專利名稱：一種重組大腸桿菌周質(zhì)蛋白液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程中下游領(lǐng)域的蛋白質(zhì)分離純化，尤指重組大腸桿菌周質(zhì)蛋白液的制備方法。
隨著70年代基因工程技術(shù)的興起，目前很多珍貴的藥物蛋白及其它活性蛋白，如人生長激素，干擾素，白介素等都可利用基因工程大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)。
所謂基因工程大腸桿菌就是整合了外源基因的大腸桿菌，該外源基因編碼目的蛋白，通過宿主大腸桿菌就可合成相應(yīng)的目的蛋白。目前，大腸桿菌細(xì)胞中的外源蛋白有三種分泌形式，即胞外分泌，周質(zhì)分泌，形成包涵體。其中最為常用的是包涵體形式，胞外分泌近年也逐步增多，而周質(zhì)分泌型雖然也有諸多的優(yōu)點但應(yīng)用較少，其中的一個重要原因就是缺少有效的專用于細(xì)胞周質(zhì)蛋白提取的工藝。胞外分泌型只需在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，離心取上清液進(jìn)行分離純化。包涵體表達(dá)形式則要先對細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，然后利用包涵體與細(xì)胞碎片及胞內(nèi)物質(zhì)的密度差進(jìn)行包涵體分離，收獲包涵體作進(jìn)一步純化。而周質(zhì)分泌型則需要定向釋放技術(shù)，該技術(shù)的關(guān)鍵在于僅作用于細(xì)胞外膜而不損害細(xì)胞內(nèi)膜和細(xì)胞壁。如果細(xì)胞壁和內(nèi)膜損害程度太大，則胞內(nèi)干擾物質(zhì)大量釋放到提取液中，將給目的蛋白的下一步純化帶來困難。
目前細(xì)胞周質(zhì)的專用提取方法很少見，特別是適合于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝還未見報道。目前已報道的周質(zhì)制備方法有溶菌酶法[MolecularCloning-A Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989]，蔗糖滲透壓法[Comelis.P.,Mol.Gen.Genet.,1982,186:507～511]、低濃度胍處理法[T.J.Naglak and H.Y.Wang,EnzymeMicrob.Technol.,1990,12(8):603]，這些方法都不過是細(xì)胞全破碎方法的溫和化而已，都未能解決細(xì)胞壁和內(nèi)膜的受損害問題。因此，或多或少會使胞內(nèi)物質(zhì)，特別是對目的蛋白質(zhì)的分離純化有嚴(yán)重干擾的核酸大分子釋放到提取液中。而雜蛋白及核酸的夾帶不僅影響目的蛋白的純化回收率，而且還會影響產(chǎn)品的質(zhì)量。特別是這些方法在試驗室小試規(guī)?？赡苓€有一定效果，但卻難以在工業(yè)規(guī)模中推廣。
為此，本發(fā)明的目的是提供一種重組大腸桿菌周質(zhì)蛋白液的制備方法，即鹽處理法制備細(xì)胞周質(zhì)液。該方法有效地防止了前述已有方法在制備細(xì)胞周質(zhì)液時對細(xì)胞壁和內(nèi)膜的損害，從而減少了細(xì)胞內(nèi)干擾物質(zhì)對蛋白分離純化的影響。它不僅適合于實驗室的小量制備，而且特別適合于工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)。
本發(fā)明是一種重組大腸桿菌周質(zhì)蛋白液的制備方法，通過鹽的陽離子作用于重組大腸桿菌細(xì)胞以增加細(xì)胞外膜的通透性，從而達(dá)到專一抽提細(xì)胞周質(zhì)中蛋白之目的。具體工藝步驟如下所述。
在重組大腸桿菌發(fā)酵結(jié)束之后，冷卻發(fā)酵液溫度(0～37℃均可，以0～15℃為佳)使細(xì)胞代謝降低，同時在發(fā)酵液中直接加入鹽處理細(xì)胞。可用的鹽類主要包括一價陽離子鹽如鈉鹽如氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉等所有的可溶性鈉鹽，鉀鹽如氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀等所有可溶性鉀鹽，銨鹽如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨等所有可溶性銨鹽，以及其它所有含一價陽離子的可溶性鹽。如實施例1、2、3、4配合圖2顯示鈉鹽、鉀鹽、銨鹽如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸銨效果相同。從成本上考慮，采用氯化鈉最佳。
鹽的加量和處理時間視不同的發(fā)酵工藝、品種、菌株而異，以鹽中的陽離子摩爾濃度計，從78m mol～8000m mol為有效濃度范圍。以氯化鈉為例，如圖3所示鈉離子濃度在78m mol～3440m mol范圍內(nèi)都有效果。針對不同的大腸桿菌及所涉及的各種蛋白，可能有不同的最佳濃度。加鹽處理時間一般需10分鐘以上，但不超過4小時，時間太長則有細(xì)胞自溶的可能。
本操作步驟也可如下進(jìn)行發(fā)酵結(jié)束后先離心發(fā)酵液收獲菌體，然后將菌體溫和分散于大于菌體體積的鹽溶液中進(jìn)行處理，工藝條件如離子濃度、溫度、時間如同上述)加鹽處理完畢后，離心收集菌體，加入冷的提取液，溫和分散菌體，低溫抽提周質(zhì)蛋白。
提取液一般使用蒸餾水即可，也可使用緩沖液如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液等作提取液，作為提取液的緩沖液和蒸餾水中也可加入某種蛋白保護(hù)劑如PMSF(蛋白酶抑制劑)、白蛋白、多糖等、也可加入鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解(如氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，濃度從50～150m mol)，也可加入離子螯合劑EDTA。如實施例7使用10mmolTris(PH=7.5)作提取液也取得相同的效果。
提取液溫度以0～15℃較好，提取液加量應(yīng)大于菌體濕重，最佳比例為5～10∶1(重量比)，此比例太小，可能提取不充分，此比例太大，提取液中目的蛋白濃度太稀。抽提時溫度也以0～15℃為佳，抽提時間視發(fā)酵工藝、品種、菌株的不同而異。一般需10分鐘以上，但不超過4小時，時間太長可能引起菌體自溶。
低溫抽提完畢后，離心收集上清液，即得周質(zhì)提取液。該周質(zhì)提取液再經(jīng)進(jìn)一步分離純化即可得到目的蛋白。
本發(fā)明方法以制備基因工程大腸桿菌BL21(Omp)周質(zhì)液為例，詳述于后。該工程菌分泌人生長激素于細(xì)胞周質(zhì)中。另外，以目前已有的周質(zhì)提取較好的方法即溶菌酶法作提取效果對照(具體操作見對照例1，在以上提到的已有方法中，溶菌酶法的目的蛋白提取率高，雜質(zhì)少)。
檢測方法使用放免法測量人生長激素含量[使用衛(wèi)生部上海生物制品研究所人生長激素試劑盒]、福林-酚法測量提取液總蛋白含量[參見生物化學(xué)實驗?zāi)暇┐髮W(xué)生物系人民出版社1979]、定磷法測核酸含量[參見生物化學(xué)實驗?zāi)暇┐髮W(xué)生物系人民出版社1979]，同時，提取液作還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以及對提取液作進(jìn)一步純化精制獲得人生長激素(常規(guī)方法如等電點沉淀、再經(jīng)硫酸銨沉淀、最后用離子交換樹脂分離)。
兩種方法的結(jié)果對照見表1，周質(zhì)提取液電泳圖見圖1。圖中顯示，本發(fā)明方法的周質(zhì)液雜蛋白明顯少于溶菌酶法，因而有利于目的蛋白的回收和產(chǎn)品的質(zhì)量的提高。目前因無其它滿意的細(xì)胞周質(zhì)中目的蛋白含量測定方法，所以無法計算本發(fā)明方法的目的蛋白提取率。
表1．本發(fā)明方法與溶菌酶法的周質(zhì)提取液的比較
表1結(jié)果顯示，本發(fā)明方法的周質(zhì)提取液中人生長激素占總蛋白含量的62％，核酸未檢出。溶菌酶法周質(zhì)液中，雖然人生長激素含量相仿，但雜蛋白含量、核酸含量均大于本發(fā)明方法。兩種方法的周質(zhì)液經(jīng)常規(guī)方法進(jìn)行純化精制，本發(fā)明方法的最終產(chǎn)量為50mg/L(發(fā)酵液)，而溶菌酶法的最終產(chǎn)量為25mg/L(發(fā)酵液)，高出一倍。
因此，本發(fā)明作為大腸桿菌周質(zhì)液的制備方法，具有以下優(yōu)點1．順利解決了從周質(zhì)分泌型重組大腸桿菌中制備含目的蛋白的周質(zhì)液這一技術(shù)關(guān)鍵，避免了已有方法對細(xì)胞壁和內(nèi)膜的損害而引起胞內(nèi)干擾物質(zhì)的過多釋放。因此，與已有方法相比本發(fā)明方法提取液的蛋白純度、目的蛋白純化回收率及最終產(chǎn)品的質(zhì)量都大為提高。2．工藝簡單，操作方便。在發(fā)酵結(jié)束后可直接加鹽對發(fā)酵液進(jìn)行處理，這與已有方法比較是一個顯著的改進(jìn)。3．本發(fā)明方法所用原料是價廉的鹽，其生產(chǎn)成本大大低于其它方法的成本。如溶菌酶法，它需要昂貴的溶菌酶、Tris、EDTA，以及20％的蔗糖。4．它不僅適合于實驗室的小量制備，而且特別適合于工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)。因此本發(fā)明方法的提出將促進(jìn)周質(zhì)分泌型工程菌的應(yīng)用，特別是為該類型基因工程菌的工業(yè)化應(yīng)用開辟道路。


圖1是本發(fā)明方法與溶菌酶法制備的周質(zhì)分泌型重組人生長激素大腸桿菌BL21(omp)菌體周質(zhì)液電泳圖。1．溶菌酶法，2．本發(fā)明方法，3．標(biāo)準(zhǔn)人生長激素。
圖2是采用各種一價陽離子鹽處理重組人生長激素大腸桿菌BL21(omp)菌體而制得的周質(zhì)液電泳圖。1．氯化鈉，2．硫酸鈉，3．氯化鉀，4．硫酸銨。
圖3是采用不同的鈉離子濃度處理重組人生長激素大腸桿菌BL21(omp)菌體而制得的周質(zhì)液電泳圖。發(fā)酵液中鈉離子濃度從左到右分別為1-78m mol,2-150m mol,3-230m mol,4-430m mol,5-860m mol,6-1720m mol,7-2580m mol,8-3440m mol。
本發(fā)明通過以下的實施例作進(jìn)一步闡述，但并不限止本發(fā)明的范圍。
實施例1采用氯化鈉處理細(xì)胞制備周質(zhì)液使用基因工程大腸桿菌BL21(Omp)，該分泌型工程菌分泌人生長激素于細(xì)胞周質(zhì)中。發(fā)酵規(guī)模為8L，取1L發(fā)酵液進(jìn)行周質(zhì)液制備。各實施例中的檢測方法均如上所述。
工程菌發(fā)酵完畢后，開始降溫，同時直接加入氯化鈉，最終鈉離子濃度為430m mol，降溫到4℃后保持30分鐘。然后冷凍離心，取菌體，以1∶7.5的比例(菌體濕重蒸餾水重量)加入4℃蒸餾水，溫和分散菌體，4℃保溫30分鐘。最后冷凍離心取上清液即周質(zhì)液。
周質(zhì)液體積250ml，周質(zhì)液中生長激素含量為0.9mg/ml，總含量為225mg。周質(zhì)液總蛋白含量為1.46mg/ml，核酸未檢出。周質(zhì)液電泳圖見圖2中的1。
周質(zhì)液經(jīng)等電點沉淀、硫酸銨沉淀，最后使用陰離子交換樹脂作純化，最終生長激素產(chǎn)量為50mg/L(發(fā)酵液)，純度96％。
實施例2采用硫酸鈉處理細(xì)胞制備周質(zhì)液使用的菌體、發(fā)酵規(guī)模及取樣量同實施例1。
工程菌發(fā)酵完畢后，開始降溫，同時直接加入硫酸鈉，鈉離子最終濃度為1200m mol，降溫到15℃后保持10分鐘。然后冷凍離心，取菌體，以1∶10的比例(菌體濕重蒸餾水重量)加入15℃蒸餾水，溫和分散菌體，15℃保溫10分鐘。最后冷凍離心取上清液即周質(zhì)液。
周質(zhì)液體積330ml，周質(zhì)液中生長激素含量為0.59mg/ml，總含量為195mg。周質(zhì)液總蛋白含量為1.00mg/ml，核酸未檢出。周質(zhì)液電泳圖見圖2中的2。
周質(zhì)液經(jīng)等電點沉淀、硫酸銨沉淀，最后使用陰離子交換樹脂作純化，最終生長激素產(chǎn)量為41mg/L(發(fā)酵液)，純度96％。
實施例3采用硫酸銨處理細(xì)胞制備周質(zhì)液使用的菌體、發(fā)酵規(guī)模及取樣量同實施例1。
工程菌發(fā)酵完畢后，開始降溫，同時直接加入硫酸銨，最終銨離子濃度為8000m mol，降溫到0℃后保持3小時。然后冷凍離心，取菌體，以1∶10的比例(菌體濕重蒸餾水重量)加入0℃蒸餾水，溫和分散菌體，0℃保溫3小時。最后冷凍離心取上清液即周質(zhì)液。
周質(zhì)液體積330ml，周質(zhì)液中生長激素含量為0.74mg/ml，總含量為244mg。周質(zhì)液總蛋白含量為1.29mg/ml，核酸未檢出。周質(zhì)液電泳圖見圖2中的4。
周質(zhì)液經(jīng)等電點沉淀、硫酸銨沉淀，最后使用陰離子交換樹脂作純化，最終生長激素產(chǎn)量為40mg/L(發(fā)酵液)，純度96％。
實施例4采用氯化鉀處理細(xì)胞制備周質(zhì)液使用的菌體、發(fā)酵規(guī)模及取樣量同實施例1。
工程菌發(fā)酵完畢后，開始降溫，同時直接加入氯化鉀，最終鉀離子濃度為230m mol，降溫到0℃后保持30分鐘。然后冷凍離心，取菌體，以1∶5的比例(菌體濕重蒸餾水重量)加入0℃蒸餾水，溫和分散菌體，0℃保溫30分鐘。最后冷凍離心取上清液即周質(zhì)液。
周質(zhì)液體積160ml，周質(zhì)液中生長激素含量為1.4mg/ml，總含量為224mg。周質(zhì)液總蛋白含量為2.20mg/ml，核酸未檢出。周質(zhì)液電泳圖見圖2中的3。
周質(zhì)液經(jīng)等電點沉淀、硫酸銨沉淀，最后使用陰離子交換樹脂作純化，最終生長激素產(chǎn)量為45mg/L(發(fā)酵液)，純度96％。
實施例5重組人生長激素大腸桿菌周質(zhì)蛋白液的大規(guī)模制備使用基因工程大腸桿菌BL21(Omp)，該分泌型工程菌分泌人生長激素于細(xì)胞周質(zhì)中。生產(chǎn)規(guī)模為220L。
工程菌發(fā)酵完畢后，開始降溫，同時直接加入氯化鈉，最終鈉離子濃度為430m mol，降溫到4℃后保持15分鐘。然后冷凍離心，取菌體，以1∶7.5的比例(菌體濕重∶蒸餾水重量)加入4℃蒸餾水，溫和分散菌體，4℃保溫30分鐘。最后冷凍離心取上清液即周質(zhì)液。周質(zhì)液電泳圖見圖1中的2。
周質(zhì)液體積35L，周質(zhì)液中生長激素含量為0.9mg/ml，總含量為31.5g。周質(zhì)液總蛋白含量為1.52mg/ml，核酸未檢出。
周質(zhì)液經(jīng)等電點沉淀、硫酸銨沉淀，最后使用陰離子交換樹脂作純化，最終生長激素產(chǎn)量為40mg/L(發(fā)酵液)，純度95％。
實施例6陽離子的有效濃度范圍實驗以氯化鈉為例，發(fā)酵液取樣量為1.5ml，制備周質(zhì)液0.37ml，使用的菌株、發(fā)酵規(guī)模及操作步驟同實施例1，發(fā)酵液的鈉離子濃度分別為78、150、230、430、860、1720、2580、3440m mol。提取液測量生長激素含量(測量方法同實施例1)，同時作還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
生長激素含量分別為0.18、0.26、0.40、0.97、0.94、0.96、0.97、0.96mg/ml周質(zhì)液。電泳結(jié)果如圖3所示從78～3440m mol的鈉離子濃度范圍均有效果。
實施例7以10mmolTris(PH=7.5)作提取液制備重組人生長激素大腸桿菌周質(zhì)蛋白液除提取液外其余條件均與實施例5相同。
結(jié)果周質(zhì)液體積35L，周質(zhì)液中生長激素含量0.91mg/ml。最終生長激素產(chǎn)量42mg/L(發(fā)酵液)，純度95％。
對照例1溶菌酶法制備重組人生長激素大腸桿菌周質(zhì)蛋白液使用的菌種、發(fā)酵規(guī)模及取樣量同實施例1。操作方法參見“MolecularCloning-A Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989”。
1L發(fā)酵液冷卻到4C后，冷凍離心后取菌體，加入250ml溶菌酶溶液溫和分散菌體，在4℃下保溫30分鐘。溶菌酶溶液組成1mg/ml溶菌酶，1mmolEDTA(PH=8.0),20mmolTris(PH=8.0)。然后冷凍離心取上清液即細(xì)胞周質(zhì)液。
周質(zhì)液總蛋白含量為1.96mg/ml，生長激素含量為0.89mg/ml周質(zhì)液，核酸含量為0.18mg/ml周質(zhì)液。周質(zhì)液電泳圖見圖1中的1。
采用常規(guī)后處理方法操作(同實施例1)，最終得到人生長激素25mg/L(發(fā)酵液)，純度91％。
權(quán)利要求
1.一種重組大腸桿菌周質(zhì)蛋白液的制備方法，其特征在于在發(fā)酵液中直接加入鹽處理細(xì)胞，離心收集菌體，然后再加入提取液抽提，離心取上清液，即得周質(zhì)蛋白液。
2.按權(quán)利要求1所述的周質(zhì)蛋白液的制備方法，其特征在于所述鹽包括鈉鹽、鉀鹽、銨鹽及其它含一價陽離子的可溶性的鹽。
3.按權(quán)利要求1所述的周質(zhì)蛋白液的制備方法，其特征在于所述鹽的陽離子濃度為78m mol-8000m mol。
4.按權(quán)利要求1所述的周質(zhì)蛋白液的制備方法，其特征在于鹽處理細(xì)胞的時間為10分鐘-4小時。
5.按權(quán)利要求1所述的周質(zhì)蛋白液的制備方法，其特征在于所述提取液是蒸餾水或緩沖液，或在水或緩沖液中還含有蛋白保護(hù)基、鹽、離子螯合劑EDTA。
6.按權(quán)利要求1所述的周質(zhì)蛋白液的制備方法，其特征在于提取液加入量與菌體濕重的重量比例為5-10∶1。
7.按權(quán)利要求1所述的周質(zhì)蛋白液的制備方法，其特征在于提取液的抽取時間為10分鐘-4小時。
全文摘要
一種重組大腸桿菌周質(zhì)蛋白液的制備方法，通過使用鹽處理大腸桿菌細(xì)胞以增加細(xì)胞外膜的通透性，從而達(dá)到專一抽提細(xì)胞周質(zhì)中的蛋白之目的。本方法有效地防止了制備細(xì)胞周質(zhì)液時對細(xì)胞細(xì)胞壁和內(nèi)膜的損害，從而減少了細(xì)胞內(nèi)干擾物質(zhì)對目的蛋白分離純化的影響。它將促進(jìn)周質(zhì)分泌型工程菌的應(yīng)用，特別是為該類型的基因工程菌工業(yè)化應(yīng)用開辟道路。
文檔編號A61K38/00GK1227873SQ9812206
公開日1999年9月8日 申請日期1998年12月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月4日
發(fā)明者林俊 申請人:中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所