專利名稱：合成長鏈多不飽和脂肪酸的方法和組合物的制作方法
相關(guān)申請本申請是申請日為1997年4月11日的流水號為08/833,610的申請的部分后續(xù)申請。
說明本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)與長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)在微生物或動物中的生成有關(guān)的酶和/或酶成分的含量。背景多不飽和脂肪酸(PUFAs)的兩種主要類型是以二十碳五烯酸(EPA)為代表的ω3脂肪酸，和以花生四烯酸(ARA)為代表的ω6脂肪酸。PUFAs是細胞質(zhì)膜的重要成分，其中，它可以諸如磷脂的形式存在。PUFAs是正常發(fā)育所必需的，特別是為嬰兒大腦發(fā)育、以及組織形成和修復(fù)所必需。PUFAs還起著對人類和動物來說具有重要意義的其它分子的前體的作用，包括前列環(huán)素、花生酸、白三烯和前列腺素。
四種主要的重要長鏈PUFAs，包括二十二碳六烯酸(DHA)和EPA，它們主要存在于不同類型的魚油中；γ-亞麻酸(GLA)，它存在于多種植物的種子中，包括月見草(Oenothera biennis)，琉璃苣(Boragoofficinalis)和黑茶簏子(Ribes nigrum)；以及stearidonic acid(SDA)，它存在于海產(chǎn)油和植物種子中。GLA和另一種重要的長鏈PUFA花生四烯酸(ARA)存在于絲狀真菌中。ARA可以從包括肝和腎上腺在內(nèi)的動物組織中純化。GLA、ARA、EPA和SDA本身是重要的長鏈脂肪酸，或食品前體，它參與前列腺素的合成，可用于心臟病的治療，并參與腦組織的發(fā)育。
多不飽和脂肪酸具有多種藥用和醫(yī)學(xué)用途，包括心臟病、癌癥和關(guān)節(jié)炎的治療。
對DHA來說，存在著多種用于商業(yè)化生產(chǎn)的資源，包括多種海洋生物，獲自冷水海洋魚類的油，以及卵黃組分。對ARA來說，可將包括被孢霉屬、蟲霉屬、腐霉屬和紫球藻屬的微生物用于商業(yè)化生產(chǎn)。SDA的商品化資源包括毛束草屬和藍薊屬。GLA的商品化資源包括月見草、黑茶簏露子和琉璃苣。不過，由天然來源商業(yè)化生產(chǎn)PUFAs存在著若干相關(guān)的缺陷。諸如動物和植物的天然PUFAs來源傾向于具有高度雜合的油類組成。因此，由所述來源獲得的油可能需要充分純化，以便分離出一種或一種以上需要的PUFAs或生產(chǎn)一種富集了一種或一種以上PUFAs的油。天然來源在可利用性方面還存在著不可控制的波動性問題。魚類資源還會發(fā)生自然波動，或者由于過度捕撈而衰竭。魚油具有令人不快的味道和氣味，不可能低成本地將其從需要的制品中分離，并使得這種產(chǎn)品不能被用作保健食品。動物油，特別是魚油可能積累環(huán)境中的污染物。天氣和病害可導(dǎo)致來自魚類和植物來源的產(chǎn)量的波動?？捎糜谏a(chǎn)輪作產(chǎn)油作物的耕地受到人口穩(wěn)定膨脹和相應(yīng)提高的對在剩余可耕地上生產(chǎn)食物的需求的壓力。能產(chǎn)生PUFAs的諸如琉璃苣的作物不適應(yīng)商業(yè)化生長，而且，在單作時表現(xiàn)欠佳。因此，種植這種作物不如種植更能盈利的和更成熟的作物經(jīng)濟效益好。諸如被孢霉屬的生物的大規(guī)模發(fā)酵也很昂貴。天然動物組織含有少量的ARA，并且難于加工。諸如紫球藻屬和被孢霉屬的微生物難于以商業(yè)化規(guī)模培養(yǎng)。
含有PUFAs的保健食品和藥物制劑可能保留了PUFAs資源的缺陷。諸如魚油膠囊的保健品可能含有少量的特定需要的成分，因此需要較大的劑量。高劑量會導(dǎo)致攝入大量不需要的成分，包括污染物。這種保健品的另人討厭的味道和氣味使得這種藥物不受歡迎，并使患者難以接受。在提供脂肪酸保健品時必須小心，因為添加過量會導(dǎo)致內(nèi)源生物合成途徑的抑制，并導(dǎo)致在體內(nèi)與各種脂類成分里的其它必需脂肪酸的競爭，導(dǎo)致不希望的后果。例如，愛斯基摩人的飲食具有高的ω3脂肪酸，他們具有較高的出血傾向(US4,874,603)。
有多種酶參與了PUFAs的生物合成。亞油酸(LA，18∶2Δ9，12)是在Δ12-脫氫酶作用下由油酸(18∶1Δ°)產(chǎn)生的。GLA(18∶3Δ6，9，12)是在Δ6-脫氫酶的作用下由亞油酸(LA，18∶2Δ9，12)產(chǎn)生的。ARA(20∶4Δ5，8，11，14)是在Δ5-脫氫酶的催化作用下由二同-γ-亞麻酸(DGLA，20∶3Δ8，11，14)產(chǎn)生的。不過，動物不能在Δ9位以外的位置上去飽和，因此，不能將油酸(18∶1Δ9)轉(zhuǎn)化成亞油酸(18∶2Δ912)。類似地，動物不能合成α-亞麻酸(ALA，18∶3Δ9，12，15)。包括真菌和植物的其它真核生物具有能在Δ12和Δ15位置上去飽和的酶。因此，動物的主要多不飽和脂肪酸源于飲食和/或源于亞油酸(18∶2Δ9，12)或∝亞麻酸(18∶3Δ9，12，15)的去飽和和延伸。因此，有意義的是，從能天然產(chǎn)生所述脂肪酸的物種中獲得參與PUFA生物合成的遺傳材料，并在微生物或動物系統(tǒng)中表達所提取的材料，所述系統(tǒng)可加以操作，以產(chǎn)生商業(yè)數(shù)量的一種或幾種PUFAs。因此，需要脂肪酸脫氫酶，編碼這種酶的基因，以及產(chǎn)生這種酶的重組方法。還需要含有較高相對比例的和/或富集了特定PUFAs的油類。還需要用于生產(chǎn)特定PUFAs的可靠的、經(jīng)濟的方法。相關(guān)文獻由Δ6-脫氫酶進行的γ-亞麻酸生產(chǎn)披露于USPN5,552,306中。在USPN5,376,541中披露了利用高山被孢霉(Mortierella alpina)生產(chǎn)8，11-二十碳二烯酸的方法。在USPN5,407,957中披露了用甲藻生產(chǎn)二十碳六烯酸的方法。在PCT公開文件WO 96/13591和USPN5,614,400中披露了Δ6-棕櫚酰-乙酰載體蛋白脫氫酶的克隆。在PCT公開文件WO96/21022中披露了由琉璃苣克隆Δ6-脫氫酶的方法。在以下公開的專利申請中披露了克隆Δ9-脫氫酶的方法PCTWO91/13972，EP0550162A1，EP0561569A2，EP0644263A2，和EP0736598A1，以及USPN5,057,419。在PCT公開文件WO94/11516和USPN5,443,974中披露了由各種生物克隆Δ12-脫氫酶的方法。在PCT公開文件WO93/11245中披露了由各種生物克隆Δ15-脫氫酶。本文所涉及的所有公開文獻和美國專利或申請均被全文收作本文的參考文獻。本發(fā)明概述提供了用于制備多不飽和長鏈脂肪酸或PUFAs的新型組合物和方法。所述組合物包括編碼Δ5-脫氫酶和/或具有Δ5-脫氫酶活性的多肽的核酸，多肽，以及用于提取和檢測所述核酸的探針。所述方法包括生長一種宿主微生物或動物，所述微生物或動物含有并能表達編碼Δ5-脫氫酶和/或具有Δ5-脫氫酶活性的多肽的一個或幾個轉(zhuǎn)基因。所述脫氫酶多肽的表達，可產(chǎn)生較大量的Δ5-去飽和PUFA，或其代謝產(chǎn)物，因為其表達改變了參與PUFA生物合成的酶和底物的濃度。例如，本發(fā)明可用于含有PUFA的油的大規(guī)模生產(chǎn)，例如，所述油包括ARA，EPA和/或DHA。
在一種優(yōu)選實施方案中，提供了一種含有圖3A-D所示Δ5-脫氫酶的核酸序列(序列1)，由所述核酸編碼的多肽，和圖3A-D所示的純化的或提取的多肽(序列2)以及編碼圖3A-D所示多肽(序列2)的提取的核酸。本發(fā)明的另一種實施方案是一種編碼多肽的提取的核酸序列，其中，能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和。所述核酸優(yōu)選源于真核細胞，如真菌細胞或被孢霉屬，或高山被孢霉的屬/種的真菌細胞。同樣優(yōu)選包括一個與圖3A-D所示核苷酸序列(序列1)退火的序列的提取的核酸，以及編碼圖3A-D所示氨基酸序列(序列2)的核酸。具體地講，所述核酸編碼圖3A-D所示的氨基酸序列(序列2)，所述氨基酸序列選自下列一組氨基酸殘基30-38，41-44，171-175，203-212，和387-394。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種提取的或純化的多肽，該多肽能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和。還提供了一種提取的核酸序列，該序列能與圖3A-D所示核苷酸序列(序列1)雜交，一種與圖3A-D所示序列(序列1)相比至少具有大約50％相同性的提取的核酸序列。
本發(fā)明還包括一種核酸結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括與一個異源核酸連接的圖3A-D所示的核苷酸序列(序列1)；一個包括可操作地連接于一個啟動子的圖3A-D所示核苷酸序列(序列1)的核酸結(jié)構(gòu)；以及一個包括可操作地連接于一個能在細菌細胞中起作用的啟動子的圖3A-D所示核苷酸序列(序列1)的核酸結(jié)構(gòu)。在一種優(yōu)選實施方案中，所述細菌細胞是酵母細胞，而所述核苷酸序列源于真菌，如被孢霉屬真菌，特別是高山被孢霉菌的真菌。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案中，提供了一種核酸結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括編碼一種多肽的核苷酸序列，所述多肽包括一個相當于或互補于圖3A-D所示氨基酸序列(序列2)的氨基酸序列，其中，所述核苷酸序列可操作地連接于一個能在宿主細胞中起作用的啟動子，并且，其中，所述核苷酸序列編碼一種能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和的多肽。另外，本發(fā)明提供了一種核酸結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括編碼一種功能活性Δ5-脫氫酶的核苷酸序列，其中，所述脫氫酶包括一個相當于或互補于圖3A-D所示氨基酸序列(序列2)的全部或部分的氨基酸序列，其中，所述核苷酸序列可操作地連接于一個在宿主細胞中起作用的啟動子。
本發(fā)明還包括一種含有本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)的宿主細胞。在一種優(yōu)選實施方案中，提供了一種重組宿主細胞，該細胞包括至少一個拷貝的編碼具有圖3A-D所示氨基酸序列(序列2)的、具有功能活性的高山被孢霉脂肪酸脫氫酶的DNA序列，其中，所述細胞或該細胞的祖細胞是用含有所述DNA序列的載體轉(zhuǎn)化過的，其中，所述DNA序列可操作地連接于一個啟動子。所述宿主細胞是真核細胞或原核細胞。優(yōu)選的真核宿主細胞選自下列一組哺乳動物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞、和藻類細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞包括禽細胞、諸如酵母的真菌細胞、和海洋藻類細胞。優(yōu)選的原核細胞包括選自下列一組的細胞細菌、藍細菌、含有噬菌體和/或病毒的細胞。所述重組宿主細胞的DNA序列優(yōu)選含有能在該宿主細胞中起作用的啟動子。
含有本發(fā)明DNA序列的本發(fā)明的宿主細胞富含諸如20∶3脂肪酸的脂肪酸。在一種優(yōu)選實施方案中，所述宿主細胞與缺乏所述DNA序列的未轉(zhuǎn)化過的宿主細胞相比富含20∶4脂肪酸，和/或與缺乏所述DNA序列的未轉(zhuǎn)化過的宿主細胞相比富含20∶5脂肪酸。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組宿主細胞，該細胞包括選自下列一組的脂肪酸二同-γ-亞麻酸，n-6十碳三烯酸，20∶3 n-6酸和20-3(8，11，14)酸。
本發(fā)明還包括用于在微生物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)花生四烯酸的方法，其中，該方法包括生長具有多個微生物細胞的微生物細胞培養(yǎng)物，所述微生物細胞含有一個或幾個編碼一種多肽的核酸，所述多肽能將二同-γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化成花生四烯酸，其中，所述核酸可操作地連接于一個啟動子，培養(yǎng)條件為使所述一個或幾個核酸能夠表達，從而在所述微生物細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生花生四烯酸。在本發(fā)明的若干優(yōu)選實施方案中，所述多肽是一種酶，它能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和；所述核酸源于被孢霉菌；而所述多肽的底物是外源提供的。用于所述方法的微生物細胞可以是真核細胞或原核細胞。優(yōu)選的真核細胞選自下列一組哺乳動物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞、和藻類細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞包括禽細胞，優(yōu)選的真菌細胞是酵母，而優(yōu)選的藻類細胞是海洋藻類細胞。優(yōu)選的原核包括選自下列一組的細胞細菌、藍細菌、含有噬菌體和/或病毒的細胞。所述微生物細胞的編碼所述多肽的核酸序列任選含有一個能在所述宿主細胞中起作用的啟動子，所述啟動子優(yōu)選為由諸如培養(yǎng)液的成分誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動子，用于所述方法的優(yōu)選微生物細胞是真菌細胞，如酵母屬細胞。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，提供了一種重組酵母細胞，它能將超過大約5％的20∶3脂肪酸底物轉(zhuǎn)化成20∶4脂肪酸產(chǎn)物。
還提供了一種含有一種或幾種PUFA的油。所述一種或幾種PUFAs的量大約為0.3-30％的花生四烯酸(ARA)，大約為0.2-30％的二同-γ-亞麻酸(DGLA)和大約為0.2-30％的γ-亞麻酸(GLA)。本發(fā)明的優(yōu)選油其ARA∶DGLA∶GLA的比例大約為1.0∶19.0∶30至6.0∶1.0∶0.2。本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案是含有存在于一種可以藥用的載體中的所述油的藥用組合物。還提供了一種含有本發(fā)明的油的營養(yǎng)組合物。本發(fā)明的營養(yǎng)組合物優(yōu)選通過腸胃外或內(nèi)服方式用于哺乳動物宿主。用于內(nèi)服的本發(fā)明的優(yōu)選組合物是嬰兒配方食品。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物為液體形式或固體形式。
本發(fā)明還包括一種用于對脂肪酸進行去飽和的方法，其中，該方法包括在適于表達由所述核酸編碼的多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組微生物細胞，其中，所述宿主細胞還含有所述多肽的脂肪酸底物。在一種優(yōu)選實施方案中，提供了一種通過該方法去飽和的脂肪酸，包括含有所述脂肪酸的油。
本發(fā)明還涉及存在于序列1-34中的純化的核苷酸和肽序列。本發(fā)明還涉及將存在于序列1-34中的序列用作探針鑒定相關(guān)序列的方法，所述序列用作表達系統(tǒng)的成分和用作可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因油的系統(tǒng)的成分。
本發(fā)明還涉及通過生長編碼轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因微生物獲取改變了的長鏈多不飽和脂肪酸生物系統(tǒng)的方法，所述表達產(chǎn)物能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的長鏈脂肪酸的配方食品、保健食品或液體或固體形式的保健食品。所述配方食品和保健品可用于人或動物。
本發(fā)明的配方食品和保健品還含有至少一種選自下列一組的常量營養(yǎng)物椰子油、大豆油、菜籽油、甘油一酯和二酯，葡萄糖、食用乳糖、電滲析乳清，電滲析脫脂乳，乳清，大豆蛋白，及其它蛋白水解物。
本發(fā)明的配方食品還可以包括至少一種選自維生素A、C、D、E和B復(fù)合物的維生素；以及至少一種選自下列一組的礦物質(zhì)鈣、鎂、鋅、錳、鈉、鉀、磷、銅、氯、碘、硒、和鐵。
本發(fā)明還涉及一種治療具有由于攝取或生產(chǎn)多不飽和脂肪酸不足而引起的癥狀的患者的方法，包括給所述患者服用治療有效量的本發(fā)明的食用替代品。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明材料的化妝品和藥用組合物。
本發(fā)明還涉及含有選自下列一組的核苷酸序列的提取的核苷酸序列序列13；序列15；序列17；序列19；序列21；序列22；序列22；序列24；序列25；序列26和序列27。
本發(fā)明還涉及一種含有選自下列一組的肽序列的提取的肽序列序列14；序列16；序列18；序列20；序列28；序列29；序列30；序列31；序列32；序列33和序列34。
本發(fā)明還涉及存在于可以藥用的載體中的轉(zhuǎn)基因油。本發(fā)明還涉及含有所述轉(zhuǎn)基因油的營養(yǎng)保健品、化妝品和嬰兒配方食品。
本發(fā)明還涉及一種用于實現(xiàn)改變了的長鏈多不飽和脂肪酸生物合成的方法，包括以下步驟生長具有包含編碼一種轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的細胞的微生物，所述表達產(chǎn)物能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和，其中，所述轉(zhuǎn)基因可操作地連接于一個表達控制序列上，生長條件為使所述轉(zhuǎn)基因能夠表達，從而改變所述細胞中長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成。
本發(fā)明還涉及選自ARA、DGLA和EPA的長鏈多不飽和脂肪酸的用途。
本發(fā)明還涉及含有至少一種選自下列一組的營養(yǎng)成分的藥用組合物維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物、糖、氨基酸、游離脂肪酸、磷脂、抗氧化劑、和酚類化合物。附圖的簡要說明

圖1表示由來自包括藻類、被孢霉屬和人的多種生物的棕櫚酸(C16)合成花生四烯酸(20∶4Δ5，8，11，14)和stearidonic acid(18∶4Δ6，9，12，15)的可能途徑。這些PUFAs可以用作對人和其它動物重要的其它分子的前體，包括前列環(huán)素、白三烯、和前列腺素，示出了其中的某一些。
圖2表示由多種生物生產(chǎn)除ARA之外的PUFAs的可能途徑，包括EPA和DHA。
圖3A-D表示高山被孢霉Δ5-脫氫酶的DNA序列及其推定的氨基酸序列。
圖4表示所述PCR片段(參見例1)的推定的氨基酸序列。
圖5A和5B表示Δ5-脫氫酶與Δ6-脫氫酶的蛋白序列的比較。
圖6A和6B表示在含有所述Δ5-脫氫酶基因的SC334中底物的添加時間對誘導(dǎo)底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的影響。
圖7A和7B表示在SC334中誘導(dǎo)物的濃度對Δ5-脫氫酶表達的影響。
圖8A和8B表示誘導(dǎo)溫度對SC334中Δ5-脫氫酶活性的影響。
圖9A和9B表示在15℃下，在表達Δ5-脫氫酶基因的菌株中，宿主菌株對底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的影響。
圖10A和10B表示在30℃下，在表達Δ5-脫氫酶基因的菌株中，宿主菌株對底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的影響。
圖11表示膽堿轉(zhuǎn)移酶和Δ5-脫氫酶基因的宿主菌株對底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的影響。
圖12A和12B表示在表達Δ5-脫氫酶基因的兩種宿主菌株中培養(yǎng)基組成和溫度對底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的影響。
圖13表示Ma29蛋白序列與重疊群253538a的蛋白序列比較。
圖14表示Ma524蛋白序列與重疊群253538a的蛋白序列比較。序列表的簡要說明序列1表示高山被孢霉Δ5-脫氫酶的DNA序列。
序列2表示高山被孢霉Δ5-脫氫酶的氨基酸序列。
序列3表示高山被孢霉PCR(參見例1)片段的推定的氨基酸序列。
序列4-序列7表示各種Δ6-脫氫酶的推定的氨基酸序列。
序列8和序列9表示Δ6-脫氫酶的PCR引物序列。
序列10表示用于總RNA逆轉(zhuǎn)錄的引物。
序列11和序列12表示脫氫酶序列的氨基酸基序。
序列13和序列14表示盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)脫氫酶序列的核苷酸及氨基酸序列。
序列15和序列16表示三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)脫氫酶序列的核苷酸及氨基酸序列。
序列17-20表示裂殖壺菌cDNA克隆的核苷酸和推定的氨基酸序列。
序列21-27表示人脫氫酶的核苷酸序列。
序列28-34表示人脫氫酶的肽序列。本發(fā)明的詳細說明為了全面理解本發(fā)明，提供了下列定義Δ5-脫氫酶Δ5-脫氫酶是一種能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5和6之間引入一個雙鍵的酶。
Δ6-脫氫酶Δ6-脫氫酶是一種能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C6和7之間引入一個雙鍵的酶。
Δ9-脫氫酶Δ9-脫氫酶是一種能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C9和10之間引入一個雙鍵的酶。
Δ12-脫氫酶Δ12-脫氫酶是一種能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C12和13之間引入一個雙鍵的酶。
脂肪酸脂肪酸是含有長的烴鏈和末端羧基的一類化合物。脂肪酸包括下列一些
考慮到上述定義，本發(fā)明涉及新型DNA序列，DNA結(jié)構(gòu)，并提供了能夠改變諸如微生物細胞或動物的多不飽和長鏈脂肪酸含量的方法和組合物。對宿主細胞進行操作，以便表達編碼一種能催化DGLA向ARA轉(zhuǎn)化的多肽的DNA的有義或反義轉(zhuǎn)錄物。所述表達酶的底物可以由所述宿主細胞產(chǎn)生或外源補充。為了實現(xiàn)表達，將所述轉(zhuǎn)化的DNA與能在所述宿主細胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止調(diào)節(jié)片段可操作地連接在一起?？梢蕴峁┖写磉_基因的結(jié)構(gòu)，以便整合到宿主細胞的基因組中或者能夠在宿主細胞中自主復(fù)制。為了生產(chǎn)ARA，常用的表達框包括能產(chǎn)生Δ5-脫氫酶活性的表達框，特別是在能產(chǎn)生或能攝入DGLA的宿主細胞中。在基本上無ALA的宿主微生物或動物中有利于諸如ARA的ω6-型不飽和脂肪酸的生產(chǎn)。所述宿主是通過消除或抑制Δ15-或ω3-型脫氫酶而篩選或獲得的(參見圖2)。通過提供反義Δ15-或ω3轉(zhuǎn)錄物的表達框，可以影響其內(nèi)源脫氫酶活性，所述表達框通過插入、取代和/或缺失靶基因的全部或部分破壞靶Δ15-或ω3-脫氫酶基因，或者通過添加Δ15-或ω3-脫氫酶抑制劑實現(xiàn)這一目的。通過提供Δ9和/或Δ12-脫氫酶表達框還可以加強LA的生產(chǎn)，而相應(yīng)的酶促活性是有限的。脂肪酸的微生物生產(chǎn)與從諸如魚或植物的天然來源中純化相比，脂肪酸的微生物生產(chǎn)具有若干優(yōu)點。已知許多微生物與高等生物相比具有大大簡化了的油的組成，這使得對需要的成分的純化更加容易。微生物生產(chǎn)不會受到由諸如天氣和食物供應(yīng)引起的波動的影響。通過微生物生產(chǎn)的油，基本上不受環(huán)境污染物的污染。另外，微生物可以提供特殊形式的、可能具有特殊用途的PUFAs。例如，螺旋藻屬可以提供主要在第一和第三位置上的甘油三酯的PUFAs；通過用胰脂肪酶消化可以優(yōu)先從上述位置上釋放脂肪酸。人或動物在攝入源于螺旋藻屬的甘油三酯之后，通過胰脂肪酶的作用以游離脂肪酸的形式釋放所述PUFAs，因此，被直接用于諸如嬰兒的大腦發(fā)育。另外，通過控制培養(yǎng)條件，特別是通過提供微生物表達的酶的特定底物，或通過添加抑制不需要生物化學(xué)途徑的化合物可以操縱微生物油生產(chǎn)。除了上述優(yōu)點之外，由重組微生物生產(chǎn)脂肪酸，提供了改變天然存在的微生物脂肪酸分布的能力，這是通過在所述宿主中提供新的合成途徑或通過抑制不需要的途徑而實現(xiàn)的，從而提高需要的PUFAs或其綴合形式的含量，并降低不需要的PUFAs的含量。在動物中生產(chǎn)脂肪酸在動物中生產(chǎn)脂肪酸也具有若干優(yōu)點。在動物中表達脫氫酶基因，可以在動物組織中產(chǎn)生含量大大提高了的PUFAs，使得從所述組織中回收脂肪酸變得更經(jīng)濟。例如，當需要的PUFAs是在動物的乳汁中表達的時候，從動物乳中提取PUFAs的方法是成熟的。除了提供用于純化需要的PUFAs的來源之外，還可以通過脫氫酶基因的表達操縱動物乳汁，所述基因是單獨表達或與其它人類基因組合表達，以提供具有大體上與嬰兒發(fā)育的不同階段的人乳汁相同的PUFAs組成的動物乳。在不可能或不希望進行人工哺乳的情況下或在營養(yǎng)不良或發(fā)病的情況下，可將人源化動物乳用作嬰兒配方食品。
根據(jù)宿主細胞、底物的可得性、和需要的最終產(chǎn)物，對若干多肽、特別是脫氫酶感興趣?！懊摎涿浮笔侵改軐⒁环N或幾種脂肪酸去飽和以產(chǎn)生感興趣的單-或多不飽和脂肪酸或其前體的多肽。特別感興趣的是能催化DGLA轉(zhuǎn)化成ARA的多肽，其中包括能在Δ5位置上去飽和的酶?！岸嚯摹笔侵杆邪被徭湥c長度或翻譯后修飾，例如，糖基化或磷酸化無關(guān)。選擇一種具有脫氫酶活性的特定多肽的考慮因素包括該多肽的最佳pH，該多肽是否是限速酶或其成分，所述脫氫酶是否為所需要的多不飽和脂肪酸的合成所必需，和/或所述多肽所需的輔助因子。所表達的多肽優(yōu)選具有與其在宿主細胞中存在部位的生物化學(xué)環(huán)境相適應(yīng)的參數(shù)。例如，所述多肽在所述宿主細胞中可能必需與其它酶競爭底物。因此，在確定特定多肽在特定宿主細胞中改變PUFAs生產(chǎn)方面的合適度時，要考慮有關(guān)多肽的Km和比活的分析。用于特定場合的多肽，是能夠在存在于預(yù)期的宿主細胞中的條件下起作用的多肽，也可以是具有脫氫酶活性的任何多肽，它具有所需要的特性，即能改變需要的PUFAs的相對產(chǎn)量。
為了生產(chǎn)ARA，所使用的DNA序列編碼一種具有Δ5-脫氫酶活性的多肽。在具體例子中，該DNA序列可以與一個表達框連接，以便生產(chǎn)具有Δ6-脫氫酶活性的多肽，并且可以通過如下方法選擇性地消除宿主細胞所具有的所有Δ15-脫氫酶活性提供用于產(chǎn)生Δ15-脫氫酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反義序列的轉(zhuǎn)錄框，破壞Δ15-脫氫酶基因，或使用天然具有或業(yè)已突變成具有低的Δ15-脫氫酶活性的宿主細胞。對不需要的脫氫酶途徑的抑制還可以通過使用諸如披露于US4,778,630中的抑制劑的特殊脫氫酶抑制劑而實現(xiàn)。所使用的表達框的組合選擇可部分取決于宿主細胞的PUFAs特性。當宿主細胞Δ5-脫氫酶活性受到限制時，Δ5-脫氫酶本身的超量表達通常就足于在有諸如DGLA的合適底物的條件下提高ARA的產(chǎn)量。ARA的產(chǎn)量還可以通過提供Δ9-或Δ12-脫氫酶基因的表達框而提高，在這種情況下，所述脫氫酶的活性有限。在圖1中示出了由棕櫚酸(C16)合成花生四烯酸(20∶4Δ5，8，11，14)的方法。該途徑中的一個關(guān)鍵酶是Δ5-脫氫酶，它能將DH-γ-亞麻酸(DGLA，二十碳三烯酸)轉(zhuǎn)化成ARA。還示出了通過Δ6-脫氫酶的作用將α-亞麻酸(ALA)轉(zhuǎn)化成stearidonic acid。除了ARA之外，在圖2中還示出了包括EPA和DHA在內(nèi)的PUFAs的生產(chǎn)。
具有脫氫酶活性的多肽的來源具有脫氫酶活性的多肽和編碼這種多肽的寡核苷酸的來源是能產(chǎn)生需要的多不飽和脂肪酸的生物。例如，具有產(chǎn)生ARA的能力的微生物可以用作Δ5-脫氫酶活性的來源。例如，所述微生物包括屬于被孢霉屬、耳霉屬、腐霉屬、疫霉屬、青霉屬、紫球藻屬、Coidosporium、毛霉屬、鏈孢屬、曲霉屬、紅酵母屬、和蟲霉屬的微生物。在紫球藻屬中，特別感興趣的是血色紫球藻(Porphyridium cruentum)。在被孢霉屬中，特別感興趣的是長孢被孢霉(Mortierella elongata)，微小被孢霉(Mortierella exigua)，喜濕被孢霉(Mortierellahygrophila)，拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)angulispora變種，和高山被孢霉。在毛霉屬中，特別感興趣的是卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)和爪哇毛霉(Mucor javanicus)。
可以用多種方法鑒定編碼需要的脫氫酶的DNAs。例如，利用可檢測的、酶促或化學(xué)合成的探針篩選諸如源于被孢霉屬的基因組或cDNA文庫的需要的脫氫酶的來源，所述探針可以由DNA、RNA、或非天然存在的核苷酸或其混合物制備。探針可以由已知脫氫酶的DNAs酶促合成，用于正?；蛉趸瘒栏裥缘碾s交方法。寡核苷酸探針還可用于篩選來源，并可根據(jù)已知脫氫酶的序列，包括在已知脫氫酶之間保守的序列，或根據(jù)由需要的純化蛋白獲得的肽序列。基于氨基酸序列的寡核苷酸探針可以簡并，以便包括其遺傳密碼的簡并性，或者改變，以有利于來源生物的優(yōu)選密碼子。寡核苷酸還可用作用于由源于已知或未知來源的逆轉(zhuǎn)錄mRNA進行PCR的引物；PCR產(chǎn)物可以是完整長度的cDNA或可被用于制備獲取需要的完整長度cDNA的探針。另外，可以對需要的蛋白進行全面測序，并實施編碼所述多肽的DNA的完整合成。
一旦提取到需要的基因組或cDNA，即可通過已知方法測序。本領(lǐng)域了解，所述方法存在著誤差，因此，通常要對相同的片段進行多次測序，但在所得到的推定序列上仍然存在可檢測比例的錯誤，特別是在具有重復(fù)的結(jié)構(gòu)域、廣泛的二級結(jié)構(gòu)、或不常見的堿基組成的片段上尤其如此，如具有高GC堿基含量的片段。當出現(xiàn)差別時，可以進行重新測序，并可以采用特定的方法。特定方法可以包括通過采用以下條件改變測序條件不同的溫度；不同的酶；能改變寡核苷酸形成更高級別的結(jié)構(gòu)的能力的蛋白；諸如ITP或甲基化dGTP的改變了的核苷酸；不同的凝膠組成，例如添加甲酰胺；不同的引物或位于距離有問題的區(qū)域不同距離的引物；或諸如單鏈DNAs的不同模板。還可以采用mRNA測序。
在多數(shù)場合下，編碼具有脫氫酶活性的多肽的編碼序列的某些或全部是源于天然來源。不過，在某些場合下，需要對其密碼子的全部或部分進行修飾，例如，通過采用宿主偏好的密碼子加強表達。宿主偏好的密碼子可以從感興趣的特定宿主種中以最大的量表達的蛋白中具有最高頻率的密碼子中確定。因此，具有脫氫酶活性的多肽的編碼序列可以全部或部分合成。還可以合成所述DNA的全部或部分，以消除可能存在于轉(zhuǎn)錄的mRNA中的二級結(jié)構(gòu)的任何去穩(wěn)定化序列或片段。還可以合成所述DNA的全部或部分，以便將其堿基組成改變成所需要的宿主細胞更偏好的形式。在現(xiàn)有文獻中已有相當完善的用于合成序列和將序列連接在一起的方法?？梢圆捎皿w外誘變和篩選，定點誘變，或其它方法實現(xiàn)天然存在的脫氫酶基因的突變，以產(chǎn)生在體內(nèi)具有脫氫酶活性的多肽，該多肽具有更理想的用于在宿主細胞中起作用的物理學(xué)和動力學(xué)參數(shù)，如更長的半衰期或更高的生產(chǎn)需要的多不飽和脂肪酸的速度。
高山被孢霉脫氫酶特別感興趣的是高山被孢霉Δ5-脫氫酶，它具有446個氨基酸，其氨基酸序列如圖3所示。編碼高山被孢霉Δ5-脫氫酶的基因可以在轉(zhuǎn)基因微生物或動物中表達，以實現(xiàn)由DGLA更大量的合成ARA。也可以使用大體上與高山被孢霉Δ5-脫氫酶DNA相同的DNA或其所編碼的多肽大體上與高山被孢霉Δ5-脫氫酶多肽相同的其它DNAs。大體上相同是指與高山被孢霉Δ5-脫氫酶氨基酸序列或編碼該氨基酸序列的核酸序列具有至少60％、80％、90％或95％的同源性的氨基酸序列或核酸序列，同源性越高越好。對于多肽來說，比較序列的長度通常至少為16個氨基酸，優(yōu)選至少20個氨基酸，或最優(yōu)選至少35個氨基酸。對核酸來說，比較序列的長度通常至少為50個核苷酸，優(yōu)選至少60個核苷酸，更優(yōu)選至少75個核苷酸，最優(yōu)選至少110個核苷酸。同源性通常是使用序列分析軟件測定的，例如，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，遺傳學(xué)計算機組的序列分析軟件包，1710大學(xué)路Madison，威斯康星53705，MEGAlign(DNAStar公司，1228S.ParkSt.，Madison，威斯康星53715)，和MacVector(牛津分子組，2105S.Bascom Avenue，Suite200，Campbell，California95008)。所述軟件通過確定與各種置換、缺失、和其它修飾的同源程度比較相似序列。保守置換通常包括發(fā)生在下列組內(nèi)的置換甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。置換還可以基于保守的疏水性或親水性進行(Kyte和Doolittel，分子生物學(xué)雜志157105-132，1982)，或基于預(yù)測相似的多肽二級結(jié)構(gòu)的能力進行(Chou和Fasman，酶學(xué)進展4745-148，1978)。
其它脫氫酶本發(fā)明包括源于相同生物或其它生物的相關(guān)脫氫酶。所述相關(guān)脫氫酶包括天然存在于相同或不同被孢霉菌中的披露的Δ5-脫氫酶的變體，以及源于其它種的所披露的Δ5-脫氫酶的同源物。還包括這樣的脫氫酶這種脫氫酶盡管不是大體上與高山被孢霉Δ5-脫氫酶相同，但能從脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和?？赏ㄟ^其以大體上與所披露的脫氫酶相同的方式起作用的能力鑒定相關(guān)的脫氫酶；就是說，它仍然能夠有效地將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA。還可以篩選序列數(shù)據(jù)庫，尋找與所披露的脫氫酶同源的序列，通過基于所披露的脫氫酶的探針與由所述來源生物構(gòu)建的文庫雜交，或通過利用源于所述來源生物的mRNA和基于所披露的脫氫酶的引物進行RT-PCR鑒定相關(guān)的脫氫酶。所述脫氫酶包括源于人、盤基網(wǎng)柄菌和三角褐指藻的脫氫酶。
通過常規(guī)誘變，表達所得到的突變多肽，并確定其活性可以確定一種脫氫酶多肽對于脫氫酶活性重要的片段。變體可以包括缺失、插入和點突變，或其組合。典型的功能分析開始于缺失誘變，以確定功能所需蛋白的N-和C-末端極限，然后進行內(nèi)部缺失、插入或點突變，以便進一步確定功能所必需的片段。還可以使用諸如盒式誘變或全合成的其它技術(shù)。例如，缺失誘變是通過利用外切酶依次去掉5’或3’編碼區(qū)而實現(xiàn)的。有用于所述技術(shù)的試劑盒。分別在Δ5-脫氫酶缺失之后，通過將含有起始密碼子或終止密碼子的寡核苷酸連接到缺失的編碼區(qū)，以完善該編碼區(qū)。另外，通過包括定點誘變，誘變PCR在內(nèi)的多種方法將編碼起始密碼子或終止密碼子的寡核苷酸插入所述編碼區(qū)，或連接到在現(xiàn)有的限制位點上消化過的DNA上。類似地，內(nèi)部缺失可以通過多種方法實現(xiàn)，包括利用該DNA中現(xiàn)有的限制位點，通過定點誘變或誘變PCR利用誘變引物。插入是通過諸如接頭-分區(qū)誘變(linker-scanning mutagenesis)、定點誘變或誘變PCR的方法實現(xiàn)的。點突變是通過定點誘變或誘變PCR的方法實現(xiàn)的。
還可將化學(xué)誘變用于鑒定脫氫酶多肽的對活性重要的片段。表達突變的結(jié)構(gòu)，并評價所得到的改變了的蛋白起著脫氫酶作用的能力。上述結(jié)構(gòu)-功能分析可以確定哪些片段可以缺失，哪些片段能承受插入，以及哪些點突變可以使突變蛋白以大體上與天然脫氫酶相同的方式起作用。上述所有突變蛋白和編碼這些蛋白的核苷酸序列屬于本發(fā)明的范疇。
脫氫酶基因的表達一旦獲得編碼一種脫氫酶多肽的DNA，將其置于能夠在一種宿主細胞中復(fù)制的載體上，或者通過諸如PCR或長PCR的技術(shù)進行體外繁殖。復(fù)制載體可以包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒、和粘粒等。理想的載體包括適用于誘變感興趣的基因的載體或適用于在宿主細胞中表達感興趣的基因的載體。長PCR技術(shù)，可以體外繁殖大型結(jié)構(gòu)，因此對感興趣的基因進行的修飾，如誘變或添加表達信號，而且所得到的結(jié)構(gòu)的繁殖完全可以在體外進行，而不使用復(fù)制載體或宿主細胞。
為了表達一種脫氫酶多肽，將功能性轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止區(qū)可操作地連接于編碼該脫氫酶多肽的DNA上。所述多肽編碼區(qū)的表達可以在體外或在宿主細胞內(nèi)進行。轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止區(qū)源于多種非排他性來源，包括待表達的DNA，已知或懷疑能在需要的系統(tǒng)中表達的基因，表達載體，化學(xué)合成，或源于宿主細胞的內(nèi)源基因座。體外表達例如，體外表達可以這樣實現(xiàn)將所述脫氫酶多肽的編碼區(qū)放入為體外使用而設(shè)計的表達載體，并添加兔網(wǎng)織紅細胞裂解物和輔助因子；如果需要，可以添加標記過的氨基酸。所述體外表達載體可以具有所使用的系統(tǒng)需要的某些或全部表達信號。所述方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，而該系統(tǒng)的成分可從商業(yè)渠道獲得，可以直接分析所述反應(yīng)混合物中的所述多肽，例如測定其活性，或者純化所合成的多肽，然后再進行測定。
在宿主細胞中表達在宿主細胞中的表達可以瞬時或穩(wěn)定形式實現(xiàn)。瞬時表達可以由導(dǎo)入的結(jié)構(gòu)進行，該結(jié)構(gòu)包括能在宿主細胞中起作用的表達信號，但該結(jié)構(gòu)不能復(fù)制，并很少整合到該宿主細胞中，或者該宿主細胞不能增殖。瞬時表達還可以通過誘導(dǎo)可操作地連接于感興趣的基因上的可調(diào)控的啟動子的活性而實現(xiàn)，不過，所述誘導(dǎo)系統(tǒng)通常存在低的基礎(chǔ)水平的表達。穩(wěn)定表達可以通過將一種能夠整合到宿主基因組上或能在該宿主細胞中自主復(fù)制的結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)。感興趣的基因的穩(wěn)定表達可以通過利用選擇標記進行篩選，所述選擇標記位于所述表達結(jié)構(gòu)上或由該表達結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染，然后篩選表達所述標記的細胞。當穩(wěn)定表達是由整合而產(chǎn)生的時，結(jié)構(gòu)的整合可以在所述宿主基因組中隨機發(fā)生，或者利用含有與所述宿主基因組同源到足于與所述宿主基因座進行定向重組的片段的結(jié)構(gòu)定向進行。當結(jié)構(gòu)被定向到一個內(nèi)源基因座時，全部或部分轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控區(qū)可以由所述內(nèi)源基因座提供。
當需要在來源生物中加強所述脫氫酶多肽的表達時，可以采用幾種方法?？蓪⒕幋a所述脫氫酶多肽的額外基因?qū)胨鏊拗魃铩＿€可以通過同源重組加強天然脫氫酶基因座的表達，例如，通過將一個較強的啟動子插入所述宿主基因組引起加強了的表達，通過消除mRNA或其所編碼的蛋白上的去穩(wěn)定化序列，通過從所述宿主基因組缺失所述信息，或通過將穩(wěn)定化序列添加到所述mRNA上(USPN4,910,141)。
當需要表達一個以上的不同基因時，可以采用合適的調(diào)控區(qū)和表達方法，導(dǎo)入的基因可以通過利用復(fù)制載體或通過整合到該宿主基因組中，在所述宿主細胞中繁殖。當兩個或兩個以上基因由獨立的復(fù)制載體表達時，需要每一個載體具有不同的復(fù)制方式。每一個導(dǎo)入的結(jié)構(gòu)，無論整合與否，應(yīng)當具有不同的篩選方式，并且應(yīng)當缺乏與其它結(jié)構(gòu)的同源性，以便維持穩(wěn)定的表達，并避免這些結(jié)構(gòu)之間因子的重配。調(diào)控區(qū)、篩選方法和導(dǎo)入結(jié)構(gòu)的繁殖方法的明智選擇可以通過實驗確定，以便所有導(dǎo)入的基因以需要的水平表達，以合成所需要的產(chǎn)物。
例如，當宿主細胞是酵母時，提供能在酵母細胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)，特別是來自該宿主種的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)。例如，所述轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)可獲自糖酵解途徑的基因，如醇脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)、葡糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸甘油酸激酶等或可調(diào)型基因，如酸性磷酸酶、乳糖酶、金屬硫蛋白、葡糖淀粉酶等。可將多種調(diào)控序列中的任一種用于特定場合，這取決于是需要組成型還是誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄，所述啟動子與感興趣的開放讀框組合后的特定效力，將一個強啟動子與一個源于不同啟動子的控制區(qū)連接的能力，所述啟動子可以進行誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄，并容易構(gòu)建等。特別感興趣的是在有半乳糖的條件下被激活的啟動子。半乳糖-誘導(dǎo)型啟動子(GAL1，GAL7，和GAL10)業(yè)已被廣泛用于在酵母中高水平地并且可調(diào)控地表達蛋白(Lue等，分子細胞生物學(xué)，第7卷，p.3446，1987；Johnston，微生物學(xué)綜述，第51卷，p.458，1987)。由GAL啟動子進行的轉(zhuǎn)錄是由GAL4蛋白激活的，所述蛋白結(jié)合于所述啟動子區(qū)，并在存在半乳糖時激活轉(zhuǎn)錄。在缺少半乳糖時，拮抗物GAL80與GAL4結(jié)合，并阻止GAL4激活轉(zhuǎn)錄。添加半乳糖能阻止GAL80抑制GAL4的活化作用。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)圍繞翻譯起始密碼子ATG的核苷酸序列影響在酵母細胞中的表達。如果需要的多肽在酵母中表達不好，可以修飾外源基因的核苷酸序列，使其包括一個有效的酵母轉(zhuǎn)錄起始序列，以獲得最佳基因表達。為了在酵母屬中表達，上述目的可以通過一個不能有效表達的基因的定點誘變而實現(xiàn)，所述誘變是通過將其以框內(nèi)形式融合到一個內(nèi)源酵母屬基因，優(yōu)選高效表達的基因，如乳糖酶基因上而實現(xiàn)的。
所述終止區(qū)可源于獲得所述起始區(qū)的同一個基因的3’區(qū)或源于不同基因。已知并且業(yè)已發(fā)現(xiàn)大量的終止區(qū)能滿足相同和不同屬和種的多種宿主。所述終止區(qū)的選擇通常更多地取決于方便性，而不是因為具有任何特殊特性。優(yōu)選地，所述終止區(qū)源于酵母基因，特別是酵母屬、裂殖酵母屬、念珠菌屬或克魯維酵母屬。兩種哺乳動物基因γ干擾素和α2干擾素的3’區(qū)也公知為能在酵母中起作用。
將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入宿主細胞可通過標準技術(shù)將含有感興趣的基因的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入宿主細胞。這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合、脂轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、感染、粒子轟擊、電穿孔、顯微注射、摩擦或能將感興趣的基因?qū)胨拗骷毎娜魏纹渌椒?。所采用的轉(zhuǎn)化方法包括乙酸鋰轉(zhuǎn)化(酶學(xué)方法，194卷，p.186-187，1991)。為方便起見，通過任何方法操作過的，攝入了DNA序列或結(jié)構(gòu)的宿主細胞，在本文中被稱作“轉(zhuǎn)化”的或“重組”的。
目標宿主具有至少一個拷貝的表達結(jié)構(gòu)，并可以具有兩個或兩個以上的表達結(jié)構(gòu)，這取決于所述基因是整合到基因組上的、是擴增的、或是存在于具有多個拷貝數(shù)的染色體外因子上。當所述目標宿主是酵母時，可以使用四種主要類型的酵母質(zhì)粒酵母整合質(zhì)粒(YIps)，酵母復(fù)制質(zhì)粒(YRps)，酵母著絲粒質(zhì)粒(YCps)，和酵母附加型質(zhì)粒(YEps)。YIps缺少酵母復(fù)制起點，因此，必須作為整合到酵母基因組上的因子繁殖。YRps具有源于染色體的自主復(fù)制序列，并且作為中等拷貝數(shù)(20-40)、自主復(fù)制、不穩(wěn)定分離的質(zhì)粒繁殖。YCps具有一個復(fù)制起點和一個著絲粒序列，并且作為低拷貝數(shù)(10-20)、自主復(fù)制、穩(wěn)定分離的質(zhì)粒繁殖。YEPs具有源于酵母2μm質(zhì)粒的復(fù)制起點，并作為高拷貝數(shù)、自主復(fù)制、不規(guī)則分離的質(zhì)粒繁殖。所述質(zhì)粒在酵母中的存在可以通過維持對該質(zhì)粒上的一個標記的篩選而得到保障。特別感興趣的是酵母載體pYES2(購自Invitrogen的YEp質(zhì)粒，提供用于表達的尿嘧啶原養(yǎng)型和GAL1半乳糖誘導(dǎo)型啟動子)，pRS425-pG1(獲自俄亥俄州立大學(xué)的分子遺傳學(xué)副教授T.H.Chang博士的YEp質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有組成型GPD啟動子并產(chǎn)生亮氨酸原養(yǎng)型)，和pYX424(一種具有組成型TP1啟動子并產(chǎn)生亮氨酸原養(yǎng)型的YEp質(zhì)粒；Alber，T.和Kawasaki，G.(1982)，分子和應(yīng)用遺傳學(xué)雜志1419)。
可以通過篩選包含在所導(dǎo)入的結(jié)構(gòu)上的標記鑒定轉(zhuǎn)化的宿主細胞。另外，可將一個獨立的標記結(jié)構(gòu)與需要的結(jié)構(gòu)一起導(dǎo)入，因為很多轉(zhuǎn)化技術(shù)能將很多DNA分子導(dǎo)入宿主細胞。一般，篩選轉(zhuǎn)化宿主在選擇培養(yǎng)基上生長的能力。選擇培養(yǎng)基可以含有一種抗生素或缺少一種未轉(zhuǎn)化的宿主所必需的因子，如營養(yǎng)或生長因子。因此，所導(dǎo)入的標記基因可以產(chǎn)生抗生素抗性，或編碼一種必需的生長因子或酶，并且，在轉(zhuǎn)化的宿主中表達以后，能夠在選擇培養(yǎng)基上生長。當表達的標記蛋白可以直接或間接檢測時，也可以進行轉(zhuǎn)化宿主的篩選。所述標記蛋白可以單獨表達或作為與其它蛋白的融合體表達。所述標記蛋白可以通過其酶促活性檢測；例如，β半乳糖苷酶能將底物X-gal轉(zhuǎn)化成有色產(chǎn)物，而螢光素酶能將螢光素轉(zhuǎn)化成發(fā)光產(chǎn)物。所述標記蛋白可以通過其發(fā)光或改變了的特性檢測例如，維克多水母(Aequoreavictoria)的綠色熒光蛋白在發(fā)光時產(chǎn)生蘭色熒光?？蓪⒖贵w用于檢測存在于諸如感興趣的蛋白上的標記蛋白或分子標記。例如，可以通過肉眼，或通過諸如FACS的技術(shù)或利用抗體淘選篩選表達標記蛋白或標記的細胞。為了篩選酵母轉(zhuǎn)化體，任何能在酵母中起作用的標記均可使用。理想的是，感興趣的有對卡那霉素和氨基糖苷G418的抗性，以及在缺少尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸、或色氨酸的培養(yǎng)基上生長的能力。
由Δ5-脫氫酶-介導(dǎo)的PUFAs的生產(chǎn)可以在原核或真核宿主細胞中進行。感興趣的原核細胞包括埃希氏菌屬、芽胞桿菌屬、乳桿菌屬、藍細菌屬等。真核細胞包括諸如產(chǎn)乳動物的哺乳動物細胞，諸如雞的禽細胞，和適于遺傳操作的其它細胞，包括昆蟲、真菌、和藻類細胞。所述細胞可以作為包括動物在內(nèi)的宿主生物的一部分或全部培養(yǎng)或構(gòu)成該宿主生物的一部分或全部。在利用細胞生產(chǎn)PUFAs時，特別是進行基因轉(zhuǎn)移，細胞定向和篩選時，還可以使用病毒和噬菌體。在一種優(yōu)選實施方案中，所述宿主是能產(chǎn)生DGLA和/或能同化外源添加的DGLA的，優(yōu)選能產(chǎn)生大量DGLA的任何微生物或動物。宿主動物的例子包括小鼠、大鼠、兔、雞、鵪鶉、火雞、牛、綿羊、豬、山羊、牦牛等，這些動物適于遺傳操作和克隆，以便迅速擴增轉(zhuǎn)基因表達群體。對動物來說，通過改變其基因調(diào)控區(qū)，Δ5-脫氫酶轉(zhuǎn)基因可適于在靶器官、組織和體液中表達。特別感興趣的是在所述宿主動物的乳汁中產(chǎn)生PUFAs。在酵母中表達宿主微生物的例子包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，或諸如念珠菌屬、克魯維酵母屬的其它酵母或其它真菌，例如，絲狀真菌，如曲霉屬、鏈孢霉屬、青霉屬等。例如，宿主微生物的理想特征是，它在遺傳學(xué)上已做過完善的鑒定，可被用于通過超高密度發(fā)酵進行產(chǎn)物的高水平表達，并且被列在GRAS(一般被認為是安全的)目錄上，因為所提供的最終產(chǎn)物將會由人攝入。特別感興趣的是將酵母，尤其是面包酵母(釀酒酵母)用作本發(fā)明的細胞宿主。特別感興趣的菌株有SC334(Matαpep4-3prbl-1122ura3-52leu2-3，112regl-501gal1；基因8357-64，1989，Hovland P.等)，YTC34(αade2-101his3Δ200lys2-801ura3-52；獲自俄亥俄州立大學(xué)的分子遺傳學(xué)副教授T.H.Chang博士)，YTC41(a/αura3-52/ura3＝52lys2-801/lys2-801ade2-101/ade2-101trp1-Δ1/trp1-Δ1his3Δ200/his3Δ200/leu2Δ1/leu2Δ1；獲自俄亥俄州立大學(xué)的分子T.H.Chang博士)，BJ1995(獲自酵母遺傳學(xué)資源中心，1021Donner實驗室，伯克萊，CA94720)，INVSC1(Matαhiw3Δ1 leu2trp1-289ura3-52；獲自Invitrogen，1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA92008)和INVSC2(Matαhis3Δ200ura3-167；獲自Invitrogen)。在禽物種中表達為了在諸如雞、火雞、鵪鶉和鴨的禽物種和細胞中生產(chǎn)PUFAs，可以按照本領(lǐng)域已知的方法通過將一個編碼Δ5-脫氫酶的核酸序列導(dǎo)入所述細胞實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。如果需要轉(zhuǎn)基因動物，可以提供具有攜帶Δ5-脫氫酶編碼轉(zhuǎn)基因的載體的胚胎多能干細胞，并發(fā)育成成體動物(USPN5,162,215；Ono等(1996)比較生物化學(xué)和生理學(xué)A113(3)287-292；WO9612793；WO9606160)。在大多數(shù)場合下，要將所述轉(zhuǎn)基因修飾成高水平表達所述脫氫酶，以便提高PUFAs的產(chǎn)量。例如，所述轉(zhuǎn)基因可以通過提供能在禽細胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控區(qū)進行修飾，如能指導(dǎo)在特定組織和諸如卵黃的卵部分中表達的啟動子。所述基因調(diào)控區(qū)可獲自多種來源，包括雞貧血或禽造白細胞組織增生病毒或諸如雞卵清蛋白基因的禽基因。在昆蟲細胞中表達在昆蟲細胞中生產(chǎn)PUFAs可以利用具有Δ5-脫氫酶轉(zhuǎn)基因的桿狀病毒表達載體進行。桿狀病毒表達載體可從若干商業(yè)渠道獲得，如Clonetech。還提供了用于生產(chǎn)雜交和轉(zhuǎn)基因藻類菌株的方法，如海藻，所述藻類含有并能表達脫氫酶轉(zhuǎn)基因。例如，可以按照披露于USPN5,426,040中的方法制備轉(zhuǎn)基因海藻。與上述其它表達系統(tǒng)一樣，通過將所述多肽編碼序列與為了特定目的而選擇的合適轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控區(qū)組合，可以調(diào)控所述脫氫酶轉(zhuǎn)基因的表達時間、程度和活性。特別感興趣的是能在預(yù)定生長條件下誘導(dǎo)的啟動子區(qū)，例如，通過將溫度敏感型和/或代謝效應(yīng)型突變引入所述脫氫酶轉(zhuǎn)基因編碼序列、其調(diào)控區(qū)、和/或?qū)朐撧D(zhuǎn)基因的細胞的基因組，可實現(xiàn)上述目的。在植物中表達在植物中生產(chǎn)PUFAs可以利用各種植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進行，如利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、植物病毒、粒子細胞轉(zhuǎn)化等，以上方法披露于本申請人的相關(guān)申請中美國申請流水號08/834,033和08/956,985以及與本申請同時申請的部分后續(xù)申請，以上所有專利均被收作本文的參考文獻。
在適于需要的最終結(jié)果的合適條件下，生長轉(zhuǎn)化的宿主細胞，對于生長在培養(yǎng)物中的宿主細胞來說，所述條件通常被優(yōu)化成能產(chǎn)生最大或最經(jīng)濟型產(chǎn)量的PUFAs，其中涉及特定的脫氫酶活性，可以優(yōu)化的培養(yǎng)基條件包括碳源、氮源、添加的底物、添加底物的終濃度、所添加底物的形式、需氧或厭氧生長、生長溫度、誘導(dǎo)劑、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時的生長階段、收獲時的生長階段、pH、密度、和篩選的維持。例如，諸如酵母的微生物優(yōu)選利用感興趣的選擇培養(yǎng)基生長，其中，包括酵母蛋白胨肉湯(YPD)和基本培養(yǎng)基(含有氨基酸、酵母氮堿基、和硫酸銨，并缺少用于選擇的成分，例如尿嘧啶)。優(yōu)選地，加入的底物首先溶解在乙醇中。如果必要，可以誘導(dǎo)感興趣的多肽表達，例如，通過摻入或添加半乳糖誘導(dǎo)由GAL啟動子啟動的表達。在動物中表達宿主動物細胞中的表達同樣可以瞬時方式實現(xiàn)。瞬時表達可以通過已知方法進行，例如，感染或脂感染，并可以重復(fù)，以便維持需要導(dǎo)入結(jié)構(gòu)的表達水平(參見Ebert，PCT公開文件WO94/05782)。穩(wěn)定表達可以通過將一個結(jié)構(gòu)整合到宿主基因組上，產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因動物而實現(xiàn)。例如，所述結(jié)構(gòu)可以通過如下方式導(dǎo)入將該結(jié)構(gòu)顯微注射到可育卵的前核中，或通過轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或其它技術(shù)將所述結(jié)構(gòu)導(dǎo)入細胞系，所述細胞系可以形成成體動物或結(jié)合到成體動物上(US4,873,191；US5,530,177；US5,565,362；US5,366,894；Wilmut等(1997)自然385；810)。將重組卵或胚胎轉(zhuǎn)移到代理母親體內(nèi)(US4,873,191；US5,530,177；US5,565,362；US5,366,894；Wilmut等(同上))。在出生以后，鑒定轉(zhuǎn)基因動物，例如，通過根據(jù)一種導(dǎo)入的標記基因的存在進行鑒定，如觀察皮毛顏色，或通過PCR或血、乳或組織樣品的Southern印跡分析檢測導(dǎo)入的結(jié)構(gòu)，或通過免疫學(xué)或酶學(xué)測定檢測表達的蛋白或由表達的蛋白產(chǎn)生的產(chǎn)物(US4,873,191；US5,530,177；US5,565,362；US5,366,894；Wilmut等(同上))。所得到的轉(zhuǎn)基因動物可以是全面轉(zhuǎn)基因的或者是嵌合型的，僅在其一部分細胞中具有轉(zhuǎn)基因。哺乳動物克隆的出現(xiàn)，提供了在獲得了含有導(dǎo)入的結(jié)構(gòu)的“建立者”動物或細胞之后進行快速、大規(guī)模生產(chǎn)的可能性，所述哺乳動物克隆的出現(xiàn)，是通過將成核細胞與去核的卵融合，然后轉(zhuǎn)移到代理母親體內(nèi)而實現(xiàn)的；在此之前，所述轉(zhuǎn)基因必需存在于用于繁殖的動物的種系中(Wilmut等(同上))。
在宿主動物中表達具有某些優(yōu)點，特別是當所述宿主是家養(yǎng)動物時。為了在容易從宿主動物上獲得的諸如乳汁的流體中生產(chǎn)PUFAs，可以在雌性宿主的乳腺細胞中表達所述脫氫酶轉(zhuǎn)基因，并且，改變所述宿主細胞的PUFAs含量。所述脫氫酶轉(zhuǎn)基因可以適當表達，以便能滯留在乳腺細胞中，或分泌到乳汁中，以形成局限于乳汁中的PUFAs反應(yīng)產(chǎn)物(PCT公開文件WO95/24488)?？梢岳锰囟ǖ恼{(diào)控序列在乳腺組織中進行定向表達，如牛α-乳清蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、或乳清酸性蛋白，并可以選擇地含有一個或幾個內(nèi)含子/或分泌信號序列(US5,530,177；Rosen，US5,565,362；Clark等，US5,366,894；Garner等，PCT公開文件WO95/23868)。脫氫酶轉(zhuǎn)基因的表達，或適用于這種方式的反義脫氫酶轉(zhuǎn)錄物，可用于改變存在于所述動物乳汁中的特定PUFAs或其衍生物的含量。另外，所述Δ5-脫氫酶轉(zhuǎn)基因可以自身表達或與其它轉(zhuǎn)基因一起表達，以便產(chǎn)生類似于人類乳汁的含有較高比例的需要的PUFAs或PUFAs比例和濃度的動物乳汁(Prieto等，PCT公開文件WO95/24494)。脂肪酸的純化在其Δ5位置上去飽和的脂肪酸可以游離脂肪酸或諸如乙酰甘油、磷脂、硫脂或糖脂的綴合形式存在于宿主微生物或動物中，并可以通過本領(lǐng)域眾所周知的多種方法從所述宿主細胞中提取。所述方法可以包括用有機溶劑提取，超聲處理，諸如利用二氧化碳超臨界流體提取，以及諸如加壓的物理方法，或這些方法的組合。特別感興趣的是用甲醇或氯仿提取。如果需要，可將含水層酸化，使其質(zhì)子化為帶負電荷的部分，并因而加強需要的產(chǎn)物向有機層的分配。在提取以后，可通過在氮氣流下蒸發(fā)，除去有機溶劑。當以綴合形式提取時，只對產(chǎn)物進行酶促或化學(xué)裂解，以釋放出游離脂肪酸或感興趣的不太復(fù)雜的綴合物，然后進行進一步的操作，以產(chǎn)生需要的最終產(chǎn)物。優(yōu)選地，用氫氧化鉀裂解綴合形式的脂肪酸。
如果需要進一步純化，可以采用標準方法。這些方法可以包括用尿素提取，處理，分級結(jié)晶，HPLC，分級蒸餾，硅凝膠層析，高速離心或蒸餾，或上述技術(shù)的組合。對諸如酸基或鏈烯基的活性基團的保護可以通過已知技術(shù)在任何步驟進行，例如，烷基化或碘化。所使用的方法包括將脂肪酸甲基化產(chǎn)生甲酯。類似地，保護基團可以在任何步驟除去。優(yōu)選地，可以通過用尿素處理和/或分級蒸餾實現(xiàn)含有ARA、DHA、和EPA級分的純化。脂肪酸的用途本發(fā)明的脂肪酸具有若干用途?；诒景l(fā)明DNAs的探針可用于提取相關(guān)分子的方法或用于檢測表達脫氫酶的生物的方法。在被用作探針時，所述DNAs或寡核苷酸必須是可檢測的。這一目的通常是通過將一個標記連接在內(nèi)部位點，例如，通過摻入一個修飾過的殘基，或連接在其5’或3’末端而實現(xiàn)。所述標記可以是直接可檢測的，可以與被可檢測地標記過的二級分子結(jié)合，或者與一個未標記過的二級分子和一個可檢測地標記過的三級分子結(jié)合；這一過程可以延長，只要能獲得另人滿意的可檢測的信號而沒有不可接受的背景信號水平即可。二級、三級或橋連系統(tǒng)可以包括抗任何其它分子的抗體的利用，包括標記物或其它抗體，或可以包括能相互連接的任何分子，例如，生物素-鏈霉親和素/親和素系統(tǒng)。可檢測的標記通常包括放射性同位素，能通過化學(xué)或酶促方法產(chǎn)生或改變光線的分子，能產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)產(chǎn)物的酶，磁性分子，熒光分子或在結(jié)合以后其熒光或發(fā)光特性改變的分子。標記方法的例子參見USPN5,011,770，另外靶分子的結(jié)合可以直接檢測，通過等溫滴定熱量法，測定在探針與靶結(jié)合時溶液的熱量變化，或通過將所述探針或靶涂在一個表面上，并檢測因為結(jié)合靶或探針而分別在該表面上產(chǎn)生反射光的變化，可以用BIAcore系統(tǒng)進行。
通過重組方法生產(chǎn)的PUFAs可應(yīng)用于多種領(lǐng)域。以各種方式給人體或動物補充PUFAs不僅可以導(dǎo)致添加的PUFAs的含量提高，而且，可提高其代謝產(chǎn)物的含量。例如，當個體的固有Δ5-脫氫酶途徑出現(xiàn)故障時，用ARA處理不僅能導(dǎo)致ARA含量的提高，而且，能提高諸如前列腺素的ARA的下游產(chǎn)物的含量(參見圖1)。復(fù)雜的調(diào)控機制可能需要合并各種PUFAs或增加PUFAs不同綴合物，以便避免、控制或克服所述機制，在個體中達到特定PUFAs的需要水平。營養(yǎng)組合物本發(fā)明還包括營養(yǎng)組合物。本發(fā)明的組合物包括用于人體吸收的一切食品或制劑，包括用于腸胃吸收或腸胃外吸收，所述組合物在攝入身體以后(a)起到營養(yǎng)或組建組織或補充能量的作用和/或(b)維持、恢復(fù)或支持適當?shù)臓I養(yǎng)狀態(tài)或代謝功能。
本發(fā)明的營養(yǎng)組合物至少包括一種按照本發(fā)明方法生產(chǎn)的油或酸，并可以是固體或液體形式。另外，所述組合物可以包括可食用的常量營養(yǎng)物、維生素和礦物質(zhì)，其含量適用特定用途的需要。所述成分的含量可根據(jù)以下條件而變化所述組合物是用于正常、健康的嬰兒、兒童還是用于具有特殊要求的成年人，如伴隨有某種代謝癥狀(例如，代謝障礙)的成年人。
可添加到所述組合物中的常量營養(yǎng)物的例子包括，但不限于食用脂肪、碳水化合物和蛋白。所述食用脂肪的例子包括，但不限于椰子油、大豆油、和甘油一酯和二酯。所述碳水化合物的例子包括，但不限于葡萄糖、食用乳糖和水解淀粉。另外，可用于本發(fā)明營養(yǎng)組合物中的蛋白的例子包括，但不限于大豆蛋白、電滲析乳清、電滲析脫脂奶、乳清、或上述蛋白的水解產(chǎn)物。
就維生素和礦物質(zhì)而言，可將下列成分添加到本發(fā)明的營養(yǎng)組合物中鈣、磷、鉀、鈉、氯、鎂、錳、鐵、銅、鋅、硒、碘和維生素A、E、D、C和B復(fù)合物。也可以添加諸如此類的其它維生素和礦物質(zhì)。
用于本發(fā)明的營養(yǎng)組合物中的成分為半純化或純化來源。半純化或純化是指通過純化天然材料或通過合成而制備的材料。
本發(fā)明的營養(yǎng)組合物的例子包括，但不限于嬰兒配方食品、保健食品、和再水合組合物。特別感興趣的營養(yǎng)組合物包括，但不限于用于為嬰兒腸道和腸胃外補充營養(yǎng)的組合物，特殊的嬰兒配方食品，老年人保健品，和供具有胃腸道疾病和/或吸收障礙的患者食用的保健品。營養(yǎng)組合物本發(fā)明的典型的營養(yǎng)組合物含有食用常量營養(yǎng)物、維生素和礦物質(zhì)，其用量符合特定用途的需要。所述成分的用量可根據(jù)下列條件而變化該制劑是用于臨時受到脅迫的正常的、健康的個體，或用于由于某種慢性或急性疾病狀態(tài)(例如，代謝障礙)而具有特殊要求的患者。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解用于本發(fā)明營養(yǎng)制劑中的成分是半純化的或純化的。半純化或純化是指通過純化天然材料或通過合成而制備的材料。以上技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的(例如，參見聯(lián)邦食品成分和食品加工管理條例；推薦的飲食許可，第10版，國家學(xué)術(shù)出版社，華盛頓特區(qū)，1989)。
在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的營養(yǎng)制劑是一種腸道營養(yǎng)制品，更優(yōu)選是一種成年人或兒童腸道營養(yǎng)制品。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種營養(yǎng)制劑，這種制劑適于喂養(yǎng)已經(jīng)歷脅迫的成年人。該配方食品除了本發(fā)明PUFAs之外，還包括常量營養(yǎng)物、維生素和礦物質(zhì)，其用量被設(shè)計成能提供成年人的日常營養(yǎng)需要。
所述主要營養(yǎng)成分包括食用脂肪、碳水化合物和蛋白。代表性食用脂肪有椰子油、大豆油和甘油一酯和二酯，以及本發(fā)明的PUFAs油。典型的碳水化合物是葡萄糖、食用乳糖和水解玉米淀粉。典型的蛋白來源是大豆蛋白、電滲析乳清或電滲析脫脂奶或乳清、或上述蛋白的水解產(chǎn)物，不過也可以得到和使用其它蛋白來源。所述常量營養(yǎng)物以常見的營養(yǎng)化合物形式加入，其添加量相當于人乳汁中的含量或能量基礎(chǔ)，即以每卡路里為基礎(chǔ)。
用于制備液體和腸道營養(yǎng)配方食品的方法在本領(lǐng)域中眾所周知，并在實施例中詳細說明。
可以對腸道配方食品進行消毒，并隨后用作隨時食用(RTF)的基礎(chǔ)或儲存在濃縮液體或粉末中。所述粉末可以通過按對上述方法制備的腸道配方食品進行噴霧干燥制備，而且，通過使該濃縮物重新水合可以重構(gòu)所述配方食品。成年人和嬰兒營養(yǎng)配方食品在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并可以由商業(yè)渠道購買(由Abbott實驗室的Ross產(chǎn)品部出售的Similac，Ensure，Jevity和Alimentum)?？蓪⒈景l(fā)明的油或酸以下文所述的用量添加到上述任一種配方食品中。
在液體形式下，所述營養(yǎng)組合物的能量密度通常可以在大約0.6-3.0Kcals/ml范圍內(nèi)。在固體或粉末形式下，所述營養(yǎng)保健品可以含有大約1.2-9Kcals/g，優(yōu)選3-7Kcals/g。一般，液體制品的滲透壓應(yīng)當?shù)陀?00mOsm，更優(yōu)選低于660mOsm。
所述營養(yǎng)配方食品除了本發(fā)明的PUFAs之外通常還包括維生素和礦物質(zhì)，以便幫助個體攝入所述物質(zhì)的最低日常需求。除了上面列舉的PUFAs之外，還需要為所述營養(yǎng)組合物補充鋅、銅、和葉酸以及抗氧化劑。據(jù)信，上述物質(zhì)也能加強受到脅迫的免疫系統(tǒng)，因此為所述個體帶來進一步的好處。鋅、銅或葉酸的存在是選擇性的，而不是必需的，以便對免疫抑制產(chǎn)生有益影響。類似地，藥用組合物中也已補充上述物質(zhì)。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述營養(yǎng)組合物除了所述抗氧化劑系統(tǒng)和PUFAs成分之外還含有一種碳水化合物來源，其中，占所述碳水化合物至少5％的是一種可攝入的寡聚糖。在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述營養(yǎng)組合物另外含有蛋白、牛黃酸和肉堿。
通過公開方法制備的PUFAs或其衍生物可被用作食用替代品或保健品，特別是嬰兒配方食品，用于對患者進行靜脈輸液或用于預(yù)防或治療營養(yǎng)不良。通常，人類乳汁的脂肪酸分布為，包括大約0.15％至大約0.36％的DHA，大約0.03％至大約0.13％的EPA，大約0.30％至大約0.88％的ARA，大約0.22％至大約0.67％的DGLA和0.27％至大約1.04％的GLA。另外，有報導(dǎo)稱人乳汁中的主要甘油三酯是1，3-二-油酰-2-棕櫚酰，還報導(dǎo)說2-棕櫚酰甘油酯的吸收好于2-油?；?-亞油酰甘油酯的吸收(USPN4,876,107)。因此，本發(fā)明生產(chǎn)的諸如ARA、DGLA、GLA和/或EPA的脂肪酸可被用于改變嬰兒配方食品的組成，以便更好地重現(xiàn)人乳汁的PUFA組成。具體地講，用于藥物和保健食品，特別是母乳替代品或添加物中的油類組合物優(yōu)選包括ARA、DGLA和GLA中的一種或幾種。更優(yōu)選，所述油包括大約0.3-30％的ARA，大約0.2-30％的DGLA，和大約0.2-30％的GLA。
除了其濃度之外，可以調(diào)整ARA、DGLA和GLA的比例，以適應(yīng)特定的最終用途。在制備母乳添加物或代用品時，油類組合物含有ARA、DGLA和GLA中的兩種或兩種以上，其比例大約為1∶19∶30至6∶1∶0.2。例如，動物乳汁的ARA∶DGLA∶DGL的比例為1∶19∶30至6∶1∶0.2，其中，包括中間比例，該中間比例優(yōu)選為大約1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶4。當與一種宿主細胞一起生產(chǎn)時，調(diào)整諸如ARA和DGLA的前體底物向ARA轉(zhuǎn)化率和百分比可以精確控制PUFA的比例。例如，5-10％的DGLA向ARA轉(zhuǎn)化的比例，可被用于產(chǎn)生約1∶19的ARA與DGLA的比例，而大約75-80％的轉(zhuǎn)化率可被用于產(chǎn)生大約6∶1的ARA與DGLA的比例。因此，無論是在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)還是在宿主動物中，按所述方法調(diào)節(jié)脫氫酶表達的時間、程度和特異性，可被用于調(diào)節(jié)PUFA的含量和比例。根據(jù)所使用的表達系統(tǒng)，例如，細胞培養(yǎng)物或能在其乳汁中表達油類的動物，還可以提取所述油類并以需要的濃度和比例重新混合。具有所述PUFA比例的油類可以通過以下標準方法確定。還可將PUFAs或含有它的宿主細胞用作動物保健食品，以便改變動物組織或乳汁脂肪酸的組成，使其更有利于人或動物吸收。
對于保健食品來說，可將純化的PUFAs或其衍生物添加到烹飪油、脂肪或配制的人造黃油中，以便在正常使用時受體即可獲得需要的量。還可將PUFAs摻入嬰兒配方食品、營養(yǎng)保健品或其它食品中，還可將其用作消炎或膽甾醇降低劑。藥用組合物本發(fā)明還包括含有按照本文所披露的本發(fā)明的方法生產(chǎn)的一種或幾種酸和/或所生成的油的藥用組合物。更具體地講，所述藥用組合物可以包括一種或幾種所述酸和/或油，以及一種標準的、眾所周知的、無毒的、可以藥用的載體、佐劑或載體，如磷酸緩沖的鹽溶液、水、乙醇、多元醇、植物油、濕潤劑或諸如水/油乳液的乳液。所述組合物可以是液體或固體形式。例如，所述組合物可以是片劑、膠囊、可攝取的液體或粉末、可注射的、或外用軟膏或霜劑形式。
例如，服用的可行途徑包括，口服、直腸使用和腸胃外使用。當然，服用的途徑取決于需要的效果。例如，如果該組合物被用于治療粗糙、干燥、或老化的皮膚，用于治療受傷或燒傷的皮膚，或用于治療受疾病或病癥影響的皮膚或毛發(fā)，就可以涂在表皮上。
患者服用所述組合物的劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)諸如患者體重、患者年齡、患者的免疫狀態(tài)等的各種因素確定。
例如，就劑型而言，所述組合物可以是溶液、分散劑、懸浮液、乳液或消毒的粉末，這種粉末可在以后重建。
另外，本發(fā)明的組合物還可用于美容目的?？蓪⑵涮砑拥浆F(xiàn)有的化妝品組合物中，以便制成一種混合物，或者用作單一的組合物。
藥用組合物還可被用于給個體服用PUFA成分。合適的藥用組合物可以包括生理上可以接受的無菌水或非水溶液，分散劑，懸浮液或乳液，以及用于重建成用于攝入的無菌溶液或分散劑的無菌粉末。合適的含水和無水載體、稀釋劑、溶劑或載體的例子包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、和甘油等)，其合適的混合物，植物油(如橄欖油)和諸如油酸乙酯的可注射的有機酯。例如，對于分散劑來說，通過維持需要的粒度和通過使用表面活性劑可以維持合適的流動性?？赡苓€需要增加等滲劑，例如，糖和氯化鈉等。除了上述惰性稀釋劑之外，所述組合物還可以包括諸如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑、增甜劑、香味劑和芳香劑的佐劑。
對懸浮液來說，除了所述活性化合物之外，還可以包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇，聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯，微晶纖維素，偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂-瓊脂和黃蓍膠或上述物質(zhì)的混合物等。
諸如片劑和膠囊的固體劑型可以用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備。例如，本發(fā)明的PUFAs可以用諸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉的常規(guī)片劑基材制成片劑，所述片劑與諸如阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠的粘結(jié)劑，諸如馬鈴薯淀粉或藻酸之類的崩解劑和諸如硬脂酸或硬脂酸鎂的潤滑劑組合。通過將所述賦形劑連同所述抗氧化劑和PUFA成分一起摻入明膠膠囊制備膠囊。摻入藥用制劑中的抗氧化劑和PUFA成分的量應(yīng)當落入上述規(guī)定的范圍。
在本申請中，“治療”一詞是指預(yù)防或降低不需要的癥狀的發(fā)病率。例如，治療免疫抑制是指預(yù)防這種抑制的發(fā)生或減弱這種抑制的量。術(shù)語“患者”和“個體”可以互換使用，這兩個詞都是指動物。本申請中所說的“動物”一詞是指所有溫血動物，包括，但不限于狗、人、猴子、和猿。在本申請中，“大約”一詞是指根據(jù)具體應(yīng)用在標明的范圍或數(shù)量的基礎(chǔ)上波動合理的量。在本說明書中所規(guī)定的所有數(shù)量或范圍都應(yīng)當被視為由術(shù)語“大約”修飾。
“劑量”和“用量”可以互換使用，并且是指在單一的方案中由患者攝取的營養(yǎng)或藥用組合物的量，所述方案被設(shè)計用于輸送有效量的抗氧化劑和結(jié)構(gòu)甘油三酯。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的是，液體營養(yǎng)粉的單一劑量或用量應(yīng)當提供上文所述量的抗氧化劑和PUFAs。所述劑量或用量應(yīng)當是一個典型的成年人在一次用藥時能夠消耗的體積。所述量可以根據(jù)患者的年齡、體重、性別或醫(yī)學(xué)癥狀而有很大的變化。不過，作為一般的原則，液體營養(yǎng)藥物的單一用量或劑量應(yīng)當被視為包括100-600ml的體積，更優(yōu)選125-500ml，最優(yōu)選125-300ml。
即使不需要對其飲食進行補充，也可將本發(fā)明的PUFAs添加到食品中。例如，可將所述組合物添加到任何類型的食品中，包括，但不限于人造黃油、改性黃油、奶酪、奶、酸奶、巧克力、糖果、小吃、沙拉油、烹飪油、烹飪脂肪、肉、魚和飲料。藥用用途就藥用用途(人用或獸用)而言，所述組合物通常通過口服服用，不過，可以通過能成功地吸收它的任何途徑服用，例如，腸胃外(即皮下、肌內(nèi)或靜脈)，直腸或陰道或表皮使用，例如，作為皮膚軟膏或洗液。本發(fā)明的PUFAs可以單獨使用或與可以藥用的載體或賦形劑組合使用。在可能的情況下，明膠膠囊是優(yōu)選的口服劑型。上文所提出的保健食品也可以提供一種口服途徑。本發(fā)明的不飽和酸可以綴合形式、或作為鹽、酯、酰胺或所述脂肪酸的藥物前體服用。本發(fā)明包括所有可以藥用的鹽；特別優(yōu)選的是鈉鹽、鉀鹽或鋰鹽。還包括諸如N-烷基多羥胺鹽，參見PCT公開文件WO96/33155。優(yōu)選地酯是乙酯。作為固體鹽，所述PUFAs還可以片劑形式服用。為了靜脈內(nèi)服用，可將所述PUFAs或其衍生物摻入諸如Intralipids的市售制劑中。典型的正常成年人血漿脂肪酸組成為，包括6.64-9.46％的ARA，1.45-3.11％的DGLA和0.02-0.08％的GLA。所述PUFAs或其代謝前體可以單獨服用或用于與其它PUFAs組成的混合物一起使用。以便在患者體內(nèi)達到正常的脂肪酸分布。如果需要，制劑的每一種成分可以分別以試劑盒形式提供，以便單獨使用或多次使用。特定脂肪酸的典型劑量為每天0.1毫克至20克，或者甚至100克，而且，如果需要優(yōu)選為每天10毫克至1、2、5或10克，或者它的摩爾當量的衍生物形式。腸胃外營養(yǎng)復(fù)合物包括以本發(fā)明所包括的甘油三酯為參數(shù)計算的重量百分比大約為2-30％的脂肪酸；優(yōu)選為含有重量百分比大約占總PUFA組合物重量1-25％的GLA(USPN5,196,198)。可以選擇性地添加其它維生素，特別是脂溶性維生素，如維生素A、D、E和L-肉堿。如果需要，可以添加諸如α生育酚的防腐劑，通常大約占其重量的0.1％。
合適的藥用組合物可以包括生理學(xué)上能接受的無菌水溶液或非水溶液，分散劑，懸浮液或乳液，以及用于重建成無菌注射液或分散劑的無菌粉末。合適的水和非水載體、稀釋劑、溶劑或載體的例子包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇和甘油等)，它們的合適的混合物，植物油(如橄欖油)和諸如油酸乙酯的可注射的有機酯。例如，對于分散劑來說，通過維持需要的粒度和通過使用表面活性劑可以維持合適的流動性?？赡苓€需要增加等滲劑，例如糖和氯化鈉等。除了上述惰性稀釋劑之外，所述組合物還可以包括諸如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑、增甜劑、香味劑和芳香劑的佐劑。
對懸浮液來說，除了所述活性化合物之外，還可以包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇，聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯，微晶纖維素，偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂-瓊脂和黃蓍膠或上述物質(zhì)的混合物等。
一種特別優(yōu)選的藥用組合物含有溶解在水基質(zhì)或溶劑中的二乙酰酒石酸單-和二甘油酯。二乙酰酒石酸單-和二甘油酯的HLB值大約為9-12，并且比現(xiàn)有的、HLB值為2-4的抗菌脂類明顯更加親水。所述現(xiàn)有的疏水脂類不能制成含水組合物。如本文所披露的，現(xiàn)在可將這種脂類與二乙酰酒石酸的單-和二甘油酯一起溶解到含水介質(zhì)中。按照本實施方案，將二乙酰酒石酸的單-和二甘油酯(例如，DATEM-C12∶0)與其它活性抗菌脂類(例如，18∶2和12∶0單甘油酯)一起熔化，并混合，以得到均勻的混合物。均勻性可以提高抗菌活性。該混合物可以完全分散在水中。在不添加二乙酰酒石酸的單-和二甘油酯、并且在導(dǎo)入水中之前與其它單甘油酯預(yù)混合的情況下這是不可能的。然后，可以在無菌條件下將所述含水組合物與生理上可以接受的稀釋劑、防腐劑、緩沖液或制備噴霧劑或吸入劑所需要的推進劑混合。
本發(fā)明還包括用脂肪酸治療多種疾病。含有本發(fā)明PUFAs的保健品可用于治療血管成型術(shù)之后的再狹窄?？梢杂帽景l(fā)明的PUFAs治療炎癥、類風濕關(guān)節(jié)炎和哮喘及牛皮癬。有證據(jù)表明PUFAs可能參與了鈣的代謝，表明本發(fā)明的PUFAs可用于治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松和腎結(jié)石或尿路結(jié)石。
本發(fā)明的PUFAs可用于治療癌癥。業(yè)已證實惡性細胞具有改變了的氨基酸組成；業(yè)已證實添加脂肪酸能延緩其生長，并導(dǎo)致細胞死亡，并能增強其對化療劑的感受性。業(yè)已證實GLA能引起癌細胞再表達E-鈣粘蛋白細胞粘著分子，這種分子的喪失與入侵性轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)。給胰腺癌患者臨床試驗靜脈服用水溶性GLA鋰鹽，從統(tǒng)計學(xué)上看顯著提高了其存活率。PUFA保健品還可用于治療與癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)。
本發(fā)明的PUFAs還可用于治療糖尿病(USPN4,826,877；Horrobin等，美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志，57卷(增刊)，732S-737S)。在患糖尿病的動物體內(nèi)業(yè)已證實了改變了的脂肪酸代謝和組成。這種改變業(yè)已表明與由糖尿病引起的某些長期并發(fā)癥相關(guān)，包括視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病、腎病和生殖系統(tǒng)損傷。業(yè)已證實含有GLA的月見草油能預(yù)防并逆轉(zhuǎn)糖尿病性神經(jīng)損傷。
本發(fā)明的PUFAs可用于治療濕疹，降低血壓并提高數(shù)學(xué)得分。業(yè)已證實必需脂肪酸缺陷與濕疹相關(guān)，而且研究業(yè)已證實了用GLA治療濕疹具有良好效果。還證實GLA能降低與緊張相關(guān)的血壓升高。并能提高在計算測驗中的表現(xiàn)。業(yè)已證實GLA和DGLA能抑制血小板聚集，引起血管舒張，降低膽甾醇含量，并抑制血管壁平滑肌和纖維組織的增殖(Brenner等，實驗醫(yī)學(xué)生物學(xué)進展，83卷，p.85-101，1976)。業(yè)已證實單獨服用GLA或DGLA，或與EPA組合使用能降低或預(yù)防胃腸出血，以及其它由非類固醇抗炎藥物引起的副作用(USPN4,666,701)。還證實GLA和DGLA能預(yù)防或治療子宮內(nèi)膜異位和經(jīng)前綜合癥(USPN4,758,592)，并能治療肌痛性腦脊髓炎和在病毒感染之后出現(xiàn)的慢性疲勞(USPN5,116,871)。
本發(fā)明PUFAs的其它用途包括用于治療AIDS、多發(fā)性硬化、急性呼吸道綜合癥、高血壓和炎性皮膚病。本發(fā)明的PUFAs還可用于供一般健康個體使用的配方食品，以及用于老年病治療。獸醫(yī)用途應(yīng)當指出的是，上述藥用和營養(yǎng)組合物可用于動物和人類，因為動物存在著很多與人相同的需要和癥狀。例如，可將本發(fā)明的油或酸用于動物飼料添加劑。
提出以下實施例是為了說明目的，而不是為了限定。
實施例例1從高山被孢霉中提取Δ5-脫氫酶核苷酸序列例2在面包酵母中表達高山被孢霉Δ5-脫氫酶克隆例3培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化例4PUFAs在酵母脂級分中的分布例5其它培養(yǎng)物的優(yōu)化例6鑒定高山被孢霉Δ5和Δ6脫氫酶的同源物例7在其它產(chǎn)PUFA生物中鑒定高山被孢霉Δ5和Δ6脫氫酶的同源物例8在其它產(chǎn)PUFA生物中鑒定高山被孢霉Δ5和Δ6脫氫酶的同源物例9人脫氫酶序列例10營養(yǎng)組合物例1從高山被孢霉中提取Δ5-脫氫酶核苷酸序列高山被孢霉通過Δ5-脫氫酶的作用由前體20∶3產(chǎn)生花生四烯酸(ARA，20∶4)。通過PCR擴增獲得編碼源于高山被孢霉的Δ5-脫氫酶核苷酸序列，利用高山被孢霉的第一股cDNA和相當于源于集胞藻屬和螺旋藻屬的Δ6-脫氫酶之間保守的氨基酸序列的簡并寡核苷酸引物。所采用的方法如下利用Hoge等(1982)實驗真菌學(xué)6225-232的方法從三日齡產(chǎn)PUFA的高山被孢霉培養(yǎng)物中提取總RNA。利用BRL’sλ-ZipLox系統(tǒng)按照生產(chǎn)商的說明用所述RNA制備雙鏈cDNA。分別包裝所述高山被孢霉cDNA的若干大小級分，以得到具有不同平均大小插入片段的文庫?！巴暾L度”文庫含有大約3×106個克隆，平均插入片段大小為1.77kb?！皽y序級”文庫含有大約6×105個克隆，平均插入片段大小為1.1kb。
利用BRL Superscript RTase和引物TSyn(5’-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3’)(序列10)對5μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。簡并寡核苷酸被設(shè)計成在兩種藍細菌Δ6-脫氫酶序列之間保守的片段。所采用的具體引物是D6DESAT-F3(序列8)(5’-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3’)和D6DESAT-R3(序列9)(5’-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3’)，其中，Y＝C+T，R＝A+G，和O＝I+C。PCR擴增是在25μl的體積中進行的，反應(yīng)物中含有源于40ng總RNA的模板，2pM的每一種引物，200μM每一種脫氧核糖核苷三磷酸，60mM Tris-Cl，pH8.5，15mM硫酸銨，2mM氯化鎂。對樣品進行初步地變性步驟，95度(所有溫度均為攝氏度)下5分鐘，然后在72℃下保持，同時加入0.2U的Taq聚合酶。PCR熱循環(huán)條件如下94℃ 1分鐘，45℃ 1.5分鐘，72℃ 2分針。PCR連續(xù)進行35個輪次。用所述引物對高山被孢霉的第一股cDNA進行的PCR產(chǎn)生了550bp的反應(yīng)產(chǎn)物。比較高山被孢霉PCR片段序列3的推定氨基酸序列發(fā)現(xiàn)了與Δ6-脫氫酶同源的片段(參見圖5)。不過，在比較的片段上僅具有大約28％的同源性。
將所述PCR產(chǎn)物用作探針從高山被孢霉文庫中提取相應(yīng)的cDNA克隆。最長的cDNA克隆Ma29被命名為pCGN5521，并且業(yè)已對兩股鏈進行了全面測序。所述cDNA作為一個1481bp的插入片段包含在載體pZL1(Bethesda研究實驗室)上，始于第一個ATG，包括一個編碼446個氨基酸的開放讀框。該讀框包括由所述PCR片段推定的序列。發(fā)現(xiàn)所述cDNA插入片段序列包括與Δ6-脫氫酶同源的片段(參見圖5)。發(fā)現(xiàn)在被孢霉屬序列的氨基酸位置171-175，207-212，和387-391上存在3個保守的“組氨酸框”(這些框被發(fā)現(xiàn)存在于膜結(jié)合脫氫酶上(Okuley等，(1994)植物細胞6147-158))。不過，發(fā)現(xiàn)所述第三個組氨酸框的典型的“HXXHH”氨基酸基序在被孢霉屬脫氫酶中為QXXHH，序列11-12。另人吃驚的是，所述編碼蛋白的氨基末端與細胞色素b5蛋白具有顯著的同源性。因此，高山被孢霉屬cDNA克隆似乎代表了細胞色素b5和脂肪酸脫氫酶之間的一種融合體。因為細胞色素b5被認為起著膜結(jié)合脫氫酶的電子供體的作用，該脫氫酶蛋白的N-末端細胞色素b5結(jié)構(gòu)域可能與其功能有關(guān)。這可能有利于在異源系統(tǒng)中表達所述脫氫酶以便生產(chǎn)PUFA。
例2在面包酵母中表達高山被孢霉脫氫酶克隆酵母轉(zhuǎn)化按照標準方法進行酵母的乙酸鋰轉(zhuǎn)化(酶學(xué)方法，194卷，p.186-187(1991))。簡單地講，在30℃下在YPD中生長酵母。離心沉淀細胞，重新懸浮于TE中，再次離心沉淀，重新懸浮于含有100mM乙酸鋰的TE中，再次離心沉淀，并重新懸浮于TE/乙酸鋰中，在30℃下?lián)u動培養(yǎng)所述重新懸浮的酵母60分鐘。加入載體DNA，并將所述酵母等分到試管中。加入轉(zhuǎn)化DNA，并在30℃下培養(yǎng)所述試管30分鐘。加入PEG溶液(35％(w/v)PEG4000，100mM乙酸鋰，TE pH7.5)，然后在30℃下培養(yǎng)50分鐘。在42℃下進行5分鐘的熱激，讓所述細胞沉淀，用TE洗滌，再次沉淀，并重新懸浮于TE中。然后將重新懸浮的細胞鋪平板于選擇培養(yǎng)基上。在轉(zhuǎn)化酵母中進行脫氫酶表達在面包酵母中篩選源于高山被孢霉的cDNA克隆的脫氫酶活性。將油菜Δ15-脫氫酶(通過PCR獲得，使用源于歐洲油菜栽培種212/86種子的第一股cDNA，并使用基于公開序列的引物(Arondel等，科學(xué)2581353-1355))用作正對照。將Δ15-脫氫酶基因和源于cDNA克隆Ma29的基因插入表達載體pYES2(Invitrogen)，分別得到質(zhì)粒pCGR-2和pCGR-4。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到釀酒酵母菌株334中，并在用半乳糖誘導(dǎo)之后，在有能檢測特殊的脫氫酶活性的底物存在的條件下表達。對照菌株為含有未改變的pYES2載體的釀酒酵母菌株334。所使用的底物、所產(chǎn)生的產(chǎn)物和所標明的脫氫酶活性為DGLA(轉(zhuǎn)化成ARA則表明有Δ5-脫氫酶活性)，亞油酸(轉(zhuǎn)化成GLA則表明有Δ6-脫氫酶活性；轉(zhuǎn)化成ALA則表明有Δ15-脫氫酶活性)，油酸(由釀酒酵母產(chǎn)生的內(nèi)源底物，轉(zhuǎn)化成亞油酸則表明有Δ12-脫氫酶活性，這種活性是釀酒酵母所缺乏的)，或ARA(轉(zhuǎn)化成EPA，則表明有Δ17-脫氫酶活性)。結(jié)果如下面的表1所示。脂類級分是按如下方法提取的在15℃下生長培養(yǎng)物48-52小時。通過離心使細胞沉淀，用無菌雙蒸餾水洗滌一次，并重新沉淀。用甲醇渦旋攪拌沉淀；將氯仿和tridecanoin(作為內(nèi)標)一起加入。在室溫下培養(yǎng)所述混合物至少1小時，或在4℃下培養(yǎng)過夜。萃取氯仿層，通過Whatman濾膜過濾，并用1克無水硫酸鈉除去顆粒和殘余水。在40℃下在氮氣流中蒸發(fā)有機溶劑。然后將萃取過的脂衍生成脂肪酸甲酯(FAME)，通過將2毫升溶解在甲醇中的0.5N氫氧化鉀加入密封的試管進行氣相色譜分析(GC)。將所述樣品加熱到95-100℃，保持30分鐘，并冷卻到室溫。將大約2毫升溶解在甲醇中的14％的三氟化硼加入，并重復(fù)加熱。在萃取過的脂類混合物冷卻之后，加入2毫升水和1毫升己烷，萃取FAME，以便通過GC進行分析。通過用所產(chǎn)生的產(chǎn)物除以(產(chǎn)生的產(chǎn)物和添加的底物)的總數(shù)并乘以100計算轉(zhuǎn)化百分比。為了計算油酸的轉(zhuǎn)化百分比，由于沒有添加底物，用所產(chǎn)生的總亞油酸除以(油酸和產(chǎn)生的亞油酸)的總數(shù)，再乘以100。
表1在面包酵母中表達高山被孢霉脫氫酶克隆 酶活性類型 底物轉(zhuǎn)化％pCGR-2 Δ60(18∶2至18∶3ω6)(油菜Δ15 Δ15 16.3(18∶2至18∶3ω3)脫氫酶) Δ52.0(20∶3至20∶4ω6)Δ17 2.8(20∶4至20∶5ω3)Δ12 1.8(18∶1至18∶2ω6)pCGR-4 Δ60(高山被孢霉 Δ15 0Ma29) Δ515.3Δ17 0.3Δ12 3.3Δ15-脫氫酶控制的克隆表現(xiàn)出底物有16.3％的轉(zhuǎn)化率。表達Ma29cDNA的pCGR-4克隆能將15.3％的20∶3底物轉(zhuǎn)化成20∶4ω6，這表明該基因編碼一種Δ5-脫氫酶。在以上情況下，其背景(底物的非特異轉(zhuǎn)化)為0-3％。通過使用不同濃度的底物發(fā)現(xiàn)了對所述活性的底物抑制。當?shù)孜锾砑拥?00μM的濃度時，與底物添加到25μM的濃度相比，轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的百分比降低(參見下文)。另外，通過在大約5-200μM的濃度范圍內(nèi)改變DGLA底物的濃度，由高山被孢霉Δ5-脫氫酶將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA的百分比在大約5-75％的范圍內(nèi)。
以上數(shù)據(jù)表明，具有不同底物專一性的脫氫酶可以在異源系統(tǒng)中表達，并被用于生產(chǎn)多不飽和長鏈脂肪酸。
表2表示感興趣的脂肪酸，作為從帶有標明的質(zhì)粒的酵母宿主釀酒酵母334中提取的總脂類的百分比。在生長培養(yǎng)基中不含葡萄糖。利用親和氣相層析分離相應(yīng)的脂類。利用GC/MS證實產(chǎn)物的性質(zhì)。當將其底物亞油酸由外源添加到誘導(dǎo)過的酵母培養(yǎng)物時，檢測到了歐洲油菜Δ15-脫氫酶的預(yù)期產(chǎn)物α-亞麻酸。這一發(fā)現(xiàn)表明，脫氫酶基因的酵母表達可以在現(xiàn)有生長條件下產(chǎn)生功能性的酶以及可檢測量的產(chǎn)物。當兩種底物以游離形式添加到誘導(dǎo)過的酵母培養(yǎng)物中時，兩種外源添加的底物均能被酵母吸收，不過摻入酵母中的較長鏈的PUFA二同-γ-亞麻酸(20∶3)略少于亞油酸(18∶2)。當將二同-γ-亞麻酸作為底物添加到釀酒酵母334(pAGL-4)中時，在酵母中檢測到一種新的PUFA花生四烯酸。這證實了pCGR-4(Ma29)是源于高山被孢霉的Δ5-脫氫酶。在此之前，尚未報導(dǎo)過從任何來源提取和表達Δ5-脫氫酶。
表2從酵母中提取的總脂類的脂肪酸百分比
添加100μl底物18∶1*是酵母中的內(nèi)源脂肪酸表的說明18∶1＝油酸18∶2＝亞油酸α-18∶3＝α-亞麻酸γ-18∶3＝γ-亞麻酸18；4＝stearidonic acid20∶3＝二同-γ-亞麻酸20∶4＝花生四烯酸例3培養(yǎng)條件的優(yōu)化表3A表示外源游離脂肪酸底物濃度對酵母吸收和轉(zhuǎn)化成脂肪酸產(chǎn)物的影響，所述轉(zhuǎn)化以占提取的酵母脂類的百分比表示。在所有例子中，少量的外源底物(1-10μM)會導(dǎo)致低的脂肪酸底物吸收和產(chǎn)物形成。在生長和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25-50μM的游離脂肪酸能形成最大百分比的脂肪酸產(chǎn)物，而100μM的濃度以及隨之而來的向酵母中的高吸收，似乎會降低或抑制脫氫酶活性。通過在表3B中對相應(yīng)脂肪酸底物的轉(zhuǎn)化百分比及其相應(yīng)的產(chǎn)物進行比較，可以了解高脂肪酸底物濃度的反饋抑制作用。在所有情況下，生長培養(yǎng)基中100μM的底物濃度都會降低轉(zhuǎn)化成底物的百分比。當生長培養(yǎng)基中存在葡萄糖時，還會出現(xiàn)培養(yǎng)基組成對Δ5-脫氫酶的影響，因為在25μM的濃度下，底物吸收的百分比降低(表3A)。不過，當生長培養(yǎng)基中存在葡萄糖時，由Δ5-脫氫酶產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化百分比提高18％，而形成產(chǎn)物的百分比保持不變。
表3A添加的底物對酵母提取物中摻入底物的百分比和產(chǎn)物形成的影響
表3B培養(yǎng)基中底物濃度對酵母提取物中脂肪酸底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的百分比的影響
◇培養(yǎng)基中不含葡萄糖+酵母蛋白胨肉湯(YPD)*18∶1是一種內(nèi)源酵母脂質(zhì)sub.是底物濃度ND(沒做)表4表示當使用不同量的游離脂肪酸底物時，由誘導(dǎo)過的酵母培養(yǎng)物的重組脫氫酶產(chǎn)生的脂肪酸的量。測定脂肪酸的重量，因為當生長條件改變時，如葡萄糖在酵母生長和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的存在，脂類的總量會急劇變化。為了更好地確定重組脫氫酶能產(chǎn)生最多PUFA產(chǎn)物時的條件，檢測個體脂肪酸的量。葡萄糖的缺乏會使由Δ5-脫氫酶產(chǎn)生的花生四烯酸的量降低一半，對Δ5-脫氫酶來說，在缺少葡萄糖的條件下，酵母脂類的總量幾乎降低一半。
表4由酵母提取物產(chǎn)生的脂肪酸的μg數(shù)
◇培養(yǎng)基中不含葡萄糖sub.是底物濃度ND(沒做)*18∶1，底物，是一種內(nèi)源酵母脂質(zhì)例4PUFAs在酵母脂類級分中的分布表5表示游離脂肪酸的吸收及其在酵母脂類中形成的新的產(chǎn)物，該產(chǎn)物分布在主要脂類級分中。按上述方法制備總的脂類提取物。將該脂類提取物在TLC平板上分離，并通過與標準物比較鑒定其級分。通過刮取收集有關(guān)帶，加入內(nèi)標。然后按上述方法對所述級分進行皂化和甲基化，并進行氣相層析。所述氣相層析通過與一種標準物比較計算脂肪酸的量。似乎所述底物是以磷脂形式接觸所述脫氫酶。
表5脂肪酸在各種酵母脂類級分中的分布，以μg計
SC＝釀酒酵母(S.cerevisiae)(質(zhì)粒)例5其它培養(yǎng)物優(yōu)化對釀酒酵母中脫氫酶的最佳活性的生長和誘導(dǎo)條件進行評價。為了最佳活性而操作的各種培養(yǎng)條件為i)誘導(dǎo)溫度，ii)誘導(dǎo)物濃度，iii)添加底物的時間，iv)底物的濃度，v)糖源，vi)誘導(dǎo)時的生長時期。以上研究是利用源于高山被孢霉的Δ5-脫氫酶基因(MA29)進行的。另外，還測定了改變宿主菌株對Δ5-脫氫酶基因表達的影響。
如上文所述，當?shù)孜餄舛葹?μM時觀察到了底物向ARA轉(zhuǎn)化的最佳比例，不過，當?shù)孜餄舛葹?5μM時ARA在總脂肪酸中的百分比最高。為了確定在底物能被所述脫氫酶利用之前是否有必要將其修飾成便于利用的形式，在誘導(dǎo)之前15小時添加底物，或與誘導(dǎo)物同時加入(如隨后在圖6A中所表示的)。如圖6A中所示，在誘導(dǎo)之前添加底物，不會對Δ5-脫氫酶的活性產(chǎn)生明顯影響。事實上，與誘導(dǎo)物一起添加底物對Δ5-脫氫酶的表達/活性來說略好一些，因為ARA在總的脂肪酸中的含量較高。不過，底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速度稍慢一些。
通過用0.5或2％(w/v)的半乳糖誘導(dǎo)SC334/pCGR5，測定誘導(dǎo)物濃度對被孢霉屬Δ5-脫氫酶表達/活性的影響。如圖7A和7B所示，在用0.5％半乳糖誘導(dǎo)時，Δ5-脫氫酶的表達更高。另外，用0.5％的半乳糖誘導(dǎo)SC334/pCGR5與用2％的半乳糖誘導(dǎo)相比，底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速度更快。
為了測定溫度對Δ5-脫氫酶活性的影響，在15℃、25℃、30℃和37℃下生長并誘導(dǎo)用pCGR5轉(zhuǎn)化過的SC334宿主菌株(SC334/pCGR5)。通過脂肪酸分析測定在添加了底物20∶3n6的SC334/pCGR5培養(yǎng)物中產(chǎn)生的ARA(20∶4n6)的量。圖8A表示以總脂肪酸百分比表示的20∶3n6和20∶4n6的量。圖8B表示底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速度。在25℃下生長并誘導(dǎo)SC334/pCGR5，對于Δ5-脫氫酶的表達來說最好，這一點由總脂肪酸中花生四烯酸的含量證實。另外，底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的最大速率也出現(xiàn)在25℃。在15℃下生長和誘導(dǎo)ARA的表達最低，而在37℃下底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速率最低。
在15℃和30℃下用5種不同的宿主菌株INVSC1、INVSC2、YTC34、YTC41和SC334研究酵母菌株對Δ5-脫氫酶基因表達的影響。在15℃下，SC334在總脂肪酸中具有最大百分比的ARA，表明在SC334中具有較高的Δ5-脫氫酶活性。不過，底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速度在SC334中最低，而在INVSC1中最高(圖9A和B)。在30℃下，在INVSC2中觀察到在總脂肪酸中有最大百分比的產(chǎn)物(ARA)，不過，在INVSC2中底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速率略低于在INVSC1中的速率(圖10A和B)。
Δ5-脫氫酶的產(chǎn)物ARA儲存在磷脂級分中(例4)。因此，在酵母中所產(chǎn)生的ARA的量受到能儲存在磷脂級分中的量的限制。如果ARA也能儲存在諸如甘油三酯級分的其它級分中，也許可以提高在酵母中所產(chǎn)生的ARA的量。為了檢驗這一假設(shè)，在酵母宿主菌株DBY746(獲自酵母遺傳學(xué)資源中心，1021Donner試驗室，伯克萊CA94720。菌株DBY746的基因型為Matα，his3-Δ1，Leu2-3，Leu2-112，ura3-32，trp1-289，gal)中表達所述Δ5-脫氫酶基因。所述DBY746酵母菌株具有編碼膽堿轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源基因。這種酶的存在可能使得DBY746菌株能將過量的磷脂轉(zhuǎn)化成甘油三酯級分。圖11中的結(jié)果表明，與SC334相比，底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的量沒有增加，SC334不具有編碼膽堿轉(zhuǎn)移酶的基因。
為了研究培養(yǎng)基對Δ5-脫氫酶表達的影響，在四種不同培養(yǎng)基中，在兩種不同溫度下(15℃和30℃)，以及兩種不同宿主菌株(SC334和INVSC1)中生長pCGR4/SC334。所述培養(yǎng)基的組成如下培養(yǎng)基Amm-尿素，+2％半乳糖+2％葡萄糖。
培養(yǎng)基Bmm-尿素，+20％半乳糖+2％葡萄糖+1M山梨醇(pH5.8)。
培養(yǎng)基Cmm--尿素，+2％半乳糖+2％棉籽糖。
培養(yǎng)基Dmm-尿素，+20％半乳糖+2％棉籽糖+1M山梨醇(pH8.5)。
mm＝基本培養(yǎng)基結(jié)果表明，在15℃下，在SC334中，底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的最高轉(zhuǎn)化速率出現(xiàn)在培養(yǎng)基C中。在SC334中，Δ5-脫氫酶的總體上的最大轉(zhuǎn)化速率是在30℃下出現(xiàn)在培養(yǎng)基D中。在INVSC1中，Δ5-脫氫酶的最大轉(zhuǎn)化速率也出現(xiàn)在30℃下在培養(yǎng)基D中(圖12A和12B)。
以上數(shù)據(jù)表明，可以從高山被孢霉中提取編碼一種能將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA的脫氫酶的DNA，并可以在異源系統(tǒng)中表達，并用于生產(chǎn)多不飽和長鏈脂肪酸。其例子為在酵母中通過Δ5-脫氫酶的表達由前體DGLA生產(chǎn)ARA。
例6鑒定高山被孢霉Δ5和Δ6-脫氫酶的同源物通過TBLASTA檢索est數(shù)據(jù)庫，鑒定編碼推測的Δ5-脫氫酶的核酸序列，所述檢索是通過利用Ma29的氨基酸100-446作為查詢?nèi)肟谕ㄟ^NCBI進行的。將Ma29序列的截短的部分用于避免挑選基于所述脫氫酶的N-末端的細胞色素b5部分的同源性。源于盤基網(wǎng)柄菌(保藏號C25549)的est的推測氨基酸序列與Ma29具有很高的同源性，而與Ma524的同源性較低，但同源性仍然顯著。所述DNA序列如序列13所示。其氨基酸序列如序列14所示。
例7在其它產(chǎn)PUFA的生物中鑒定高山被孢霉Δ5和Δ6同源物為了尋找參與PUFA生產(chǎn)的脫氫酶，用從三角褐指藻中提取的總RNA構(gòu)建cDNA文庫。利用市售試劑盒(GIBCO-BRL)，按照生產(chǎn)商的說明在pSPORT1(GIBCO-BRL)中構(gòu)建基于質(zhì)粒的cDNA文庫。對隨機cDNA克隆進行測序，通過BLAST檢索所述數(shù)據(jù)庫，并與Ma29和Ma524序列進行比較鑒定編碼推測的Δ5和Δ6-脫氫酶的核酸序列。
從所述褐指藻屬文庫中鑒定到一個與Ma29和Ma524有同源性的克??；該克隆被命名為144-011-B12。其DNA序列如序列15所示。其氨基酸序列如序列16所示。
例8在其它產(chǎn)PUFA生物中鑒定高山被孢霉Δ5和Δ6同源物為了尋找參與PUFA生產(chǎn)的脫氫酶，用從裂殖壺菌中提取的總RNA構(gòu)建cDNA文庫。利用市售試劑盒(GIBCO-BRL)，按照生產(chǎn)商的說明在pSPORT1(GIBCO-BRL)中構(gòu)建基于質(zhì)粒的cDNA文庫。對隨機cDNA克隆進行測序，通過BLAST檢索所述數(shù)據(jù)庫，并與Ma29和Ma524序列進行比較，鑒定編碼推測的Δ5和Δ6-脫氫酶的核酸序列。
從所述裂殖壺菌文庫中鑒定到一個與Ma29和Ma524有同源性的克??；該克隆被命名為81-23-C7。該克隆含有大約1kb插入片段。利用通用正向和反向測序引物由該克隆的每一端獲得部分序列。源于正向引物的DNA序列如序列17所示。其肽序列如序列18所示。源于反向引物的DNA序列如序列19所示，源于反向引物的氨基酸序列如序列20所示。
例9人脫氫酶基因序列根據(jù)人cDNA序列與高山被孢霉脫氫酶基因序列之間的同源性，提取有可能參與長鏈不飽和脂肪酸生物合成的人脫氫酶基因序列。發(fā)現(xiàn)了已知的膜結(jié)合脫氫酶之間三個保守的“組氨酸框”。與某些其它膜結(jié)合脫氫酶一樣，最后一個HXXHH組氨酸框基序是QXXHH。推測的人脫氫酶的氨基酸序列與高山被孢霉Δ5、Δ6、Δ9、和Δ12脫氫酶具有同源性。
將高山被孢霉Δ5脫氫酶和Δ6脫氫酶cDNA序列用于篩選IncytePharmaceuticals公司的LifeSeq數(shù)據(jù)庫，Palo Alto，加利福尼亞94304。Δ5脫氫酶序列分成以下片段1)1-150號氨基酸，2)151-300號氨基酸，和3)301-446號氨基酸。Δ6脫氫酶序列分成三個片段1)1-150號氨基酸，2)151-300號氨基酸，和3)301-457號氨基酸。采用“tblastn”算法，用所述多肽片段篩選所述數(shù)據(jù)庫。該算法將一個蛋白查詢序列與所有6個讀框(兩股鏈)動態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行比較。
高山被孢霉Δ5和Δ6的多肽片段2和3與CloneID序列具有同源性，如表6所示。所述CloneID表示一種源于Incyte LifeSeq數(shù)據(jù)庫的一個序列。在對所述“tblastn”結(jié)果進行綜合之后，對克隆信息進行檢索，對不同的CloneID數(shù)來說，缺省設(shè)置為Stringency＞＝50，和Productscore＜＝100。所述克隆信息結(jié)果展示了包括ClusterID、CloneID、文庫、HitID，Hit描述在內(nèi)的信息。在篩選時，ClusterID數(shù)表示了所有ClusterID克隆的克隆信息。組合指令能將所有包括ClusterID的CloneID組合在一起。將以下缺省設(shè)置用于GCG(遺傳學(xué)計算機組，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，Madison，威斯康星53705)組合Word大小 7最低重疊 14Stringency0.8最低相同性14最大間隙 10間隙重量 8長度重量 2GCG組合結(jié)果展示了基于CloneID內(nèi)的序列信息產(chǎn)生的重疊群。一個重疊群是基于序列之間的同源區(qū)的一系列DNA序列。根據(jù)所述重疊群內(nèi)的排列的DNA序列制備一種新的序列(共有序列)。鑒定含有CloneID的重疊群，并根據(jù)所述CloneIDs的排列(參見序列21-序列25)編輯所述共有序列的多義點，以產(chǎn)生最佳的可能序列。對表6中所列舉的所有6個CloneID重復(fù)以上過程。由此產(chǎn)生了5個不同的重疊群。將所述5個重疊群編輯的共有序列輸入測序軟件程序(GeneCodes Corporation，Ann Arbor，Michigan48105)。匯編所述共有序列。重疊群2511785與重疊群3506132重疊，并將這種新的重疊群命名為2535(序列27)。將來自所述測序程序的重疊群拷貝到GCG的序列分析軟件包中。
將每一個重疊群以所有6種讀框翻譯成蛋白序列。利用FastA檢索將高山被孢霉Δ5(Ma29)和Δ6(Ma524)序列與每一種翻譯的重疊群進行比較(用于檢索查詢序列與一組相同類型序列(核酸或蛋白)之間的相似性的Pearson和Lipman檢索)。上述序列之間的同源性表明了每一個重疊群的開放讀框。將高山被孢霉Δ5和Δ6與重疊群2535和3854933之間的同源性用于產(chǎn)生最終的被稱為253538a的重疊群。圖13是最終的重疊群253538a與MA29的FastA比較，而圖14是最終的重疊群253538a與MA524的FastA比較。在序列21-27中示出了各種重疊群的DNA序列。在序列28-34中示出了各種肽序列。
盡管所述開放讀框是通過合并兩個重疊群產(chǎn)生的，但重疊群2535表明在該重疊群的開始部分存在一個特殊序列，該序列與重疊群2854933不吻合。因此，這些重疊群有可能是由獨立的脫氫酶樣人基因產(chǎn)生的。
重疊群253538a含有一個編碼432個氨基酸的開放讀框。它始于Gln(CAG)，并終止于終止密碼子(TGA)。重疊群253538a與高山被孢霉Δ5和Δ6序列接近，這表明它有可能是所述脫氫酶，還有可能是相互具有同源性的其它已知脫氫酶。表6中所列舉的人體重疊群，以及中間重疊群2535和最終重疊群253538a可被用于提取編碼人脫氫酶的完整基因。
人脫氫酶的用途可以用在前面的實施例中所披露的方法在酵母和植物中表達所述人的序列。為了在哺乳動物細胞和轉(zhuǎn)基因動物中表達，所述基因可帶有優(yōu)選密碼子偏好。所述人的序列還可被用于鑒定相關(guān)的脫氫酶序列。
表6<
<p>例10營養(yǎng)組合物可將前面實施例中的PUFAs用于各種營養(yǎng)保健品、嬰兒配方食品、營養(yǎng)替代品和其它營養(yǎng)液。
I.嬰兒配方食品A.含有鐵的Isomil大豆配方食品用途作為供對牛奶過敏或敏感的嬰兒、幼兒和成年人的飲料，供患有應(yīng)避免使用乳糖的疾病的患者使用的食物，所述疾病為乳糖酶缺陷型、不耐乳糖和半乳糖血癥。
特征●大豆蛋白提取物，可以避免對牛奶蛋白過敏或敏感的癥狀。
●無乳糖制劑，可以避免與乳糖相關(guān)的腹瀉。
●低滲透壓(240mOsm/kg水)，可以降低滲透壓腹瀉的危險。
●雙重碳水化合物(玉米糖漿和蔗糖)設(shè)計，可以提高碳水化合物的吸收并降低超過受損傷腸道的吸收能力的危險。
●每100卡路里1.8mg鐵(硫酸亞鐵)，有助于避免缺鐵。
●推薦含量的維生素和礦物質(zhì)。
●植物油，用于提供推薦含量的必需脂肪酸。
●乳白色，乳樣稠度和宜人的芳香。
成分(Pareve，)85％水、4.9％玉米糖漿、2.6％糖(蔗糖)、2.1％大豆油、1.9％大豆蛋白提取物、1.4％椰子油、0.15％檸檬酸鈣、0.11％三堿價磷酸鈣、檸檬酸鉀、單堿價磷酸鉀、氯化鉀、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、角叉菜聚糖、抗壞血酸、L-甲硫氨酸、氯化鎂、二堿價磷酸鉀、氯化鈉、氯化膽堿、牛黃酸、硫酸亞鐵、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、L-肉堿、煙酰胺、泛酸鈣、硫酸銅、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、葉酸、硫酸錳、碘化鉀、葉綠醌、生物素、亞硒酸鈉、維生素D3和氰鈷胺素。
B.用于腹瀉的IsomilDF大豆配方食品用途作為對嬰兒和兒童進行腹瀉飲食控制的短期食物。
特征●最初的嬰兒配方食品，含有源于大豆纖維的、添加的食用纖維，特別適用于腹瀉治療。
●臨床上證實，在嬰兒中度至重度腹瀉期間，能降低腹瀉、水樣大便的持續(xù)時間。
●營養(yǎng)能完全滿足嬰兒的營養(yǎng)需要。
●添加了L-甲硫氨酸的大豆蛋白提取物，能滿足或超過嬰兒對全部必需氨基酸的需要。
●無乳糖制劑，可以避免與乳糖相關(guān)的腹瀉。
●低滲透壓(240mOsm/kg水)，可以降低滲透性腹瀉的危險。
●雙重碳水化合物(玉米糖漿和蔗糖)設(shè)計，可以提高碳水化合物的吸收并降低超過受損傷的腸道的吸收能力的危險。
●滿足或超過由美國兒科學(xué)營養(yǎng)委員會推薦的維生素和礦物質(zhì)水平，并滿足嬰兒配方食品條例的要求。
●每100卡路里1.8mg鐵(硫酸亞鐵)，有助于避免缺鐵。
●植物油，用于提供推薦含量的必需脂肪酸。
成分(Pareve，)86％水、4.8％玉米糖漿、2.5％糖(蔗糖)、2.1％大豆油、2.0％大豆蛋白提取物、1.4％的椰子油、0.77％大豆纖維、0.12％檸檬酸鈣、0.11三堿價磷酸鈣、0.10％檸檬酸鉀、氯化鉀、單堿價磷酸鉀、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、角叉菜聚糖、氯化鎂、抗壞血酸、L-甲硫氨酸、二堿價磷酸鉀、氯化鈉、氯化膽堿、牛黃酸、硫酸亞鐵、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、L-肉堿、煙酰胺、泛酸鈣、硫酸銅、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、葉酸、硫酸錳、碘化鉀、葉綠醌、生物素、亞硒酸鈉、維生素D3和氰鈷胺素。
C.含有鐵的IsomilSF無蔗糖大豆配方食品。
用途作為對牛奶蛋白過敏或敏感的或不耐受蔗糖的嬰兒、幼兒和成年人的飲料。作為患有避免使用乳糖和蔗糖的疾病的患者的食物。特征●大豆蛋白提取物，可以避免牛奶蛋白過敏或敏感的癥狀。
●無乳糖制劑，可以避免與乳糖相關(guān)的腹瀉(碳水化合物源是Polycose葡萄糖聚合物)。
●不含蔗糖，用于不能耐蔗糖的患者。
●低滲透壓(180mOsm/kg水)，可以降低滲透壓性腹瀉的危險。
●每100卡路里1.8mg鐵(硫酸亞鐵)，有助于避免缺鐵。
●推薦含量的維生素和礦物質(zhì)。
●植物油，用于提供推薦含量的必需脂肪酸。
●乳白色，乳樣稠度和宜人的芳香。
成分(Pareve，)75％水、11.8％水解玉米淀粉、4.1％大豆油、4.1％大豆蛋白提取物、2.8％椰子油、1.0％改性玉米淀粉、0.38％三堿價磷酸鈣、0.17％檸檬酸鉀、0.13％氯化鉀、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、氯化鎂、抗壞血酸、L-甲硫氨酸、碳酸鈣、氯化鈉、氯化膽堿、角叉菜聚糖、牛黃酸、硫酸亞鐵、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、L-肉堿、煙酰胺、泛酸鈣、硫酸銅、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、葉酸、硫酸錳、碘化鉀、葉綠醌、生物素、亞硒酸鈉、維生素D3和氰鈷胺素。
D.含有即時可食用的鐵的Isomil20大豆配方食品，20Cal/floz。
用途在需要大豆喂養(yǎng)時使用。
成分(Pareve，)85％水、4.9％玉米糖漿、2.6％糖(蔗糖)、2.1％大豆油、1.9％大豆蛋白提取物、1.4％椰子油、0.15％檸檬酸鈣、0.11％三堿價磷酸鈣、檸檬酸鉀、單堿價磷酸鉀、氯化鉀、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、角叉菜聚糖、抗壞血酸、L-甲硫氨酸、氯化鎂、二堿價磷酸鉀、氯化鈉、氯化膽堿、牛黃酸、硫酸亞鐵、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、L-肉堿、煙酰胺、泛酸鈣、硫酸銅、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、葉酸、硫酸錳、碘化鉀、葉綠醌、生物素、亞硒酸鈉、維生素D3和氰鈷胺素。
E.Similac嬰兒配方食品用途當需要嬰兒配方食品時當在1周歲之前決定終止母乳喂養(yǎng)時，當需要對母乳喂養(yǎng)進行補充時或當母乳喂養(yǎng)不合適時作為一種日常喂養(yǎng)。
特征●適于良好生長的適當質(zhì)量和數(shù)量的蛋白；加熱變性，這樣可以降低與奶相關(guān)的腸失血的危險。
●來自混合植物油的脂肪(雙重勻化)，提供容易吸收的必需亞油酸。
●諸如乳糖的碳水化合物，其比例類似于人乳的比例。
●低的腎溶質(zhì)負擔，以降低對發(fā)育中的器官的壓力。
●粉狀、濃縮液體和可立即喂養(yǎng)形式。
成分(-D)水、無脂奶粉、乳糖、大豆油、椰子油、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、抗壞血酸、角叉菜聚糖、氯化膽堿、牛黃酸、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、煙酰胺、硫酸亞鐵、泛酸鈣、硫酸銅、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、葉酸、硫酸錳、碘化鉀、葉綠醌、生物素、亞硒酸鈉、維生素D3和氰鈷胺素。
F.SimilacNeocare含鐵早產(chǎn)嬰兒配方食品用途用于滿足出院后早產(chǎn)嬰兒的特殊營養(yǎng)需求。SimilacNeocare是生產(chǎn)的一種全營養(yǎng)的配方食品，用于為早產(chǎn)嬰兒提供所需的額外的卡路里、蛋白、維生素和礦物質(zhì)，以改善其同步生長并支持發(fā)育。
特征●降低對補充卡路里和維生素的需要。比標準配方食品(20Cal/fl oz)更多的卡路里(22 Cal/fl oz)。
●含有中等-鏈甘油三酯(MCT油)的高效吸收的脂肪混合物，有利于滿足早產(chǎn)嬰兒特殊的消化需要。
●每100卡路里具有更高含量的蛋白、維生素和礦物質(zhì)，以便延長始于醫(yī)院的營養(yǎng)支持。
●更多的鈣和磷有利于骨骼礦物化。
成分-D玉米糖漿固體、無脂奶粉、乳糖、乳蛋白濃縮物、大豆油、高油酸紅花油、分離過的椰子油(中等鏈甘油三酯)、椰子油、檸檬酸鉀、三堿價磷酸鈣、碳酸鈣、抗壞血酸、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉、牛黃酸、硫酸亞鐵、m-肌醇、氯化膽堿、抗壞血酸棕櫚酸酯、L-肉堿、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、煙酰胺、混合生育酚、檸檬酸鈉、泛酸鈣、硫酸銅、鹽酸氯化硫胺素、維生素A棕櫚酸酯、β胡蘿卜素、核黃素、鹽酸吡哆醇、葉酸、硫酸錳、葉綠醌、生物素、亞硒酸鈉、維生素D3和氰鈷胺素。
G.即用型Similac天然保健低鐵人乳強化劑，24Cal/fl oz。
用途被設(shè)計用于與人乳混合或與人乳交替喂養(yǎng)低出生體重嬰兒。
成分-D水、無脂奶粉、水解玉米淀粉、乳糖、分離過的椰子油(中等鏈甘油三酯)、乳蛋白濃縮物、大豆油、椰子油、三堿價磷酸鈣、檸檬酸鉀、氯化鎂、檸檬酸鈉、抗壞血酸、碳酸鈣、甘油一酯和二酯、大豆卵磷脂、角叉菜聚糖、氯化膽堿、m-肌醇、牛黃酸、煙酰胺、L-肉堿、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、氯化鉀、泛酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸銅、核黃素、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、鹽酸吡哆醇、生物素、葉酸、硫酸錳、葉綠醌、亞硒酸鈉、維生素D3和氰鈷胺素。
可以用本發(fā)明的各種PUFAs取代和/或添加上述嬰兒配方食品，以及本領(lǐng)域中公知的其它嬰兒配方食品。
II.營養(yǎng)制劑A.ENSURE用途ENSURE是一種被設(shè)計成主要用作口服營養(yǎng)保健品的低殘留物液體食品，用于在就餐時服用或在兩餐之間服用，或以適當?shù)牧咳〈澄?。ENSURE是不含乳糖和谷蛋白的，并適用于改進的飲食，包括低膽甾醇飲食。不過它主要是作為一種口服保健品，可以通過飼管喂飼。
患者癥狀●用于改變了飲食的患者●用于有營養(yǎng)危險的老年性患者●用于不隨意的體重減輕的患者●用于病后或手術(shù)后恢復(fù)的患者●用于需要低殘留飲食的患者成分-D水、糖(蔗糖)、麥芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸鈣和鈉、高油酸紅花油、大豆蛋白提取物、大豆油、菜籽油、檸檬酸鉀、三堿價磷酸鈣、檸檬酸鈉、氯化鎂、二堿價磷酸鎂、人工香精、氯化鈉、大豆卵磷脂、氯化膽堿、抗壞血酸、角叉菜聚糖、硫酸鋅、硫酸亞鐵、α-生育酚乙酸酯、吉蘭膠、煙酰胺、泛酸鈣、硫酸錳、硫酸銅、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、鹽酸吡哆醇、核黃素、葉酸、鉬酸鈉、氯化鉻、生物素、碘化鉀、硒酸鈉。
D.ENSURE棒用途ENSURE棒是全面、均衡營養(yǎng)的，用于作為兩餐之間的補充或與食物一起使用。它可以作為替代其它快餐的美味、營養(yǎng)豐富的替代品。ENSURE棒的每一個棒含有低于1克的乳糖，并且巧克力FudgeBrownie香料不含谷蛋白。(Honey Graham Crunch香料含有谷蛋白)?；颊甙Y狀●用于需要額外卡路里、蛋白、維生素和礦物質(zhì)的患者●特別適用于為攝取足夠卡路里和養(yǎng)分的人●用于有咀嚼和吞咽能力的人●任何對豌豆過敏或?qū)怨腥魏晤愋瓦^敏的人都不能食用成分Honey Graham Crunch-高果糖玉米糖漿、大豆蛋白提取物、紅糖、蜜、麥芽糖糊精(玉米)、松脆大米(研磨過的大米)，糖[蔗糖]，鹽[氯化鈉]和麥芽、燕麥麩皮、部分氫化的棉籽油和大豆油、大豆多糖、甘油、乳清蛋白濃縮物、聚葡萄糖、果糖、酪蛋白酸鈣、可可粉、人工香精、菜籽油、高油酸紅花油、無脂奶粉、乳清粉、大豆卵磷脂和玉米油。在加工堅果的設(shè)備中生產(chǎn)。維生素和礦物質(zhì)三堿價磷酸鈣、二堿價磷酸鉀、氧化鎂、鹽(氯化鈉)、氯化鉀、抗壞血酸、正磷酸鐵、α-生育酚乙酸酯、煙酰胺、氧化鋅、泛酸鈣、葡糖酸銅、硫酸錳、核黃素、β胡蘿卜素、鹽酸吡哆醇、一硝酸硫胺素、葉酸、生物素、氯化鉻、碘化鉀、硒酸鈉、鉬酸鈉、葉綠醌、維生素D3和氰鈷胺素。蛋白Honey Graham Crunch-蛋白來源是大豆蛋白提取物和乳蛋白的混合物。
大豆蛋白提取物 74％乳蛋白 26％脂肪Honey Graham Crunch-脂肪來源是部分氫化的棉籽油和大豆油、菜籽油、高油酸紅花油、和玉米油、以及大豆卵磷脂的混合物。
部分氫化的棉籽油和大豆油76％菜籽油 8％高油酸紅花油8％玉米油 4％大豆卵磷脂 4％碳水化合物Honey Graham Crunch-碳水化合物源是高果糖玉米糖漿、紅糖、麥芽糖糊精、蜜、松脆大米、甘油、大豆多糖、和燕麥麩皮的混合物。
高果糖玉米糖漿 24％紅糖21％麥芽糖糊精 12％蜜 11％松脆大米9％甘油9％大豆多糖7％燕麥麩皮7％C.ENSURE高蛋白用途ENSURE高蛋白是一種為在其飲食中需要額外卡路里、蛋白、維生素和礦物質(zhì)的人設(shè)計的濃縮的、高蛋白液體食品?？蓪⑵溆米骺诜I養(yǎng)保健品，與食物一起食用或在兩餐之間食用，或者以適當?shù)牧孔鳛槭澄锏奶娲?。ENSURE高蛋白是不含乳糖和谷蛋白的，并適合一般手術(shù)或髖關(guān)節(jié)骨折后恢復(fù)的人使用，并適于有壓力型潰瘍危險的患者使用。
患者癥狀●用于需要額外卡路里、蛋白、維生素和礦物質(zhì)的患者，如一般手術(shù)或髖關(guān)節(jié)骨折后恢復(fù)的患者、有壓力型潰瘍危險的患者、和需要低膽甾醇飲食的患者。
特征-●飽和脂肪含量低●每1份含有6克總脂肪和低于5毫克的膽甾醇●味道豐滿、奶油味
●是蛋白、鈣和其它必需維生素和礦物質(zhì)的優(yōu)良來源●用于低膽甾醇飲食●不含乳糖，容易消化成分Vanilla Suppreme--D水、糖(蔗糖)、麥芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸鈣和鈉、高油酸紅花油、大豆蛋白提取物、大豆油、菜籽油、檸檬酸鉀、三堿價磷酸鈣、檸檬酸鈉、氯化鎂、二堿價磷酸鎂、人工香精、氯化鈉、大豆卵磷脂、氯化膽堿、抗壞血酸、角叉菜聚糖、硫酸鋅、硫酸亞鐵、α-生育酚乙酸酯、吉蘭膠、煙酰胺、泛酸鈣、硫酸錳、硫酸銅、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、鹽酸吡哆醇、核黃素、葉酸、鉬酸鈉、氯化鉻、生物素、碘化鉀、硒酸鈉、葉綠醌、維生素D3和氰鈷胺素。蛋白蛋白來源是兩種高生物學(xué)價值蛋白酪蛋白和大豆蛋白的混合物。
酪蛋白酸鈉和鈣 85％大豆蛋白提取物 15％脂肪脂肪來源是三種油的混合物高油酸紅花油、菜籽油、和大豆油。
高油酸紅花油40％菜籽油 30％大豆油 30％ENSURE高蛋白中的脂肪含量滿足美國心臟協(xié)會(AHA)的規(guī)定。ENSURE高蛋白中的6克脂肪相當于24％的總卡路里，其中2.6％的脂肪來自飽和脂肪酸，7.9％的脂肪來自多不飽和脂肪酸。以上數(shù)字在AHA規(guī)定的范圍之內(nèi)來自脂肪的總卡路里≤30％，＜10％的卡路里來自飽和脂肪酸，≤10％的總卡路里來自多不飽和脂肪酸。碳水化合物ENSURE高蛋白含有麥芽糖糊精和蔗糖的組合物。適中的甜度和各種風味(香草味、巧克力味、野漿果味、和香蕉味)，加上大胡桃、櫻桃、草莓、檸檬、和橙的VARI-FLAVORSOFlavor Pacs有助于避免產(chǎn)生對味道的麻木，并有助于患者接受。香草和其它非巧克力風味蔗糖 60％麥芽糖糊精 40％巧克力蔗糖 70％麥芽糖糊精 30％D.ENSURELIGHT用途ENSURE LIGHT是一種被設(shè)計用作口服營養(yǎng)保健品的低脂肪液體食品，與食物一起使用或在兩餐之間使用。ENSURE LIGHT不含乳糖和谷蛋白，適用于改變的飲食，包括低膽甾醇飲食。患者癥狀●用于正常體重或肥胖患者，這種患者需要在一種保健品中有額外的營養(yǎng)，這種保健品所含脂肪比ENSURE低50％，所含的卡路里比ENSURE少20％。
●用于因為飲食不正常而需要額外營養(yǎng)的健康成年人特征●脂肪和飽和脂肪含量低●每1份含有3克總脂肪和低于5毫克的膽甾醇●味道豐滿、奶油味●是鈣和其它必需維生素和礦物質(zhì)的優(yōu)良來源●用于低膽甾醇飲食●不含乳糖，容易消化成分法國香草-D水、麥芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、酪蛋白酸鈣、高油酸紅花油、菜籽油、氯化鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、二堿價磷酸鉀、二堿價磷酸鎂、天然和人工香精、三堿價磷酸鈣、纖維素凝膠、氯化膽堿、大豆卵磷脂、角叉菜聚糖、鹽(氯化鈉)、抗壞血酸、纖維素膠、硫酸亞鐵、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、煙酰胺、硫酸錳、泛酸鈣、硫酸銅、鹽酸氯化硫胺素、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸吡哆醇、核黃素、氯化鉻、葉酸、鉬酸鈉、生物素、碘化鉀、硒酸鈉、葉綠醌、維生素D3和氰鈷胺素。蛋白蛋白來源是酪蛋白酸鈣。
酪蛋白酸鈣100％脂肪脂肪來源是兩種油的混合物高油酸紅花油和菜籽油。
高油酸紅花油 70％菜籽油30％ENSURE LIGHT中的脂肪含量符合美國心臟協(xié)會(AHA)的規(guī)定。ENSURE LIGHT中的3克脂肪相當于13.5％的總卡路里，其中1.4％的脂肪來自飽和脂肪酸，2.6％的脂肪來自多不飽和脂肪酸。以上數(shù)字在AHA規(guī)定的范圍之內(nèi)來自脂肪的總卡路里≤30％，＜10％的卡路里來自飽和脂肪酸，≤10％的總卡路里來自多不飽和脂肪酸。碳水化合物ENSURE LIGHT含有麥芽糖糊精和蔗糖的組合物。巧克力風味的還含有玉米糖漿。適中的甜度和各種風味(法國香草味、巧克力王、草莓旋風)，加上大胡桃、櫻桃、草莓、檸檬、和橙的VARI-FLAVORSOFlavor Pacs有助于避免產(chǎn)生對味道的麻木，并有助于患者接受。香草和其它非巧克力風味蔗糖 51％麥芽糖糊精 49％巧克力蔗糖 47.0％玉米糖漿 26.5％麥芽糖糊精 26.5％維生素和礦物質(zhì)1份8-fl-oz的ENSURE LIGHT至少能提供24種重要的維生素和礦物質(zhì)的25％的RDIs?？Х纫蚯煽肆ο阄逗?.1毫克咖啡因/8fl ozE.ENSURE PLUS用途ENSURE PLUS是一種高卡路里、低殘留液體食品，用于在需要額外的卡路里和營養(yǎng)，但需要正常濃度的蛋白時使用。它主要被設(shè)計成一種口服營養(yǎng)保健品，用于在就餐時使用或在兩餐之間使用，或者以合適的量作為食物的替代品。ENSURE PLUS不含乳糖和谷蛋白。不過，它主要是一種口服營養(yǎng)保健品，可以通過飼管喂飼?；颊甙Y狀●用于在有限的體積中需要額外卡路里和營養(yǎng)，但需要正常濃度的蛋白的患者●用于需要到達或維持健康體重的患者特征●味道豐滿，奶油味●是必需維生素和礦物質(zhì)的良好來源成分香草-D水、玉米糖漿、麥芽糖糊精(玉米)、玉米油、酪蛋白酸鈉和鈣、糖(蔗糖)、大豆蛋白提取物、氯化鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、三堿價磷酸鈣、大豆卵磷脂、天然和人工香精、檸檬酸鈉、氯化鉀、氯化膽堿、抗壞血酸、角叉菜聚糖、硫酸鋅、硫酸亞鐵、α-生育酚乙酸酯、煙酰胺、泛酸鈣、硫酸錳、硫酸銅、鹽酸氯化硫胺素、鹽酸吡哆醇、核黃素、維生素A棕櫚酸酯、葉酸、生物素、氯化鉻、鉬酸鈉、碘化鉀、亞硒酸鈉、葉綠醌、氰鈷胺素和維生素D3。蛋白蛋白來源是兩種高生物學(xué)價值蛋白的混合物酪蛋白和大豆蛋白。
酪蛋白酸鈉和鈣 84％大豆蛋白提取物 16％脂肪脂肪來源是玉米油。
玉米油 100％碳水化合物ENSURE PLUS含有麥芽糖糊精和蔗糖的組合物。適中的甜度和多種風味(香草味、巧克力味、草莓味、咖啡味、黃油大胡桃、和雞蛋酒味)，加上大胡桃、櫻桃、草莓、檸檬、和橙的VARI-FLAVORSOFlavorPacs，有助于避免產(chǎn)生對味道的麻木，并有助于患者接受。香草、草莓、黃油大胡桃、和咖啡味玉米糖漿 39％
麥芽糖糊精 38％蔗糖23％巧克力和雞蛋酒味玉米糖漿36％麥芽糖糊精 34％蔗糖30％維生素和礦物質(zhì)1份8fl oz ENSURE PLUS至少可提供25種重要維生素和礦物質(zhì)的15％的RDIs?？Х纫蚯煽肆ξ逗?.1毫克咖啡因/8fl oz?？Х任逗形⒘康目Х纫?。
F.ENSURE PLUSHN用途ENSURE PLUS HN是一種全營養(yǎng)高卡路里、高氮液體食品，是為需要較多卡路里和蛋白或具有有限的體積承受能力的人設(shè)計的?？蓪⑵溆糜诳诜a充或通過飼管進行全營養(yǎng)支持。ENSURE PLUS HN不含乳糖和谷蛋白。患者癥狀●用于需要較多卡路里和蛋白的患者，如手術(shù)或受傷后的患者●用于具有有限的體積承受能力和提前產(chǎn)生飽滿感的患者特征●用于補充或全營養(yǎng)●用于口服或飼管喂養(yǎng)●1.5CaVmL●高氮●卡路里稠密成分香草-D水、麥芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸鈉和鈣、玉米油、糖(蔗糖)、大豆蛋白提取物、氯化鎂、檸檬酸鉀、三堿價磷酸鈣、大豆卵磷脂、天然和人工香精、檸檬酸鈉、氯化膽堿、抗壞血酸、牛黃酸、L-肉堿、硫酸鋅、硫酸亞鐵、α-生育酚乙酸酯、煙酰胺、角叉菜聚糖、泛酸鈣、硫酸錳、硫酸銅、鹽酸氯化硫胺素、鹽酸吡哆醇、核黃素、維生素A棕櫚酸酯、葉酸、生物素、氯化鉻、鉬酸鈉、碘化鉀、亞硒酸鈉、葉綠醌、氰鈷胺素和維生素D3。
G.ENSURE粉用途ENSURE粉(用水重配)是一種低殘留液體食品，主要被設(shè)計用作口服營養(yǎng)保健品，用于就餐時使用或在兩餐之間使用。ENSURE粉不含乳糖和谷蛋白，因此，適用于改變了的飲食，包括低膽甾醇飲食。癥狀●用于飲食改變了的患者●用于有營養(yǎng)危險的老年患者●用于病后/手術(shù)后恢復(fù)的患者●用于需要低殘留飲食的患者特征●方便、容易混合●飽和脂肪含量低●每1份含有9克總脂肪和低于5毫克的膽甾醇●維生素和礦物質(zhì)含量高●用于低膽甾醇飲食●不含乳糖，容易消化成分-D玉米糖漿、麥芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、玉米油、酪蛋白酸鈉和鈣、大豆蛋白提取物、人工香精、檸檬酸鉀、氯化鎂、檸檬酸鈉、三堿價磷酸鈣、氯化鉀、大豆卵磷脂、抗壞血酸、氯化膽堿、硫酸鋅、硫酸亞鐵、α-生育酚乙酸酯、煙酰胺、泛酸鈣、硫酸錳、鹽酸氯化硫胺素、硫酸銅、鹽酸吡哆醇、核黃素、維生素A棕櫚酸酯、葉酸、生物素、鉬酸鈉、氯化鉻、碘化鉀、硒酸鈉、葉綠醌、維生素D3和氰鈷胺素。蛋白蛋白來源是兩種高生物學(xué)價值蛋白的混合物酪蛋白和大豆蛋白酪蛋白酸鈉和鈣 84％大豆蛋白提取物 16％脂肪脂肪來源是玉米油。
玉米油 100％碳水化合物ENSURE粉含有玉米糖漿、麥芽糖糊精和蔗糖的混合物。適中甜度的ENSURE粉加上大胡桃、櫻桃、草莓、檸檬、和橙的VARI-FLAVORSOFlavor Pacs有助于避免產(chǎn)生對味道的麻木，并有助于患者接受。香草玉米糖漿35％麥芽糖糊精 35％蔗糖30％H.ENSURE布丁用途ENSURE布丁是一種富含營養(yǎng)的保健品，以非液體形式提供均衡的營養(yǎng)，用于在就餐時使用或在兩餐之間使用。它適用于稠度改變了的飲食(例如軟的、果泥的、或全液體的飲食)或用于患有吞咽障礙的人。ENSURE布丁不含谷蛋白。患者癥狀●適用于食用稠度改變了的飲食(例如軟的、果泥的、或全液體的飲食)的患者●用于有吞咽障礙的患者特征●豐富和奶油味的良好味道●必需維生素和礦物質(zhì)的良好來源●方便需要，無須冷藏●不含谷蛋白每5盎司的營養(yǎng)分布卡路里250，蛋白10.9％、全脂肪34.9％，碳水化合物54.2％成分香草-D無脂奶、水、糖(蔗糖)、部分氫化的大豆油、改性食用淀粉、硫酸鎂、硬脂酰乳酸鈉、二堿價磷酸鈉、人工香精、抗壞血酸、硫酸鋅、硫酸亞鐵、α-生育酚乙酸酯、氯化膽堿、煙酰胺、硫酸錳、泛酸鈣、FD&amp;C Yellow#5、檸檬酸鉀、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、鹽酸吡哆醇、核黃素、FD&amp;C Yellow#6、葉酸、生物素、葉綠醌、維生素D3和氰鈷胺素。蛋白蛋白來源是無脂奶。無脂奶 100％脂肪脂肪來源是氫化大豆油。
氫化大豆油 100％碳水化合物ENSURE布丁含有蔗糖和改性食用淀粉的混合物。適中的甜度和多種風味(香草味、巧克力味、奶油硬糖味、和木薯味)有助于防止對味道的麻木。每1份該產(chǎn)品含有9.2克乳糖。香草和其它非巧克力味蔗糖 56％乳糖 27％改性食用淀粉 17％巧克力蔗糖 58％乳糖 26％改性食用淀粉 16％I.含纖維的ENSURE用途含纖維的ENSURE是一種含纖維的全營養(yǎng)的液體食品，這種食品被設(shè)計用于可以通過提高飲食的纖維和養(yǎng)分而受益的人。含纖維的ENSURE適用于不需要低殘留飲食的人?？梢钥诜蛲ㄟ^飼管喂飼，并可用作常規(guī)飲食的營養(yǎng)保健品，或以合適的量用作食物的替代品。含纖維的ENSURE不含乳糖和谷蛋白，因此，適用于改變了的飲食，包括低膽甾醇飲食?；颊甙Y狀●用于能通過提高飲食的纖維和養(yǎng)分而受益的患者特征●新開發(fā)的配方食品飽和脂肪酸含量低，維生素和礦物質(zhì)含量較高
●每1份含有6克總的脂肪和小于5毫克的膽甾醇●豐富、奶油味的味道●良好的纖維來源●必需維生素和礦物質(zhì)的優(yōu)良來源●用于低膽甾醇飲食●不含乳糖和谷蛋白成分香草-D水、麥芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、酪蛋白酸鈉和鈣、燕麥纖維、高油酸紅花油、菜籽油、大豆蛋白提取物、玉米油、大豆纖維、三堿價磷酸鈣、氯化鎂、檸檬酸鉀、纖維素凝膠、大豆卵磷脂、二堿價磷酸鉀、檸檬酸鈉、天然和人工香精、氯化膽堿、磷酸鎂、抗壞血酸、纖維素膠、氯化鉀、角叉菜聚糖、硫酸亞鐵、α-生育酚乙酸酯、硫酸鋅、煙酰胺、硫酸錳、泛酸鈣、硫酸銅、維生素A棕櫚酸酯、鹽酸氯化硫胺素、鹽酸吡哆醇、核黃素、葉酸、氯化鉻、生物素、鉬酸鈉、碘化鉀、硒酸鈉、葉綠醌、維生素D3和氰鈷胺素。
蛋白蛋白來源是兩種高生物學(xué)價值蛋白的混合物酪蛋白和大豆蛋白酪蛋白酸鈉和鈣 80％大豆蛋白提取物 20％脂肪脂肪來源是三種油的混合物高油酸紅花油、菜籽油、和玉米油。
高油酸紅花油40％菜籽油 40％玉米油 20％含纖維的ENSURE中的脂肪含量符合美國心臟協(xié)會(AHA)的規(guī)定。含纖維的ENSURE中的6克脂肪相當于22％的總的卡路里，其中2.01％的脂肪來自飽和脂肪酸，而6.7％的脂肪來自多不飽和脂肪酸。這些數(shù)字在AHA規(guī)定的范圍之內(nèi)來自脂肪的總卡路里≤30％，＜10％的卡路里來自飽和脂肪酸，≤10％的總卡路里來自多不飽和脂肪酸。碳水化合物含纖維的ENSURE含有麥芽糖糊精和蔗糖的組合物。適中的甜度和和多種風味(香草味、巧克力味、和黃油大胡桃味)，加上大胡桃、櫻桃、草莓、檸檬、和橙的VARI-FLAVORSFlavor Pacs有助于避免產(chǎn)生對味道的麻木，并有助于患者接受。香草及其它非巧克力味麥芽糖糊精66％蔗糖 25％燕麥纖維 7％大豆纖維 2％巧克力麥芽糖糊精55％蔗糖 36％燕麥纖維 7％大豆纖維 2％纖維用于含纖維的ENSURE的纖維混合物包括燕麥纖維和大豆多糖。該混合物能為每8-fl-oz的罐裝食物提供大約4克的總的飲食纖維。不可溶性纖維和可溶性纖維的比例為95∶5。
上述各種營養(yǎng)保健品及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它保健品可以用本發(fā)明的PUFAs取代和/或補充。
J.OxepaTM營養(yǎng)制品Oxepa是低碳水化合物、卡路里密集的腸道營養(yǎng)制品，是為了患有或處于ARDS危險期的患者的飲食管理而設(shè)計的。它具有特殊的成分組合，包括一種專利油混合物，該混合物含有二十碳五烯酸(源于魚油的EPA)，γ-亞麻酸(源于琉璃苣油的GLA)，和較高的抗氧化劑含量?？防锓植肌窨防锩芏雀哌_1.5Cal/mL(355 Cal/8fl oz)，以降低滿足能量需求所需要的體積。
●Oxepa中的卡路里分布如表7所示
脂肪●每1份8-fl oz的Oxepa含有22.2克脂肪(93.7g/L)?！裰緛碓词且环N油類混合物31.8％的菜籽油，25％的中等鏈甘油三酯(MCTs)，20％的琉璃苣油，20％的魚油和3.2％的大豆卵磷脂。在表8中示出了Oxepa的典型脂肪酸特征?！袢绫?0所示，Oxepa能提供均衡量的多不飽和脂肪酸、單飽和脂肪酸和飽和脂肪酸。●中等鏈甘油三酯(MCTs)—占脂肪混合物的25％--有助于腸道排空，因為它能被腸道吸收而不會被膽酸乳化?！馩xepaTM營養(yǎng)制品中的各種脂肪酸成分可以用本發(fā)明的PUFAs取代和/或補充。
脂肪酸大約相當于總脂肪的95％表9<t
碳水化合物●每1份8-fl oz的服用量的碳水化合物的含量為25.0克(105.5g/L)。
●碳水化合物來源是45％的麥芽糖糊精(一種復(fù)合碳水化合物)和55.5％的蔗糖(單糖)，這兩種碳水化合物都容易消化和吸收。
●Oxepa的高脂肪和低碳水化合物含量是為了降低二氧化碳的產(chǎn)生而設(shè)計的。高二氧化碳含量會使通風機-依賴性患者的不良習(xí)慣戒斷復(fù)雜化。低含量碳水化合物還可被用于出現(xiàn)了由緊張誘導(dǎo)的高血糖的患者。
●Oxepa不含乳糖。
飲食中的碳水化合物、來自蛋白的氨基酸、和脂肪的甘油組分在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成葡萄糖。通過這一過程，可以滿足葡萄糖依賴型組織(如中樞神經(jīng)系統(tǒng)和紅血細胞)對碳水化合物的需要。不過，不含碳水化合物的飲食會導(dǎo)致酮病、組織蛋白的過度分解代謝和失去體液和電解質(zhì)。如果卡路里攝取適度的話，通過每天攝取50-100克的可消化的碳水化合物可避免上述后果。如果滿足了能量需求的話，Oxepa中的碳水化合物含量還足于降低葡糖異生作用。
蛋白●每1份8-fl oz的Oxepa含有14.8克的蛋白(62.5g/L)。
●總的卡路里/氮的比例(150∶1)滿足脅迫患者的需要。
●Oxepa能提供足夠的蛋白，以促進合成代謝并維持苗條的體形，而不會產(chǎn)生呼吸問題。高蛋白攝取是呼吸不足患者所關(guān)心的問題。不過，蛋白對二氧化碳的產(chǎn)生具有很少的影響，高蛋白飲食可提高通風器的動力。
●Oxepa的蛋白來源是86.8％的酪蛋白酸鈉和13.2％的酪蛋白酸鈣。
在本說明書中所提到的所有公開文獻和專利申請是本發(fā)明領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)水平的指標。所有公開文獻和專利申請在本文中以相同的程度收作參考文獻，就如同每一份公開文獻或?qū)＠暾埍粚ｉT和單獨地指明為收作參考文獻一樣。
現(xiàn)在已對本發(fā)明作了全面說明，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，顯而易見的是，在不脫離所附權(quán)利要求書的實質(zhì)或范圍的前提下可以作出各種改變或改進。
序列表(1)一般資料(i)申請人KNUTZON，DEBORAHMURKERJI，PRADIPHUANG，YUNG-SHENGTHURMOND，JENNIFERCHAUDHARY，SUNITALEONARD，AMANDA(ii)發(fā)明名稱合成長鏈多不飽和脂肪酸的方法和組合物(iii)序列數(shù)34(iv)聯(lián)系地址(A)收件人LIMBACH&amp;LIMBACH LLP(B)街道2001 FERRY BUILDING(C)城市舊金山(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵編94111(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(viii)律師/代理人資料(A)姓名邁克R.沃德(B)注冊號38，651(C)資料/文件號CGAB-110(ix)電信資料(A)電話(415)433-4150
(B)傳真(415)433-8716(C)電傳N/A(2)序列1資料(i)序列特征(A)長度1483個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列1GCTTCCTCCA GTTCATCCTC CATTTCGCCA CCTGCATTCT TTACGACCGT TAAGCAAGAT 60GGGAACGGAC CAAGGAAAAA CCTTCACCTG GGAAGAGCTG GCGGCCCATA ACACCAAGGA120CGACCTACTC TTGGCCATCC GCGGCAGGGT GTACGATGTC ACAAAGTTCT TGAGCCGCCA180TCCTGGTGGA GTGGACACTC TCCTGCTCGG AGCTGGCCGA GATGTTACTC CGGTCTTTGA240GATGTATCAC GCGTTTGGGG CTGCAGATGC CATTATGAAG AAGTACTATG TCGGTACACT300GGTCTCGAAT GAGCTGCCCA TCTTCCCGGA GCCAACGGTG TTCCACAAAA CCATCAAGAC360GAGAGTCGAG GGCTACTTTA CGGATCGGAA CATTGATCCC AAGAATAGAC CAGAGATCTG420GGGACGATAC GCTCTTATCT TTGGATCCTT GATCGCTTCC TACTACGCGC AGCTCTTTGT480GCCTTTCGTT GTCGAACGCA CATGGCTTCA GGTGGTGTTT GCAATCATCA TGGGATTTGC540GTGCGCACAA GTCGGACTCA ACCCTCTTCA TGATGCGTCT CACTTTTCAG TGACCCACAA600CCCCACTGTC TGGAAGATTC TGGGAGCCAC GCACGACTTT TTCAACGGAG CATCGTACCT660GGTGTGGATG TACCAACATA TGCTCGGCCA TCACCCCTAC ACCAACATTG CTGGAGCAGA720TCCCGACGTG TCGACGTCTG AGCCCGATGT TCGTCGTATC AAGCCCAACC AAAAGTGGTT780TGTCAACCAC ATCAACCAGC ACATGTTTGT TCCTTTCCTG TACGGACTGC TGGCGTTCAA840GGTGCGCATT CAGGACATCA ACATTTTGTA CTTTGTCAAG ACCAATGACG CTATTCGTGT900CAATCCCATC TCGACATGGC ACACTGTGAT GTTCTGGGGC GGCAAGGCTT TCTTTGTCTG960GTATCGCCTG ATTGTTCCCC TGCAGTATCT GCCCCTGGGC AAGGTGCTGC TCTTGTTCAC 1020GGTCGCGGAC ATGGTGTCGT CTTACTGGCT GGCGCTGACC TTCCAGGCGA ACCACGTTGT 1080TGAGGAAGTT CAGTGGCCGT TGCCTGACGA GAACGGGATC ATCCAAAAGG ACTGGGCAGC 1140TATGCAGGTC GAGACTACGC AGGATTACGC ACACGATTCG CACCTCTGGA CCAGCATCAC 1200TGGCAGCTTG AACTACCAGG CTGTGCACCA TCTGTTCCCC AACGTGTCGC AGCACCATTA 1260TCCCGATATT CTGGCCATCA TCAAGAACAC CTGCAGCGAG TACAAGGTTC CATACCTTGT 1320CAAGGATACG TTTTGGCAAG CATTTGCTTC ACATTTGGAG CACTTGCGTG TTCTTGGACT 1380CCGTCCCAAG GAAGAGTAGA AGAAAAAAAG CGCCGAATGA AGTATTGCCC CCTTTTTCTC 1440CAAGAATGGC AAAAGGAGAT CAAGTGGACA TTCTCTATGA AGA 1483(2)序列2資料(i)序列特征(A)長度446個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列2Met Gly Thr Asp Gln Gly Lys Thr Phe Thr Trp Glu Glu Leu Ala Ala1 5 10 15His Asn Thr Lys Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ile Arg Gly Arg Val Tyr20 25 30Asp Val Thr Lys Phe Leu Ser Arg His Pro Gly Gly Val Asp Thr Leu35 40 45Leu Leu Gly Ala Gly Arg Asp Val Thr Pro Val Phe Glu Met Tyr His50 55 60Ala Phe Gly Ala Ala Asp Ala Ile Met Lys Lys Tyr Tyr Val Gly Thr65 70 75 80Leu Val Ser Asn Glu Leu Pro Ile Phe Pro Glu Pro Thr Val Phe His85 90 95Lys Thr Ile Lys Thr Arg Val Glu Gly Tyr Phe Thr Asp Arg Asn Ile100 105 110Asp Pro Lys Asn Arg Pro Glu Ile Trp Gly Arg Tyr Ala Leu Ile Phe115 120 125Gly Ser Leu Ile Ala Ser Tyr Tyr Ala Gln Leu Phe Val Pro Phe Val130 135 140Val Glu Arg Thr Trp Leu Gln Val Val Phe Ala Ile Ile Met Gly Phe145 150 155 160Ala Cys Ala Gln Val Gly Leu Asn Pro Leu His Asp Ala Ser His Phe165 170 175Ser Val Thr His Asn Pro Thr Val Trp Lys Ile Leu Gly Ala Thr His180 185 190Asp Phe Phe Asn Gly Ala Ser Tyr Leu Val Trp Met Tyr Gln His Met195 200 205Leu Gly His His Pro Tyr Thr Asn Ile Ala Gly Ala Asp Pro Asp Val210 215 220Ser Thr Ser Glu Pro Asp Val Arg Arg Ile Lys Pro Asn Gln Lys Trp225 230 235 240Phe Val Asn His Ile Asn Gln His Met Phe Val Pro Phe Leu Tyr Gly245 250 255Leu Leu Ala Phe Lys Val Arg Ile Gln Asp Ile Asn Ile Leu Tyr Phe260 265 270Val Lys Thr Asn Asp Ala Ile Arg Val Asn Pro Ile Ser Thr Trp His275 280 285Thr Val Met Phe Trp Gly Gly Lys Ala Phe Phe Val Trp Tyr Arg Leu290 295300Ile Val Pro Leu Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Val Leu Leu Leu Phe305 310 315 320Thr Val Ala Asp Met Val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gln325 330 335Ala Asn His Val Val Glu Glu Val Gln Trp Pro Leu Pro Asp Glu Asn340 345 350Gly Ile Ile Gln Lys Asp Trp Ala Ala Met Gln Val Glu Thr Thr Gln355 360 365Asp Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser Ile Thr Gly Ser Leu370 375380Asn Tyr Gln Ala Val His His Leu Phe Pro Asn Val Ser Gln His His385 390 395 400Tyr Pro Asp Ile Leu Ala Ile Ile Lys Asn Thr Cys Ser Glu Tyr Lys405 410 415Val Pro Tyr Leu Val Lys Asp Thr Phe Trp Gln Ala Phe Ala Ser His420 425 430Leu Glu His Leu Arg Val Leu Gly Leu Arg Pro Lys Glu Glu435 440 445(2)序列3資料(i)序列特征(A)長度186個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列3Leu His His Thr Tyr Thr Asn Ile Ala Gly Ala Asp Pro Asp Val Ser1 5 10 15Thr Ser Glu Pro Asp Val Arg Arg Ile Lys Pro Asn Gln Lys Trp Phe20 25 30Val Asn His Ile Asn Gln His Met Phe Val Pro Phe Leu Tyr Gly Leu35 40 45Leu Ala Phe Lys Val Arg Ile Gln Asp Ile Asn Ile Leu Tyr Phe Val50 55 60Lys Thr Asn Asp Ala Ile Arg Val Asn Pro Ile Ser Thr Trp His Thr65 70 75 80Val Met Phe Trp Gly Gly Lys Ala Phe Phe Val Trp Tyr Arg Leu Ile85 90 95Val Pro Leu Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Val Leu Leu Leu Phe Thr100 105 110Val Ala Asp Met Val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gln Ala115 120 125Asn Tyr Val Val Glu Glu Val Gln Trp Pro Leu Pro Asp Glu Asn Gly130 135 140Ile Ile Gln Lys Asp Trp Ala Ala Met Gln Val Glu Thr Thr Gln Asp145 150 155 160Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser Ile Thr Gly Ser Leu Asn165 170 175Tyr Gln Xaa Val His His Leu Phe Pro His180 185(2)序列4資料(i)序列特征(A)長度457個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列4Met Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Val Leu1 5 10 15Asn Ala Glu Ala Leu Asn Glu Gly Lys Lys Asp Ala Glu Ala Pro Phe20 25 30Leu Met Ile Ile Asp Asn Lys Val Tyr Asp Val Arg Glu Phe Val Pro35 40 45Asp His Pro Gly Gly Ser Val Ile Leu Thr His Val Gly Lys Asp Gly50 55 60Thr Asp Val Phe Asp Thr Phe His Pro Glu Ala Ala Trp Glu Thr Leu65 70 75 80Ala Asn Phe Tyr Val Gly Asp Ile Asp Glu Ser Asp Arg Asp Ile Lys85 90 95Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gln100 105 110Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val115 120 125Ser Phe Asn Leu Cys Ile Trp Gly Leu Ser Thr Val Ile Val Ala Lys130 135 140Trp Gly Gln Thr Ser Thr Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu145 150 155 160Gly Leu Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His165 170 175His Gln Val Phe Gln Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe180 185 190Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys195 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Ile Ala Ser Asn Tyr Arg Trp Leu340 345 350Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser355(2)序列7資料(i)序列特征(A)長度365個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列7Met Thr Ser Thr Thr Ser Lys Val Thr Phe Gly Lys Ser Ile Gly Phe1 5 10 15Arg Lys Glu Leu Asn Arg Arg Val Asn Ala Tyr Leu Glu Ala Glu Asn20 25 30Ile Ser Pro Arg Asp Asn Pro Pro Met Tyr Leu Lys Thr Ala Ile Ile35 40 45Leu Ala Trp Val Val Ser Ala Trp Thr Phe Val Val Phe Gly Pro Asp50 55 60Val Leu Trp Met Lys Leu Leu Gly Cys Ile Val Leu Gly Phe Gly Val65 70 75 80Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Ser His Asp Gly Asn His Gly Gly Tyr85 90 95Ser Lys Tyr Gln Trp Val Asn Tyr Leu Ser Gly Leu Thr His Asp Ala100 105 110Ile Gly Val Ser Ser Tyr Leu Trp Lys Phe Arg His Asn Val Leu His115 120 125His Thr Tyr Thr Asn Ile Leu Gly His Asp Val Glu Ile His Gly Asp130 135 140Glu Leu Val Arg Met Ser Pro Ser Met Glu Tyr Arg Trp Tyr His Arg145 150 155 160Tyr Gln His Trp Phe Ile Trp Phe Val Tyr Pro Phe Ile Pro Tyr Tyr165 170 175Trp Ser Ile Ala Asp Val Gln Thr Met Leu Phe Lys Arg Gln Tyr His180 185 190Asp His Glu Ile Pro Ser Pro Thr Trp Val Asp Ile Ala Thr Leu Leu195 200 205Ala Phe Lys Ala Phe Gly Val Ala Val Phe Leu Ile Ile Pro Ile Ala210 215 220Val Gly Tyr Ser Pro Leu Glu Ala Val Ile Gly Ala Ser Ile Val Tyr225 230 235 240Met Thr His Gly Leu Val Ala Cys Val Val Phe Met Leu Ala His Val245 250 255Ile Glu Pro Ala Glu Phe Leu Asp Pro Asp Asn Leu His Ile Asp Asp260 265 270Glu Trp Ala Ile Ala Gln Val Lys Thr Thr Val Asp Phe Ala Pro Asn275 280 285Asn Thr Ile Ile Asn Trp Tyr Val Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Thr Val290 295 300His His Leu Phe Pro His Ile Cys His Ile His Tyr Pro Lys Ile Ala305 310 315 320Pro Ile Leu Ala Glu Val Cys Glu Glu Phe Gly Val Asn Tyr Ala Val325 330 335His Gln Thr Phe Phe Gly Ala Leu Ala Ala Asn Tyr Ser Trp Leu Lys340 345 350Lys Met Ser Ile Asn Pro Glu Thr Lys Ala Ile Glu Gln355 360 365(2)序列8資料(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型其它核酸(A)說明desc＝“合成寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc-feature(B)位置21(D)其它資料/數(shù)量＝1/注釋＝“N＝肌苷或胞苷”(ix)特征(A)名稱/鍵misc-feature(B)位置27(D)其它資料/數(shù)量＝2/注釋＝“N＝肌苷或胞苷”(xi)序列描述序列8CUACUACUAC UACAYCAYAC NTAYACNAAY AT 32(2)序列9資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型其它核酸(A)說明desc＝“合成寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc-feature(B)位置13(D)其它資料/數(shù)量＝1/注釋＝“N＝肌苷或胞苷”(ix)特征(A)名稱/鍵misc-feature(B)位置19(D)其它資料/數(shù)量＝2/注釋＝“N＝肌苷或胞苷”(xi)序列描述序列9CAUCAUCAUC AUNGGRAANA RRTGRTG 27(2)序列10資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型其它核酸
(xi)序列描述序列10CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTTT 35(2)序列11資料(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列11His Xaa Xaa His His1 5(2)序列12資料(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列12Gln Xaa Xaa His His1 5(2)序列13資料(i)序列特征(A)長度746個核酸(B)類型核酸(C)鏈型不相關(guān)
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型核酸(xi)序列描述序列13CGTATGTCAC TCCATTCCAA ACTCGTTCAT GGTATCATAA ATATCAACAC ATTTACGCTC60CACTCCTCTA TGGTATTTAC ACACTCAAAT ATCGTACTCA AGATTGGGAA GCTTTTGTAA 120AGGATGGTAA AAATGGTGCA ATTCGTGTTA GTGTCGCCAC AAATTTCGAT AAGGCCGCTT 180ACGTCATTGG TAAATTGTCT TTTGTTTTCT TCCGTTTCAT CCTTCCACTC CGTTATCATA 240GCTTTACAGA TTTAATTTGT TATTTCCTCA TTGCTGAATT CGTCTTTGGT TGGTATCTCA 300CAATTAATTT CCAAGTTAGT CATGTCGCTG AAGATCTCAA ATTCTTTGCT ACCCCTGAAA 360GACCAGATGA ACCATCTCAA ATCAATGAAG ATTGGGCAAT CCTTCAACTT AAAACTACTC 420AAGATTATGG TCATGGTTCA CTCCTTTGTA CCTTTTTTAG TGGTTCTTTA AATCATCAAG 480TTGTTCATCA TTTATTCCCA TCAATTGCTC AAGATTTCTA CCCACAACTT GTACCAATTG 540TAAAAGAAGT TTGTAAAGAA CATAACATTA CTTACCACAT TAAACCAAAC TTCACTGAAG 600CTATTATGTC ACACATTAAT TACCTTTACA AAATGGGTAA TGATCCAGAT TATGTTAAAA 660AACCATTAGC CTCAAAAGAT GATTAAATGA AATAACTTAA AAACCAATTA TTTACTTTTG 720ACAAACAGTA ATATTAATAA ATACAA 746(2)序列14資料(i)序列特征(A)長度227個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列14Tyr Val Thr 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520(2)序列18資料(i)序列特征(A)長度153個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列18Met Glu Phe Val Trp Ile Ala Val Arg Tyr Ala Thr Trp Phe Lys1 5 10 15Arg His Gly Cys Ala Trp Val His Ala Gly Ala Val Val Gly His20 25 30Val Leu Val Arg Leu Trp Ser Arg Leu His Leu His Phe Ser Ala35 40 45Val Arg Arg Lys Ser His Pro Phe Ala Arg Glu Gln Pro Gly Gly50 55 60Ser Ala Ala Leu Ala Arg Val Arg Ala Asp His Thr Val Asn Ile65 70 75Ser Thr Lys Ser Trp Phe Val Thr Trp Trp Met Ser Asn Leu Asn80 85 90Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Ala Pro Gln Phe Arg95 100 105Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu Phe Lys Arg His110 115 120Gly Leu Pro Tyr Tyr Asp Met Pro Tyr Thr Ser Ala Val Ser Thr125 130 135Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly Asp Ala140 145 150Lys Arg Asp(2)序列19資料(i)序列特征(A)長度429個核酸(B)類型核酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型核酸(xi)序列描述序列19ACGCGTCCGC CCACGCGTCC GCCGCGAGCA ACTCATCAAG GAAGGCTACT TTGACCCCTC 60GCTCCCGCAC ATGACGTACC GCGTGGTCGA GATTGTTGTT CTCTTCGTGC 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(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列2Arg Val Arg Pro Arg Val Arg Arg Glu Gln Leu Ile Lys Glu Gly1 5 10 15Tyr Phe Asp Pro Ser Leu Pro His Met Thr Tyr Arg Val Val Glu20 25 30Ile Val Val Leu Phe Val Leu Ser Phe Trp Leu Met Gly Gln Ser35 40 45Ser Pro Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Val Val Ser Gly Ile Ser50 55 60Gln Gly Arg Cys Gly Trp Val Met His Glu Met Gly His Gly Ser65 70 75Phe Thr Gly Val Ile Trp Leu Asp Asp Arg Leu Cys Glu Phe Phe65 70 75Tyr Gly Val Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gln80 85 90His Ser Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Val95 100 105Asp Leu Asn Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Arg Val Val110 115 120Arg Lys Val Arg Pro125(2)序列21資料(i)序列特征(A)長度1219個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型其它核酸(編輯重疊群2692004)(xi)序列描述序列21GCACGCCGAC CGGCGCCGGG AGATCCTGGC AAAGTATCCA GAGATAAAGT CCTTGATGAA 60ACCTGATCCC AATTTGATAT GGATTATAAT TATGATGGTT CTCACCCAGT TGGGTGCATT120TTACATAGTA AAAGACTTGG ACTGGAAATG GGTCATATTT GGGGCCTATG CGTTTGGCAG180TTGCATTAAC CACTCAATGA 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(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型氨基酸(重疊群2153526的翻譯)(xi)序列描述序列29Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Leu Pro His Leu Cys Ala Thr Ile Gly1 5 10 15Ala Glu Ser Phe Leu Gly Leu Phe Phe Ile Val Arg Phe Leu Glu20 25 30Ser Asn Trp Phe Val Trp Val Thr Gln Met Asn His Ile Pro Met35 40 45His Ile Asp His Asp Arg Asn Met Asp Trp Val Ser Thr Gln Leu50 55 60Gln Ala Thr Cys Asn Val His Lys Ser Ala Phe Asn Asp Trp Phe65 70 75Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr80 85 90Met Pro Arg His Asn Tyr His Lys Val Ala Pro Leu Val Gln Ser95 100 105Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Ser Lys Pro Leu Leu110 115 120Ser Ala Phe Ala Asp Ile Ile His Ser Leu Lys Glu Ser Gly Gln125 130 135Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Gln *** Gln Gln Pro Pro Cys140 145 150Pro Val Trp Lys Lys Arg Arg Lys Thr Leu Glu Pro Arg Gln Arg155 160 165Gly Ala *** Gly Thr Met Pro Leu *** Phe Asn Thr Gln Arg Gly170 175 180Leu Gly Leu Gly Thr *** Ser Leu *** Leu Lys Leu Leu Pro Phe185 190 195Ile Phe *** Pro Gln Phe *** Asp Pro Lys Trp Gly Val Asp Thr200 205 210Glu Val Pro Arg Arg Glu Gly Ala215(2)序列30資料(i)序列特征(A)長度71個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型氨基酸(重疊群3506132的翻譯)(xi)序列描述序列30Val Phe Tyr Phe Gly Asn Gly Trp Ile Pro Thr Leu Ile Thr Ala1 5 10 15Phe Val Leu Ala Thr Ser Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu Gln His20 25 30Asp Tyr Gly His Leu Ser Val Tyr Arg Lys Pro Lys Trp Asn His35 40 45Leu Val His Lys Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala50 55 60Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gln His His Ala Lys Pro Asn65 70 75Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu Tyr Gly Lys Xxx80 85(2)序列31資料(i)序列特征(A)長度306個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型氨基酸(重疊群3854933的翻譯)(xi)序列描述序列31Gln Gly Pro Thr Pro Arg Tyr Phe Thr Trp Asp Glu Val Ala Gln1 5 10 15Arg Ser Gly Cys Glu Glu Arg Trp Leu Val Ile Asp Arg Lys Val20 25 30Tyr Asn Ile Ser Glu Phe Thr Arg Arg His Pro Gly Gly Ser Arg35 40 45Val Ile Ser His Tyr Ala Gly Gln Asp Ala Thr Asp Pro Phe Val50 55 60Ala Phe His Ile Asn Lys Gly Leu Val Lys Lys Tyr Met Asn Ser65 70 75Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ser Pro Glu Gln Pro Ser Phe Glu Pro80 85 90Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu Phe Arg Glu Leu Arg Ala95 100 105Thr Val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His Val Phe Phe110 115 120Leu Leu Tyr Leu Leu His Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp125 130 135Leu Thr Leu Trp Val Phe Gly Thr Ser Phe Leu Pro Phe Leu Leu140 145 150Cys Ala Val Leu Leu Ser Ala Val Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu155 160 165Gln His Asp Phe Gly His Leu Ser Val Phe Ser Thr Ser Lys Trp170 175 180Asn His Leu Leu His His Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala185 190 195Pro Ala Ser Trp Trp Asn His Met His Phe Gln His His Ala Lys200 205 210Pro Asn Cys Phe Arg Lys Asp Pro Asp Ile Asn Met His Pro Phe215 220 225Phe Phe Ala Leu Gly Lys Ile Leu Ser Val Glu Leu Gly Lys Gln230 235 240Lys Lys Lys Tyr Met Pro Tyr Asn His Gln His Xxx Tyr Phe Phe245 250 255Leu Ile Gly Pro Pro Ala Leu Leu Pro Leu Tyr Phe Gln Trp Tyr260 265 270Ile Phe Tyr Phe Val Ile Gln Arg Lys Lys Trp Val Asp Leu Ala275 280 285Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ala Gly Leu Pro Leu Ser290 295 300Thr Ala Asn Ala Ser Lys305(2)序列32資料(i)序列特征(A)長度566個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型氨基酸(重疊群2511785的翻譯)(xi)序列描述序列32His Leu Lys Gly Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe1 5 10 15Gln His His Ala Lys Pro Asn Ile Phe His Lys Asp Pro Asp Val20 25 30Asn Met Leu His Val Phe Val Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu35 40 45Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gln His50 55 60Glu Tyr Phe Phe Leu Ile Gly Pro Pro Leu Leu Ile Pro Met Tyr65 70 75Phe Gln Tyr Gln Ile Ile Met Thr Met Ile Val His Lys Asn Trp80 85 90Val Asp Leu Ala Trp Ala Val Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Phe Ile95 100 105Thr Tyr Ile Pro Phe Tyr Gly Ile Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu110 115 120Asn Phe Ile Arg Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr125 130 135Gln Met Asn His Ile Val Met Glu Ile Asp Gln Glu Ala Tyr Arg140 145 150Asp Trp Phe Ser Ser Gln Leu Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gln155 160 165
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Gly Leu Leu Phe *** Gly Val Ser Glu Arg Leu460 465 470Val Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp Leu Ser Pro Phe475 480 485Leu Leu Ser Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His Ser Thr Leu Pro490 495 500Ser Trp Asp Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gln Pro Ser Ala Met Ala505 510 515Leu Pro Val Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gln Gly Ala Glu Arg Trp520 525 530Pro Pro Gly Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu Pro Leu Lys535 540 545Met Gly Gly Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser Pro550 555 560Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly Ile Thr Pro Ala Leu Val Leu Gln565 570 575Met Leu Leu Gly Phe Ile Gly Ala Gly Pro Ser Arg Ala Gly Pro580 585 590Leu Thr Leu Pro Ala Trp Leu His Ser Pro *** Arg Leu Pro Leu595 600 605Val His Pro Phe Ile Glu Arg Pro Ala Leu Leu Gln Ser Ser Gly610 615 620Leu Pro Pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser *** Asp625 630 635Val Gln Gly Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser Pro Asn Leu Gly640 645 650Pro Trp Lys Ser Pro Pro Pro His His *** Ser Ala Leu Thr Leu655 660 665Gly Phe His Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro Thr *** Ala Cys670 675 680Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Val Pro Arg Leu Leu *** Leu Ser685 690 695Arg Gly Ser Gly His Val Gln Gly Gly Ala Gly Trp Pro Gly Gly700 705 710Ser Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gln Gly Val Leu Arg Ser Lys715 720 725Ile Leu Glu Gln Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala Leu Leu Ser Ala730 735 740Gly Gln Cys Gln Pro Ile Pro Gly His Leu Ala Pro Gly Asp Val745 750 755Gly Pro Xxx
權(quán)利要求
1.一種提取的核酸，包括序列1所示的核苷酸序列。
2.一種由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的多肽。
3.一種純化或提取的多肽，含有序列2所示的氨基酸序列。
4.一種提取的核酸，編碼序列2的多肽。
5.一種提取的核酸，包括一個核苷酸序列，它編碼一種能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和的多肽。
6.如權(quán)利要求5的提取的核酸，其中，所述核苷酸序列源于真核細胞。
7.如權(quán)利要求6的提取的核酸，其中，所述真核細胞是真菌細胞。
8.如權(quán)利要求7的提取的核酸，其中，所述真菌細胞是被孢霉屬的。
9.如權(quán)利要求8的提取的核酸，其中，所述被孢霉屬細胞是高山被孢霉菌。
10.如權(quán)利要求5的提取的核酸序列，其中，所述核苷酸序列能與序列1所示的核苷酸序列退火。
11.如權(quán)利要求10的核酸，其中，所述核苷酸序列編碼序列2所示的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求11的核酸，其中，所述如序列2所示的氨基酸序列選自下列一組氨基酸殘基30-38，41-44，171-175，203-212，和387-394。
13.一種提取的或純化的多肽，它能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和。
14.一種提取的核酸，包括一個核苷酸序列，它大體上與序列1中的一個至少有50個核苷酸的序列相同。
15.一種提取的核酸序列，與序列1至少有大約50％的同一性。
16.一種核酸結(jié)構(gòu)，包括連接于一個異源核酸的序列1所示的核苷酸序列。
17.一種核酸結(jié)構(gòu)，包括一個可操作地連接于一個啟動子的序列1所示的核苷酸序列。
18.如權(quán)利要求17的核酸結(jié)構(gòu)，其中，所述啟動子可在微生物細胞中起作用。
19.如權(quán)利要求18的核酸結(jié)構(gòu)，其中，所述微生物細胞是酵母細胞。
20.如權(quán)利要求17的核酸結(jié)構(gòu)，其中，所述核苷酸序列源于真菌。
21.如權(quán)利要求19的核酸結(jié)構(gòu)，其中，所述真菌是被孢霉屬。
22.如權(quán)利要求20的核酸，其中，所述真菌是高山被孢霉菌。
23.一種核酸結(jié)構(gòu)，包括一個核苷酸序列，它編碼一種多肽，該多肽包括一個相當于或互補于序列2所示氨基酸序列的氨基酸序列，其中，所述核苷酸序列可操作地連接于一個能在宿主細胞中起作用的啟動子，其中，所述核苷酸序列編碼一種能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和的多肽。
24.一種核酸結(jié)構(gòu)，包括一個核苷酸序列，它編碼一種具有功能活性的Δ5-脫氫酶，該脫氫酶的氨基酸序列相當于或互補于序列2所示氨基酸序列的全部或一部分，其中，所述核苷酸序列可操作地連接于一個能在宿主細胞中起作用的啟動子。
25.一種重組酵母細胞，包括一個如權(quán)利要求23或24所述的核酸結(jié)構(gòu)。
26.如權(quán)利要求25的重組酵母細胞，其中所述酵母細胞是酵母屬細胞。
27.一種宿主細胞，包括至少一個拷貝的核苷酸序列，該序列編碼一種能將二同-γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化成花生四烯酸的多肽，其中，所述微生物細胞或該微生物細胞的祖細胞是用一種包括所述核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化過的，而且，其中，所述核苷酸序列可操作地連接于一個能在所述宿主細胞中起作用的啟動子。
28.如權(quán)利要求27的微生物細胞，其中，所述細胞是選自真菌細胞和藻類細胞的宿主細胞。
29.如權(quán)利要求28的微生物細胞，其中，所述真菌細胞是酵母細胞，而所述藻類細胞是海藻細胞。
30.如權(quán)利要求27的微生物細胞，其中，所述細胞與缺乏所述核苷酸序列的宿主細胞相比富含20∶3脂肪酸。
31.如權(quán)利要求27的微生物細胞，其中，所述細胞與缺乏所述DNA序列的宿主細胞相比富含20∶4或ω-3 20∶4脂肪酸。
32.如權(quán)利要求27的微生物細胞，其中，所述細胞與缺乏所述DNA序列的宿主細胞相比富含20∶5脂肪酸。
33.如權(quán)利要求27的微生物細胞，其中，所述細胞與未轉(zhuǎn)化的微生物細胞相比具有改變量的20∶3(8，11，14)脂肪酸。
34.一種用于在微生物細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生花生四烯酸的方法，該方法包括生長一種具有多個微生物細胞的微生物細胞培養(yǎng)物，其中，所述微生物細胞或該微生物細胞的祖細胞是用包括一個或幾個具有編碼一種能將二同-γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化成花生四烯酸多肽的核苷酸序列的核酸的載體轉(zhuǎn)化過的，其中，所述一個或幾個核酸可操作地連接于一個啟動子，生長條件為所述一個或幾個核酸能在所述微生物細胞培養(yǎng)物中表達并產(chǎn)生花生四烯酸。
35.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述多肽是一種酶，它能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和。
36.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述核苷酸序列源于被孢霉菌。
37.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述二同-γ-亞麻酸是外源補充的。
38.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述微生物細胞是酵母細胞。
39.如權(quán)利要求38的方法，其中，所述酵母細胞是酵母菌細胞。
40.如權(quán)利要求34的方法，其中，所述條件是可誘導(dǎo)的。
41.一種重組酵母細胞，它能將超過大約5％的20∶3脂肪酸轉(zhuǎn)化成20∶4脂肪酸。
42.一種核酸探針，包括一個如序列1所示的核苷酸序列。
43.一種宿主細胞，包括一個如權(quán)利要求23或24所述的核酸結(jié)構(gòu)。
44.一種宿主細胞，包括一個載體，該載體包括一個源于高山被孢霉的編碼一種脂肪酸脫氫酶的核酸，其中，所述脂肪酸脫氫酶包括一個序列2所示的氨基酸序列，其中，所述核酸可操作地連接于一個啟動子。
45.如權(quán)利要求44的宿主細胞，其中，所述宿主細胞是真核細胞。
46.如權(quán)利要求45的宿主細胞，其中，所述真核細胞選自下列一組哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞、禽細胞和藻類細胞。
47.如權(quán)利要求45的宿主細胞，其中，所述宿主細胞含有二同-γ-亞麻酸。
48.如權(quán)利要求45的宿主細胞，其中，所述宿主細胞含有EPA。
49.如權(quán)利要求44的宿主細胞，其中，所述啟動子是外源提供的。
50.一種用于將二同-γ-亞麻酸去飽和的方法，該方法包括在適于表達由所述核酸編碼的多肽的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求37所述的重組微生物細胞，其中，所述宿主細胞還包括一種所述多肽的脂肪酸底物。
51.一種用權(quán)利要求50所述方法去飽和的脂肪酸。
52.一種含有權(quán)利要求51所述脂肪酸的油。
53.一種用于實現(xiàn)改變了的長鏈多不飽和脂肪酸生物合成的方法，包括以下步驟生長一種微生物，該微生物具有包含一種轉(zhuǎn)基因的細胞，該轉(zhuǎn)基因編碼一種轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物，該產(chǎn)物能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和，其中，所述轉(zhuǎn)基因與一個表達控制序列可操作地連接在一起，生長條件為使所述轉(zhuǎn)基因能夠表達，從而改變所述細胞中長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成。
54.一種用于實現(xiàn)改變了的長鏈多不飽和脂肪酸生物合成的方法，包括以下步驟生長一種微生物，該微生物具有一種含有源于真菌或藻類的轉(zhuǎn)基因的細胞，該轉(zhuǎn)基因編碼一種轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物，該產(chǎn)物能從一個脂肪酸分子的羧基末端在C5位將該分子去飽和，其中，所述轉(zhuǎn)基因與一個表達控制序列可操作地連接在一起，生長條件為使所述一個或幾個轉(zhuǎn)基因能夠表達，從而改變所述細胞中長鏈多不飽和脂肪酸的生物合成。
55.如權(quán)利要求53或54的方法，其中，所述長鏈多不飽和脂肪酸選自ARA、DGLA和EPA。
56.一種按照權(quán)利要求53或54所述方法產(chǎn)生的微生物油類或其級分。
57.一種治療或預(yù)防營養(yǎng)不良的方法，包括給需要這種治療或預(yù)防的患者服用足于實現(xiàn)所述治療或預(yù)防目的量的如權(quán)利要求56所述的微生物油類。
58.一種藥用組合物，含有權(quán)利要求56所述的微生物油類或其級分，以及一種可以藥用的載體。
59.如權(quán)利要求58的藥用組合物，其中，所述藥用組合物為固體或液體形式。
60.如權(quán)利要求59的藥用組合物，其中，所述藥用組合物為膠囊或片劑形式。
61.如權(quán)利要求58的藥用組合物，還包括至少一種選自下列一組的養(yǎng)分維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物、糖、氨基酸、游離脂肪酸、磷脂、抗氧化劑、和酚類化合物。
62.一種含有權(quán)利要求56所述微生物油類或其級分的營養(yǎng)配方食品。
63.如權(quán)利要求62的營養(yǎng)配方食品，其中，所述營養(yǎng)配方食品選自下列一組嬰兒配方食品、保健食品和食用替代品。
64.如權(quán)利要求63的營養(yǎng)配方食品，其中，所述嬰兒配方食品、保健食品或保健食品為液體或固體形式。
65.一種嬰兒配方食品，含有權(quán)利要求56所述的微生物油類或其級分。
66.如權(quán)利要求65的嬰兒配方食品，還包括至少一種選自下列一組的常量營養(yǎng)物椰子油、大豆油、菜籽油、甘油一酯和二酯、葡萄糖、食用乳糖、電滲析乳清、電滲析脫脂乳、乳清、大豆蛋白、以及其它蛋白水解物。
67.如權(quán)利要求66的嬰兒配方食品，還包括至少一種選自下列一組的維生素維生素A、C、D、E和B復(fù)合物以及至少一種選自下列一組的礦物質(zhì)鈣、鎂、鋅、錳、鈉、鉀、磷、銅、氯、碘、硒、和鐵。
68.一種保健食品，含有權(quán)利要求56所述的微生物油類或其級分。
69.如權(quán)利要求68的保健食品，還包括至少一種選自下列一組的常量營養(yǎng)物椰子油、大豆油、菜籽油、甘油一酯和二酯、葡萄糖、食用乳糖、電滲析乳清、電滲析脫脂乳、乳清、大豆蛋白、以及其它蛋白水解物。
70.如權(quán)利要求69的保健食品，還包括至少一種選自下列一組的維生素維生素A、C、D、E和B復(fù)合物以及至少一種選自下列一組的礦物質(zhì)鈣、鎂、鋅、錳、鈉、鉀、磷、銅、氯、碘、硒、和鐵。
71.如權(quán)利要求68或70的保健食品，其中，所述保健食品被用于人或動物。
72.一種食用替代品，含有權(quán)利要求56所述的微生物油類或其級分。
73.如權(quán)利要求72的食用替代品，還包括至少一種選自下列一組的常量營養(yǎng)物椰子油、大豆油、菜籽油、甘油一酯和二酯、葡萄糖、食用乳糖、電滲析乳清、電滲析脫脂乳、乳清、大豆蛋白、以及其它蛋白水解物。
74.如權(quán)利要求73的食用替代品，還包括至少一種選自下列一組的維生素維生素A、C、D、E和B復(fù)合物以及至少一種選自下列一組的礦物質(zhì)鈣、鎂、鋅、錳、鈉、鉀、磷、銅、氯、碘、硒、和鐵。
75.如權(quán)利要求72或74的食用替代品，其中，所述食用替代品被用于人或動物。
76.一種治療患有由攝取或產(chǎn)生多不飽和脂肪酸不足而引起的癥狀的患者的方法，包括以足于實現(xiàn)所述治療的量給所述患者服用權(quán)利要求72所述的食用替代品或權(quán)利要求68所述的保健食品。
77.如權(quán)利要求72的方法，其中，所述食用替代品或保健食品是通過腸道或腸胃外服用的。
78.一種化妝品，含有權(quán)利要求56所述的微生物油類或其級分。
79.如權(quán)利要求78的化妝品，其中，所述化妝品是表皮使用的。
80.如權(quán)利要求58的藥用組合物，其中，所述藥用組合物被用于人或動物。
81.一種動物飼料，含有權(quán)利要求56所述的微生物油類或其級分。
82.如權(quán)利要求54的方法，其中，所述真菌是被孢霉菌。
83.如權(quán)利要求82的方法，其中，所述真菌是高山被孢霉。
84.一種選自序列13和序列15的提取的核苷酸序列。
85.一種選自序列7和序列19的提取的核苷酸序列。
86.一種提取的核苷酸序列，包括選自下列一組的核苷酸序列序列13；序列15；序列17；序列19；序列21；序列22；序列23；序列24；序列25；序列26和序列27。
87.一種提取的肽序列，包括選自下列一組的肽序列序列14；序列16；序列18；序列20；序列28；序列29；序列30；序列31；序列32；序列33和序列34。
88.由權(quán)利要求84-86的核苷酸序列產(chǎn)生的純化多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能催化二同－γ－亞麻酸轉(zhuǎn)化成花生四烯酸的脂肪酸△5－脫氫酶。披露了編碼△5－脫氫酶的核酸序列、能與它雜交的核酸序列、包括△5－脫氫酶基因的DNA結(jié)構(gòu)、和能高水平表達△5－脫氫酶的重組宿主微生物或動物。披露了用于使脂肪酸在其△5位置上去飽和的方法和用于通過表達高水平的△5－脫氫酶產(chǎn)生花生四烯酸的方法,提供了通過由重組宿主微生物或動物產(chǎn)生的△5－脫氫酶去飽和的脂肪酸及含有這種脂肪酸的油。披露了含有通過由重組宿主微生物或動物產(chǎn)生的△5－脫氫酶去飽和的脂肪酸的藥用組合物、嬰兒配方食品或保健食品。
文檔編號A61P3/02GK1253587SQ98804090
公開日2000年5月17日 申請日期1998年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月11日
發(fā)明者D·克努特宗, P·穆克爾吉, Y·S·黃, J·圖爾蒙德, S·喬德哈賴, A·E·Y·勒安納德 申請人:加利福尼亞基因公司, 艾博特公司