平均值±SEM)，以及用無(wú)活性RANTES(3-68)或緩沖液預(yù)先培育THP-1細(xì)胞后向RANTES(1-68)的趨化反應(yīng)的抑制百分?jǐn)?shù)(％)(四次實(shí)驗(yàn)的抑制％的平均值±SEM)。
RANTES(3-68)對(duì)人單核細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞的削弱的趨化活性在表II中比較了天然RANTES(3-68)與單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-3以及完整RANTES(1-68)的趨化效力?？梢钥闯觯琈CP-3和RANTES(1-68)分別在3ng/ml和30ng/ml下對(duì)新鮮分離的外周血單核細(xì)胞仍有趨化性，而天然的RANTES(3-68)在100ng/ml下仍沒(méi)有活性。
用重組RANTES(3-68)確認(rèn)了該天然變體的降低的趨化效力。盡管對(duì)單核細(xì)胞的趨化性較弱(在1微克/毫升下)，但是純化的重組RANTES(3-68)還是顯示出比活比完整的重組RANTES低10倍。
最后，在對(duì)100ng/ml完整RANTES以及30ng/mlMCP-3仍有反應(yīng)的人嗜酸性粒細(xì)胞上驗(yàn)證了RANTES(3-68)的趨化效力(圖5)。與單核細(xì)胞相似，嗜酸性粒細(xì)胞只在1微克/毫升下受刺激遷移。
表II比較RANTES(3-68)與RANTES(1-68)和MCP-3的單核細(xì)胞趨化活性單核細(xì)胞趨化活性a)濃度(ng/ml) MCP-3 natRANTES(3- recRANTES(1- recRANTES(3-68) 68) 68)1000 _b)-3.6±0.8(6) 3.3(1)300 6.0±1.2(6)-- -100 - 1.1±0.1(3) 3.3±0.4(6) 1.0(1)30 6.9±1.0(6)1.7±0.2(3) - -10 - 1.9±0.6(3) 1.9±0.4(6) ＜1.0(1)34.1±0.4(6)-- -a)指在新鮮分離的外周血單核細(xì)胞上的平均趨化指數(shù)(CI)±SEM(n)b)未測(cè)定RANTES(3-68)通過(guò)CCR5而不是通過(guò)CCR1和CCR3傳遞信號(hào)并使RANTES(1-68)脫敏為了解釋RANTES(3-68)的減少的趨化活性，驗(yàn)證了該趨化因子變體通過(guò)RANTES所用的已知受體來(lái)結(jié)合和傳遞信號(hào)的能力。
在測(cè)定胞內(nèi)鈣濃度增加的信號(hào)傳導(dǎo)試驗(yàn)中，采用了用趨化因子受體CCR1、CCR3或CCR5轉(zhuǎn)染的HOS細(xì)胞。在高達(dá)300ng/ml的濃度下，RANTES(3-68)沒(méi)有增加CCR1(表III)或CCR3(數(shù)據(jù)未顯示)轉(zhuǎn)染的HOS細(xì)胞中的[Ca2+]i，而30ng/ml和100ng/ml的完整的RANTES卻足以分別誘導(dǎo)CCR1和CCR3轉(zhuǎn)染體中的[Ca2+]i增加。
然而，完整的和截短的RANTES均能在30ng/ml下誘導(dǎo)CCR5轉(zhuǎn)染體中的[Ca2+]i明顯增加。而且，通過(guò)用3至10倍過(guò)量的RANTES(3-68)或完整的RANTES預(yù)先培育CCR5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，隨后用完整的RANTES(100ng/ml)攻擊獲得了對(duì)[Ca2+]i升高的相同抑制(約75％)(圖6)。
相反，300ng/ml的RANTES(3-68)僅僅使CCR1和CCR3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)100ng/ml完整RANTES的鈣反應(yīng)勉強(qiáng)脫敏，而3倍以上的完整RANTES作為第一刺激幾乎完全抑制了這些細(xì)胞因隨后RANTES(1-68)的刺激而產(chǎn)生的[Ca2+]i增加。因此，必定能得出這樣的結(jié)論，即，從RANTES中除去兩個(gè)氨基端殘基對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有顯著影響，因?yàn)橼吇蜃邮荏wCCR1和CCR3不再被功能性地識(shí)別。因此，RANTES(3-68)的趨化效力削弱可以解釋為它不能通過(guò)CCR1和CCR3起作用。相反，RANTES(3-68)完全保留了完整RANTES的CCR5信號(hào)傳導(dǎo)特性。RANTES(3-68)可以通過(guò)與完整RANTES的競(jìng)爭(zhēng)而具有抗炎性，但是仍然能通過(guò)保留其結(jié)合CCR5的能力而起HIV-抑制劑的作用。
表IIIRANTES的各種形式在CCR1和CCR5轉(zhuǎn)染體中的鈣遷移趨化因子 濃度(ng/ml) [Ca2+]i的增加(nM)a)CCR1 CCR5RANTES(1-68) 300 133±5(3)96±1(2)100 100±28(3) 60±4(2)30 25±(3) 24±2(2)10 ＜15(2) ＜15(1)RANTES(3-68) 300 19±9(3) 119±5(2)100 ＜15±0(3) 76±4(2)30 ＜15(2) 56±13(2)10 ＜15(1)a)顯示了[Ca2+]i增加的平均值為兩次或多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的nM±SEM。
RANTES(3-68)抑制人單核細(xì)胞中CC趨化因子誘導(dǎo)的趨化作用為了驗(yàn)證單核細(xì)胞中是否也發(fā)生RANTES(3-68)對(duì)CC趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)的抑制，在THP-1細(xì)胞中進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)。證據(jù)表明，與完整RANTES相比，RANTES(3-68)顯示增加單核細(xì)胞中[Ca2+]i的效力減少了10倍(數(shù)據(jù)未示出)。另外，通過(guò)將測(cè)試細(xì)胞與300ng/ml RANTES(3-68)一起培育，完整RANTES(30ng/ml)對(duì)單核細(xì)胞的趨化效應(yīng)受到抑制(71％)，如表IV所示。
另外，RANTES(3-68)減少了對(duì)其它CC趨化因子的趨化反應(yīng)，這些CC趨化因子包括單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)(67％)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1a(MIP-1α)(61％)和MIP-1β(80％)。
這表明RANTES(3-68)的功能是其它CC趨化因子誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移的廣譜抑制劑。
表IVRANTES(3-68)抑制單核細(xì)胞向CC趨化因子的趨化THP-1細(xì)胞趨化的抑制趨化因子a)濃度(ng/ml) 緩沖液b，c)RANTES(3-68)b，c)％抑制d)RANTES 3019.0±6.6 3.7±0.6 71±16MCP-33048.5±9.3 24.9±2.0 45±10MCP-33 7.6±2.53.1±0.8 67±13MIP-1α 306.2±2.43.0±1.1 61±22MIP-1β 300 4.3±1.01.9±0.6 80±12對(duì)照 1.5±0.51.0±0.5a)在微室的下排孔中加入RANTES、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β和緩沖液作為趨化吸引物。
b)在微室的上排孔中加入用300ng/ml RANTES(3-68)或緩沖液預(yù)先培育(37℃10分鐘)的THP-1細(xì)胞。
c)四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的CI平均值±SEM。
d)在300ng/ml RANTES(3-68)存在下，對(duì)完整趨化因子誘導(dǎo)的遷移的抑制。
RANTES的CD26特異性截短是其抗病毒活性所必需的。
首先評(píng)價(jià)不同形式的RANTES在健康獻(xiàn)血員衍生的人PBMC中抵御兩種不同M向性HIV-1病毒株(BaL和SF162)的作用。完整RANTES(1-68)針對(duì)BaL病毒株的IC50為3.4nM，RANTES(3-68)的IC50為0.39nM。RANTES(1-68)的IC90為71nM，它約為RANTES(3-68)IC90的10倍。當(dāng)在PBMC中評(píng)價(jià)抵抗SF162病毒株時(shí)，RANTES(1-68)(IC50為23nM；IC90為95nM)的活性比RANTES(3-68)(IC50為2nM；IC90為8.5nM)低10倍(表V)。圖8中顯示了兩種趨化因子在133至0.2nM的濃度范圍內(nèi)HIV-1 SF162在抵抗PBMC中復(fù)制的濃度依賴型效應(yīng)。濃度為5.2nM的RANTES(3-68)在減少病毒復(fù)制方面是明顯有效的，而RANTES(1-68)在此濃度下沒(méi)有活性。注意到，在Pepro Tech或R&D Systems獲得的完整RANTES之間抗病毒活性沒(méi)有差別。
當(dāng)在CCR5轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞中測(cè)試時(shí)，兩種形式的RANTES之間抗病毒活性的顯著差別更為明顯。在U78.CD4.CCR5細(xì)胞中，RANTES(1-68)和RANTES(3-68)抵抗BaL病毒株的IC50分別為21nM和0.65nM。RANTES(1-68)的IC90高于133nM，而RANTES(3-68)的IC90為63nM。另如表V所示，RANTES(1-68)在HOS.CD4.CCR5細(xì)胞中基本上沒(méi)有活性(IC50大于133nM)，而RANTES(3-68)是HIV-1 BaL在這些細(xì)胞中復(fù)制的強(qiáng)效抑制劑(IC50為5.5nM)。然而，兩種形式的RANTES在這些細(xì)胞中均沒(méi)有到達(dá)IC90值。
RANTES的抗病毒活性取決于膜結(jié)合的或可溶的CD26(sCD26)的存在。
評(píng)價(jià)了兩種不同的CCR5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系和新鮮分離的PBMC上的CD26表達(dá)。經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析測(cè)定，HOS轉(zhuǎn)染體對(duì)于CD26表達(dá)呈陰性，而U87轉(zhuǎn)染體染色弱，但對(duì)抗CD26單抗呈明顯陽(yáng)性染色(圖9)。另外，發(fā)現(xiàn)新鮮分離的PMBC亞群的CD26表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖9)。
圖10顯示了RANTES(1-68)和RANTES(3-68)對(duì)于BaL病毒株在HOS.CD4.CCR5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中在sCD26存在下產(chǎn)生病毒p24 Ag的濃度依賴型效應(yīng)。在HIV感染開(kāi)始時(shí)sCD26的加入和RANTES(1-68)一起，明顯增強(qiáng)了完整RANTES在HOS.CD4.CCR5細(xì)胞中的抗病毒活性。當(dāng)加入50U/I的sCD26和RANTES一起時(shí)，獲得的RANTES的IC50為13nM。單獨(dú)加入sCD26對(duì)病毒復(fù)制沒(méi)有影響。將sCD26加入RANTES(3-68)也不改變RANTES(3-68)的抗病毒活性(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，CD26的存在是完整RANTES具有抗病毒活性所必需的。
天然MIP-1α的氨基端截短不影響其抗HIV-1趨化性和Ca2+遷移活性。
由于大多數(shù)天然的MIP-1α是氨基端截短的(截去4個(gè)氨基酸)，因此我們研究該截短的MIP-1α(5-70)是否具有改變的HIV-1抑制能力。與RANTES獲得的結(jié)果相反，在PMBC或CCR5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到完整MIP-1α和MIP-1α(5-70)的IC50值有明顯不同(表V，圖8)。另外，在THP-1單核細(xì)胞上的趨化作用和胞內(nèi)Ca2+遷移試驗(yàn)中比較了完整的MIP-1α和截短的MIP-1α(5-70)。表VI證明，MIP-1α(5-70)誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的最低有效劑量?jī)H稍稍低于完整MIP-1α。而且，盡管在趨化試驗(yàn)中，用0.13nM完整MIP-1α獲得的最大遷移較高，但是兩種MIP-1α同種型的最低效應(yīng)濃度卻大致相似?？傊?，結(jié)論必然是，MIP-1α的氨基端加工與RANTES相反，只是最低程度地削弱了其抗炎和抗HIV-1活性。
表V.RANTES和MIP-1α在PHA-刺激的PMBC，U87.CD4.CCR5細(xì)胞中的抗HIV-1活性。
RANTES(1-68) RANTES(3-68) MIP-(1-70) MIP-1α(5-70)IC50IC90IC50IC90IC50IC90IC50IC90PBMCBaL3.4710396.9 1.9 621.6 13SF16223 952.08.2 3.1 303.6 32U87.CD4.CCR5BaL21 ＞130 0.65 63NDNDND NDHOS.CD4.CCR5BaL＞130 ＞130 5.5＞130 32 ＞130 21 ＞130用病毒性p24 Ag ELISA在感染后8-12天監(jiān)測(cè)無(wú)細(xì)胞上清液中的病毒產(chǎn)量。表中顯示了IC50和IC90的平均值(nM)。數(shù)據(jù)代表了兩至四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。數(shù)值標(biāo)為“＞130”表明在130nM下沒(méi)有達(dá)到50％或90％抑制。ND，未進(jìn)行。
表VI完整和截短的MIP-1α之間的生物學(xué)效力沒(méi)有差別趨化*[Ca2+]i的增加+趨化因子 nMC.I.nMnM[Ca2+]iMIP-1α(1-70)1.38.5±3.33.9 240/1950.13 22.2±4.4 0.39 120/1300.013 5.7±1.60.34 30/140.0013 4.0±3.1MIP-1α(5-70)1.314.2±0.4 4.0 196/1780.13 11.4±2.9 0.4 71/330.013 3.8±1.40.04 10/＜100.0013 2.1±0.6*單核細(xì)胞THP-1遷移通過(guò)微室中5.0μm的孔。結(jié)果是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
+檢測(cè)THP-1中[Ca2+]i的增加。表中顯示了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.
(B)街道14 JOHN B.GORSIRAWEG(C)城市CURACAO(E)國(guó)家THE NETHERLANDS ANTILLES(F)郵政編碼沒(méi)有(G)電話599-9-639300(H)電傳599-9-614129(ii)發(fā)明名稱作為趨化因子拮抗劑的氨基端截短的RANTES(iii)序列數(shù)目2(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度91氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)沒(méi)有(iv)反義沒(méi)有(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..68
(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Lys Val Ser Ala Ala Arg Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala-20 -15 -10Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro-5 1 5Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys10 15 20 25Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe30 35 40Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala A5n Pro Glu Lys Lys Trp45 50 55Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser60 65(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度66氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)沒(méi)有(iv)反義沒(méi)有(xi)序列描述SEQ ID NO2Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro1 5 10 15Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys20 25 30Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys35 40 45Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu50 55 60Met Ser6權(quán)利要求
1.一種氨基端截短的RANTES，它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的RANTES的氨基酸殘基1、1-2、1-3或1-4的氨基端氨基酸，并具有趨化因子拮抗活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基端截短的RANTES，它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的RANTES的氨基酸殘基1-2的氨基端氨基酸，并具有趨化因子拮抗活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基端截短的RANTES，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的氨基端截短的RANTES，它是糖基化的形式。
5.一種DNA分子，它包含編碼前述任一權(quán)利要求所述的本發(fā)明氨基端截短的RANTES的DNA序列，該DNA序列包括基本上相同的核苷酸序列。
6.一種表達(dá)載體，它包含權(quán)利要求5所述的DNA分子。
7.一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。
8.一種制備權(quán)利要求1至4任一所述的蛋白質(zhì)的重組方法，該方法包括將權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中。
9.權(quán)利要求1至4任一所述的蛋白作為藥物的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1至4任一所述的蛋白在生產(chǎn)用于治療和/或診斷疾病的藥物中的應(yīng)用，其中該疾病的治療和/或診斷需要有拮抗趨化因子作用的活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，該應(yīng)用用于生產(chǎn)治療炎性疾病、HIV感染、血管生成和血細(xì)胞生成相關(guān)疾病以及腫瘤的藥物。
12.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1至4任一所述的蛋白質(zhì)以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。
13.CD26/DPP IV在治療和/或診斷疾病中的應(yīng)用，其中該疾病的治療和/或診斷需要有拮抗趨化因子作用的活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，該應(yīng)用用于治療炎性疾病、免疫疾病和傳染病。
全文摘要
本發(fā)明涉及以氨基端截短的RANTES,它缺少對(duì)應(yīng)于天然存在的RANTES的氨基酸殘基1、1—2、1—3或1—4的NH
文檔編號(hào)A61K38/46GK1271386SQ98809572
公開(kāi)日2000年10月25日 申請(qǐng)日期1998年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者P·皮奧斯特, S·斯特勒伊夫, J·范達(dá)默 申請(qǐng)人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司