專(zhuān)利名稱(chēng)：肝細(xì)胞癌的預(yù)防及治療的制作方法
與相關(guān)申請(qǐng)的前后對(duì)照本申請(qǐng)是共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)60/038,375的部分繼續(xù)申請(qǐng)，后者題為“用于預(yù)防及治療肝細(xì)胞癌的方法和組合物”并于1997年2月13日提出申請(qǐng)。
發(fā)明本底原發(fā)性肝癌是全世界癌癥死亡的主要原因之一。肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌的最常見(jiàn)類(lèi)型，每年約發(fā)生120萬(wàn)例。在世界上某些地區(qū)，如東南亞和南非，肝細(xì)胞癌是惡性腫瘤中最常見(jiàn)的類(lèi)型之一。在這些地區(qū)，這類(lèi)疾病的高頻出現(xiàn)似乎與肝炎的高發(fā)生率有關(guān)。
對(duì)肝細(xì)胞癌的可愈性療法目前限于非轉(zhuǎn)移性疾病的個(gè)體，包括外科手術(shù)切除腫瘤并進(jìn)行或不進(jìn)行肝移植。然而，即使是手術(shù)切除和移植也不能治愈大多數(shù)腫瘤，因?yàn)榍谐g(shù)后又有復(fù)發(fā)。直到今天，治療中的化療方法一直很不見(jiàn)效。過(guò)去二十多年來(lái)對(duì)肝細(xì)胞癌的治療未取得任何有意義的進(jìn)展。
故，仍需要尋求一種針對(duì)肝細(xì)胞癌的有效治療方法。這種治療方法最好應(yīng)適用于這種病的發(fā)生率很高的不發(fā)達(dá)國(guó)家。而且，這種治療方法應(yīng)適用于具有不可手術(shù)切除的腫瘤及患有轉(zhuǎn)移性疾病的患者。
發(fā)明簡(jiǎn)述依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了可用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物(包括人)體內(nèi)的諸如肝細(xì)胞癌這樣的癌癥的方法，這種方法所含步驟包括在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)甲胎蛋白分子的至少一部分氨基酸序列的免疫應(yīng)答。
產(chǎn)生免疫應(yīng)答之步驟可包括給予哺乳動(dòng)物至少一種組合物，其中含有的一種肽包含甲胎蛋白的至少部分氨基酸序列；或給予至少一種組合物，其中含有的一種肽包含甲胎蛋白的至少部分氨基酸序列并有至少一個(gè)氨基酸被替代。產(chǎn)生免疫應(yīng)答之步驟亦可包括給予哺乳動(dòng)物至少一種組合物，其中包含甲胎蛋白分子的至少部分cDNA序列。更進(jìn)一步，產(chǎn)生免疫應(yīng)答之步驟可包括給予哺乳動(dòng)物至少一種組合物，其中含有轉(zhuǎn)導(dǎo)了可表達(dá)甲胎蛋白cDNA的某種重組載體的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于免疫接種人體以預(yù)防或治療癌癥的一種組合物。該組合物中含有選自下述成員的一種肽AFP5、AFP7、AFP13、AFP14、AFP18、AFP22、AFP23、AFP28、AFP38、AFP39、AFP45、AFP49、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
發(fā)明圖示參照以下描述、所附權(quán)利要求書(shū)及附圖，將能更好地理解本發(fā)明的諸多特點(diǎn)、各個(gè)方面及優(yōu)勢(shì)

圖1是顯示用人AFP49肽產(chǎn)生的CTL細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞毒性的條形圖；圖2示針對(duì)肽靶和AFP靶檢測(cè)的CTL標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放試驗(yàn)所得特異性裂解率對(duì)靶細(xì)胞之條形圖，其中CTL由來(lái)自一位正常的HLA A2.1供體、經(jīng)肽刺激的PBMC產(chǎn)生；圖3為用BWIC3-一種mAFP陽(yáng)性的鼠腫瘤細(xì)胞系-對(duì)經(jīng)鼠AFPcDNA免疫接種過(guò)的小鼠(圖中以空心盒表示)及未免疫的小鼠(圖中以實(shí)心方形表示)進(jìn)行腫瘤激發(fā)后，平均腫瘤大小對(duì)激發(fā)后天數(shù)的曲線(xiàn)；圖4為用EL4(親代)-一種不產(chǎn)生mAFP的鼠腫瘤細(xì)胞系-對(duì)經(jīng)鼠AFP cDNA免疫接種過(guò)的小鼠(空心盒)及未免疫的小鼠(實(shí)心圓)進(jìn)行腫瘤激發(fā)后，平均腫瘤大小對(duì)激發(fā)后天數(shù)的曲線(xiàn)；圖5為用EL4(AFP)-一種能產(chǎn)生mAFP的鼠腫瘤細(xì)胞系-對(duì)經(jīng)鼠AFP cDNA免疫接種過(guò)的小鼠(空心盒)及未免疫的小鼠(實(shí)心圓)進(jìn)行腫瘤激發(fā)后，平均腫瘤大小對(duì)激發(fā)后天數(shù)的曲線(xiàn)；圖6為用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有AFP表達(dá)載體的FSA C3H本底纖維肉瘤細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有僅表達(dá)neo之載體的FSA C3H本底纖維肉瘤細(xì)胞平均腫瘤直徑對(duì)對(duì)免疫接種了小鼠AFP-AdV穿梭載體帶neo表達(dá)質(zhì)粒的質(zhì)粒DNA(實(shí)心圓，較低實(shí)心方形，實(shí)心菱形)的小鼠，和未經(jīng)免疫的小鼠(較高實(shí)心方形，實(shí)心倒三角形)進(jìn)行腫瘤攻擊后，平均腫瘤直徑對(duì)激發(fā)后天數(shù)的曲線(xiàn)；圖7為用BWIC3腫瘤對(duì)經(jīng)能合成小鼠AFP基因的質(zhì)粒載體免疫接種過(guò)的小鼠(實(shí)心圓)和未免疫接種過(guò)的小鼠(實(shí)心方形)進(jìn)行腫瘤激發(fā)后，平均腫瘤直徑對(duì)激發(fā)后天數(shù)的曲線(xiàn)；圖8為用BWIC3腫瘤對(duì)經(jīng)能合成小鼠AFP基因的質(zhì)粒載體免疫接種過(guò)的小鼠(實(shí)心三角，實(shí)心菱形，實(shí)心倒三角)和未免疫接種過(guò)的小鼠(實(shí)心圓和實(shí)心方形)進(jìn)行腫瘤激發(fā)后，平均腫瘤直徑對(duì)激發(fā)后天數(shù)的曲線(xiàn)；圖9為分離自以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)導(dǎo)了AdVmAFP的鼠DC的mRNA的RT-PCR分析結(jié)果(圖中第4-7道)與分離自不同對(duì)照的mRNA(圖中第2，3，8，9道)的比較；圖10為用EL4(AFP)-一種產(chǎn)生mAFP的鼠腫瘤細(xì)胞系-對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)有AdVmAFP之樹(shù)突細(xì)胞免疫接種過(guò)的小鼠(實(shí)心方形)，經(jīng)各種對(duì)照物免疫接種過(guò)的小鼠(朝上的實(shí)心三角及實(shí)心倒三角)及未免疫的小鼠(實(shí)心圓)進(jìn)行腫瘤激發(fā)后，平均腫瘤大小對(duì)激發(fā)后天數(shù)的曲線(xiàn)；圖11為用BWIC3-一種能產(chǎn)生mAFP的鼠腫瘤細(xì)胞系-對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)有AdVmAFP之樹(shù)突細(xì)胞免疫接種過(guò)的小鼠(實(shí)心方形)及未免疫的小鼠(實(shí)心圓)進(jìn)行腫瘤激發(fā)后，平均腫瘤大小對(duì)激發(fā)后天數(shù)的曲線(xiàn)。
發(fā)明詳述依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物(如人)的癌癥(包括肝細(xì)胞癌)的方法，其中所述癌癥在其表面上帶有甲胎蛋白分子的至少部分，所述方法為在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)甲胎蛋白分子至少部分的免疫應(yīng)答。該方法涉及對(duì)有癌哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫接種或基因操作以產(chǎn)生針對(duì)癌細(xì)胞表面上的甲胎蛋白分子至少部分的免疫應(yīng)答。然后，使該受感染哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)破壞帶有該表面標(biāo)志的癌癥細(xì)胞，從而預(yù)防臨床型癌癥或治療已有癌癥。
大多數(shù)人類(lèi)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞合成人甲胎蛋白(hAFP)，這是一種609個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO1)，這種蛋白質(zhì)正常情況下由胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生，至出生時(shí)停止產(chǎn)生。肝細(xì)胞癌的細(xì)胞傾向于在其表面顯示甲胎蛋白分子的至少部分。肝細(xì)胞癌中甲胎蛋白的存在已被用作篩查和診斷的標(biāo)志物。
由于甲胎蛋白正常情況下存在于免疫系統(tǒng)發(fā)育階段，很自然會(huì)有假設(shè)認(rèn)為免疫系統(tǒng)不會(huì)保留對(duì)該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答能力。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即可促使哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)將甲胎蛋白作為一種外源蛋白質(zhì)進(jìn)行應(yīng)答，并將表面帶有甲胎蛋白至少一部分的細(xì)胞作為外源細(xì)胞與之發(fā)生反應(yīng)。故這種免疫應(yīng)答的產(chǎn)生可通過(guò)引起哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)損壞肝細(xì)胞癌的細(xì)胞而用于預(yù)防肝細(xì)胞癌和治療該疾病。
如本文所公開(kāi)，免疫接種甲胎蛋白可經(jīng)以下各種方式完成免疫接種含甲胎蛋白序列至少部分的合成肽，包括基于甲胎蛋白序列的至少部分，但有替代或其他改變的合成肽；免疫接種甲胎蛋白cDNA序列的至少部分，從而產(chǎn)生甲胎蛋白分子的至少部分并被呈遞給適當(dāng)?shù)拿庖呦到y(tǒng)細(xì)胞；將基因工程化的抗原呈遞細(xì)胞導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)；及應(yīng)用基因治療性病毒載體使甲胎蛋白分子的至少部分被表達(dá)。這種免疫接種的目的是活化甲胎蛋白肽特異性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)抗攜有這些表面標(biāo)志物的細(xì)胞的免疫應(yīng)答，較優(yōu)選活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞以破壞肝細(xì)胞癌的細(xì)胞。
1)測(cè)定和生產(chǎn)可在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的人甲胎蛋白肽為測(cè)定是否人甲胎蛋白分子的任一部分均能在人體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，檢驗(yàn)了衍生自人甲胎蛋白(hAFP)全分子(SEQ ID NO1)的一系列肽，以測(cè)定它們作為I類(lèi)限制性肽能否產(chǎn)生抗腫瘤應(yīng)答及能否作為細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的目標(biāo)分子。根據(jù)它們是否能與HLAA2.1 I類(lèi)結(jié)合溝相匹配來(lái)選擇hAFP中可能有免疫原性的肽。之所以選擇HLA A2.1(世界衛(wèi)生組織亞型命名法中的HLA A 0201)，是因?yàn)樗前追N人中最常見(jiàn)的等位基因，也在其它人種中廣泛分布。測(cè)定過(guò)程如下首先，根據(jù)已公布的共有序列鑒定來(lái)自hAFP(SEQ ID NO1)中有可能結(jié)合HLA A2.1的肽序列。HLA A2.1被確信可結(jié)合8至10個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽，但較優(yōu)選九聚體肽。異亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸被認(rèn)為是肽中2號(hào)位置的重要錨定殘基，而異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸被認(rèn)為是肽中9或10號(hào)位(取決于肽長(zhǎng)度)的重要錨定殘基。
利用威斯康辛大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)研究小組程序“find pattern”篩選hAFP序列(SEQ ID NO1)，并鑒定出含有2個(gè)強(qiáng)結(jié)合“錨定”殘基(一個(gè)在第2位，另一個(gè)相應(yīng)在九肽或十肽的9位或10位)的九肽和十肽(命名為“強(qiáng)”肽)；只有一個(gè)強(qiáng)結(jié)合錨定殘基的肽(名為“中間”肽)；或無(wú)強(qiáng)結(jié)合錨定殘基，但有其他陽(yáng)性結(jié)合殘基的肽(名為“弱”肽)，以檢測(cè)出相配于HLA A2.1 I類(lèi)結(jié)合基序的適當(dāng)肽序列。排除掉含有不止一個(gè)被認(rèn)為能消除結(jié)合作用的殘基的肽序列。
篩選研究鑒別出共72段肽序列能配于HLA A2.1 I類(lèi)結(jié)合基序，但其中6段在進(jìn)一步考查中被排除，因?yàn)樗鼈兏叨仁杷?，難以合成。所剩66段肽序列用Chiron Mimetopes(Victoria，Australia)按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)合成以備檢驗(yàn)。它們包括10段“強(qiáng)”肽序列，43段“中間”肽序列和13段“弱”肽序列?，F(xiàn)參見(jiàn)表1，從右至左分別顯示66個(gè)肽序列中每一個(gè)的肽命名號(hào)，該肽序列代表的hAFP序列(SEQID NO1)的殘基，肽所含氨基酸。肽命名號(hào)根據(jù)Chiron中收取的肽順序而定，故與hAFP分子(SEQ ID NO1)氨基酸序列的順序無(wú)關(guān)。
表I 人AFP肽序列
表I(續(xù)) 人AFP肽序列
下一步，在T2細(xì)胞穩(wěn)定化試驗(yàn)中檢驗(yàn)66段肽的每一段以濃度依賴(lài)方式結(jié)合HLA A2.1、并因此穩(wěn)固HLA A2.1的能力，步驟如下。將每段肽與缺失TAP1和TAP2的T2細(xì)胞溫育過(guò)夜，這類(lèi)T2細(xì)胞已在前一夜于室溫溫育以增加細(xì)胞表面MHC I類(lèi)分子的表達(dá)。檢測(cè)每個(gè)肽在從0.1μM至100μM的肽濃度范圍內(nèi)結(jié)合HLA A2.1分子的能力。在T2細(xì)胞系中，只有填滿(mǎn)8至10肽的MHC分子能穩(wěn)定在細(xì)胞表面。以抗HLA A2抗體BB7.2(ATCC)和山羊抗小鼠FITC對(duì)T2細(xì)胞染色，再用流式細(xì)胞儀分析HLA A2.1的穩(wěn)定性。作為陽(yáng)性結(jié)合對(duì)照，所用為FLU基質(zhì)肽(FLU基質(zhì)1蛋白的第58-66位殘基，GILGFVFTL)和MART-1肽(MART-1的第27-35位殘基，AAGIGILTV，完整蛋白的GenBank錄入號(hào)為U06452)。FLU基質(zhì)肽一貫?zāi)茉?.5μM的濃度下將A2.1分子穩(wěn)固在T2細(xì)胞表面。
現(xiàn)參見(jiàn)表II，其中列有66段hAFP肽中的22段。第1列為肽命名號(hào)，第2列表示該肽序列代表的hAFP序列(SEQ ID NO1)中的殘基，第3列表示該序列中錨定殘基數(shù)。
表II的第4列是結(jié)合T2細(xì)胞表面之HLA 2.1所需的最小肽濃度。正如所見(jiàn)，10段“強(qiáng)”肽序列中的6段，43段“中間”肽序列中的7段顯示能結(jié)合HLA 2.1。而13段“弱”肽序列無(wú)一顯示可結(jié)合HLA A2.1。
更進(jìn)一步，還在EBV類(lèi)淋巴母細(xì)胞解離動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)中，隨時(shí)間檢測(cè)66段肽之每一段與I類(lèi)分子解離的速率，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)，結(jié)合I類(lèi)分子的肽的解離動(dòng)力學(xué)，即解離速率，可較明顯預(yù)示該肽的免疫原性。例如，象病毒肽HPV 16 E7，EBV LMP2，F(xiàn)LU M1和HIV pol等這類(lèi)非自我結(jié)合肽，已發(fā)現(xiàn)顯示有最慢解離動(dòng)力學(xué)的最強(qiáng)結(jié)合肽具有最高的免疫原性。還發(fā)現(xiàn)一些已知的自身蛋白質(zhì)，來(lái)自gp100、MART-1這類(lèi)黑色素瘤抗原的免疫原性表位，有1個(gè)錨定殘基，經(jīng)可溶性I類(lèi)重建試驗(yàn)測(cè)得結(jié)合親和力不太穩(wěn)定，但有非常慢的解離動(dòng)力學(xué)。見(jiàn)，如，Bakker，A.B.，等，具有改善的MHC I類(lèi)結(jié)合能力的CTL表位類(lèi)似物可誘導(dǎo)能識(shí)別野生型表位的抗黑色素瘤CTL。國(guó)際癌癥雜志，1997年70卷第3期302至309頁(yè)；又見(jiàn)Van der Burg，S.H.，等，自身抗原衍生的表位對(duì)MHC I類(lèi)抗原能否顯示低親和力？(信件)今日免疫學(xué)，1997.1892)97至98頁(yè)；兩篇文獻(xiàn)均全文引入作為參考。
表II 人AFP肽序列及結(jié)合特點(diǎn)
EBV類(lèi)淋巴母細(xì)胞解離動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)按Van der Burg，S.H.，等，結(jié)合MHC I類(lèi)分子的肽的免疫原性取決于MHC-肽復(fù)合物的穩(wěn)定性。免疫學(xué)雜志，1996年156卷第9期3308至3314頁(yè)所公開(kāi)的進(jìn)行，在此將其全文引入作為參考。簡(jiǎn)而言之，在能使MHC分子不穩(wěn)定的pH3.2酸性溫和緩沖液中使HLA A2.1 EBV類(lèi)淋巴母細(xì)胞剝脫其表面I類(lèi)肽和β2微球蛋白。在β2微球蛋白的存在下，每段肽被迅速以200μM過(guò)量脈沖加到剝脫后細(xì)胞上1小時(shí)。然后洗去剩余未結(jié)合肽，并將細(xì)胞于37℃溫育0，2，4，6個(gè)小時(shí)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)均洗細(xì)胞并用BB7.2抗體染色HLA A2。如果細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度比剝脫后未加肽脈沖標(biāo)記的細(xì)胞強(qiáng)至少1.5倍，就認(rèn)為肽-I類(lèi)分子復(fù)合物是穩(wěn)定的。
T2細(xì)胞穩(wěn)定性試驗(yàn)和EBV類(lèi)淋巴母細(xì)胞解離動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)均對(duì)每段肽做了至少兩次。仍參見(jiàn)表II，第5列顯示肽在EBV類(lèi)淋巴母細(xì)胞上穩(wěn)定的時(shí)間。正如所見(jiàn)，只有強(qiáng)肽中的3段(AFP5，AFP14和AFP22)、43段中間肽中的12段(包括AFP49)和弱肽中的1段顯示水平較慢的解離動(dòng)力學(xué)。綜合考慮T2細(xì)胞穩(wěn)定性試驗(yàn)和EBV類(lèi)淋巴母細(xì)胞解離動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，可見(jiàn)有7段肽序列在兩個(gè)試驗(yàn)中均有最好結(jié)果，它們是AFP5、AFP7、AFP13、AFP14、AFP28、AFP38和AFP45。
接著利用表III第1列所列的肽在體外產(chǎn)生肽特異性CTL，方法按Plebanski，M.等，人外周血中肽特異性初級(jí)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。歐洲免疫學(xué)雜志，1995年25卷第6期1783至1787頁(yè)所公開(kāi)的進(jìn)行，并檢驗(yàn)CTL裂解A2.1陽(yáng)性、AFP陽(yáng)性肝細(xì)胞癌細(xì)胞的能力。裂解試驗(yàn)可以說(shuō)明肽是人AFP的某種天然加工的、有免疫原性的表位，是潛在的靶抗原。按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，用BB7.2(HLAA2)抗體(ATCC)對(duì)HLA A2.1供體及細(xì)胞系進(jìn)行篩選，并經(jīng)PCR和UCLA組織定型實(shí)驗(yàn)室的直接序列分析進(jìn)一步確證和定亞型。簡(jiǎn)而言之，針對(duì)表III AFP肽中所列各肽產(chǎn)生肽特異性CTL，方法如下來(lái)自某正常A2.1供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)2×107用Ficoll梯度純化。于1ml無(wú)血清的培養(yǎng)基中用50μg/ml肽脈沖處理這些PBMC，37℃90分鐘。然后清洗細(xì)胞一次，再當(dāng)天置于24孔板中，每孔3×106個(gè)PBMC(于1.5ml含10％自身血清的RPMI培養(yǎng)基中)，并加入溶于RPMI/10％自身血清的IL-7(10ng/ml)和KLH(4.5μg/ml)。每周通過(guò)取出未吸附細(xì)胞，按PBMC對(duì)CTL 1∶1的比例將它們加入新鮮的、經(jīng)肽脈沖過(guò)、洗凈并照射過(guò)的PBMC中，從而對(duì)CTL進(jìn)行重新刺激。每周加10單位/ml IL-2兩次。
表III 人AFP肽的細(xì)胞毒性
培養(yǎng)3周后，在標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)31Cr釋放試驗(yàn)中檢驗(yàn)推定由hAFP肽刺激生成的CTL的細(xì)胞毒性。還檢驗(yàn)其對(duì)經(jīng)用來(lái)生成該CTL的特異性hAFP肽脈沖過(guò)的T2細(xì)胞的肽特異性殺傷作用，并與經(jīng)作為對(duì)照的FLU基質(zhì)肽或MART-1肽脈沖過(guò)的T2細(xì)胞的殺傷進(jìn)行比較。用NK敏感性靶K562評(píng)估非特異性NK殺傷作用。還檢驗(yàn)CTL對(duì)HLA A2.1陽(yáng)性、AFP陽(yáng)性的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2的殺傷作用。
現(xiàn)參見(jiàn)表III，顯示來(lái)自正常供體、用于產(chǎn)生CTL、得出陽(yáng)性肽細(xì)胞毒性結(jié)果的12段AFP肽的細(xì)胞性毒檢驗(yàn)結(jié)果。第2列顯示大批量淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物的CD4/CD8表型。第3和4列分別顯示對(duì)經(jīng)肽脈沖過(guò)的T2細(xì)胞和對(duì)HepG2靶的細(xì)胞毒性水平及其效應(yīng)物(CTL)對(duì)靶細(xì)胞的比率(E∶T)。
如表III所見(jiàn)，證實(shí)肽AFP22、AFP39、AFP45和AFP49可高水平地特異性殺傷AFP+、HLA A2.1+的HepG2細(xì)胞。還可注意到AFP22和AFP49有一個(gè)四氨基酸重疊，即hAFP(SE ID NO1)的547-550位殘基。且AFP22與AFP23有兩個(gè)氨基酸(即SEQ ID NO1的555-556位殘基)重疊，后者顯示或多或少的HepG2殺傷作用。
再次檢驗(yàn)用AFP49產(chǎn)生的CTL，其仍保持對(duì)HepG2的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步，用另兩位正常HLA A2.1供體制備新的AFP49肽產(chǎn)生的CTL培養(yǎng)物。用其它靶細(xì)胞來(lái)確證用AFP49所觀(guān)察到的細(xì)胞毒性作用是AFP抗原特異性的及I類(lèi)限制性的。
現(xiàn)參見(jiàn)圖1，示有這些檢驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。首先，為確證所觀(guān)察到的細(xì)胞毒性是I類(lèi)限制的，用抗β2微球蛋白抗體封閉了HepG2細(xì)胞上CTL與T細(xì)胞受體的相互作用。這導(dǎo)致HepG2的裂解顯著減少。接著，為消除非特異性NK/LAK殺傷作用，加入了40倍過(guò)量的未標(biāo)記(冷)K562細(xì)胞。這并未導(dǎo)致HepG2裂解的顯著減少。更進(jìn)一步，HepG2細(xì)胞與γIFN(50單位/ml)溫育過(guò)夜上調(diào)了其表面MHC I類(lèi)的表達(dá)。正如所見(jiàn)，MHC I類(lèi)表達(dá)的上調(diào)增加了HepG2的裂解。此外也利用一種AFP+、HLA A2.1陰性的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Hep3B，即一種I類(lèi)錯(cuò)配的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系作為靶細(xì)胞。AFP49 CTL以很低水平裂解這些Hep3B。所觀(guān)察到的這種小量Hep3B裂解現(xiàn)象在加入過(guò)量的冷K562細(xì)胞后即可消除，而特異性殺傷HepG2的現(xiàn)象在加入冷K562細(xì)胞后仍然保持著。
現(xiàn)參見(jiàn)圖2，顯示有CTL的標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放試驗(yàn)中特異性裂解率對(duì)靶細(xì)胞的條形圖，其中CTL是經(jīng)肽脈沖來(lái)自正常HLA A2.1供體的PBMC生成的，已測(cè)試過(guò)肽靶和AFP靶。為確證CTL的肽特異性，每一培養(yǎng)物均對(duì)經(jīng)生成CTL培養(yǎng)物的特異性肽脈沖過(guò)的T2細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)(圖上最左邊的各帶)，并與經(jīng)不同HLA A2.1結(jié)合肽(作為對(duì)照)脈沖過(guò)的T2細(xì)胞的檢驗(yàn)(從左數(shù)第2組的各帶)進(jìn)行比較。正如所見(jiàn)，AFP49肽培養(yǎng)物、AFP49 V9肽培養(yǎng)物、AFP5肽培養(yǎng)物和對(duì)照FLU基質(zhì)肽培養(yǎng)物均顯示肽特異性，對(duì)經(jīng)特異性肽脈沖過(guò)的T2細(xì)胞能夠裂解，但不裂解經(jīng)其他肽脈沖過(guò)的T2細(xì)胞。
再參見(jiàn)圖2，測(cè)試這些肽特異性CTL培養(yǎng)物中的每一種對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)了AdVhAFP或?qū)φ誂dVRR5的M202(HLA A2.1+/AFP-)黑色素瘤細(xì)胞的殺傷。兩種AFP肽-AFP5和AFP49，以及在AFP49的第9位替換了一個(gè)氨基酸的AFP49L9〔SEQ ID NO2；GVALQTMKL〕及AFP49V9〔SEQ ID NO3；GVALQTMKV〕，這些肽的肽特異性CTL培養(yǎng)物均顯示出對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)了AdVhAFP的M202細(xì)胞比對(duì)RR5對(duì)照轉(zhuǎn)導(dǎo)的M202細(xì)胞的殺傷作用更顯著。FLU肽特異性CTL培養(yǎng)物對(duì)M202/AdVhAFP和M202/RR5都能殺傷，有相似的本底水平細(xì)胞毒作用。
已知M202細(xì)胞能正確加工并呈遞HLA A2.1限制性的、免疫顯性MART-1肽。故它們是轉(zhuǎn)導(dǎo)AdVhAFP的理想細(xì)胞系，預(yù)期來(lái)自AFP的正確HLA A2.1限制性表位將被加工并呈遞在其表面。因此，這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明AFP5、AFP49、AFP49L9(SEQ ID NO2)及AFP49V9(SEQ ID NO3)是天然加工并呈遞的肽，可用來(lái)引導(dǎo)CTL殺傷AFP陽(yáng)性腫瘤。而且，正如所見(jiàn)，AFP49L9(SEQ ID NO2)和AFP49V9(SEQ ID NO3)的肽特異性CTL培養(yǎng)物比AFP49的肽特異性CTL培養(yǎng)物能更有效地殺傷M202/AdVhAFP，故AFP49L9(SEQID NO2)和AFP49V9(SEQ ID NO3)均為引導(dǎo)對(duì)AFP陽(yáng)性細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的改良肽。
因此，根據(jù)此公開(kāi)內(nèi)容可以體會(huì)到，本發(fā)明包括預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物(含人)體內(nèi)的癌癥，其中癌癥細(xì)胞攜有甲胎蛋白分子的至少部分作為表面標(biāo)志物。該預(yù)防或治療是通過(guò)給予該哺乳動(dòng)物一種含肽組合物而達(dá)到的，所述肽包含甲胎蛋白分子的至少一部分，或是甲胎蛋白分子的至少部分通過(guò)取代或其他變化而產(chǎn)生的。這些肽包括AFP5、AFP7、AFP13、AFP14、AFP18、AFP22、AFP23、AFP28、AFP38、AFP39、AFP45、AFP49、AFP49L9(SEQ ID NO2)和AFP49V9(SEQ ID NO3)。
2)用甲胎蛋白cDNA免疫接種哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生針對(duì)表面上攜有甲胎蛋白的細(xì)胞(包括肝細(xì)胞癌的細(xì)胞)的免疫應(yīng)答用甲胎蛋白cDNA免疫接種哺乳動(dòng)物可產(chǎn)生免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答可部分或徹底地保護(hù)機(jī)體對(duì)抗表面攜有甲胎蛋白的腫瘤細(xì)胞(包括肝細(xì)胞癌的細(xì)胞)的攻擊。這一效應(yīng)可按如下證實(shí)按如下步驟生成人甲胎蛋白cDNA首先，用PCR技術(shù)從Hep3B細(xì)胞(ATCC提供)所得總RNA制備人甲胎蛋白cDNA，其中總RNA是用Trizol法(Life Technologies，Gaithersburg，MD，按廠(chǎng)家建議)和RNAZolB法(TelTest，F(xiàn)rlendswood，TX)制得的。利用約1μg總RNA，采用Perkin Elmer RT-PCR盒和根據(jù)以公布序列設(shè)計(jì)的AFP特異性引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。5′引物是5′GCA ACC ATG AAGTGG GT。3′引物是5′AAC TCC CAA AGC AGC ACG AGT。這些引物包括了全長(zhǎng)編碼區(qū)(ATG至終止密碼子)，并在引物中引入了一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)XbaI，且終止于6個(gè)堿基(CTC TCT)，以促進(jìn)PCR之后的酶解切割。引物序列由Operon Technologies合成，為50nM規(guī)模，未純化。
在瓊脂糖凝膠上分析上述制得的人甲胎蛋白PCR cDNA產(chǎn)物以檢查其大小。大小正確的產(chǎn)物在Qiagen PCR快速凈化柱上純化，用XbaI酶消化(其酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物中)，再按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，在克隆反應(yīng)中將其克隆進(jìn)pRcCMV(對(duì)人)或pCR3.1(用于鼠)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。經(jīng)小量制備分析識(shí)別陽(yáng)性質(zhì)粒。大量制備這些陽(yáng)性質(zhì)粒，用UCLA的DNA測(cè)序核心設(shè)備。對(duì)其中的一等份進(jìn)行測(cè)序，以確證插入片段的序列正確。序列數(shù)據(jù)只是一條鏈的，證實(shí)了AFP插入片段的一致性。因此，克隆到的人AFP cDNA等同于已公布的人AFP序列(GenBanK錄入號(hào)J00077，J00076，V01514，SEQ ID NO1的48至1877位堿基)。
采用上文用于克隆人AFP cDNA的公開(kāi)方法的相應(yīng)方法，但使用的是小鼠特異性引物，克隆鼠AFP cDNA(mAFP cDNA)。5′鼠特異性引物是5′GCC ATG AAG TGG ATC ACA。3′鼠特異性引物是TTA AAC GCC CAA AGC ATC A。用于分離總RNA的小鼠AFP陽(yáng)性細(xì)胞系為Hepa16。本文所公開(kāi)的所有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子和肌肉內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)均用含信號(hào)序列的cDNA克隆得到或進(jìn)行。小鼠的這一序列為EmblV00743(SEQ ID NO4)的42至1859位堿基。
接著，將mAFP cDNA放入真核表達(dá)載體VR1012(Vical，Inc.，SanDiego，CA)中。該VR1012表達(dá)載體包含強(qiáng)組成型CMV立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，內(nèi)有一個(gè)可增強(qiáng)表達(dá)的內(nèi)含子，一個(gè)BGH終止子和用于體內(nèi)表達(dá)的poly A序列。
給C57BL/6小鼠肌肉內(nèi)注射含mAFP cDNA的VR1012 100μg或鹽水對(duì)照，3周內(nèi)每周1次。末次注射一周后，用4×106個(gè)活BWIC3肝細(xì)胞癌細(xì)胞攻擊經(jīng)VR1012 mAFP cDNA免疫接種的小鼠及未免疫接種的對(duì)照組小鼠，所述癌細(xì)胞來(lái)自同系小鼠體內(nèi)進(jìn)行性生長(zhǎng)的腫瘤制成的單細(xì)胞懸液。BWIC3是一種mAFP陽(yáng)性鼠細(xì)胞系。
現(xiàn)參見(jiàn)圖3，可見(jiàn)經(jīng)免疫接種的動(dòng)物(空心盒)相比于對(duì)照組動(dòng)物(實(shí)心方形)顯示了腫瘤生長(zhǎng)延遲或完全的保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)重復(fù)多次出現(xiàn)。在一相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，肌內(nèi)注射可表達(dá)MART-1黑色素瘤抗原的質(zhì)粒載體未能保護(hù)動(dòng)物抵抗BWIC3肝細(xì)胞癌細(xì)胞的攻擊(數(shù)據(jù)未顯示)。
另一組實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)用mAFP cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EL4(H-2b)淋巴瘤構(gòu)建了一株代用性的鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞系。這個(gè)EL4(mAFP)腫瘤細(xì)胞系具有與親代EL4細(xì)胞系相同的體內(nèi)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)EL4(mAFP)腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的AFP水平只有BWIC3肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的1％或更少。
給C57BL/6小鼠肌內(nèi)注射含mAFP cDNA的VR1012 100μg或注射鹽水作對(duì)照，一周一次，共三周。末次注射一周后，用7×105個(gè)活EL4(親代)或EL4(mAFP)細(xì)胞攻擊經(jīng)VR1012 mAFP cDNA免疫接種的小鼠和未經(jīng)免疫接種的對(duì)照組小鼠。
現(xiàn)參見(jiàn)圖4，可以看到，當(dāng)用EL4(親代)細(xì)胞攻擊時(shí)，經(jīng)免疫接種的動(dòng)物(空心盒)及對(duì)照動(dòng)物(實(shí)心圓)顯示無(wú)差別(p＝0.07，斯氏T檢驗(yàn))。但正如圖5所見(jiàn)，接受EL4(mAFP)細(xì)胞攻擊時(shí)，經(jīng)免疫接種的動(dòng)物(空心盒)與對(duì)照動(dòng)物(實(shí)心圓)相比確實(shí)顯示有部分保護(hù)作用(P＝0.07，斯氏T檢驗(yàn))。這些發(fā)現(xiàn)亦重復(fù)出現(xiàn)多次。
另一系列實(shí)驗(yàn)中，用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了的小鼠纖維肉瘤細(xì)胞系作替代，證實(shí)對(duì)表面攜有甲胎蛋白的細(xì)胞的攻擊有保護(hù)作用。首先，用DOTAP脂轉(zhuǎn)染法(Boehringer Mannheim)按廠(chǎng)家建議、或用CaPO4沉淀法(按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法)制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠纖維肉瘤細(xì)胞系。簡(jiǎn)短說(shuō)，DOTAP脂轉(zhuǎn)染法在一個(gè)6孔板中每孔使用1×105個(gè)細(xì)胞，提前一晚吸附過(guò)夜。將2.5μg質(zhì)粒(鼠AFP pCR3.1)混入于25μl的20mM Hepes中，將15μl脂質(zhì)混入于50μl Hepes中，室溫混15分鐘。將之加入1ml培養(yǎng)基(RPMI 1640，內(nèi)含10％胎牛血清及抗生素)稀釋?zhuān)偌尤肟字械募?xì)胞上。4至6小時(shí)后，用2ml新鮮培養(yǎng)基取代溶液。48至72小時(shí)后，用G418(遺傳霉素)@500μg/ml(總濃度，75％活性)開(kāi)始選擇。選擇2至3周后，用RT-PCR檢驗(yàn)每一個(gè)可能的轉(zhuǎn)染子表達(dá)小鼠AFP RNA、neo-RNA的情況，并用鼠APRT基因表達(dá)情況進(jìn)行半定量。
如下證實(shí)AFP免疫接種在抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)腫瘤產(chǎn)生方面的效力。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備小鼠AFP-pCR3.1質(zhì)粒和小鼠AFP AdV穿梭載體質(zhì)粒(pLpA CMV)，并構(gòu)建小鼠AFP-Vical載體VR1012。用上述的mAFP PCR3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼠纖維肉瘤細(xì)胞系FSA、NFSA、MCAK和SVEC。
給C3H小鼠每周肌內(nèi)注射質(zhì)粒DNA進(jìn)行免疫接種，共三周，所述質(zhì)粒DNA是利用Qiagen質(zhì)粒制備試劑盒制備成無(wú)內(nèi)毒素的小鼠AFP-AdV穿梭載體帶neo的表達(dá)質(zhì)粒(50μg質(zhì)粒溶于50μl PBS中)。然后用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有表達(dá)AFP的載體的FSA C3H本底纖維肉瘤、或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了只表達(dá)neo的載體自身的FSA C3H本底纖維肉瘤細(xì)胞攻擊C3H小鼠，以測(cè)定是否產(chǎn)生了AFP抗自身抗原應(yīng)答，或應(yīng)用表達(dá)新霉素的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子是否會(huì)產(chǎn)生能掩蓋AFP應(yīng)答的抗neo(非自身抗原)應(yīng)答。腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)傳代，利用單細(xì)胞懸液進(jìn)行腫瘤攻擊。
現(xiàn)參見(jiàn)圖6，可見(jiàn)至腫瘤攻擊后第18天，以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有AFP表達(dá)載體的FSA C3H本底纖維肉瘤細(xì)胞攻擊的免疫接種CH3小鼠中只有1只(圖中較下部的實(shí)心方形)顯示有一點(diǎn)腫瘤生長(zhǎng)(一個(gè)3mm×3mm大小的腫瘤)，其余4只同樣處理的CH3小鼠(實(shí)心圓)并未有任何腫瘤生長(zhǎng)的跡象。與之相比，5只以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有AFP表達(dá)載體的FSAC3H本底纖維肉瘤細(xì)胞攻擊的未免疫接種C3H小鼠中有2只(圖中上部的實(shí)心方形)顯示有一點(diǎn)腫瘤生長(zhǎng)(平均6.8mm2)。FSA親代腫瘤細(xì)胞和neo載體-FSA細(xì)胞在免疫接種的CH3小鼠(實(shí)心菱形)和未免疫接種的CH3小鼠(實(shí)心倒三角)中的生長(zhǎng)相似。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)步驟獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)。
用來(lái)自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor Maine)的C57L/J(“不活潑”)小鼠進(jìn)行第二個(gè)實(shí)驗(yàn)。給這些小鼠免疫接種來(lái)自Vical(VR1012)的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體中不含新霉素，故只合成小鼠AFP基因。用一種同系鼠腫瘤細(xì)胞系，即來(lái)自ATCC的BWIC3，攻擊C57L/J小鼠。這些BWIC3細(xì)胞合成的小鼠AFP水平遠(yuǎn)高于上文所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的鼠纖維肉瘤細(xì)胞所合成的水平。
照上文所述用mAFP-Vical載體免疫接種C57L/J小鼠，然后于皮下對(duì)每只小鼠用1×106個(gè)BWIC3細(xì)胞進(jìn)行腫瘤攻擊?，F(xiàn)參見(jiàn)圖7，可以看到，腫瘤攻擊后第14天，未免疫接種的C57L/J小鼠(實(shí)心方形)生成的腫瘤比免疫接種過(guò)的C57L/J小鼠(實(shí)心圓)內(nèi)的腫瘤平均大兩倍。
第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用只合成小鼠AFP基因的質(zhì)粒載體(VR1012)免疫接種另一批C57L/J小鼠，再如上述用1×106個(gè)BWIC3細(xì)胞攻擊?，F(xiàn)參見(jiàn)圖8，可以看到，攻擊后第17天，所有五只未免疫接種的小鼠(實(shí)心圓和實(shí)心方形)均有腫瘤，平均腫瘤直徑為11.4mm2。與之相比，經(jīng)mAFP-Vical免疫接種的5只小鼠中有3只(實(shí)心三角)的腫瘤平均直徑為9mm2，1只(實(shí)心菱形)有一個(gè)3mm2的小腫瘤，1只(實(shí)心倒三角)未顯示有腫瘤。
因此，正如可從本公開(kāi)內(nèi)容領(lǐng)會(huì)的那樣，本發(fā)明包括對(duì)哺乳動(dòng)物(含人)體內(nèi)的癌癥進(jìn)行預(yù)防或治療，其中癌癥細(xì)胞攜有甲胎蛋白的至少部分作為表面標(biāo)志物。預(yù)防或治療是通過(guò)給該哺乳動(dòng)物施用一種含甲胎蛋白cDNA至少一部分的組合物，以產(chǎn)生針對(duì)甲胎蛋白分子至少部分的免疫應(yīng)答而達(dá)到的。
3)用基因工程化的樹(shù)突細(xì)胞免疫接種哺乳動(dòng)物，以針對(duì)表面有甲胎蛋白的細(xì)胞，包括肝細(xì)胞癌細(xì)胞。
用轉(zhuǎn)導(dǎo)了可表達(dá)鼠AFP甲胎蛋白cDNA的重組腺病毒載體(AdVmAFP)的樹(shù)突細(xì)胞免疫接種哺乳動(dòng)物，產(chǎn)生了一種可部分或徹底地保護(hù)動(dòng)物抵抗肝細(xì)胞癌細(xì)胞攻擊的免疫應(yīng)答。這一效應(yīng)可證實(shí)如下首先，按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建表達(dá)鼠AFP的重組腺病毒載體(AdVmAFP)。見(jiàn)如，Ribas，A.，L.H.Butterfield，W.H.McBride，S.M.Jilani，L.A.Bui，C.M.Vollmer，R.Lau，V.B.Dissette，B.Hu，A.Y.Chen，J.A.Glaspy和J.S.Economou，1997年。用重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠樹(shù)突細(xì)胞基因性免疫接種黑色素瘤抗原MART-1/Melan-A。癌癥研究57卷2865頁(yè)；Toloza，E.M.，K.Hunt，S.Swisher，W.McBride，R.Lau，S.Pang.K.Rhoades，T.Drake，A.Belldegrum，J.Glaspy，和J.S.Economou 1996年。用重組白介素2腺病毒載體進(jìn)行體內(nèi)癌癥的基因治療。癌癥基因治療3卷1l頁(yè)，本文將其全文引入作為參考。然后，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，從經(jīng)GM-CSF和IL-4作用分化7天的C57BL/6骨髓產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞。見(jiàn)如，Ribas，A.，L.H.Butterfield，W.H.McBride，S.M.Jilani，L.A.Bui，C.M.Vollmer，R.Lau，V.B.Dissette，B.Hu，A.Y.Chen，J.A.Glaspy和J.S.Economou，1997年。用重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠樹(shù)突細(xì)胞基因性免疫接種黑色素瘤抗原MART-1/Melan-A。癌癥研究57卷2865頁(yè)；Inaba，K.，M.Inaba，N.Romani，H.Aya，M.Deguchi，S.Ikehara，S.Muramatsu，和R.M.Steinman，1992年。從加有粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子的小鼠骨髓培養(yǎng)物中產(chǎn)生大量樹(shù)突細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志176卷1693頁(yè)，將其全文引入作為參考。
現(xiàn)參見(jiàn)圖9，顯示分離自以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)導(dǎo)了AdVmAFP的鼠樹(shù)突細(xì)胞(DC)的mRNA的RT-PCR分析。從左至右讀，第1道示凝膠大小標(biāo)準(zhǔn)品；第2道示作為陰性對(duì)照的mAFP陰性細(xì)胞的結(jié)果；第3道示用作陰性對(duì)照的鼠樹(shù)突細(xì)胞的結(jié)果；第4至7道示分別以10、100、1000和5000的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)了AdVmAFP的鼠樹(shù)突細(xì)胞的結(jié)果；第8道示用作陽(yáng)性對(duì)照的BWIC3細(xì)胞的結(jié)果(最靠頂?shù)木€(xiàn)約1.9kb)；第9示雙蒸水(DDW)的結(jié)果，作為無(wú)模板的對(duì)照檢測(cè)PCR污染問(wèn)題。正如所見(jiàn)，表達(dá)鼠AFP的重組腺病毒載體(AdVmAFP)成功地轉(zhuǎn)導(dǎo)了樹(shù)突細(xì)胞。
隨后，準(zhǔn)備3組C57BL/6小鼠，每組5只，每周靜脈內(nèi)注射一次以100的MOI分別轉(zhuǎn)染有AdVmAFP或RR5(E1缺失的空腺病毒)的5×105個(gè)樹(shù)突細(xì)胞，或未轉(zhuǎn)染的樹(shù)突細(xì)胞，其二周。這三組小鼠及另一組未經(jīng)注射而充當(dāng)對(duì)照的小鼠在末次注射一周后用7.5×105個(gè)EL4(AFP)攻擊。結(jié)果示于圖10。正如所見(jiàn)，注射RRS的小鼠(朝上的實(shí)心三角)或注射未處理樹(shù)突細(xì)胞的小鼠(實(shí)心倒三角)，及對(duì)照小鼠(實(shí)心圓)均未顯示有對(duì)抗腫瘤攻擊的保護(hù)作用。與之相比，注射了以MOI 100轉(zhuǎn)染有AdVmAFP的樹(shù)突細(xì)胞5×105個(gè)的小鼠(實(shí)心方形)顯示有針對(duì)腫瘤攻擊的部分保護(hù)作用。
更進(jìn)一步，準(zhǔn)備另一組5只小鼠，2周內(nèi)每周靜脈內(nèi)注射一次以MOI 100轉(zhuǎn)染有AdVmAFP的樹(shù)突細(xì)胞5×105個(gè)。末次注射轉(zhuǎn)導(dǎo)了的樹(shù)突細(xì)胞一周后，用4×106個(gè)BWIC3腫瘤細(xì)胞攻擊該組小鼠，將產(chǎn)生的應(yīng)答與另一組未注射的類(lèi)似對(duì)照小鼠比較。該檢測(cè)結(jié)果示于圖11。正如所見(jiàn)，免疫接種小鼠(實(shí)心方形)顯示針對(duì)腫瘤攻擊的保護(hù)作用比對(duì)照小鼠(實(shí)心圓)更顯著，證實(shí)用轉(zhuǎn)導(dǎo)了的樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行治療比較有效。
因此，正如根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容可以領(lǐng)會(huì)的那樣，本發(fā)明包括對(duì)哺乳動(dòng)物(含人)體內(nèi)的癌癥進(jìn)行預(yù)防或治療，其中的癌癥細(xì)胞攜有甲胎蛋白分子的至少部分作為表面標(biāo)志物。這種預(yù)防或治療是通過(guò)給該哺乳動(dòng)物施用一種含免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞)的組合物完成的，其中所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)了能表達(dá)甲胎蛋白cDNA的重組載體。
實(shí)施例1對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)肝細(xì)胞癌的治療依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種通過(guò)在人體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)甲胎蛋白分子至少部分的免疫應(yīng)答而治療人體內(nèi)肝細(xì)胞癌的方法。該方法包括用本文所公布方法之一的相似方法或相關(guān)方法免疫接種此人，或?qū)Υ巳诉M(jìn)行基因操作，以產(chǎn)生針對(duì)甲胎蛋白的免疫應(yīng)答。在一個(gè)較優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)此肝細(xì)胞癌病人進(jìn)行免疫接種，以產(chǎn)生針對(duì)甲胎蛋白分子至少部分(如針對(duì)AFP5、AFP7、AFP13、AFP14、AFP18、AFP22、AFP23、AFP28、AFP38、AFP39、AFP45或AFP49)的免疫應(yīng)答。該免疫接種導(dǎo)致此人的免疫系統(tǒng)攻擊表面具有甲胎蛋白分子相應(yīng)部分的肝細(xì)胞癌細(xì)胞。
盡管參照某些較優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了十分詳盡的討論，但其它實(shí)施方案也可能是可行的。故所附權(quán)利要求書(shū)的精神和范圍應(yīng)不限于在此所包含的對(duì)較優(yōu)選實(shí)施方案的描述。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Economou，James S.，Butterfield，Lisa H.(ii)發(fā)明題目肝細(xì)胞癌的預(yù)防及治療(iii)序列數(shù)4(iv)通訊地址(A)地址Sheldan & Mak(B)街名225 S.Lake Avenue，9th.Floor(C)城市Pasadena(D)州名加利福尼亞(E)郵編91101(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型3.5寸軟盤(pán)，1.44兆內(nèi)存(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容型(C)操作系統(tǒng)Windows 95(D)軟件Windows 8.0版的Word Perfect(Vi)現(xiàn)有申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)柎颂幧暾?qǐng)(B)申請(qǐng)日1998年2月13日(C)分類(lèi)待分配(Vii)代理人代理機(jī)構(gòu)資料(A)姓名Farah，David A.
(B)登記號(hào)38,134(C)參考/文檔號(hào)11969-1PCT(iX)電信資料(A)電話(huà)(626)796-4000(B)電傳(626)795-6321(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度2032個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)序列描述SEQ ID NO1TCCATATTGT GCTTCCACCA CTGCCAATAA CAAAATAACT AGCAACC ATG AAG TGG 56Met Lys Trp1GTG GAA TCA ATT TTT TTA ATT TTC CTA CTA AAT TTT ACT GAA TCC AGA 104Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr Glu Ser Arg5 10 15ACA CTG CAT AGA AAT GAA TAT GGA ATA GCT TCC ATA TTG GAT TCT TAC 152Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr20 25 30 35CAA TGT ACT GCA GAG ATA AGT TTA GCT GAC CTG GCT ACC ATA TTT TTT 200Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe40 45 50GCC CAG TTT GTT CAA GAA GCC ACT TAC AAG GAA GTA AGC AAA ATG GTG 248Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val55 60 65AAA GAT GCA TTG ACT GCA ATT GAG AAA CCC ACT GGA GAT GAA CAG TCT 296Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser70 75 80TCA GGG TGT TTA GAA AAC CAG CTA CCT GCC TTT CTG GAA GAA CTT TGC 344Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys85 90 95CAT GAG AAA GAA ATT TTG GAG AAG TAC GGA CAT TCA GAC TGC TGC AGC 392His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser100 105 110 115CAA AGT GAA GAG GGA AGA CAT AAC TGT TTT CTT GCA CAC AAA AAG CCC 440Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro120 125 130ACT CCA GCA TCG ATC CCA CTT TTC CAA GTT CCA GAA CCT GTC ACA AGC 488Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser135 140 145TGT GAA GCA TAT GAA GAA GAC AGG GAG ACA TTC ATG AAC AAA TTC ATT 536Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe Ile150 155 160TAT GAG ATA GCA AGA AGG CAT CCC TTC CTG TAT GCA CCT ACA ATT CTT 584Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu165 170 175CTT TGG GCT GCT CGC TAT GAC AAA ATA ATT CCA TCT TGC TGC AAA GCT 632Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala180 185 190 195GAA AAT GCA GTT GAA TGC TTC CAA ACA AAG GCA GCA ACA GTT ACA AAA 680Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys200 205 210GAA TTA AGA GAA AGC AGC TTG TTA AAT CAA CAT GCA TGT GCA GTA ATG 728Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met215 220 225AAA AAT TTT GGG ACC CGA ACT TTC CAA GCC ATA ACT GTT ACT AAA CTG 776Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu230 235 240AGT CAG AAG TTT ACC AAA GTT AAT TTT ACT GAA ATC CAG AAA CTA GTC 824Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val245 250 255CTG GAT GTG GCC CAT GTA CAT GAG CAC TGT TGC AGA GGA GAT GTG CTG 872Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu260 265 270 275GAT TGT CTG CAG GAT GGG GAA AAA ATC ATG TCC TAC ATA TGT TCT CAA 920Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln280 285 290CAA GAC ACT CTG TCA AAC AAA ATA ACA GAA TGC TGC AAA CTG ACC ACG 968Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr295 300 305CTG GAA CGT GGT CAA TGT ATA ATT CAT GCA GAA AAT GAT GAA AAA CCT 1016Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro310 315 320GAA GGT CTA TCT CCA AAT CTA AAC AGG TTT TTA GGA GAT AGA GAT TTT 1064Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe325 330 335AAC CAA TTT TCT TCA GGG GAA AAA AAT ATC TTC TTG GCA AGT TTT GTT 1112Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val340 345 350 355CAT GAA TAT TCA AGA AGA CAT CCT CAG CTT GCT GTC TCA GTA ATT CTA 1160His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu360 365 370AGA GTT GCT AAA GGA TAC CAG GAG TTA TTG GAG AAG TGT TTC CAG ACT 1208Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr375 380 385GAA AAC CCT CTT GAA TGC CAA GAT AAA GGA GAA GAA GAA TTA GAG AAA 1256Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys390 395 400TAC ATC CAG GAG AGC CAA GCA TTG GCA AAG CGA AGC TGC GGC CTC TTC 1304Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe405 410 415CAG AAA CTA GGA GAA TAT TAC TTA CAA AAT GCG TTT CTC GTT GCT TAC 1352Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr420 425 430 435ACA AAG AAA GCC CCC CAG CTG ACC TCG TCG GAG CTG ATG GCC ATC ACC 1400Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr440 445 450AGA AAA ATG GCA GCC ACA GCA GCC ACT TGT TGC CAA CTC AGT GAG GAC 1448Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp455 460 465AAA CTA TTG GCC TGT GGC GAG GGA GCG GCT GAC ATT ATT ATC GGA CAC 1496Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His470 475 480TTA TGT ATC AGA CAT GAA ATG ACT CCA GTA AAC CCT GGT GTT GGC CAG 1544Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln485 490 495TGC TGC ACT TCT TCA TAT GCC AAC AGG AGG CCA TGC TTC AGC AGC TTG 1592Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu500 505 510 515GTG GTG GAT GAA ACA TAT GTC CCT CCT GCA TTC TCT GAT GAC AAG TTC 1640Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe520 525 530ATT TTC CAT AAG GAT CTG TGC CAA GCT CAG GGT GTA GCG CTG CAA ACG 1688Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr535 540 545ATG AAG CAA GAG TTT CTC ATT AAC CTT GTG AAG CAA AAG CCA CAA ATA 1736Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile550 555 560ACA GAG GAA CAA CTT GAG GCT GTC ATT GCA GAT TTC TCA GGC CTG TTG 1784Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu565 570 575GAG AAA TGC TGC CAA GGC CAG GAA CAG GAA GTC TGC TTT GCT GAA GAG 1832Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu580 585 590 595GGA CAA AAA CTG ATT TCA AAA ACT CGT GCT GCT TTG GGA GTT TAAATTA 1881Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val600 605CTTCAGGGGA AGAGAAGACA AAACGAGTCT TTCATTCGGT GTGAACTTTT CTCTTTAATT 1941TTAACTGATT TAACACTTTT TGTGAATTAA TGAAATGATA AAGACTTTTA TGTGAGATTT 2001CCTTATCACA GAAATAAAAT ATCTCCAAAT G 2032(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸殘基(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型肽(ix)序列描述SEQ ID NO2Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Leu1 5(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸殘基(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型肽(ix)序列描述SEQ ID NO3Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Val1 5(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2009個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)序列描述SEQ ID NO4TCCCACTTCC AGCACTGCCT GCGGTGAAGG AACAAGCAGC CATGAAGTGG ATCACACCCG 60CTTCCCTCAT CCTCCTGCTA CATTTCGCTG CGTCCAAAGC ATTGCACGAA AATGAGTTTG 120GGATAGCTTC CACGTTAGAT TCCTCCCAGT GCGTGACGGA GAAGAATGTG CTTAGCATAG 180CTACCATCAC CTTTACCCAG TTTGTTCCGG AAGCCACCGA GGAGGAAGTG AACAAAATGA 240CTAGCGATGT GTTGGCTGCA ATGAAGAAAA ACTCTGGCGA TGGGTGTTTA GAAAGCCAGC 300TATCTGTGTT TCTGGATGAA ATTTGCCATG AGACGGAACT CTCTAACAAG TATGGACTCT 360CAGGCTGCTG CAGCCAAAGT GGAGTGGAAA GACATCAGTG TCTGCTGGCA CGCAAGAAGA 420CTGCTCCGGC CTCTGTCCCA CCCTTCCAGT TTCCAGAACC TGCCGAGAGT TGCAAAGCAC 480ATGAAGAAAA CAGGGCAGTG TTCATGAACA GGTTCATCTA TGAAGTGTCA AGGAGGAACC 540CCTTCATGTA TGCCCCAGCC ATTCTGTCCT TGGCTGCTCA GTACGACAAG GTCGTTCTGG 600CATGCTGCAA AGCTGACAAC AAGGAGGAGT GCTTCCAGAC AAAGAGAGCA TCCATTGCAA 660AGGAATTAAG AGAAGGAAGC ATGTTAAATG AGCATGTATG TTCAGTGATA AGAAAATTTG 720GATCCCGAAA CCTCCAGGCA ACAACCATTA TTAAGCTAAG TCAAAAGTTA ACTGAAGCAA 780ATTTTACTGA GATTCAGAAG CTGGCCCTGG ATGTGGCTCA CATCCACGAG GAGTGTTGCC 840AAGGAAACTC GCTGGAGTGT CTGCAGGATG GGGAAAAAGT CATGACATAT ATATGTTCTC 900AACAAAATAT TCTGTCAAGC AAAATAGCAG AGTGCTGCAA ATTACCCATG ATCCAACTAG 960GCTTCTGCAT AATTCACGCA GAGAATGGCG TCAAACCTGA AGGCTTATCT CTAAATCCAA1020GCCAGTTTTT GGGAGACAGA AATTTTGCCC AATTTTCTTC AGAGGAAAAA ATCATGTTCA1080TGGCAAGCTT TCTTCATGAA TACTCAAGAA CTCACCCCAA CCTTCCTGTC TCAGTCATTC1140TAAGAATTGC TAAAACGTAC CAGGAAATAT TGGAGAAGTG TTCCCAGTCT GGAAATCTAC1200CTGGATGTCA GGACAATCTG GAAGAAGAAT TGCAGAAACA CATCGAGGAG AGCCAGGCAC1260TGTCCAAGCA AAGCTGCGCT CTCTACCAGA CCTTAGGAGA CTACAAATTA CAAAATCTGT1320TCCTTATTGG TTACACGAGG AAAGCCCCTC AGCTGACCTC AGCAGAGCTG ATCGACCTCA1380CCGGGAAGAT GGTGAGCATT GCCTCCACGT GCTGCCAGCT CAGCGAGGAG AAATGGTCCG1440GCTGTGGTGA GGGAATGGCC GACATTTTCA TTGGACATTT GTGTATAAGG AATGAAGCAA1500GCCCTGTGAA CTCTGGTATC AGCCACTGCT GCAACTCTTC GTATTCCAAC AGGAGGCTAT1560GCATCACCAG TTTTCTGAGG GATGAAACCT ATGCCCCTCC CCCATTCTCT GAGGATAAAT1620TCATCTTCCA CAAGGATCTG TGCCAAGCTC AGGGCAAAGC CCTACAGACC ATGAAACAAG1680AGCTTCTCAT TAACCTGGTG AAGCAAAAGC CTGAACTGAC AGAGGAGCAG CTGGCGGCTG1740TCACTGCAGA TTTCTCGGGC CTTTTGGAGA AGTGCTGCAA AGCCCAGGAC CAGGAAGTCT1800GTTTCACAGA AGAGGGTCCA AAGTTGATTT CCGAAACTCG TGATGCTTTG GGCGTTTAAA1860CATCTCCAGA AGGAAGAGTG GACAAAAAAA TGTGTTGACG CTTTGGTGTG AGCCTTTTGG1920CTTAACTGTA ACTGCTAGTA CTTTAACCAC ATGGTGAAGA TGTCCATGTG AGATTTCTAT1980ACCTTAGGAA TAAAAACTTT TCAACTATT 2009
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物體內(nèi)癌癥的方法，該方法包括的步驟有在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生一種針對(duì)甲胎蛋白分子氨基酸序列的至少一部分的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲胎蛋白分子為SEQ ID NO1。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲胎蛋白分子的部分選自以下組SEQ ID NO1的1-9位殘基，SEQ ID NO1的12-20位殘基，SEQ ID NO1的158-166位殘基，SEQ ID NO1的178-186位殘基，SEQ ID NO1的235-243位殘基，SEQ ID NO1的287-295位殘基，SEQ ID NO1的404-412位殘基，SEQ ID NO1的441-450位殘基，SEQ ID NO1的492-500位殘基，SEQ ID NO1的542-550位殘基，SEQ ID NO1的547-556位殘基，SEQ ID NO1的555-563位殘基。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥為肝細(xì)胞癌。
5.權(quán)利要求1的方法，其中該哺乳動(dòng)物為人。
6.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的步驟包括給該哺乳動(dòng)物施用至少一種組合物，所述組合物含有包含甲胎蛋白氨基酸序列至少部分的一種肽。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述肽選自以下組SEQ ID NO1的1-9位殘基，SEQ ID NO1的12-20位殘基，SEQ ID NO1的158-166位殘基，SEQ ID NO1的178-186位殘基，SEQ ID NO1的235-243位殘基，SEQ ID NO1的287-295位殘基，SEQ ID NO1的404-412位殘基，SEQ ID NO1的441-450位殘基，SEQ IDNO1的492-500位殘基，SEQ ID NO1的542-550位殘基，SEQID NO1的547-556位殘基，和SEQ ID NO1的555-563位殘基。
8.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生免疫應(yīng)答之步驟包括給該哺乳動(dòng)物施用至少一種組合物，所述組合物中含有包含甲胎蛋白氨基酸序列的至少部分并有至少一個(gè)氨基酸取代的一種肽。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述肽選自SEQ ID NO2和SEQ IDNO3。
10.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的步驟包括給該哺乳動(dòng)物至少一種組合物，所述組合物中包含甲胎蛋白分子cDNA序列的至少部分。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述甲胎蛋白cDNA為SEQ ID NO1。
12.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的步驟包括給該哺乳動(dòng)物施用至少一種組合物，所述組合物中包含轉(zhuǎn)導(dǎo)有可表達(dá)甲胎蛋白cDNA的重組載體的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞為樹(shù)突細(xì)胞。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述甲胎蛋白cDNA為SEQ ID NO1。
15.一種用于免疫接種人以預(yù)防或治療癌癥的組合物，該組合物中含有選自以下組的一種肽SEQ ID NO1的1-9位殘基，SEQ IDNO1的12-20位殘基，SEQ ID NO1的158-166位殘基，SEQ IDNO1的178-186位殘基，SEQ ID NO1的235-243位殘基，SEQID NO1的287-295位殘基，SEQ ID NO1的404-412位殘基，SEQ ID NO1的441-450位殘基，SEQ ID NO1的492-500位殘基，SEQ ID NO1的542-550位殘基，SEQ ID NO1的547-556位殘基，SEQ ID NO1的555-563位殘基，SEQ IN NO2和SEQ IDNO3。
16.一種預(yù)防或治療人體內(nèi)癌癥的方法，該方法中包括有給此人施用權(quán)利要求13的組合物這一步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物體內(nèi)癌癥(包括肝細(xì)胞癌)的方法,其中的癌癥在其表面攜有甲胎蛋白分子的至少一部分,此方法是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)甲胎蛋白分子的至少部分的免疫應(yīng)答。此外,本發(fā)明還提供了一種可在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)甲胎蛋白分子的至少部分的免疫應(yīng)答的組合物,用以預(yù)防或治療癌癥(包括肝細(xì)胞癌),該組合物中含有甲胎蛋白分子的至少部分,或含有其內(nèi)一或多個(gè)天然氨基酸已被其它氨基酸取代以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的甲胎蛋白分子至少一部分。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1259139SQ98805228
公開(kāi)日2000年7月5日 申請(qǐng)日期1998年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月13日
發(fā)明者J·S·艾克挪茅, L·H·巴特菲爾德, A·李巴斯布魯格拉 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)