專利名稱：新型多功能大腸桿菌非融合蛋白表達(dá)載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域一種DNA重組技術(shù)中使用的表達(dá)載體，具體地說，涉及一種大腸桿菌非融合蛋白表達(dá)載體及其構(gòu)建方法、用途。
目前人們普遍使用PCR方法獲得外源基因，由于現(xiàn)在商業(yè)化的非融合蛋白表達(dá)載體不具備測序功能，外源基因需首先在克隆載體上進(jìn)行測序，證實(shí)無誤后再亞克隆至表達(dá)載體，這增加了分子生物學(xué)操作步驟，也增加了基因轉(zhuǎn)移過程中出錯的幾率，同時，在亞克隆時對外源基因5′端酶切位點(diǎn)的種類要求嚴(yán)格，它要求克隆載體和表達(dá)載體中外源基因上游存在共同的酶切位點(diǎn)。對酶切位點(diǎn)的限定大大影響了AUG與SD保守序列之間距離的選擇。而二者之間的距離對基因表達(dá)水平有極大的影響。研究結(jié)果表明，SD與AUG之間以6-12個堿基為最佳，超出此范圍會降低蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(Chen H.Y，BjerknesR.Determination of the optimal aligned spacing between theShine-Dalgarno sequences and the translation initiation codonof Escherichia coli mRNA.Nucleic Acid Res，1994，224953-4957；Gold L.Posttranscriptional regulatory mechanism inEscherichia coli.Ann Rev Bilchem)。
在篩選外源基因與表達(dá)載體的重組子時，除Novagen公司新開發(fā)的pETBlue-1表達(dá)載體增添了藍(lán)白篩選手段，目前都采用提取多個菌株中質(zhì)粒進(jìn)行鑒別的方法，既浪費(fèi)時間，工作量又繁重，而且成功率、可靠性都比較差。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述表達(dá)載體的構(gòu)建方法，從而減少克隆次數(shù)并簡化分子生物學(xué)操作步驟。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述表達(dá)載體的用途，即被用于克隆、測序、表達(dá)外源基因。
本發(fā)明提供一種新型多功能大腸桿菌非融合蛋白表達(dá)載體，以pGEM系列克隆載體為出發(fā)質(zhì)粒，亦即具有T7啟動子和Lacz基因片段的PGEM系列克隆載體，在其多克隆位點(diǎn)的上游和下游分別插入有T7噬菌體基因10的SD序列和T7終止子序列，SD保守序列下游引入有一個NdeI酶切位點(diǎn)，NdeI位點(diǎn)中的ATG與SD保守序列之間間隔6-12個堿基的距離，優(yōu)選8個堿基距離。
上述的表達(dá)載體的構(gòu)建方法是選擇PGEM系列克隆載體為出發(fā)質(zhì)粒，該克隆載體具有T7啟動子和Lacz基因片段的，可將其插入T7啟動子下游，并在插入序列的下游，距離SD6-12個堿基處人為引入NdeI酶切位點(diǎn)；NdeI酶切位點(diǎn)中的ATG可用于充當(dāng)外源基因的起始密碼子，ATG與SD保守序列之間保持6-12個堿基的距離；再將T7終止子片斷插入pGEM載體多克隆位點(diǎn)的下游，由此構(gòu)建成新的表達(dá)載體。
上述的表達(dá)載體的構(gòu)建過程如圖3所示。
本發(fā)明選擇pGEM系列克隆載體為出發(fā)質(zhì)粒來構(gòu)建新型的多功能表達(dá)載體。選擇pGEM系列克隆載體是因?yàn)樗哂袕?qiáng)的T7啟動子和適于藍(lán)白篩選的LacZ基因片段(如

圖1所示)，同時利用T7/SP6或pUC/13通用引物可對其上的外源基因進(jìn)行測序。作為表達(dá)載體，pGEM系列克隆載體缺少高效的SD序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列。T7噬菌體基因10的SD序列能高效起始外源基因的翻譯(Peter O.Olins and Shaukat.H.R.Vector for enhanced translation of foreign genes inEscherichia coli.Methods in Enzymology，1990，185115-119)，可將其插入T7啟動子下游，并在插入序列的下游，距離SD6-12個堿基處人為引入NdeI酶切位點(diǎn)。NdeI酶切位點(diǎn)中的ATG可用于充當(dāng)外源基因的起始密碼子，而ATG與SD保守序列之間保持6-12個堿基的距離是高效起始蛋白質(zhì)翻譯的最佳距離。再將T7終止子片斷插入pGEM載體多克隆位點(diǎn)的下游，由此構(gòu)建成新的表達(dá)載體。本發(fā)明優(yōu)選以pGEM3Zf(+)或pGEM7Zf(+)克隆載體作為出發(fā)質(zhì)粒，所得載體為3ZTS或7ZTS表達(dá)載體。
新構(gòu)建的表達(dá)載體不僅具備了強(qiáng)T7啟動子，強(qiáng)T7終止子，高效SD序列，抗性選擇標(biāo)記，復(fù)制起點(diǎn)等表達(dá)載體應(yīng)具有的特征，而且它也具備pGEM克隆載體所有的特征。用PCR法擴(kuò)增的目的基因(在正向引物5′端基因起始密碼子處加NdeI酶切位點(diǎn))可直接克隆于新表達(dá)載體上，并利用通用引物對其測序，測序正確后就可以進(jìn)行表達(dá)。此種操作大大簡化了操作步驟，減少了基因出錯的幾率。由于我們選擇的SD序列和T7終止子序列的大小及插入位點(diǎn)未影響LacZ基因片段的α-互補(bǔ)功能，藍(lán)白篩選手段仍然適于對重組子的篩選，此種方法大大簡化了篩選目的轉(zhuǎn)化子的工作。可在同一載體上完成基因克隆、測序和高效表達(dá)三種功能并能方便地依據(jù)藍(lán)白反應(yīng)鑒定目的轉(zhuǎn)化子是本表達(dá)載體的特點(diǎn)，不僅節(jié)約時間，減輕工作量，而且成功率、可靠性都比較高。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例來詳述本發(fā)明。具體實(shí)施例用于說明目的面并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中具體的操作方法按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯 著，科學(xué)出版社，1998)和廠商說明書所述。
依據(jù)T7終止子的堿基序列，設(shè)計一組引物T7 F5′ACAAgCTTCCACCgCTgAgCAATAAC3′，T7 R5′-ACgAgcTCTATAgTTCCTC3′以pGEMEX-2為模板，擴(kuò)增T7終止子序列。膠回收后，用SacI和HindIII雙酶切.同時用SacI和HindIII雙切pGEM7Zf(+)，并回收載體大片段。將兩種酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒(稱為7ZT)。
依據(jù)T7噬菌體基因10的SD序列，設(shè)計引物F5′ATgggCCCgAAATAATTTTg 3′，F(xiàn)引物帶ApaI切點(diǎn)R5′CATAAgCCATATgTATATCTCCTTC 3′，R引物帶NdeI位點(diǎn)利用此組引物從pGEMEX-2上擴(kuò)增出T7噬菌體基因10的SD序列，用ApaI和NdeI雙酶切，得到粘末端序列。
用ApaI和SphI雙酶切7ZT，并回收大片段。
合成兩條單鏈DNA片段，一條5′CgAgTCCA3′，另一條是5′TATggACgTCgCATg3′，將此兩條鏈混合并退火，得到帶NdeI和SphI粘端的片段。
用T4 DNA ligase將以上三條DNA鏈連接起來，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選轉(zhuǎn)化子。對重組質(zhì)粒測序，與預(yù)想完全符合，載體上各功能元件的位置見圖5，其中92-130bp為T7噬菌體gene10的SD序列，130-196bp為多克隆位點(diǎn)，196-260bp為T7終止子序列，SD與ATG間隔8個堿基。其中，SD與ATG間隔也可以是6個堿基、10個堿基或12個堿基。
將此質(zhì)粒命名為7ZTS。
5′帶有NdeI粘端，3′帶有另一種酶切粘端的外源基因PCR產(chǎn)物可直接克隆于載體7ZTS上，重組子在IPTG，X-gal平板上可方便地通過藍(lán)白反應(yīng)加以選擇。利用通用的T7/SP6或pUC/M13測序引物就可對7ZTS上的外源基因進(jìn)行測序。所測序列證實(shí)無誤后，即可進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。利用此載體大大簡化了陽性轉(zhuǎn)化子的篩選過程。亞克隆步驟的省略也大大避免了基因從克隆載體到表達(dá)載體轉(zhuǎn)移過程中的錯誤，從而極大地保證了表達(dá)基因的正確性。
本實(shí)施例只是本發(fā)明的一個優(yōu)選例，對于pGEM系列克隆載體都適用，包括pGEM3Z、pGEM4Z、pGEM3Zf(+/-)、pGEM5Zf(+/-)、pGEM9Zf(-)、pGEM11Zf(+/-)和pGEM3Zf(+)，對其任何的變動和修飾都屬于本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
2.新型表達(dá)載體功能的測試設(shè)計兩組引物，分別從兩株金黃色葡萄球菌基因組DNA中擴(kuò)增sea基因和seb基因。這兩組引物的特點(diǎn)是，每組中的正向引物都設(shè)計帶有NdeI酶切位點(diǎn)，反向引物則設(shè)計帶有任意的載體多克隆位點(diǎn)具有的酶切位點(diǎn)，本例中反向引物設(shè)計了HindIII酶切位點(diǎn)。利用NdeI和HindIII雙切sea基因和seb基因的PCR產(chǎn)物，并將雙粘端PCR產(chǎn)物分別連到表達(dá)載體7ZTS的NdeI與HindIII酶切位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，在IPTG，X-gal平板上挑選白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用pUC/M13測序引物進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明所擴(kuò)增的基因序列與文獻(xiàn)報道完全一致。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109(DE3)，挑單菌落轉(zhuǎn)化子，于LB(含Amp 50μg/mL)中，37℃培養(yǎng)過夜。次日，以1％接種量轉(zhuǎn)接新鮮LB(含Amp50μg/mL)液，當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.6～0.8時，加入1.0mmo1/L IPTG誘導(dǎo)，于32℃培養(yǎng)6小時后，取1mL的培養(yǎng)液收集菌體。對細(xì)胞全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，表達(dá)結(jié)果如圖6所示。其中M泳道是標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，1泳道是空白菌株，2泳道是sea基因的表達(dá)，3泳道是seb基因的表達(dá)。電泳凝膠于560nm波長下掃描，sea基因表達(dá)帶占細(xì)胞總蛋白的25％，seb基因的表達(dá)帶占細(xì)胞總蛋白的27％。文獻(xiàn)未見如此高效表達(dá)的報道。
如上所述，新型多功能大腸桿菌非融合蛋白表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)是，它將目的基因的克隆，陽性轉(zhuǎn)化子的篩選，基因序列的證實(shí)，以及高效表達(dá)多種功能集于一體，極大地簡化了分子生物學(xué)操作步驟，大大提高了工作效率。
3.本實(shí)施例以pGEM3Zf(+)克隆載體作為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體基本步驟同實(shí)施例1。
以pGEMEX-2為模板，利用PCR方法擴(kuò)增T7終止子序列。膠回收后，用SphI和HindIII雙酶切.同時用SphI和HindIII雙切pGEM3Zf(+)，并回收載體大片段。將兩種酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒(稱為3ZT)。
依據(jù)T7噬菌體基因10的SD序列，設(shè)計引物F和R。F引物帶EcoRI切點(diǎn)，R引物帶NdeI位點(diǎn)。利用此組引物從pGEMEX-2上擴(kuò)增出T7噬菌體基因l0的SD序列，用EcoRI和NdeI雙酶切，得到粘末端序列。
用EcoRI和SacI雙酶切3ZT，并回收大片段。
人工合成兩條單鏈DNA片段，將此兩條鏈混合并退火，得到帶NdeI和SacI粘端的DNA片段。
用T4 DNA ligase將以上三條DNA鏈連接起來，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選轉(zhuǎn)化子。重組質(zhì)粒測序結(jié)果與預(yù)想完全符合，SD與ATG間隔10個堿基。
將此質(zhì)粒命名為3ZTS。
此3ZTS表達(dá)載體具有同7ZTS完全相同的優(yōu)點(diǎn)，即，將克隆，測序，表達(dá)三種功能集于一體，并能方便地利用藍(lán)白反應(yīng)挑選重組子。
利用sea基因?qū)?ZTS的功能進(jìn)行測試，結(jié)果表明3ZTS表達(dá)載體使用的便捷性與表達(dá)水平都同7ZTS表達(dá)載體相同。
權(quán)利要求
1.新型多功能大腸桿菌非融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于以pGEM系列克隆載體為出發(fā)質(zhì)粒，亦即具有T7啟動子和Lacz基因片段的PGEM系列克隆載體，在其多克隆位點(diǎn)的上游和下游分別插入有T7噬菌體基因10的SD序列和T7終止子序列，SD保守序列下游引入有一個NdeI酶切位點(diǎn)，NdeI位點(diǎn)中的ATG與SD保守序列之間間隔6-12個堿基的距離。
2.一種如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于以pGEM系列克隆載體為出發(fā)質(zhì)粒，在其多克隆位點(diǎn)的上游和下游分別插入T7噬菌體gene10的SD序列和T7終止子序列，并于SD保守序列下游引入一個NdeI酶切位點(diǎn)，NdeI位點(diǎn)中的ATG與SD保守序列之間間隔6-12個堿基的距離，由此構(gòu)建成新的表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，其特征在于以pGEM7Zf(+)或pGEM3Zf(+)克隆載體作為出發(fā)質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，其特征在于ATG與SD保守序列之間間隔8個堿基的距離。
5.如權(quán)利要求1或2所述的大腸桿菌非融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于能利用通用引物T7/SP6或pUC/M13對外源基因進(jìn)行測序。
6.如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌非融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于該載體是按照圖3所構(gòu)建完成的7ZTS表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌非融合蛋白表達(dá)載體，其特征在于該載體為3ZTS表達(dá)載體。
8.一種可克隆、藍(lán)白篩選、測序和高效表達(dá)外源基因的方法，其特征在于它使用權(quán)利要求1所述的載體。
9.如權(quán)利要求1所述載體的用途，其特征在于它被用于克隆、藍(lán)白篩選、測序和表達(dá)外源基因。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于該載體是7ZTS或3ZTS表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明是根據(jù)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)原理，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的一種新型原核生物非融合蛋白表達(dá)載體。主要特點(diǎn)是以pGEM系列克隆載體為出發(fā)質(zhì)粒，在其多克隆位點(diǎn)的兩端加上T7噬菌體基因10的SD序列和T7終止子序列，從而具備表達(dá)載體的各種元件；新引入的NdeI位點(diǎn)中的ATG提供了表達(dá)天然蛋白所需的起始密碼子ATG；ATG與SD保守序列之間6－12個堿基的距離是高效起始翻譯的最佳距離；可依據(jù)藍(lán)白反應(yīng)挑選重組子；外源基因的克隆，測序和表達(dá)可在同一個載體上進(jìn)行。
文檔編號C12N15/66GK1458277SQ0210968
公開日2003年11月26日 申請日期2002年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月15日
發(fā)明者呂安國, 時成波, 吳文芳, 楊立泉 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所