專利名稱：選擇性調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的短肽的制作方法
相關(guān)申請本申請是1997年5月21日提交的美國專利序列號No.08/861,338的部分繼續(xù)申請，其全部內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。
本發(fā)明的技術(shù)背景絲氨酸/蘇氨酸激酶是真核蛋白質(zhì)激酶大家族中的成員。這一類的酶特異磷酸化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基，對于調(diào)節(jié)多細(xì)胞有機體中的信號傳導(dǎo)是很重要的。許多絲氨酸/蘇氨酸激酶是以細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)存在的，參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，包括向核子的信號傳導(dǎo)和激活其他蛋白質(zhì)的信號傳導(dǎo)。在細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)了其他的絲氨酸/蘇氨酸激酶，如G蛋白質(zhì)-偶聯(lián)受體激酶，它們參與跨膜信號傳導(dǎo)。
這樣，絲氨酸/蘇氨酸激酶對絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化作用，對于隨環(huán)境變化而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)事件方面是一項重要的機理。許多細(xì)胞事件是由絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)的。一些實例包括細(xì)胞進(jìn)入和完成有絲分裂的能力，細(xì)胞繁殖，細(xì)胞分化，脂肪新陳代謝的控制，免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，及肝糖新陳代謝的控制。
這樣，可以調(diào)節(jié)(增加或降低)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的藥劑對于治療多種疾病和狀況如，癌癥，肥胖，自動免疫病變，炎癥和II型糖尿病，有很大的潛力。
本發(fā)明的概述目前已發(fā)現(xiàn)從絲氨酸/蘇氨酸激酶的HJ環(huán)衍生的短肽，可顯著地影響表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸激酶細(xì)胞的活性(“HJ環(huán)”本文下面定義)。如，Raf和Polo的HJ環(huán)的肽衍生物，濃度為10μm(實例2)時就可阻止體外牛動脈細(xì)胞的繁殖和轉(zhuǎn)換鼠細(xì)胞組MS1和/或SVR細(xì)胞。依據(jù)前面提及的發(fā)現(xiàn)，本文公開的新的肽是從絲氨酸/蘇氨酸激酶的HJ環(huán)衍生的肽。同時公開的還有確定從絲氨酸/蘇氨酸激酶HJ環(huán)衍生的調(diào)節(jié)所說的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的肽的方法。在受試者中調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的方法也公開了。
本發(fā)明的一個具體實施是一種新的肽，是一種從絲氨酸/蘇氨酸激酶HJ環(huán)衍生的肽。這種肽包括約五個到約二十個之間的氨基酸殘基或氨基酸殘基類似物，調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性。肽的N-端和/或C-端可以是取代或未取代的。肽可以是線性的或環(huán)狀的。
本發(fā)明的另一個具體實施是在對象中調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的方法。該方法包括服用治療上有效量的肽，這種肽是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶HJ環(huán)的衍生物，如上所述。
本發(fā)明的另一個具體實施是確定調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的肽的方法。該方法包括提供一種“測試肽”，其含有約五個到二十個氨基酸或氨基酸類似物，是一種從所說的絲氨酸/蘇氨酸激酶衍生的肽。在所說的絲氨酸/蘇氨酸激酶的控制下，在適合測定絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的條件下，將測試肽與有細(xì)胞活性或功能的細(xì)胞一起溫育。測定絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，并與在相同條件但沒有測試肽存在的情況下生長的相同細(xì)胞類型的細(xì)胞比較。與在沒有測試肽存在的情況下生長的細(xì)胞比較大些或小些的活性表明測試肽調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性。
本發(fā)明的肽可用在治療多種由絲氨酸/蘇氨酸激酶(STK)活性過度及活性不足引起的疾病。實例包括但不限于，癌癥，糖尿病，肥胖，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，炎癥病變，自動免疫及心血管疾病。本發(fā)明的肽也可在體外應(yīng)用，例如，產(chǎn)生與肽的衍生絲氨酸/蘇氨酸激酶特異結(jié)合的抗體。這些抗體可用來確定表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸激酶的細(xì)胞，研究絲氨酸/蘇氨酸激酶的細(xì)胞內(nèi)分布。此外，本發(fā)明的肽可用來確定和定量與衍生出肽的絲氨酸/蘇氨酸激酶HJ環(huán)結(jié)合的配體。
附圖簡要說明

圖1是在絲氨酸/蘇氨酸激酶家族中發(fā)現(xiàn)的HJ環(huán)的從氨基酸1到氨基酸10的共有序列。
圖2是環(huán)狀A(yù)MP依賴蛋白質(zhì)激酶和蛋白質(zhì)激酶C的HJ環(huán)的從氨基酸1到氨基酸20的共有序列。
圖3的表給出了絲氨酸/蘇氨酸激酶RAF(SEQ ID NO.1)，環(huán)狀A(yù)MP依賴蛋白質(zhì)激酶(CAPK)(SEQ ID NO.2)，蛋白質(zhì)激酶C(PKC)(SEQ ID NO.3)，G-受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)激酶β-2腎上腺素受體激酶1和2(bARK1.2)(SEQ ID NO.4)，調(diào)鈣素依賴激酶(CaMK)(SEQ ID NO.5)，Polo激酶(SEQ ID NO.6)，Akt/PKB(SEQ ID NO.7)和G-蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體激酶GRK1(SEQ ID NO.8)，GRK4(SEQ ID NO.9)，GRK5(SEQ ID NO.10)，GRK6(SEQ ID NO.11)和GSK3(SEQ ID NO.12)的HJ環(huán)的氨基酸序列。也演示了在這些氨基酸序列中的保守取代的實例?！?”表示谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯。
圖4的表給出了肽HJ-38(SEQ ID NO.13)，J-41(SEQID NO.14)，J-42(SEQ ID NO.15)，J-43(SEQ ID NO.1 6)，J-43.1(SEQ ID NO.17)，J-45(SEQ ID NO.18)，J-46(SEQ ID NO.19)，J-47(SEQ ID NO.20)，J-48(SEQID NO.21)，J-29(SEQ ID NO.22)的序列。所有肽是N-乙?；暮虲-酰胺化的?！癊！”表示谷氨酸的芐基酯。
圖5以圖的形式表示了在增加K048H101(SEQ ID NO.24)濃度(μm)的情況下，與對照物相比，對胚胎肺纖維原細(xì)胞中膠原質(zhì)產(chǎn)出的抑制百分比。K048H101是絲氨酸/蘇氨酸激酶ALK1的HJ環(huán)的肽衍生物。
圖6以表的形式給出了本發(fā)明的示例肽衍生物的序列，和從其HJ環(huán)衍生出示例肽的絲氨酸/蘇氨酸激酶。所示肽衍生物有K095H101(SEQ ID NO.23)；K048H101(SEQ ID NO.24)；K098H101(SEQ ID NO.25)；K099H101(SEQ ID NO.26)；K093H101(SEQ ID NO.27)；K014H101(SEQ ID NO.28)；K004H001(SEQ ID NO.29)；K004H002(SEQ ID NO.30)；K049H101(SEQ ID NO.31)；K050H101(SEQ ID NO.32)；K088H001(SEQ ID NO.33)；K088H101(SEQ ID NO.34)；K088H103(SEQ ID NO.35)；K088H104(SEQ ID NO.36)；K092H001(SEQ ID NO.37)；K018H101(SEQ ID NO.38)；K087H001(SEQ ID NO.39)；K087H101(SEQ ID NO.40)；K087H102(SEQ ID NO.41)；K087H103(SEQ ID NO.42)；K090H101(SEQ ID NO.43)；K091H001(SEQ ID NO.44)；K091H1O1(SEQ ID NO.45)；K107H001(SEQ ID NO.46)；K107H101(SEQ ID NO.47)；K107H101(SEQ ID NO.47)；K107H102(SEQ ID NO.48)；K045H101(SEQ ID NO.49)；K045H102(SEQ ID NO.50)；K008H001(SEQ ID NO.51)；K008H101(SEQ ID NO.52)；K008H102(SEQ ID NO.53)；K008H103(SEQ ID NO.54)；K035H001(SEQ ID NO.55)；K035H101(SEQ ID NO.56)；K038H101(SEQ ID NO.57)；K038H102(SEQ ID NO.58)；K003H101(SEQ ID NO.59)；K003H104(SEQ ID NO.60)；K001H102(SEQ ID NO.61)；K001H103(SEQ ID NO.62)。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述絲氨酸/蘇氨酸激酶(本文后面稱“STK”)是一種細(xì)胞內(nèi)或膜結(jié)合蛋白質(zhì)，它使用ATP或GTP的γ-磷酸鹽，在絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基基團(tuán)上生成磷酸單酯。STK含有同源的實施磷酸化作用的“激酶域”或“催化域”。根據(jù)對大量蛋白質(zhì)激酶的比較，目前已了解蛋白質(zhì)激酶的激酶域，包括STK，可被分成十二個亞域，這些區(qū)域通常不被大型氨基酸插入打斷，并且含有保守殘基的特性模式(參見Hanks和Hunter所著“真核蛋白質(zhì)激酶家族”蛋白質(zhì)激酶實事手冊，卷I，學(xué)院出版社，第二章1995[Hanks and Hunter，“The Eukaryotic Protein KinaseSuperfamily”，in Hardie and Hanks(ed.)，The Protein Kinase FactsBook，Volume I，Academic Press，Chapter 2，1995)]。這些亞域指亞域I到亞域XII。
本文所指的“HJ環(huán)”是在STK的激酶域內(nèi)，亞域IX中間和亞域X中間之間的區(qū)域發(fā)現(xiàn)的。因為在不同的蛋白質(zhì)激酶的亞域中發(fā)現(xiàn)高度的同源性，包括STK，所以不同STK的域的氨基酸序列可以對比。這樣，STK的HJ環(huán)可通過參考標(biāo)準(zhǔn)型蛋白質(zhì)激酶的氨基酸序列確定，如PKA-Cα，可以說是與在PKA-Cα的約氨基酸229-248之間發(fā)現(xiàn)的約二十個氨基酸殘基的鄰接序列相對應(yīng)。
對STK的HJ環(huán)的第二個定義，是對在前面段落中提供的定義的補充，可通過參考STK的激酶域的三維結(jié)構(gòu)得出。STK的激酶域已發(fā)現(xiàn)含有至少九個α-螺旋，稱為螺旋A到螺旋I[Tabor 等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B340315(1993)，Mohammadi等人，<細(xì)胞>Cell 86577(1996)；Hubbard等人，《自然》372746(1994)]。HJ環(huán)是約二十個氨基酸的鄰接序列，開始于F螺旋內(nèi)從F螺旋N-端的約五個氨基酸殘基，延伸約五個氨基酸殘基到G螺旋中。
此外，本發(fā)明的肽的C-端或N-端，或它們兩者，可分別地被羧酸保護(hù)基或胺保護(hù)基取代或不取代。適合的保護(hù)基的描述可見于在Green和Wuts的著作“有機合成中的保護(hù)基”[Green andWuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley和Sons，第5和第7章，1991]，其內(nèi)容通過在此引述而全部合并于本文。較好的保護(hù)基是那些了促使肽運送入細(xì)胞的基團(tuán)，如，通過減小肽的親水性并增加親油性的基團(tuán)。N-端保護(hù)基的實例包括?；鶊F(tuán)(-CO-R1)和烷氧基羰基或芳氧基羰基(-CO-O-R1)，其中R1是脂族、取代的脂族、芐基、取代的芐基、芳族或取代的芳族的基團(tuán)。酰基基團(tuán)的具體實例包括乙酰基，(乙基)-CO-，n-丙基-CO-，異-丙基-CO-，n-丁基-CO-，仲-丁基-CO-，叔-丁基-CO-，苯基-CO-，取代的苯基-CO-，芐基-CO-，(取代的芐基)-CO-。烷氧基羰基和芳氧基羰基的實例包括CH3-O-CO-，(乙基)-O-CO-，n-丙基-O-CO-，異-丙基-O-CO-，n-丁基-O-CO-，仲-丁基-O-CO-，叔-丁基-O-CO-，苯基-O-CO-，取代的苯基-O-CO-，芐基-O-CO-，(取代的芐基)-O-CO-。在C-端的羰基基團(tuán)可被保護(hù)起來，為酰胺(如，在C-端的羥基基團(tuán)被-NH2-，-NHR2和-NR2R3取代)或酯(在C-端的羥基基團(tuán)被-OR2取代)。R2和R3分別是脂族、取代的脂族、芐基、取代的芐基、?；蛉〈孽；幕鶊F(tuán)。此外，與氮原子一起，R2和R3可形成帶有約0-2個雜原子如氮、氧或硫的C4到C8的雜環(huán)。適合的雜環(huán)實例包括哌啶烷基，吡咯烷基，嗎啉代，硫嗎啉代，哌嗪烷基。C-端保護(hù)基實例包括-NH2，-NHCH3，-NH(CH3)2，-N(乙基)，-N(乙基)2，-N(甲基)(乙基)，-NH(芐基)，-N(C1-C4烷基)(芐基)，-NH(苯基)，-N(C1-C4烷基)(苯基)，-OCH3，-O-(乙基)，-O-(n-丙基)，-O-(n-丁基)，-O-(異-丙基)，-O-(仲-丁基)，-O-(叔-丁基)，-O-芐基，-O-苯基。
“HJ環(huán)的肽衍生物”包括含有HJ環(huán)的氨基酸序列的肽。“HJ環(huán)的肽衍生物”還包括如，STK的HJ環(huán)的亞序列。亞序列是在較大序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)的從約五個到約二十個氨基酸或氨基酸殘基的鄰接序列。這樣，HJ環(huán)的亞序列是在HJ環(huán)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的從約五個到二十個氨基酸或氨基酸殘基的鄰接序列。HJ環(huán)的亞序列也可指HJ環(huán)的“片段”。
“肽衍生物”也包括含有“改性序列”的肽，其中在原始序列或亞序列中的一個或多個氨基酸已被自然產(chǎn)生的氨基酸或氨基酸類似物取代(也稱“改性氨基酸”)。在本發(fā)明的一個方面，肽衍生物含有與STK的HJ環(huán)的亞序列相對應(yīng)的序列，附帶條件是在肽衍生物中的任何一個氨基酸殘基可與亞序列中的相對應(yīng)的氨基酸殘基不同。例如，如果亞序列是[AA1]-[AA2]-[AA3]-[AA4]-[AA5]-，那么肽衍生物可以是[AA1’]-[AA2]-[AA3]-[AA4]-[AA5]-，[AA1]-[AA2’]-[AA3]-[AA4]-[AA5]-，[AA1]-[AA2]-[AA3’]-[AA4]-[AA5]-，[AA1]-[AA2]-[AA3]-[AA4’]-[AA5]-，[AA1]-[AA2]-[AA3]-[AA4]-[AA5’]-，其中[AA’]是自然產(chǎn)生的或改性的與[AA]不同的氨基酸。在本發(fā)明的另一方面，肽衍生物含有與STK的HJ環(huán)的亞序列相對應(yīng)的序列，附帶條件是在肽衍生物中任何兩個氨基酸殘基可與亞序列中相對應(yīng)的氨基酸殘基不同。
“氨基酸殘基”是在肽內(nèi)發(fā)現(xiàn)的組成，由-NH-CHR-CO-表示，其中R是自然產(chǎn)生氨基酸的側(cè)鏈。當(dāng)指在肽內(nèi)發(fā)現(xiàn)的組成時，在本申請中“氨基酸殘基”和“氨基酸”可互換使用?！鞍被釟埢愃莆铩卑ê邢铝惺阶拥腄或L殘基-NH-CHR-CO-，其中R是脂族基團(tuán)，取代的脂族基團(tuán)，芐基基團(tuán)，取代的芐基基團(tuán)，芳族基團(tuán)或取代的芳族基團(tuán)，其中R不與自然產(chǎn)生氨基酸的側(cè)鏈相對應(yīng)。當(dāng)在肽內(nèi)發(fā)現(xiàn)的組成時，在本申請中“氨基酸殘基類似物”和“氨基酸類似物”可互換使用。
如本文所用的，脂族基團(tuán)包括直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的C1-C8完全飽和的烴，含有一個或兩個雜原子如氮、氧或硫和/或含有一個或多個不飽和單元。芳族基團(tuán)包括，碳環(huán)芳族基團(tuán)如苯基和萘基，以及雜環(huán)芳組基團(tuán)如咪唑基，吲哚基，噻嗯基，呋喃基，吡啶基，吡喃基，呃唑基，苯噻嗯基，苯呋喃基，喹啉基，異喹啉基，吖啶基。
脂族基團(tuán)、芳族基團(tuán)或芐基基團(tuán)上適合的取代基包括-OH，鹵代基(-Br，-Cl，-I和-F)，-O(脂族基團(tuán)、取代的脂族基團(tuán)、芐基、取代的芐基、?；蛉〈孽；?，-CN，-NO2，-COOH，-NH2，-NH(脂族基團(tuán)、取代的脂族基團(tuán)、芐基、取代的芐基、?；蛉〈孽；?，-N(脂族基團(tuán)、取代的脂族基團(tuán)、芐基、取代的芐基、?；蛉〈孽；?2，-COO(脂族基團(tuán)、取代的脂族基團(tuán)、芐基、取代的芐基、?；蛉〈孽；?，-CONH2，-CONH(脂族基團(tuán)、取代的脂族基因、芐基、取代的芐基、?；蛉〈孽；?，-SH，-S(脂族基團(tuán)、取代的脂族基團(tuán)、芐基、取代的芐基、芳族基團(tuán)或取代的芳族基團(tuán))和-NH-C(＝NH)-NH2。取代的芐基或芳族基團(tuán)也可含有脂族基團(tuán)或取代的脂族基團(tuán)作為取代基。取代的脂族基團(tuán)也可含有芐基，取代的芐基，?；蛉〈孽；鳛槿〈?。取代的脂族基團(tuán)，取代的芳族基團(tuán)或取代的芐基可含有一個或多個取代基。
在HJ環(huán)的序列或HJ環(huán)亞序列中的氨基酸殘基的適合的取代基包括，產(chǎn)生調(diào)節(jié)STK活性的肽衍生物的保守取代基?！氨Ｊ厝〈笔侵溉〈腥〈被?自然產(chǎn)生或改性的)含有與被取代的氨基酸大約相同的尺寸和電子屬性。這樣，取代氨基酸在側(cè)鏈上就會有與原始氨基酸相同或相似的官能團(tuán)。
“保守取代基”也指使用與被取代的氨基酸相同的取代氨基酸，只是在其側(cè)鏈中的官能團(tuán)已經(jīng)被用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基功能化了。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基在Green和Wuts的論著“有機合成中的保護(hù)基”[Green和Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，JohnWiley和Sons，第5和7章，1991]中公開了，其內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。對于N-端和C-段保護(hù)基而言，較好的保護(hù)基是那些促使肽運送到細(xì)胞內(nèi)的基團(tuán)，如，通過減小肽的親水性及增加肽的親油性，在細(xì)胞內(nèi)通過水解或酶解可在體內(nèi)裂開的基團(tuán)[參見Ditter等人，《藥物化學(xué)科學(xué)》[J.Pharm，Sci.57783(1968)]；Ditter等人，《藥物化學(xué)科學(xué))》[J.Pharm，Sci.57828(1968)]；Ditter等人，《藥物化學(xué)科學(xué)》[J.Pharm，Sci.57557(1968)]；King等人，《(生物化學(xué)》[Biochemistry 262294(1987)]；Lindberg等人，《藥物新陳代謝及生理處置》[Drug Metabolism andDisposition 17311(1989)]；以及Tunek等人，《生化藥物化學(xué)》[Biochem.Pharm.373867(1988)]；Alderson等人，《生物化學(xué)生物物理學(xué)》[Arch.Biochem.Biophys.239538(1985)]，以及Singhal等人的論著[FASEB J.1220(1987)]。羥基保護(hù)基包括酯、碳酸鹽和氨基甲酸鹽的保護(hù)基。胺保護(hù)基包括烷氧基和芳氧基，如上所述的N-端保護(hù)基。羧酸保護(hù)基包括脂族、芐基和?；サ孽ィ缟纤龅腃-端保護(hù)基。在一個具體實施中，在本發(fā)明的肽中，一個或多個谷氨酸或天冬氨酸殘基的側(cè)鏈上的羧酸基團(tuán)被保護(hù)起來，較好的是用如甲基、乙基、芐基或取代的芐基酯，更好的是用芐基酯保護(hù)起來。
下面提供的自然產(chǎn)生和改性的氨基酸組，組中的每一種氨基酸具有相似的電子和空間屬性。這樣，保守取代基可用同組的另一種氨基酸來取代該氨基酸而制成。應(yīng)該理解的是，這些組是沒有限制的，即每個組中都可以添加有其他改性氨基酸。
組I包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸和含有下列側(cè)鏈的改性氨基酸乙基，n-丁基，-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CHOHCH3和-CH2SCH3。較好地，組I包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，蛋氨酸。
組II包括甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸和含有乙基側(cè)鏈的改性氨基酸。較好地，組II包括甘氨酸，丙氨酸。
組III包括苯基丙氨酸，苯基甘氨酸，酪氨酸，色氨酸，環(huán)己基甲基，和含有取代的芐基或苯基側(cè)鏈的改性氨基酸殘基。較好的取代基包括下列中的一個或多個鹵代基，甲基，乙基，硝基，甲氧基，乙氧基和-CN。較好地，組III包括苯基丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。
組IV包括谷氨酸，天冬氨基酸，谷氨酸或天冬氨酸取代或未取代的脂族，芳組或芐基酯(如甲基，乙基，n-丙基，異-丙基，環(huán)己基，芐基或取代的芐基)，谷氨酰胺，天冬酰胺，CO-NH-烷基化谷氨酰胺或天冬酰胺(如甲基，乙基，n-丙基，異-丙基)和含有側(cè)鏈-(CH2)3-COOH的改性氨基酸，它的酯(取代或未取代所脂族，芳族或芐基酯)，它的酰胺，和它的取代或未取代的N-烷基化酰胺。較好地，組IV包括谷氨酸，天冬氨酸，甲基天冬氨酸，乙基天冬氨酸，芐基天冬氨酸，甲基谷氨酸，乙基谷氨酸，和芐基谷氨酸。
組V包括組氨酸，賴氨酸，精氨酸，N-硝基精氨酸，β-環(huán)精氨酸，γ-羥基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸，賴氨酸同系物，精氨酸同系物，鳥氨酸同系物。較好地，組V包括組氨酸，賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸。氨基酸的同系物包括在側(cè)鏈上從1到約3個其他亞甲基單元。
組VI包括絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸和含有由-OH或-SH取代的C1-C5直鏈或支鏈烷基側(cè)鏈的改性氨基酸。較好地，組VI包括絲氨酸，蘇氨酸或半胱氨酸。
在另一方面，在HJ環(huán)序列或HJ環(huán)亞序列中的氨基酸殘基的適合的取代基還包括“重度”取代基，其產(chǎn)生調(diào)節(jié)STK活性的肽衍生物。產(chǎn)生調(diào)節(jié)STK活性的肽衍生物的重度取代基，與高度保守的位置相比，更可能處于整個絲氨酸/蘇氨酸激酶家族中不是高度保守性的位置上。圖1顯示了STK的HJ環(huán)的前十個氨基酸的共有序列。圖2顯示了環(huán)狀A(yù)MP相關(guān)激酶和蛋白質(zhì)激酶C的HJ環(huán)的約二十個氨基酸的共有序列。在STK家族中的高度保守位置，和在那些位置上通?？砂l(fā)現(xiàn)的保守氨基酸已作指示。在STK家族中不是高度保守的位置用“X”標(biāo)出。因為D-氨基酸在與甘氨酸氫側(cè)鏈相同的位置上有一個氫，所以D-氨基酸和其類似物可在圖1的位置6，或在圖2位置6和12上替代甘氨酸。
“重度取代基”其中取代氨基酸(自然產(chǎn)生或改性的)與被取代的氨基酸相比，尺寸和/或電子屬性顯著不同。這樣，取代氨基酸的側(cè)鏈可以比被取代的氨基酸的側(cè)鏈顯著地大(或小)，和/或可以含有與被取代的氨基酸電子屬性顯著不同的官能團(tuán)。這種類型的重度取代基實例包括取代丙氨酸的苯基丙氨酸或環(huán)己基甲基甘氨酸，取代甘氨酸的異亮氨酸，取代相應(yīng)L氨基酸的D氨基酸，或取代天冬氨酸的-NH-CH((-CH2)3-COOH)-CO-。另外，官能團(tuán)也可加在側(cè)鏈上，從側(cè)鏈上刪除或與其他官能團(tuán)交換。這種類型的重度取代基的實例包括，在纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸的脂族側(cè)鏈上加上胺或羥基，羧酸，在天冬氨酸或谷氨酸的側(cè)鏈上用胺替換羧酸，或在賴氨酸或鳥氨酸的側(cè)鏈上刪除胺。在另一個可選擇的方式中，取代氨基酸的側(cè)鏈可以具有與被取代的氨基酸的官能團(tuán)顯著不同的空間和電子屬性。這樣的改性包括色氨酸取代甘氨酸，賴氨酸取代天冬氨酸，和-CH(-CH2)4-COOH取代絲氨酸的側(cè)鏈。這些實例不意味有限制性。
其活性可被肽及肽衍生物調(diào)節(jié)的STK的實例，如本文所述，包括但不限于，屬于下列STK家族的STKPolo家族[Glover等人，<細(xì)胞生物學(xué)>J.Cell Biol.，1351681(1996)]，Raf，分裂素活性蛋白質(zhì)激酶(MAP激酶)，Akt/PKB[Frank等人，(細(xì)胞)Cell 88435(1997)和Hemmings等人，《科學(xué)》275628(1997)]和G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體激酶。其他適合的STK包括環(huán)狀A(yù)MP(cAMP)相關(guān)蛋白質(zhì)激酶，蛋白質(zhì)激酶C，調(diào)鈣素相關(guān)激酶，肝糖合成酶激酶-3(GSK3)和環(huán)狀GMP(cGMP)相關(guān)蛋白質(zhì)激酶。
適合的Polo家族組成包括但不限于，Plk，Snk和SaK。適合的Raf家族組成包括但不限于，Raf-1，A-Raf，B-Raf。適合的G蛋白質(zhì)相關(guān)激酶包括但不限于，β-腎上腺素受體激酶1和2，視網(wǎng)膜紫質(zhì)激酶(GRK1)，GRK4，GRK5，GRK6。適合的MAP激酶包括但不限于，MAPK，MAPKK，和MAPKKK。還包括蛋白質(zhì)激酶C異形，其包括但不限于，異形為α，βI/Hγ，δ，ε，η(L)，θ，μ，ξ，ι和λ。
本發(fā)明包括含有與在STK的HJ環(huán)中發(fā)現(xiàn)的序列，其亞序列和其改性亞序列相對應(yīng)的氨基酸序列的肽。適合的亞序列包括但不限于，與STK的JH環(huán)的[AA]1到[AA]20，[AA]3到[AA]10，[AA]7到[AA]14，[AA]11到[AA]18，[AA]3到[AA]14，[AA]7到[AA]18，和[AA]3到[AA]18和其亞序列相對應(yīng)的序列。圖3顯示了下列STK的HJ環(huán)的序列RAF，環(huán)狀A(yù)MP相關(guān)激酶，蛋白質(zhì)激酶C，G-蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體激酶βARK1和2和GRK1，GRK4，GRK5，和GRK6，調(diào)鈣素相關(guān)激酶，Polo，Akt/PKB和GSK3。
圖3也提供了環(huán)中氨基酸序列的號碼圖表。HJ環(huán)N-端的氨基酸在位置1上，可稱為“[AA]1。序列中的下一個氨基酸稱為“[AA]2，在位置2上，接著氨基酸[AA]3到[AA]20，在位置3-20上。這樣，帶有氨基酸序列[AA]1到[AA]20的肽20-mer包括在HJ環(huán)中的二十個氨基酸。帶有氨基酸序列[AA]3到[AA]10的HJ環(huán)的肽衍生物，如在前面段落中所述的，在所說的HJ環(huán)中包括第三個氨基酸到第十個氨基酸。
本發(fā)明還包括含有與STK的HJ環(huán)的改性序列或亞序列相對應(yīng)的氨基酸序列的肽，調(diào)節(jié)包括RAF，環(huán)狀A(yù)MP相關(guān)激酶，蛋白質(zhì)激酶C，G-蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體激酶βARK1，βARK2，GRK1和GRK4-6，調(diào)鈣素相關(guān)激酶和Polo的STKs的活性。一方面，序列或亞序列中的一個、兩個或多個氨基酸用保守取代基改性；取代基可在共有位置上，也可在非共有位置上，或在兩種位置上都有。另一方面，序列或亞序列中的一個、兩個或多個氨基酸用重度取代基改性；取代基較好的是在非共有位置上。取代基還包括帶有D-氨基酸殘基或其類似物的保守甘氨酸殘基(如圖1中的位置6或圖2中的位置6和12)。圖3還提供了RAF，環(huán)狀A(yù)MP相關(guān)激酶，蛋白質(zhì)激酶C，G-蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體激酶βARK1，βARK2，GRK1和GRK4-6，調(diào)鈣素相關(guān)激酶和Polo，Akt/PKB，GSK3的HJ環(huán)的保守氨基酸取代基實例。
本發(fā)明肽衍生物的具體實例包括肽HJ-38(SEQ ID NO.13)，HJ-41(SEQ ID NO.14)，HJ-42(SEQ ID NO.15)，HJ-43(SEQ ID NO.16)，HJ-43.1(SEQ ID NO.17)，HJ-45(SEQ ID NO.18)，HJ-46(SEQ ID NO.19)，HJ-47(SEQ IDNO.20)，HJ-48(SEQ ID NO.21)，HJ-29(SEQ ID NO.22)，肽的序列在圖4中給出。如上所述這些肽的N-端和/或C-端可被改性。如圖4中所示，這些肽的N-端被乙?；?，C-端被酰胺化了。如上所述，酰胺和羧酸的其他保護(hù)基也可使用。此外，可去掉或不去掉一個或兩個保護(hù)基。肽可以是線性的或環(huán)狀的。
還包括含有HJ-38(SEQ ID NO.13)，HJ-41(SEQ ID NO.14)，HJ-42(SEQ ID NO.15)，HJ-43(SEQ ID NO.16)，HJ-43.1(SEQ ID NO.17)，HJ-45(SEQ ID NO.18)，HJ-46(SEQ ID NO.19)，HJ-47(SEQ ID NO.20)，HJ-48(SEQ IDNO.21)，和HJ-29(SEQ ID NO.22)序列的肽，附帶條件是在肽中的任何一個氨基殘基可以變化，為任何自然產(chǎn)生氨基酸或其類似物。本發(fā)明也包括含有，附帶條件是在肽中的任何兩個氨基殘基可以變化，為任何自然產(chǎn)生氨基酸或其類似物的序列的肽。
本發(fā)明還包括調(diào)節(jié)SRK活性的環(huán)狀肽，其含有與STK的HJ環(huán)的改性序列或亞序列相對應(yīng)的氨基酸序列。
“環(huán)狀肽”指，如在肽或肽衍生物內(nèi)通過N-端的氮原子和C-端的羰基碳的肽鍵形成環(huán)。
“環(huán)化”也是指，通過化合物的N-端的氮和肽中的適當(dāng)氨基酸的側(cè)鏈之間的共價鍵形成環(huán)，較好地是C-端的氨基酸。如，可在N-端的氮原子和天冬氨酸或谷氨酸的側(cè)鏈的羰基碳之間形成酰胺。另外，肽或肽衍生物可通過在化合物C-端羰基和肽中適當(dāng)氨基酸的側(cè)鏈之間形成共價鍵進(jìn)行環(huán)化，較好地是N-端氨基酸。如，在C-端羰基碳和賴氨酸或鳥氨酸的側(cè)鏈上的氨基氮原子之間形成酰胺；在C-端羰基碳和絲氨酸或蘇氨酸的側(cè)鏈上的羥基氧原子之間形成酯。
“環(huán)化”也指，通過肽中適當(dāng)?shù)膬蓚€氨基酸的側(cè)鏈之間的共價鍵形成環(huán)，較好地是終端氨基酸。如，在兩個半胱氨酸的側(cè)鏈上的硫原子之間可形成二硫化物。或者，可在如谷氨酸或天冬氨酸的側(cè)鏈上的羰基碳，和如絲氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈上的氧原子之間形成酯。在如谷氨酸或天冬氨酸的側(cè)鏈上的羰基碳，和如賴氨酸或鳥氨酸的側(cè)鏈上的氨基氮之間形成酰胺。
此外，肽和肽衍生物可通過在兩個端點之間，在一個端點和肽或肽衍生物中氨基酸側(cè)鏈之間，或在肽或肽衍生物中兩個氨基酸的側(cè)鏈之間的連接基團(tuán)進(jìn)行環(huán)化。適當(dāng)?shù)倪B接基團(tuán)在Lobl等人，WO92/00995和Chiang等人，WO94/15958中公開，其內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。
在原始氨基酸序列或亞序列中適當(dāng)?shù)娜〈悄切?，如上所述可產(chǎn)生調(diào)節(jié)STK活性的肽衍生物的取代基。當(dāng)STK的活性增加了或降低了，STK的活性是“被調(diào)節(jié)了”。STK活性的增加或降低可通過測定測試STK的蛋白質(zhì)底物的磷酸化的程度來測定，或通過受STK控制的細(xì)胞活性或功能的相應(yīng)調(diào)節(jié)，增加或降低來測定。這些細(xì)胞功能的實例包括細(xì)胞繁殖，細(xì)胞分化，細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞存活或凋亡，細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)，基因表達(dá)，油脂新陳代謝，肝糖新陳代謝和有絲分裂。
通過提供一種或多種細(xì)胞活性受STK控制的細(xì)胞，可容易地確定肽或肽衍生物對STK活性的調(diào)節(jié)。在適合測試絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的條件下，用肽或肽衍生物溫育細(xì)胞制備測試混合物。測定STK活性并與適當(dāng)?shù)膶φ瘴锵啾?，如與在相同的條件下，沒有肽或肽衍生物存在下溫育的相同的細(xì)胞活性相比。與對照物相比，在測試混合物中STK活性的大些或小些，表示測試肽或肽衍生物調(diào)節(jié)了所說的STK活性。
適用測試的細(xì)胞包括表達(dá)膜結(jié)合或細(xì)胞內(nèi)STK的正常細(xì)胞，已被遺傳設(shè)計以表達(dá)STK的細(xì)胞，表達(dá)STK的惡性細(xì)胞或表達(dá)STK的不死細(xì)胞。
測定STK活性的適當(dāng)條件包括適合測試受STK控制的細(xì)胞活性或功能的條件。通常，當(dāng)細(xì)胞暴露在適合細(xì)胞生長的條件下時，包括適合的溫度(如在約30℃到42℃之間)和介質(zhì)中適當(dāng)濃度的營養(yǎng)物的(如氨基酸，維生素，生長因子)存在，可測定細(xì)胞的活性。
另一方面，通過在剝奪血清的情況下生長細(xì)胞，可估定某些STK活性[如，Atk/PKB，Dudek等人，《科學(xué))》275661(1997)]。細(xì)胞通常在存在血清的培養(yǎng)物中生長，如牛血清，馬血清或牛胎血清。許多細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞如PC-12細(xì)胞，在血清不充分時通常不能存活。使用不充分血清培養(yǎng)細(xì)胞即是指“剝奪血清的情況”，包括如含約0％到4％的血清。通過肽或肽衍生物在血清剝奪的狀況中對細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)程度確定STK的活性。具體條件在Dudek等人，及與本申請一起提交的題目為“選擇調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號發(fā)出的短肽”的共同待審理申請(1997年5月21日提交，律師案卷號No.CMCC-547)中的實例4提供了，其內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。
一般，通過定量測定STK控制的細(xì)胞活性，來測定測試混合物中STK的活性。細(xì)胞活性可以是如，細(xì)胞擴增。由STK控制的擴增細(xì)胞的實例包括內(nèi)皮細(xì)胞如牛動脈細(xì)胞，鼠MSI細(xì)胞或鼠SVR細(xì)胞[參閱Arbiser等人，1997年，《美國國家科學(xué)研究學(xué)報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94861(1997))]，血管平滑肌細(xì)胞，和多種組織的惡性細(xì)胞如乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，惡性黑素瘤。通過測量細(xì)胞擴增測定STK活性，如通過比較初始細(xì)胞存在的數(shù)目和給定的一段時間后的細(xì)胞存在數(shù)目。涉及細(xì)胞擴增的STK是polo家族，Taf或Atk/PKB中的成員。如果使用的細(xì)胞其中STK控制細(xì)胞的分化[如前成脂肪細(xì)胞如3T3-L1表達(dá)STKs Akt/PKB，GSK3和蛋白質(zhì)激酶-參閱Kohn等人，《生物化學(xué)雜志)》，1996年(J.Biol.Chem.27131372(1996))]，那么通過測量分化程度可測定活性。通過細(xì)胞如初生脂肪細(xì)胞，肝細(xì)胞和纖維原細(xì)胞的代謝作用活性變化，或通過測量葡萄糖的吸收，脂肪生成，或肝糖的新陳代謝[參閱，如Weise等人，《生物化學(xué)雜志》，1995年(J.Biol.Chem.2703442(1995))]可測定活性?；钚砸部赏ㄟ^基因表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)或細(xì)胞顯型的改變程度來測定。細(xì)胞形態(tài)改變的一個實例在與本申請一起提交的題目為“選擇調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號發(fā)出的短肽”的共同待審理的申請(1997年5月21日提交，律師案卷號No.CMCC-547)中作了報道，其中公開了蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的HJ環(huán)的某些肽衍生物可以使血管平滑肌變長并呈現(xiàn)紡錘形。
通過測定細(xì)胞擴增確定STK活性的適當(dāng)條件的具體實例在實例2中提供。
本文上述的確定肽或肽衍生物是否調(diào)節(jié)由STK控制的細(xì)胞活性或功能的試驗可用細(xì)胞實施，而不是本文所特別描述的其他方式。尚未發(fā)現(xiàn)的STK或其功能尚未了解的STK，一旦確定了其所控制的細(xì)胞功能或活性，也可用于這種試驗。這些STK也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明也涉及在受試者中調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的方法。“受試者”較好的是人，但也可以是需要治療的動物，如獸醫(yī)動物(如狗，貓，等等)，畜牧動物(如牛，豬，馬等等)和實驗室動物(如田鼠，鼠，豚鼠等等)。
可以調(diào)節(jié)受試者中的STK活性來治療由STK活性不足或活性過度引發(fā)的疾病。如，MAP激酶[Seger和Krebs在FASEB期刊上的文獻(xiàn)，(FASEB J.9726(1995))]和環(huán)狀相關(guān)蛋白質(zhì)激酶[《細(xì)胞分子生物學(xué)》“Molecular Biology of the Cell，”由Alberts，Bray，Lewis，Raff，Roberts和Watson等人編輯.第5章，(Garland出版公司)，(1994)]，在真核細(xì)胞中是細(xì)胞分化周期控制系統(tǒng)的重要組分。其他STK，如蛋白質(zhì)激酶C，Raf激酶[Nishizuka，在FASEB期刊上(The FASEB Journal)的文獻(xiàn)，9484(1995)，Locric，等人，Oncongene 121109(1996)；Laird等人，《生物化學(xué)》27026，742(1995)]和G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體[Lange-Carter，等人，《科學(xué)》260315(1993)]，依次涉及MAP激酶的控制或在有絲分裂期間活化。另一方面，G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體(GRK)，可減少受體的敏感性，這樣就涉及調(diào)節(jié)多種荷爾蒙反應(yīng)[Freedman和Leflowitz在<荷爾蒙研究進(jìn)展>中的文獻(xiàn)，(Freedman and Leflowitz，Recent Prog.Hormon.Res.)52319(1996)]。Akt/PKB的活化作用涉及抑制凋亡如逐漸的細(xì)胞死亡[Frank等人，<細(xì)胞>88435(1997)；《邊緣科學(xué)》(Hemmings Science)275628(1997)]。調(diào)節(jié)這些酶活性的本發(fā)明的肽和肽衍生物，在給受試者服用治療上有效的量時，可用來在受試者中治療癌癥。
C-AMP依賴激酶，GSK3和Akt/PKB涉及肝糖新陳代謝的控制。調(diào)節(jié)C-AMP相關(guān)激酶活性的本發(fā)明的肽和肽衍生物，在給受試者服用治療上有效量時，可用來在受試者中治療II型糖尿病和出血性休克。已報道CAMP衍生物可抑制人類癌癥細(xì)胞生長[Karsros等人，F(xiàn)EBS Lett.22397(1987)]，說明C-AMP依賴激酶的抑制劑也可用于治療癌癥。
Raf激酶涉及脂肪新陳代謝的控制。調(diào)節(jié)Raf激酶活性的本發(fā)明的肽和肽衍生物，在給受試者服用治療上有效的量時，可用來在受試者中治療肥胖。
調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)激酶C的藥劑可用來治療多種疾病狀況，包括心血管疾病(血栓癥，動脈硬化癥，動脈硬化，心臟肥大，局部缺血，再灌注損傷，高血壓)，免疫抑制和炎癥病變(如哮喘，牛皮癬，紅斑狼瘡，糖尿病，器官移植排斥抑制，腸炎和AIDS)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如Alzheimer’s癥，中風(fēng)，創(chuàng)傷)，依賴蛋白質(zhì)激酶C活化作用的膿毒性休克和局部缺血引發(fā)的腎臟衰竭[Nambi，WO93/16703，Bradshaw，等人，“藥劑作用”(AgentsAction)38135(1993)；Birchall等人，“藥物化學(xué)和試驗治療”(The J.Pharm.And Exper.Therapeut).2922(1994)]。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)激酶C活性的本發(fā)明的肽和肽衍生物，在給受試者服用治療上有效量時，可用來在受試者中治療這些疾病。
已知G-蛋白質(zhì)受體激酶的磷酸化作用[Freedman和Lefkowitz的<荷爾蒙研究進(jìn)展>，(Freedman and Lefkowitz，RecentProg.Hormon.Res)51319(1996)]會導(dǎo)致受體敏感性減少，這樣就延長了如腎上腺素荷爾蒙效用的持續(xù)時間。因此，調(diào)節(jié)G-蛋白質(zhì)受體激酶活性的藥劑對治療由相配體如多巴胺的較低生物藥效性造成的疾病有潛在的作用。已報道調(diào)鈣素相關(guān)激酶的抑制劑可抑制多巴胺釋放[Nagatsu等人<生物化學(xué)生物物理學(xué)研究公報>，(“Biochem.Biophy.Research，Commun”)1431045(1987)]。這樣，調(diào)節(jié)G-蛋白質(zhì)受體激酶和調(diào)鈣素受體激酶活性的藥劑對治療與多巴胺信號功能紊亂有關(guān)的疾病，如Pardinson’s癥，有潛在的作用。已報道調(diào)鈣素相關(guān)激酶的抑制劑可舒緩動脈肌肉[Saitoh等人，<生物化學(xué)>J.Bio.Chem.2627796(1987)]，這樣，對治療高血壓有潛在的作用。GSK3的抑制作用可增加胰島素受體的細(xì)胞內(nèi)活性，從而加強了葡萄糖的吸收和其他相關(guān)的代謝活性。這樣，調(diào)節(jié)GSK3活性的藥劑對治療I類和II類糖尿病有潛在的作用。
依據(jù)本文所公開的方法，肽和肽衍生物可設(shè)計用來調(diào)節(jié)HJ環(huán)已排序和細(xì)胞功能已知的STK的活性。這樣，肽和肽衍生物可設(shè)計用來影響(增加或減少)那些細(xì)胞功能。進(jìn)一步的研究可能會揭示，某些其根本病因目前不了解的疾病狀況，是由STK控制細(xì)胞功能的活性過度或活性不足引起的。這些疾病可通過服用肽來治療，這些肽是活性過度的或活性不足的STK的HJ環(huán)的肽衍生物。適當(dāng)?shù)碾暮碗难苌锟捎帽疚乃_的方法確定。這些治療方法，肽和肽衍生物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
“治療上有效量”是指與在沒有治療的情況下典型臨床結(jié)果相比，產(chǎn)生了作為治療效果的改善的臨床結(jié)果的化合物的量。“改善的臨床結(jié)果”包括作為治療結(jié)果延長了攜帶疾病個體的生命期望?！案纳频呐R床結(jié)果”也可包括作為治療結(jié)果使攜帶疾病個體經(jīng)歷少一些的疾病癥狀或并發(fā)癥。對于癌癥，“改善的臨床結(jié)果”包括延長的生命期望。還可包括減緩或制止腫瘤生長的速度，致使腫瘤尺寸縮小，降低轉(zhuǎn)移速度和/或改善生命質(zhì)量(如減少身體不舒適或增加靈活性)。
對于糖尿病，改善的臨床結(jié)果是指延長的生命期望，減少疾病的并發(fā)癥(如神經(jīng)病，視網(wǎng)膜病，腎病和血管衰退)及改善生命質(zhì)量，如上所述。
對于肥胖，改善的臨床結(jié)果是指對攝入的每卡路里的體重增加量被減少了。還指減少了肥胖的并發(fā)癥如心臟疾病，如動脈硬化和高血壓。
給個體服用的肽或肽衍生物的量取決于疾病的種類和嚴(yán)重性，及個體的特性，如通常的健康狀況，年齡，性別，體重和對藥物的容忍量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可依據(jù)這些和其他因素確定適當(dāng)?shù)膭┝浚话愕?，對于成人肽或肽衍生物的治療有效量的范圍是從約每天1mg到約每天1000mg。較好的劑量范圍是從約每天1mg到約每天100mg。
本發(fā)明的肽和肽衍生物較好地是非腸道用藥。非腸道用藥可包括，如系統(tǒng)用藥，如通過肌肉注射，靜脈注射，皮下注射，腹腔注射。抗蛋白水解作用的肽或肽衍生物可口服用藥，如用膠囊，懸浮劑或片劑的形式。
肽或肽衍生物可與藥用可接受的作為治療上述疾病藥用合成物的部分的載體一起給個體服用。適合的藥用載體可含有不與肽或肽衍生物作用的惰性組分?？蓪嵤┑臉?biāo)準(zhǔn)藥用配方技術(shù)如在Remington’的《藥科學(xué)》，Mack出版公司(Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA)中所述的那些技術(shù)。非腸道用藥適合的藥用載體包括如，無菌水，，生理鹽水，細(xì)菌抑制鹽水(鹽水含有約0.9％mg/ml芐基乙醇)，磷酸緩沖鹽水，Hank’s溶液，Ringer’s-乳酸鹽等等。制備膠囊合成物(如包裹著硬凝膠或環(huán)糊精)的方法在此領(lǐng)域是已知的(Baker，等人，“生物活性藥劑的控釋”(Controlled Release of BiologicalActive Agents)，John Wiley和Sons編輯，1986)。
本發(fā)明的肽和肽衍生物除了治療用途還有其他許多應(yīng)用。一些應(yīng)用在下面的段落中闡述。
本發(fā)明的HJ環(huán)肽是從在天然蛋白質(zhì)中線性的排列中衍生而來的。因此，它們可用來制備STK的特異抗體。而且，因為對于每個STK的亞家族，HJ-環(huán)序列是獨特的，所以抗HJ-環(huán)抗體可特別地用來分離STK不同的亞家族。
通過與適當(dāng)?shù)妮d體共軛結(jié)合如匙孔戚血藍(lán)蛋白或血清蛋白，可培養(yǎng)HJ環(huán)肽適當(dāng)?shù)目贵w；多克隆和單克隆抗體的制備可采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)實施。有很多種方法已被描述[參閱如Kohler等人，《自然》，256495-497(1975)；Eur.J.的<免疫>(Immunol)6511-519(1976)；Milstein等人，《自然》266550-552(1977)；Koprowski等人，美國專利第4,172,124號(U.S.Patent No.4,172,124)；Harlow，E.和D.Lane，1988，抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，(寒春碼頭實驗室，ColdSpring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY)；“分子生物學(xué)中的通用方案”，卷2，(Current Protocols In Molecular Biology，Vol.2)，增補27(Supplement 27，1994年夏)，Ausubel，F(xiàn).M.等人編輯.，(John Wiley&Sons紐約，New York，NY)，第11章Chapter11，(1991)]。通常，細(xì)胞雜交可通過融合適當(dāng)?shù)牟凰兰?xì)胞組(如骨髓瘤細(xì)胞組如SP2/0)和抗體產(chǎn)生細(xì)胞來制備?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞，較好的是脾或淋巴節(jié)產(chǎn)生的細(xì)胞，可用從重要抗原免疫的動物中獲取。融合的細(xì)胞(雜交細(xì)胞)可采用選擇性培養(yǎng)條件分離，并用限制稀釋液克隆。產(chǎn)生有所需特異性的抗體的細(xì)胞可用適當(dāng)?shù)脑囼灧椒ㄟx取(如ELISA)。
HJ環(huán)肽的抗體，包括單克隆抗體有很多用途。如，那些抗從HJ環(huán)肽衍生來的蛋白質(zhì)的抗體，或與從HJ環(huán)肽衍生來的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體，較好的是與所說的蛋白質(zhì)特異結(jié)合的抗體，可用來確定和/或分類在細(xì)胞表面表現(xiàn)那種蛋白質(zhì)細(xì)胞(如通過熒光活性細(xì)胞分類或組織學(xué)分析的方式)。對蛋白質(zhì)特異的單克隆抗體也可用來檢測和/或定量在細(xì)胞表面的表達(dá)或在樣品中的存在(如在ELISA中)。另外，抗體也可用來確定在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中是否存在細(xì)胞內(nèi)STK。生成澄清的細(xì)胞溶胞體(如用氫氧化鈉(0.2N)和十二烷基硫酸鈉(1％)處理細(xì)胞，離心，將沉淀與上層液分離)，并用STK特異的抗-HJ環(huán)抗體處理。然后，分析澄清溶胞體，如通過對STK和抗體之間的Western印跡分析或免疫沉淀分析。接受刺激后一些STKs變成膜結(jié)合的，或細(xì)胞骨架締合的?？?HJ環(huán)抗體可用來在多種生理條件下，通過采用傳統(tǒng)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)如免疫熒光技術(shù)，免疫過氧化酶技術(shù)，和免疫電子顯微鏡法，連同特異抗-HJ-環(huán)抗體，研究STK多種亞家族的細(xì)胞內(nèi)分布(劃分)。
與免疫原作用的抗體也很有用。如它們可用來檢測和/或定量樣品中的免疫原，或提純免疫原(如免疫親和提純法)。
STK內(nèi)的HJ環(huán)在調(diào)節(jié)STK活性中起重要的作用，如本發(fā)明的肽和肽衍生物在STK活性方面具有顯著影響的事實所證實的。本發(fā)明的HJ環(huán)肽也可用來確定與特異STK的HJ環(huán)相互作用，并調(diào)節(jié)STK活性的配體。如可直接地或通過連接物，制備特異HJ環(huán)共價接合的親和柱。這種柱接著可用來分離和確定那些鍵合HJ肽的并也可能鍵合從HJ肽衍生出的STK的特異配體。然后配體可從柱中洗脫，鑒定測試其調(diào)節(jié)STK功能的能力。
蛋白質(zhì)酪氨酸激酶是另一類蛋白質(zhì)激酶。這些蛋白質(zhì)以膜-結(jié)合受體出現(xiàn)參與跨膜信號發(fā)出，或以細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)出現(xiàn)參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，包括向核子的信號傳導(dǎo)。鍵合配體產(chǎn)生信號傳導(dǎo)，通過激酶對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化作用啟動。與STK相同，酪氨酸激酶也用這種磷酸化作用機制控制細(xì)胞功能。酪氨酸激酶與STK具有高度的同源性，包括HJ環(huán)。這樣，酪氨酸激酶活性和它們控制的細(xì)胞功能可用肽(它們HJ環(huán)的肽衍生物)調(diào)節(jié)，如上面對STK的討論一樣。肽和酪氨酸激酶HJ環(huán)的肽衍生物，和使用它們的方法，在一起提交的題目為“選擇性調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號發(fā)出的短肽”(1997年5月21日提交，律師案卷號No.CMCC-547)的共同待審理的申請中公開，其內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。
本發(fā)明化合物中的肽序列的合成可用固相肽合成法(如，BOC或FMOC)，溶液相合成法，或其他適合的技術(shù)包括前述方法的綜合來合成。BOC和FMOC法已經(jīng)被建立并被廣泛應(yīng)用，具體的描述在Merrifield的<美國化學(xué)學(xué)報>(J.Am.Chem.Soc.)882149(1963)；Meienhofer的，<荷爾蒙蛋白質(zhì)和肽>(Hormonal Proteins and Peptides)，由C.H.Li，編輯，“學(xué)院出版社”(Academic Press)，1983，pp.48-267；Barany和Merrifield在“肽工程”，“The Peptides，E”中，Gross and J.Meienhofer，編輯，“學(xué)院出版社”(Academic Press)，紐約New York，1980，pp，3-285中。固相肽合成法在Merrifield，R.B.，《科學(xué)》，232341(1986)；Carpino，L.A.和Han，G.Y.，<有機化學(xué)>J.Org.Chem.，373404(1972)；及Gauspohl，H.等人，<合成>Synthesis，5315(1992)中作了描述。這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。
含有肽序列的化合物環(huán)化的方法在如Lobl等人，WO92/00995中作了描述，其內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。環(huán)化的化合物可通過，用當(dāng)其他側(cè)鏈保護(hù)基保持完整時可選擇性移去的基團(tuán)，保護(hù)要用在環(huán)閉合的兩個氨基酸的側(cè)鏈來制備。選擇性去保護(hù)作用，通過使用直交側(cè)鏈保護(hù)基如烯丙基(OAI)(如谷氨酸或天冬氨酸側(cè)鏈的羰基基團(tuán))，烯丙氧基羰基(Aloc)(如賴氨酸或鳥氨酸側(cè)鏈的氮)或乙酰氨基甲基(Acm)(如半胱氨酸的巰基)保護(hù)基可很好地實施。OAI和Aloc可用Pd°輕易地移去，Acm可用碘處理輕易移去。
下面的實例是用于說明本發(fā)明的，它們不在任何方面對本發(fā)明有任何限制。
實例1-HJ肽的制備本發(fā)明的新型化合物可采用Applied Biosystems的430A肽合成器，使用F-Moc技術(shù)依據(jù)制造商方案合成。制備肽的其他適用方法對此領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。參閱如，Merrifield，P.B.，《科學(xué)》，232341(1986)；Carpino，L.A.，Han，G.Y，<有機化學(xué)>(J.Org.Chem.)，373404(1972)；Gauspohl，H.，等人，《合成》(Synthesis)，5315(1992)，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。
使用Rink酰胺樹脂[4(2’，4’二甲氧基苯基-FMOC氨基甲基)苯氧基樹脂]來合成C-酰胺化的肽。用FMOC基團(tuán)保護(hù)氨基酸的α-氨基基團(tuán)，用弱堿，N-甲基吡咯烷酮的20％哌啶(NMP)在每個環(huán)的開始處移去FMOC基團(tuán)。去除保護(hù)基后，將樹脂用NMP沖洗移去哌啶。使用溶解在HOBt(1-羥基苯并三唑)和DMF(二甲基甲酰胺)中的HBTU(2(1-苯并三唑基-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲陽離子)，用FASTMOC化學(xué)(FASTMOC Chemistry)實施氨基酸衍生物的原位激活。加入NMP將氨基酸溶解在這種溶液中。加入DIEA(二異丙基乙基胺)啟動激活作用。另外，采用DCC(二環(huán)己基碳化二亞胺)和HOBt的激活法以形成HOBt活性酯。在NMP中實施偶聯(lián)。接著使用0.75g晶體苯酚；0.25ml EDT(1，2-乙二硫醇)；0.5ml(苯硫基甲烷)；0.5ml的去離子水；10ml TFA，進(jìn)行N-端(選擇地)乙酰基化作用，肽從樹脂中的TFA(三氟乙酸)解離過程，和加側(cè)鏈保護(hù)基。實例2-Raf和Polo的HJ肽衍生物調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞體外擴增用Gospodorowicz等人，《美國國家科學(xué)研究學(xué)報》，1976年(Proc.Narl.Acad.Sci.734120(1976))中公開的工藝獲取牛動脈細(xì)胞(本文稱為“A19細(xì)胞”)。用Arbiser等人，《美國國家科學(xué)研究學(xué)報》，1976年(Proc.Narl.Acad.Sci.94861(1997))中公開的工藝獲取鼠MS1和SVR細(xì)胞，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。
將96孔的平底組織培養(yǎng)微滴板，在馬上要平鋪細(xì)胞之前，預(yù)鋪上凝膠(Difco)，即在玻片雙蒸餾水(DDW)中加入0.100ml/孔的新鮮過濾的1％凝膠。在37℃將培養(yǎng)皿溫育約1小時，然后用吸去多余的溶液。
培養(yǎng)介質(zhì)由DMEM，青霉素/鏈霉素/谷酰胺(青霉素-100U/ml；鏈霉素-100μg/ml；谷酰胺-2mM)和10％不含內(nèi)毒素的牛胎血清制備。測試的細(xì)胞類25×103個細(xì)胞/ml的懸浮液，在上述培養(yǎng)介質(zhì)中制備，并以0.160ml/孔分布(約4000個內(nèi)皮細(xì)胞/孔)。
用含有0.1％BSA的磷酸緩沖鹽水(PBS)，在100％DMSO中稀釋10mM HJ肽溶液制備一組HJ肽原種溶液。將每個原種溶液中HJ肽的濃度調(diào)節(jié)到測試混合物中HJ肽所需濃度的九倍。
細(xì)胞平鋪約2小時后，將0.020ml的每種HJ肽原種溶液加入到相應(yīng)的孔中，每種濃度進(jìn)行六份復(fù)制。此外，沒有加入HJ肽的BSA溶液用作對照物。在10％CO2濕潤溫育箱內(nèi)37℃溫育72-80小時。
將板標(biāo)記，棄除介質(zhì)。然后每塊板用PBS(0.200ml/孔)沖洗一次。將孔用100％乙醇沖洗(0.200ml/孔)。將乙醇移去，完全干燥這些孔。另外，對孔用4％甲醛PBS(費舍爾應(yīng)用科學(xué)(Fisher Scientific)；分類號(Catalog No).HC200-1的PBS緩沖的10％福爾馬林液)(0.12ml/孔)處理至少30分鐘。用甲醛處理加強了與乙醇對比的O.D.。
用硼酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.5)沖洗各孔。在各孔中加入新鮮過濾的1％亞甲基藍(lán)溶液(0.600ml/孔)，并在室溫溫育10分鐘。將各孔用自來水沖洗五次，之后將各孔徹底干燥。加入0.1N的HCl(0.200ml/孔)析去顏色。析去過夜后，在630nm讀取O.D.確定每個孔的細(xì)胞數(shù)量。計數(shù)細(xì)胞的工藝在Oliver等人，的<細(xì)胞學(xué)>J.Of Cell Sci.，(1989)中非常詳細(xì)的描述了，其內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。
一些不同種HJ肽的結(jié)果在表中列出。
表
*在該濃度觀察到了對細(xì)胞擴增的顯著抑制。
從表中的結(jié)果可用看出，Raf和Polo的HJ肽衍生物抑制牛動脈細(xì)胞和轉(zhuǎn)換的鼠細(xì)胞組MS1和SVR的細(xì)胞擴增。實例3-活化素/TGFbR K048H101(SEQ ID NO.24)的HJ肽衍生物抑制胚胎肺纖維原細(xì)胞膠原質(zhì)的生成將胚胎肺纖維原細(xì)胞懸浮在含有0.5％FCS的DMEM中，以每孔50,000個細(xì)胞(45μl/孔)的密度接種在96孔平底組織培養(yǎng)板中。在45μl熱活化的含TGFβD的條件介質(zhì)(從MCF-7細(xì)胞中收集)中，在沒有或有增加濃度的測試肽(0-10μM在10μlPBS+0.1％BAS+1％DMSO)存在的情況下，溫育細(xì)胞48小時。總體積為每孔100μl?？扇苣z原質(zhì)在溫育的最后階段，移去上清液，并以50μl/孔的等分試樣平鋪在新的組織培養(yǎng)板中。在濕潤環(huán)境中37℃將板溫育24小時，使得膠原質(zhì)粘著，然后在37℃干燥24小時。干燥的板用蒸餾水沖洗3次，每孔200μl，每次沖洗1分鐘，在每孔中，用100μl在飽和的苦味酸中的(w/v)0.1％直接紅80染色，室溫下約1小時。多余的染料用10mM HCl沖洗五次，每孔200μl，每次沖洗10秒。膠原質(zhì)結(jié)合染料用0.1M氫氧化鈉洗脫，每孔200μl，在540nm讀取。細(xì)胞計數(shù)移去上清液后，室溫下細(xì)胞用每孔200μl緩沖福爾馬林液處理1小時，然后用每孔200μl的0.1M硼酸鹽緩沖液沖洗，處理過的細(xì)胞用每孔50μl的1％亞甲基藍(lán)染色。多余的染料用自來水沖洗。細(xì)胞結(jié)合的染料用200μl的0.1M的HCl洗脫，在595nm讀取。膠原質(zhì)按照相對每個細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。
K048H101(SEQ ID NO.24)的結(jié)果在圖5中顯示。如從圖5中可看到的，在K048H101濃度低至1μM時，仍然出現(xiàn)對膠原質(zhì)生成的幾乎完全的抑制。在0.6μM的K048H101中，出現(xiàn)約80％的抑制。
抑制膠原質(zhì)形成可用于抑制疤痕形成，如在整形手術(shù)中，和抑制粘連產(chǎn)生，一種腹部手術(shù)的主要并發(fā)癥。實例4-整聯(lián)蛋白-連接的激酶(ILK)K107H101(SEQ ID NO.47)的HJ肽導(dǎo)致B16黑素瘤細(xì)胞形態(tài)改變當(dāng)在有K107H101時進(jìn)行溫育，可觀察到B16黑素瘤細(xì)胞形態(tài)的改變，K107H101是從絲氨酸/蘇氨酸激酶的HJ環(huán)衍生的，名為整聯(lián)蛋白-連接的激酶(ILK)的肽。如在Wu C.等人，<生物化學(xué)>(J.Bio.Chem.)273528-536(1998)中所述的，ILK和腫瘤形成有關(guān)。因此，ILK衍生的肽可能用作抗腫瘤藥劑。Wu等人，文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過在此引述而合并于本文。等同物使用不超過常規(guī)的試驗，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認(rèn)出或能確定本文所述發(fā)明的具體實施的許多等同物。這樣的等同物都包含在下面權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種含有絲氨酸/蘇氨酸激酶HJ環(huán)的肽衍生物的肽，其中(a)所說的肽有約五個到約二十個之間的氨基酸或氨基酸類似物；(b)所說的肽調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中的肽是環(huán)狀的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中的肽是線性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中的肽的N-端和C-端是未取代的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中的N-端或C-端中的至少一個是被取代的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽，其中的N-端是酰胺化的，C-端是?；?。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中的肽衍生物含有與所說的絲氨酸/蘇氨酸激酶的所說的HJ環(huán)的氨基酸序列的任何亞序列相對應(yīng)的氨基酸序列，附帶條件是肽衍生物序列中的任何一個氨基酸可變化，為任何氨基酸或其類似物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中的絲氨酸/蘇氨酸激酶是從下列家族基團(tuán)中選取的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員Polo，Raf，分裂素活性蛋白質(zhì)激酶(MAP激酶)和G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體激酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中的絲氨酸/蘇氨酸激酶是從下列基團(tuán)中選取的蛋白質(zhì)激酶C，環(huán)狀A(yù)MP依賴激酶，調(diào)鈣素依賴激酶，環(huán)狀GMP依賴蛋白質(zhì)激酶，Akt/PKB和GSK3。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肽，其中絲氨酸/蘇氨酸激酶是Polo家族的成員，是從含有Plk，Snk，和Sak的組中選取的。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肽，其中絲氨酸/蘇氨酸激酶是Raf家族的成員，是從含有Raf-1，A-Raf，和B-Raf的組中選取的。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肽，其中絲氨酸/蘇氨酸激酶是G蛋白質(zhì)依賴激酶，是從含有β2-腎上腺素受體激酶，視網(wǎng)膜紫質(zhì)激酶和GRK4-6的組中選取的。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中肽衍生物含有與所說的HJ環(huán)的氨基酸序列的任何亞序列相對應(yīng)的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中肽含有序列HJ-38(SEQID NO.13)，J-41(SEQ ID NO.14)，J-42(SEQ ID NO.15)，J-43(SEQ ID NO.16)，J-43.1(SEQ ID NO.17)，J-45(SEQ ID NO.18)，J-46(SEQ ID NO.19)，J-47(SEQ ID NO.20)，J-48(SEQ ID NO.21)，J-29(SEQ ID NO.22)。
15.一種肽，其含有序列HJ-38(SEQ ID NO.13)，J-41(SEQID NO.14)，J-42(SEQ ID NO.15)，J-43(SEQ ID NO.16)，J-43.1(SEQ ID NO.17)，J-45(SEQ ID NO.18)，J-46(SEQ ID NO.19)，J-47(SEQ ID NO.20)，J-48(SEQ ID NO.21)，J-29(SEQ ID NO.22)，附帶條件是肽中的任何一個氨基酸殘基可變化，為任何自然產(chǎn)生的氨基酸或其類似物。
16.一種肽，其含有AA1到AA20的氨基酸序列，或含有其包括至少五個氨基酸的亞序列，其中AA1是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的組中選取的；AA2是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA3是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA4是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA5是從含有丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸的組中選取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是從含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA8是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA9是脯氨酸；AA10是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA11是從含有丙氨酸，絲氨酸，和蘇氨酸的組中選取的；AA12是從含有組氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA13是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA14是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA15是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA16是從含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-環(huán)精氨酸，γ-羥基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸的組中選取的；AA17是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA18是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA19是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，和纈氨酸的組中選取的；AA20是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，和纈氨酸的組中選取的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)Raf的HJ環(huán)序列(SEQ ID NO.1)或其亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的兩個氨基酸可變化。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)Raf的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.1)或亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的任何一個氨基酸可變化。
19.根據(jù)權(quán)利要求18或20所述的肽，其中的肽包括序列AA1到AA20的一個八個氨基酸的亞序列，其中亞序列從含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的組中選取。
20.一種包括有AA1到AA20的氨基酸序列其至少五個氨基酸的亞序列的肽，其中AA1是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的組中選取的；AA2是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA3是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA4是丙氨酸或甘氨酸；AA5是從含有丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA6是甘氨酸和丙氨酸；AA7是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA8是脯氨酸；AA9是脯氨酸；AA10是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA11是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA12是甘氨酸，丙氨酸；AA13是從含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA14是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA15是脯氨酸；AA16是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸，的組中選取的；AA17是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA18是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，和纈氨酸的組中選取的；AA19是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的組中選取的；AA20是從含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)環(huán)狀A(yù)MP相關(guān)激酶的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.2)或其亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的兩個氨基酸可變化。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)的環(huán)狀A(yù)MP相關(guān)激酶HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.2)或亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的任何一個氨基酸可變化。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一個八個氨基酸的亞序列，其中亞序列從含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的組中選取。
24.一種肽，其含有AA1到AA20的氨基酸序列，或含有其至少五個氨基酸的亞序列，其中AA1是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的組中選取的；AA2是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA3是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA4是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA5是從含有半胱氨酸，丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA6是甘氨酸和丙氨酸；AA7是從含有組氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA8是從含有脯氨酸，丙氨酸，絲氨酸的組中選取的；AA9是脯氨酸；AA10是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA11是從含有組氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA12是甘氨酸或丙氨酸；AA13是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA14是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA15是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA16是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA17是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA18是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，和纈氨酸的組中選取的；AA19是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的組中選取的；AA20是從含有谷氨酸，組氨酸，和谷氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)蛋白質(zhì)激酶C的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.3)或其亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的兩個氨基酸可變化。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)蛋白質(zhì)激酶C的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.3)或亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的任何一個氨基酸可變化。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一個八個氨基酸的亞序列，其中亞序列從含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的組中選取。
28.一種肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列，或包括其至少五個氨基酸的亞序列，其中AA1是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的組中選取的；AA2是賴氨酸或鳥氨酸；AA3是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA4是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA5是從含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-環(huán)精氨酸，γ-羥基精氨酸，脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸的組中選取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是組氨酸；AA8是絲氨酸或蘇氨酸；AA9是脯氨酸；AA10是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA11是從含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-環(huán)精氨酸，γ-羥基精氨酸，脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸的組中選取的；AA12是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA13是組氨酸；AA14是賴氨酸或鳥氨酸；AA15是絲氨酸或蘇氨酸；AA16是賴氨酸或鳥氨酸；AA17是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA18是賴氨酸或鳥氨酸；AA19是組氨酸；AA20是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)bARK1.2的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.4)或其亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的兩個氨基酸可變化。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)bARK1.2的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.4)或亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的任何一個氨基酸可變化。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一個八個氨基酸的亞序列，其中亞序列從含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的組中選取。
32.一種肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列或其含有至少五個氨基酸的亞序列，其中AA1是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的組中選取的；AA2是從含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA3是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA4是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA5是從含有半胱氨酸，絲氨酸，和蘇氨酸的組中選取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是從含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-環(huán)精氨酸，γ-羥基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸的組中選取的；AA8是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA9是脯氨酸；AA10是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA11是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA12是谷氨酰胺，天冬酰胺；AA13是谷氨酰胺，天冬酰胺；AA14是從含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA15是從含有；賴氨酸，鳥氨酸和組氨酸的組中選取的；AA16是從含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA17是從含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-環(huán)精氨酸，γ-羥基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸，賴氨酸，鳥氨酸的組中選取的；AA18是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，和纈氨酸的組中選取的；AA19是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的組中選取的；AA20是從含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)Akt/PKB的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.7)或其亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的兩個氨基酸可變化。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)Akt/PKB的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.7)或亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的任何一個氨基酸可變化。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一個八個氨基酸的亞序列，其中亞序列從含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的組中選取。
36.一種肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列或其至少五個氨基酸的亞序列，其中AA1是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的組中選取的；AA2是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA3是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA4是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA5是從含有谷氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的組中選取的；AA8是脯氨酸；AA9是脯氨酸；AA10是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA11是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA12是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA13是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA14是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA15是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA16是組氨酸；AA17是從含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-環(huán)精氨酸，γ-羥基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸，賴氨酸，鳥氨酸的組中選取的；AA18是從含有賴氨酸，鳥氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，和纈氨酸的組中選取的；AA19是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的組中選取的；AA20是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)調(diào)鈣素相關(guān)激酶的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.5)或其亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的兩個氨基酸可變化。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)調(diào)鈣素相關(guān)激酶的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.5)或亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的任何一個氨基酸可變化。
39.權(quán)利要求37或38所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一個八個氨基酸的亞序列，其中亞序列從含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的組中選取。
40.一種肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列或其至少五個氨基酸的亞序列，其中AA1是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的組中選取的；AA2是從含有絲氨酸和蘇氨酸的組中選取的；AA3是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA4是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA5是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是從含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-環(huán)精氨酸，γ-羥基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸，賴氨酸，鳥氨酸的組中選取的；AA8是脯氨酸；AA9是脯氨酸；AA10是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的組中選取的；AA11是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA12是絲氨酸或蘇氨酸；AA13是絲氨酸或蘇氨酸；AA14是從含有半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸的組中選取的；AA15是從含有；亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的；AA16是賴氨酸或鳥氨酸；AA17是從含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯的組中選取的；AA18是絲氨酸或蘇氨酸；AA19是從含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的組中選取的；AA20是從含有亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，纈氨酸的組中選取的。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)polo的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.6)或其亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的兩個氨基酸可變化。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)polo的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.6)或亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的任何一個氨基酸可變化。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一個八個氨基酸的亞序列，其中亞序列從含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的組中選取。
44.一種肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列或其至少五個氨基酸的亞序列，其中AA1是丙氨酸或甘氨酸；AA2是谷氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯；AA3是亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，或纈氨酸；AA4是亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，或纈氨酸；AA5是亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，或纈氨酸；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是谷氨酰胺，天冬酰胺；AA8是脯氨酸；AA9是亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，或纈氨酸；AA10是酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸；AA11是脯氨酸；AA12是甘氨酸或丙氨酸；AA13是谷氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯；A14是絲氨酸或蘇氨酸；AA15是甘氨酸或丙氨酸；AA16是亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，或纈氨酸；AA17是谷氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，芐基，取代的芐基，芳族或取代的芳族的酯；AA18是谷氨酰胺，天冬酰胺；AA19是亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，或纈氨酸；AA20是亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，或纈氨酸。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)GSK3的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.12)或其亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的兩個氨基酸可變化。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亞序列對應(yīng)GSK3的HJ環(huán)的序列(SEQ ID NO.12)或亞序列，附帶條件是序列AA1到AA20或其亞序列中的任何一個氨基酸可變化。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一個八個氨基酸的亞序列，其中亞序列從含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的組中選取。
48.一種確定調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的肽的方法，該方法包括步驟(a)提供肽，指“測試肽”，該肽包括所說的絲氨酸/蘇氨酸激酶的HJ環(huán)的肽衍生物，并含有從約五個到約二十個氨基酸或其類似物；(b)在適合測試絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的條件下，將測試肽與含有由絲氨酸/蘇氨酸激酶控制的一個或多個細(xì)胞活性的細(xì)胞一起溫育；(c)測定絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其中和沒有與測試肽一起溫育的生長細(xì)胞相比，大些或小些的活性表示，肽調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中絲氨酸/蘇氨酸激酶活性是通過測量組織培養(yǎng)物中所說的細(xì)胞的存活率或擴增狀況測定的。
50.一種在受試者中調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的方法，該方法包括服用治療上有效量的含有絲氨酸/蘇氨酸激酶HJ環(huán)的肽衍生物的肽，其中(a)所說的肽有約五個到約二十個氨基酸或其類似物；(b)所說的肽調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。
全文摘要
公開的肽是絲氨酸/蘇氨酸激酶HJ環(huán)的肽衍生物。這種肽可調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。還公開了通過服用本發(fā)明的一種肽,調(diào)節(jié)受試者絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的方法。
文檔編號A61P25/00GK1257538SQ98805328
公開日2000年6月21日 申請日期1998年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月21日
發(fā)明者施姆爾·本－賽森 申請人:兒童醫(yī)療中心有限公司, 耶路撒冷希伯來大學(xué)依蘇姆研究發(fā)展公司