專利名稱：二價反應性水溶性高分子衍生物及包含該衍生物的復合體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及作為間隔基的配體(抗原、抗體等蛋白質(zhì)，激素等)和低分子藥物、標記分子、蛋白質(zhì)、微膠粒或脂質(zhì)體等活性物質(zhì)結(jié)合而成的雜合的二價反應性水溶性高分子衍生物、由此獲得的復合體、含有該復合體的醫(yī)藥診斷劑組合物及該復合體的制備方法。本發(fā)明所得的復合體可用于給藥裝置、診斷、檢查等用途。
近年，在多個領域進行了使抗原、抗體、鐵傳遞蛋白等蛋白質(zhì)和激素等配體與醫(yī)藥品、同位素、標記物質(zhì)等結(jié)合，賦予它們以特異性的研究開發(fā)。
特別是使抗體等蛋白質(zhì)與抗癌劑等醫(yī)藥品、放射性同位素、毒素等蛋白質(zhì)結(jié)合，作為部位特異的治療藥品和特異性較高的診斷劑使用更是人們所期待的。此外，抗體和堿性磷酸酯酶等酶結(jié)合而成的復合體也被當作鑒定試劑使用。
上述復合化可以是直接結(jié)合，也可以通過脂質(zhì)體等載體結(jié)合。以抗體為例，有將抗體糖鏈氧化成醛，與具有酰肼基的活性物質(zhì)(酶、脂質(zhì)體等)進行結(jié)合的方法；有在抗體的氨基上導入馬來酰亞胺基，在活性物質(zhì)中導入巰基，再進行結(jié)合的方法；有利用還原劑還原內(nèi)源性二硫化物，生成巰基，使其進行反應的方法；有通過抗生物素蛋白·生物素進行結(jié)合的方法等(總論，酶免疫測定法，第3版，石川等著，醫(yī)學書院(1987))。
另一方面，大家都知道聚乙二醇(以下，也稱為“PEG”)是一種柔性水溶性高分子，將其作為蛋白質(zhì)修飾劑已對許多例子進行了探討。PEG的毒性和免疫性都較低，而且，已經(jīng)知道，通過PEG修飾有大大改善蛋白質(zhì)在血中滯留性的效果(《DDS的進步1995-1996》，中山書店，P82-94(1995))。
最近，對將PEG作為上述間隔基使用的情況也進行了研究，特別是對在脂質(zhì)體領域，將PEG部分作為間隔基的抗體結(jié)合脂質(zhì)體的研究更為活躍。
具有極性基團的脂質(zhì)和既親水又親油的脂質(zhì)體等能形成脂質(zhì)微膠粒、高分子微膠粒、脂質(zhì)體、脂質(zhì)微膠粒封閉鏈二重相等微粒。
近年，這些微粒作為藥物和核酸等的載體試用的機會逐漸增多。在脂質(zhì)體中，能夠?qū)⒅苄晕镔|(zhì)封入脂質(zhì)體的脂質(zhì)相中，將水溶性物質(zhì)封入內(nèi)部水相中，不僅能夠荷載低分子化合物，還能夠荷載蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)，所以，對將其作為藥物、蛋白質(zhì)、核酸等的DDS用載體使用進行了大量研究。近年，不僅對封入藥物以降低其毒性等的效果進行了研究，在脂質(zhì)體表面結(jié)合抗體、糖鏈等以賦予其靶向功能等的脂質(zhì)體的實用化研究方面也取得了進展。
另一方面，針對脂質(zhì)體的一般缺陷，如易凝集，在肝臟、脾臟等網(wǎng)狀組織中的非特異性捕捉，公知的技術(shù)是在脂質(zhì)體中導入聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚甘油等水溶性高分子以改善上述缺陷。特別是對聚乙二醇的修飾作用進行了大量的研究，通過聚乙二醇的修飾能夠有效地抑制網(wǎng)狀組織內(nèi)的非特異性捕捉，這一點也是公知的。
而且，為了能使脂質(zhì)體既具有靶向功能又在網(wǎng)狀組織內(nèi)具備回避效果，所以還揭示了在經(jīng)過聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體的聚乙二醇末端再結(jié)合了抗體等靶向配體的脂質(zhì)體。
即，以具有官能團的聚乙二醇-脂質(zhì)衍生物為中介，使抗體和脂質(zhì)體復合體化的方法，其例如下所示Klibanov等，J.Liposome Res.2(1992)321，日本專利公開公報平6-126152號，日本專利公開公報平6-220070號，WO94/22429,Hansen等，BBA 1239(1995)133,Shahinian等BBA 1237(1995)99。
也就是在有機溶劑中使脂質(zhì)和聚乙二醇衍生物反應，合成具有脂質(zhì)-PEG-官能團型化合物。然后，與其他結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)一起脂質(zhì)體化后的抗體結(jié)合，獲得抗體-PEG-脂質(zhì)體型復合體。
作為具體的聚乙二醇脂質(zhì)衍生物，日本專利公開公報平6-126152號揭示了脂肪族碳氫化合物-PEG-羰基咪唑；日本專利公開公報平6-220070號、BBA1237(1995)99揭示了磷脂乙醇胺(PE)-PEG-馬來酰亞胺；WO94/22429、Hansen等的BBA 1239(1995)133揭示了使用PE-PEG-NH2-生物素、二硬脂酰磷脂二乙醇胺(DSPE)-PEG-酰肼(Hz)、DSPE-PEG-3-(2-吡啶基巰基)丙?；?PDP)的抗體結(jié)合脂質(zhì)體。
上述復合體使抗體的結(jié)合率有所提高，而且，還可改善其在血液中的動態(tài)。
但是，同時也指出了幾個問題。即，使用DSPE-PEG-Hz的方法中，在處理抗體的過程中抗體活性有所降低，而且，抗體的結(jié)合率幾乎沒有得到改善；使用DSPE-PEG-PDP的方法中，脂質(zhì)體化之后需要進行還原處理，這就可能會對封入的藥物產(chǎn)生影響，且操作麻煩；使用PE-PEG-NH2-生物素的方法是通過抗生物素蛋白/生物素為中介進行結(jié)合的，在用于生物體時需要考慮作為異種蛋白的免疫源性的問題；使用脂肪族碳氫化合物-PEG-羰基咪唑的方法中，PEG衍生物被封入，可能會與藥物的氨基發(fā)生反應。
要十分有效地結(jié)合抗體，就必須在脂質(zhì)體中導入對應于抗體的過量PEG脂質(zhì)衍生物，所以，即使在抗體結(jié)合后，具有活性基團的PEG部分還在能夠容易地與其他部分(體內(nèi)給藥時為生物體成分)反應的領域殘存。而且，這些量的脂質(zhì)-PEG-官能團衍生物導入脂質(zhì)體時，會加速封入脂質(zhì)體內(nèi)的藥物的漏出(BBA1237(1995)99)。
從上述觀點看，以往技術(shù)還不能十分令人滿意。
本發(fā)明者們?yōu)榻鉀Q上述以往問題而進行的研究的結(jié)果是，將雜合的二價反應性水溶性高分子作為間隔基使用，能夠改善以往的不足之處，上述高分子的特征在于它們是合成水溶性高分子的衍生物，具有可與氨基進行反應的部位，還具有巰基或潛在的巰基S-乙?；鶐€基。
此外，還發(fā)現(xiàn)了能夠容易地制備配體結(jié)合體的方法，即雜合的二價反應性水溶性高分子衍生物首先與配體結(jié)合，然后利用另一端與微膠粒等活性物質(zhì)結(jié)合，接著，如有必要，還可與具有活性物質(zhì)和反應性的一價水溶性高分子結(jié)合。
即，本發(fā)明有如下要點1．一種二價反應性水溶性高分子衍生物，其特征是具有可與氨基反應的部位及巰基部分或S-乙?；鶐€基部分。
2．下式(Ⅰ)表示的上述水溶性高分子衍生物，
(式中，S表示巰基部分或S-乙?；鶐€基部分，P表示水溶性高分子，N表示可與氨基反應的部位。此外，R1和R2表示任意的連接基團，R1及/或R2不是必須的)。
3．水溶性高分子為生物分解性聚合物或聚乙二醇的上述高分子衍生物。
4．水溶性高分子為聚乙二醇的上述高分子衍生物。
5．可與氨基反應的部位為琥珀酰亞胺基的上述高分子衍生物。
6．通過上述高分子衍生物，由配體和活性物質(zhì)結(jié)合而成的復合體。
7．下式(Ⅱ)表示的上述復合體，
(式中，L表示活性物質(zhì)，A表示配體，S、R1、P、R2和N如前所述)。
8．活性物質(zhì)選自低分子藥物、標記分子、蛋白質(zhì)、微膠粒和脂質(zhì)體的上述復合體。
9．活性物質(zhì)為脂質(zhì)體或微膠粒的上述復合體。
10．配體為抗體的上述復合體。
11．在活性物質(zhì)上再結(jié)合具有活性物質(zhì)和反應性的一價水溶性高分子衍生物的復合體。
12．含有上述復合體的醫(yī)藥組合物。
13．作為抗腫瘤劑使用的上述醫(yī)藥組合物。
14．含有上述復合體的診斷劑組合物。
15．上述復合體的制備方法，其特征是，使上述二價反應性水溶性高分子衍生物與配體結(jié)合，然后通過上述水溶性高分子衍生物的另一端結(jié)合活性物質(zhì)。
16．上述制備方法還包括在上述高分子衍生物上再結(jié)合具有活性物質(zhì)和反應性的一價反應性水溶性高分子衍生物的步驟。
17．通過配體的氨基使二價反應性水溶性高分子衍生物與配體結(jié)合的上述制備方法。
18．通過二價反應性水溶性高分子衍生物的巰基部分使二價反應性水溶性高分子衍生物和活性物質(zhì)與微膠粒的巰基反應性部分結(jié)合的上述制備方法。
即，本發(fā)明的水溶性高分子(以下稱為“本高分子化合物”或“本水溶性高分子”)首先與具有氨基的配體結(jié)合，獲得具有巰基的PEG-配體復合體(為S-乙?；鶐€基時，在適當?shù)臈l件下脫去乙?；?，然后，和具有巰基反應性部位的脂質(zhì)體等活性物質(zhì)混合，使它們進行反應，就能夠容易地獲得配體-PEG-活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的復合體。
這樣，就不需要可能會造成抗體等配體活性降低的氧化和還原。而且，還可采用通過對活性物質(zhì)影響較小的巰基進行反應的方法來形成復合體。
令人驚奇的是，比較通過本高分子化合物使抗體和脂質(zhì)體結(jié)合的方法和通過沒有高分子部分而與前述高分子化合物具有相同官能團的低分子化合物使兩者結(jié)合的方法發(fā)現(xiàn)，前者對靶細胞顯現(xiàn)出高結(jié)合活性。而且，還發(fā)現(xiàn)具備可減少以往指出的內(nèi)封物漏出的效果。
此外，本方法中，由于首先形成了抗體等的配體-PEG衍生物，所以，不需要象以往方法那樣在熱力學不穩(wěn)定的活性物質(zhì)中導入具有過量官能團的PEG脂質(zhì)衍生物，就能夠形成配體-PEG結(jié)合體。因此，不會有以往具有官能團的PEG脂質(zhì)可能造成的影響，充分利用脂質(zhì)體等活性物質(zhì)制備技術(shù)、藥物封入技術(shù)等以往技術(shù)就可形成活性物質(zhì)。
此外，也不會出現(xiàn)以往方法中即使在配體結(jié)合后，具有活性基團的PEG部分還在能夠容易地與其他部分(體內(nèi)給藥時為生物體成分)反應的領域殘存的問題。
又，通過使用雜合的二價反應性水溶性高分子衍生物，就不需要可能導致抗體等配體的活性降低的氧化和還原。
以下，對本發(fā)明進行詳細說明。
本發(fā)明的水溶性高分子衍生物是二價反應性的。本發(fā)明中，二價反應性是指能夠與同一分子內(nèi)的某個官能團進行反應的基團有2個，且它們是不同的。
本發(fā)明所用的水溶性高分子為聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸等合成高分子，較好的是聚乙二醇，此外，適用的還有聚醇等生物分解性聚合物。分子量較好為約500～20000，更好的是1500～10000，特別好的是2000～6000。
本發(fā)明的水溶性高分子衍生物在上述水溶性高分子的一端具有巰基部分或S-乙?；鶐€基部分，在另一端具有可與氨基反應的部位。
巰基或S-乙?；鶐€基可直接加成到水溶性高分子上，也可通過中間作為連接基團的亞烷基、羰基、酯基、酰胺基進行結(jié)合。
作為可與氨基反應的部位是指羧基或羥基的能夠與氨基進行縮合反應的部位。具體來講可使用琥珀酰亞胺酯、異硫氰酸酯、磺酰氯、羰基咪唑等，較好的是琥珀酰亞胺酯。此外，可與氨基反應的部位同樣可以直接加成到水溶性高分子上，也可通過上述連接基團進行結(jié)合。
對本發(fā)明的水溶性高分子衍生物沒有特別的限定，例如，利用經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇和巰基乙胺反應就可獲得，或使具有氨基的聚乙二醇與S-乙酰基巰基乙醇酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SATA)、S-乙?；鶐€基丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯或S-乙?；鶐€基乙酸水合物反應而獲得的高分子衍生物。
利用上述所得的本發(fā)明的二價反應性水溶性高分子衍生物能夠形成配體和活性物質(zhì)結(jié)合的復合體。
配體較好是具有氨基，能夠和本水溶性高分子的氨基的反應部位結(jié)合。作為配體包括植物凝血素、抗原、抗體、激素、傳導物質(zhì)等，較好的是抗體。此外，還可使用后述的制備方法中提到的配體。
具有氨基的配體和本水溶性高分子的結(jié)合可通過在水溶液中混合配體和本水溶性高分子，并在常溫下使它們反應而進行。高分子衍生物與配體的較好的摩爾比是約0.3～50，更好的是0.8～30。
此外，作為水溶性高分子，如果使用的是具有S-乙?；鶐€基的高分子，則如上所述，在與配體結(jié)合后，脫去乙酰基，成為巰基后，可與下述活性物質(zhì)結(jié)合。脫乙?；鶗r的條件如果對配體實質(zhì)上是穩(wěn)定且溫和的，則對其沒有特別的限定，較好的是在使用羥胺的中性緩沖液中，在常溫下進行反應，使最終濃度在約20mM～200mM的范圍內(nèi)。
如上所述，與配體結(jié)合后，可在本水溶性高分子的另一端結(jié)合活性物質(zhì)。
作為活性物質(zhì)可使用甲氨喋呤、絲裂霉素C、阿霉素、道諾霉素等低分子藥物，氨基熒光素、熒光素尸胺、熒光素黃尸胺、過氧化物酶、堿性磷酸酯酶等標記分子，新制癌菌素、白喉毒素A鏈、細胞溶素A鏈、尿激酶、彈性硬蛋白酶、精氨酸酶、冬酰胺酶、超氧化歧化酶、纖維蛋白溶酶原激活劑、ィンタ-ロィキン2、TNF等蛋白質(zhì)，內(nèi)啡肽、降鈣素、緩激肽、與CRF有關的肽等肽微膠粒，脂質(zhì)體等，本發(fā)明中較好的是微膠粒、脂質(zhì)體。而且，微膠粒、脂質(zhì)體中可封入醫(yī)藥品和診斷劑。微膠粒將在后面進行說明。
作為可封入其中的醫(yī)藥品包括阿霉素、道諾霉素、長春堿、順鉑、絲裂霉素、爭光霉素、放線霉素、5-FU(氟脲嘧啶)等抗腫瘤劑，噻嗎心安等腎上腺素阻滯劑，氯壓定等高血壓治療劑，普魯卡因酰胺等制吐劑，氯喹等抗瘧疾劑，兩性霉素等抗生素，以及它們的藥學上允許的鹽和衍生物，細胞溶素和白喉毒素等毒素蛋白質(zhì)及它們經(jīng)過編碼的DNA、TNF等細胞遺傳因子、ァンチセンスDNA等核苷酸等。作為上述抗腫瘤劑等的藥學上允許的鹽，較好的是與多價陰離子性物質(zhì)形成的鹽，例如，檸檬酸鹽、酒石酸鹽、谷氨酸鹽。特別好的是抗腫瘤劑。
此外，作為診斷劑包括放射性元素，例如，銦、锝等圖象調(diào)整劑，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶等酶，銪衍生物，羧基熒光素等熒光體，N-甲基吖啶衍生物等熒光體等。
將這類醫(yī)藥品和診斷劑導入微膠粒、脂質(zhì)體可使用已知的常用方法。例如，在形成微膠粒、脂質(zhì)體時，形成pH梯度等當?shù)臐舛忍荻龋瑢⒃撾妱葑鳛閯恿肟呻x子化的藥物的方法(Cancer Res.49 5922(1989))。
所用的活性物質(zhì)是利用已知方法使活性物質(zhì)具備可與巰基反應的部位的物質(zhì)。即，可使用選自馬來酰亞胺基、鹵化烷基、氮丙啶基、吡啶基二巰基等的反應基。較好的是馬來酰亞胺基。但對其沒有特別的限定，具體例子有按照公知的方法，使馬來酰亞胺己酰二棕櫚酰磷脂乙醇胺(日本專利公開公報平4-346918號)和馬來酰亞胺苯基丁酰基磷脂乙醇胺等具有馬來酰亞胺基部分的脂質(zhì)和磷脂膽堿及膽固醇一起脂質(zhì)體化(脂質(zhì)體，第2章，野島等編，江南堂(1988))，就可獲得具有馬來酰亞胺基的脂質(zhì)體。作為脂質(zhì)體可使用MLV、LUV、SUV等各種脂質(zhì)體，較好的是LUV。
此外，使N-琥珀酰亞胺基-6-馬來酰亞胺己酰酯和蛋白質(zhì)反應也可獲得具有馬來酰亞胺部分的蛋白質(zhì)。還可使用馬來酰亞胺熒光素、曙紅馬來酰亞胺等熒光色素。
在近中性的緩沖液中混合這些具有巰基反應性基團的活性物質(zhì)和以上獲得的具有巰基的本水溶性高分子-配體復合體就能夠容易地復合體化，獲得作為目的產(chǎn)物的配體-PEG-活性物質(zhì)型復合體。如有必要，可采用超濾、凝膠過濾色譜法-離子交換色譜法等方法精制。
下面，對本發(fā)明的復合體的制備方法進行詳細說明。
本發(fā)明的制備方法的主要內(nèi)容如圖5所示。圖中高分子1由具有可與配體中的官能團A反應的A′部分和可與活性物質(zhì)中的反應性部分B結(jié)合的B＇部分組成，也就是前述的二價反應性水溶性高分子衍生物高分子2具有與B結(jié)合的B″。B＇和B″可以是同樣的殘基。本發(fā)明中，還可結(jié)合具有活性物質(zhì)和反應性的一價反應性高分子。
本發(fā)明的制備方法有以下特征，首先，雜合的二價反應性水溶性高分子1與配體結(jié)合，然后，在另一端與活性物質(zhì)結(jié)合，如有必要，還可與具有活性物質(zhì)和反應性的一價高分子2結(jié)合。
作為配體中的A可使用氨基、羧基、糖鏈部分，較好的是使用氨基。作為氨基反應性基團的A＇如前所述。
B和B＇的組合實質(zhì)上不需要B和配體進行反應，而是選擇特異性的B-B＇組合，較好的是B＇為巰基、B為可與巰基反應的基團的組合。巰基如前所述，可使用反應前被保護起來的潛在的巰基，即S-乙?；鶐€基，這種情況下，在反應時脫去保護基后即可使用。
本發(fā)明所用的配體除了前述的之外，還可使用選自鐵傳遞蛋白、GEF、甲胎蛋白(AFP)等蛋白質(zhì)，胰島素等肽或多克隆抗體、單克隆抗體等的抗體，可使用其整體，也可使用通過酶處理等獲得的碎片。用于治療各種疾病時，較好的是鼠和人的嵌合體抗體和人體抗體。
水溶性高分子1和2可使用前面列舉的水溶性高分子。高分子1和2可以是不同的組合，也可以是相同的組合。
配體和本高分子的反應如前所述。
如前所述，使用具有S-乙?；鶐€基的高分子時，在配體結(jié)合后，脫去乙?；涂色@得巰基。
本發(fā)明中，作為活性物質(zhì)可使用前述的物質(zhì)，但特別好的是微膠粒和脂質(zhì)體。所以，以下作為復合體，以微膠粒和脂質(zhì)體為代表例對本發(fā)明進行說明，但活性物質(zhì)不僅限于微膠粒。微膠粒由既親水又親油的分子構(gòu)成。作為構(gòu)成微膠粒的既親水又親油的分子，只要包含親水性部分和疏水性部分，利用已知的常用方法能夠形成微膠粒即可，其中較好的既親水又親油的分子是脂質(zhì)。
本發(fā)明中可形成微膠粒的脂質(zhì)包括天然磷脂膽堿如卵黃磷脂膽堿(EYPC)等，磷脂膽堿(PC)如二棕櫚酰磷脂膽堿(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂膽堿(DMPC)、二硬脂酰磷脂膽堿(DSPC)、二油酰磷脂膽堿(DOPC)等，天然磷脂乙醇胺如卵黃磷脂乙醇胺(EYPC)，磷脂乙醇胺(PE)如二棕櫚酰磷脂乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂乙醇胺(DOPE)等，磷脂甘油(PG)如二棕櫚酰磷脂甘油(DPPG)等，磷脂絲氨酸(PS)，磷脂肌醇(PI)，磷脂酸(PA)等磷脂；神經(jīng)鞘糖脂質(zhì)；甘油糖脂質(zhì)等。這些脂質(zhì)可單獨使用，也可2種以上或與膽固醇等非極性物質(zhì)組合使用。
本發(fā)明的微膠粒除了上述脂質(zhì)和非極性物質(zhì)之外，還包括用于結(jié)合配體-高分子1復合體和高分子2的脂質(zhì)衍生物。這些脂質(zhì)衍生物可使用包含在微膠粒中的反應性部分B，即具有作為巰基反應性部位的選自馬來酰亞胺基、鹵化烷基、吖啶基、吡啶基二聯(lián)硫基的反應基團的磷脂衍生物，但較好的是馬來酰亞胺基，對其沒有特別的限定，具體可使用馬來酰亞胺基己酰二棕櫚酰磷脂乙醇胺(日本專利公開公報平4-346918號)和馬來酰亞胺基苯基丁酰基磷脂乙醇胺等具有馬來酰亞胺基部分的脂質(zhì)。
所用的上述脂質(zhì)衍生物與形成微膠粒的既親水又親油的分子的組成比為0.1～8mol％，較好的是0.5～3mol％，更好的是1～3mol％。所用的膽固醇和形成微膠粒的既親水又親油的分子的組成比為0～100mol％，較好的是40～70mol％。
本發(fā)明的微膠?？捎萌魏畏椒ㄖ苽?，采用上述原料通過已知的常用制備技術(shù)即可獲得。例如，可使用在附著于玻璃壁上的脂質(zhì)薄膜中加水溶液，機械振蕩后形成的多層狀脂質(zhì)體(MLV)；或使用通過超聲波處理法，乙醇注入法，フレンチプレス法獲得的小的單層脂質(zhì)體；或使用通過表面活性劑除去法，逆相蒸發(fā)法(脂質(zhì)體，砂本順三等，南洪堂1988)，用具有均勻孔徑的膜加壓、壓制出MLV的ィクストゥル-ジョン法獲得的大的單層脂質(zhì)體(LUV)(Liposome Technology,Vol.1,2nd Edition)。
還可在微膠粒中封入醫(yī)藥品和診斷用藥物。
能夠封入微膠粒的醫(yī)藥品和診斷劑如前所述。
溫度約為4℃～40℃，在中性緩沖液中將配體-高分子1復合體和上述脂質(zhì)體、微膠?；旌?，即可使它們進行反應。而且，巰基被保護的情況下，在反應前可進行前述的脫保護基操作。
反應時的pH較好約為5～8，更好的是5.5～7.0。反應時還可添加1mM左右的EDTA。
用于反應的配體-高分子1復合體量少于微膠粒中反應性脂質(zhì)的量。只要少量的配體就能夠獲得所需靶向性能的情況下，不需要大量結(jié)合配體，在殘存的微膠粒上的反應性基團中添加高分子2，可使反應繼續(xù)進行。此外，通過添加高分子2，在微膠粒-高分子1-配體復合體作為醫(yī)藥品、診斷劑使用時，能夠維持其在血液中的滯留性。
本發(fā)明所用的高分子2如前所述，高分子2實質(zhì)上只具有與微膠粒共有的結(jié)合部位。
對高分子2沒有特別的限定，可使用具有2,4-雙(聚乙二醇)-6-氯-S-三嗪和胱氨酸形成的具有巰基的PEG衍生物(日本專利公開公報平4-346918號)、N-丙酰酯-3-(巰基)甲氧基聚氧乙烯烷胺(J.Controlled Release 28(1994)155)等。
高分子2可在微膠粒和配體-高分子1復合體的反應后進行反應，也可在精制微膠粒-配體-高分子1復合體后再添加。
添加量與微膠粒中的反應性脂質(zhì)相同，0.2～5mol，較好的是0.5～2mol。在中性緩沖液中，溫度約為4℃～40℃的條件下混合，就能夠容易地進行反應。
反應時的pH較好約為5～8，更好的是5.5～7.0。反應時還可添加1mM左右的EDTA。
如有必要，可采用超濾、凝膠過濾色譜法-離子交換法等方法對本發(fā)明所得的結(jié)合了配體的微膠粒進行精制。
以下，通過實施例進行更為詳細的說明，只要不超出本發(fā)明的要旨，對其沒有特別的限定。
實施例1在1g溶于10ml二氯甲烷的聚(乙二醇)-雙-ω-氨基-α-羧酸酯(ポリ(ェチレングルコ-ル)-ビス-ω-ァミノ-α-カルポキシル)(PEG平均分子量為3400,Shearwater polymers,Inc)中添加74.8mg S-乙?；蚋蚀妓酦-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma)和41μl三乙胺k。攪拌溶解后，再添加10mg S-乙酰硫甘醇酸N-羥基琥珀酰亞胺，于室溫攪拌3.5小時，進行反應。通過TLC(氯仿/甲醇=85/10，碘顯色，以下的TLC也在此條件下進行)進行檢測，如果添加的聚(乙二醇)-雙-ω-氨基-α-羧酸酯(ポリ(ェチレングリコ-ル)-ビス-ω-ァミノ-α-カルポキシル)的低Rf斑點轉(zhuǎn)移到高Rf(約0.6)，則可確認反應的進行。
在氮氣氛圍下除去溶劑后的反應物中添加10ml氯仿，溶解。然后添加到用氯仿膨潤過的sep-pak(SILICA PLUS Wates公司)中，用氯仿/甲醇(4/1(v/v))溶出，對試樣進行前處理。再次在氮氣氛圍中除去溶劑，溶于氯仿后，注入硅膠柱(羅渤柱LiChroprep Si60 25×310cm關東化學公司)。用氯仿洗凈后，以氯仿/甲醇(85/15(v/v))為展開劑洗脫，引出TLC的Rf約為0.6的主生成物，并對其進行精制。在氮氣氛圍中除去溶劑，獲得543mg生成物。將583mg生成物溶于約2ml經(jīng)過脫水的二氯甲烷中，添加乙醚，使其沉淀，濾取，用真空泵減壓干燥，溶于5ml經(jīng)過脫水的二氯甲烷后，添加17.8mgN-羥基琥珀酰亞胺(Sigma)，攪拌10分鐘。再添加31.9mg N,N＇-二環(huán)己基碳二亞胺，在氮氣氛圍中，室溫下攪拌一晚，使其反應。濾去沉淀物后，在氮氣氛圍中除去溶劑，溶于少量脫水二氯甲烷中。加乙醚濾去析出的沉淀，用真空泵減壓干燥，通過TLC獲得337mg單一的目的產(chǎn)物(以下記為“Ac-S-PEG-Suc”)。最后用1H-NMR確認目的產(chǎn)物的生成。
abcdefghi表1
<p>然后，通過與人體γ球蛋白的結(jié)合試驗來確認目的產(chǎn)物的生成。
即，在0.9ml溶有人體γ球蛋白(IgG、F(ab＇)2)(4.7mg/ml)的50mN磷酸緩沖液(pH7.0)和1mM EDTA組成的緩沖液中添加溶于脫水甲醇的30mg/ml Ac-S-PEG-Suc。添加量以摩爾比計為抗體的0～8倍，調(diào)整添加量與PEG導入量的關系。添加Ac-S-PEG-Suc，于25℃反應1小時后，使用電 セファクリルS100(ファルマシア公司)，通過上述緩沖液展開，用凝膠色譜法精制，分離未反應的Ac-S-PEG-Suc(PEG分子量為3.4K)和抗體(分子量為100K)。
用羥胺使一部分所得的修飾抗體脫去保護基。即在0.9ml抗體溶液中添加0.1ml羥胺溶液(0.5M羥胺、0.5M HEPES、25mM EDTA,pH為7.0)，于25℃反應10分鐘，脫去乙酰基后，用經(jīng)過0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)和1mM EDTA平衡化的PD-10(ファルマシァ公司)除去低分子，獲得具有巰基的抗體。以使用4,4′-二巰基吡啶(Sigma社)的方法為基準測定導入抗體的巰基(續(xù)生化學實驗講座5p109日本生化學編)。作為對照，同樣測定沒有用羥胺進行脫保護基處理的各修飾抗體的巰基含量。其結(jié)果是，如

圖1所示，經(jīng)過Ac-S-PEG-Suc修飾的人體γ球蛋白具有通過羥胺的脫保護基處理而生成的潛在的巰基，即S-乙酰基巰基，可確認它們隨著Ac-S-PEG-Suc添加量的增大而增多。
實施例2與實施例1同樣，使所得抗CEA鼠モノクロナ-ル抗體(IgG1F(ab＇)2)與Ac-S-PEG-Suc反應，獲得修飾抗體后，利用陽離子交換樹脂精制抗體蛋白。即在反應液(3.4mg/ml2ml)中添加0.1M的乙酸，將pH調(diào)整為4，添加到用pH4.0的0.1M乙酸緩沖液平衡化的2ml柱床的SP瓊脂糖(ファルマシァ公司)中。用上述緩沖液4ml洗凈后，再用50mM磷酸緩沖液(pH7.5)溶出蛋白質(zhì)。用セントルコン 30(ァミコン社)超濾器將緩沖液調(diào)整為50mM磷酸緩沖液(pH7.0)、1mMEDTA后，與實施例1同樣，添加羥胺，脫保護基。通過PD-10使具有SH基團的抗體脫鹽，并添加到0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)、1mM EDTA溶液中，用于下述的與脂質(zhì)體的結(jié)合。此外，相當于Ac-S-PEG-Suc和Ac-S-PEG-Suc的水解物的Ac-S-PEG-COOH(實施例1中琥珀酰亞胺化前的化合物)在本條件下沒有與SP瓊脂糖結(jié)合。
作為對照，用S-乙?；顽牾啺坊g沒有PEG部分的S-乙?；蚋蚀妓酦-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma)(以下，也稱為“SATA”)來代替Ac-S-PEG-Suc與本抗體進行反應，用PD-10脫鹽后，用羥胺脫保護基，用PD-10脫鹽(0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)、1mM EDTA)，同樣調(diào)整具有巰基的抗體。
封入熒光色素羧基熒光素，對具有可與巰基反應的馬來酰亞胺化磷脂作為膜成分的脂質(zhì)體與上述抗體的結(jié)合進行探討。
即，在100mg由二棕櫚酰磷脂膽堿(DPPC)/膽固醇(CHOL)/馬來酰亞胺己酰二棕櫚酰磷脂乙醇胺(日本專利公開公報平4-346918號)18/10/0.5(摩爾比)組成的脂質(zhì)混合液中添加1ml0.1M的羧基熒光素水溶液(pH7左右)，水合，制得多層狀脂質(zhì)體。然后通過擠壓機(LIpes Biomembranes)用0.1μm的聚碳酸酯膜整粒。
抗體和脂質(zhì)體的結(jié)合是在pH為6的0.1M檸檬酸緩沖液中，于25℃反應1小時而進行的，使抗體最終濃度為48mg/ml，脂質(zhì)體的最終濃度(作為脂質(zhì))為19mg/ml，反應后利用瓊脂糖CL6B(ファルマシァ公司)，通過凝膠過濾色譜分離法分離除去未反應抗體和沒有封入的羧基熒光素。
制得的各免疫脂質(zhì)體的活性可通過以下方法測定，即測定內(nèi)封入固定了抗原的96孔塑料板上的結(jié)合量的羧基熒光素的熒光量。也就是在96孔板(ファルマシァ公司)上以50μl/孔的標準添加20μg/ml抗原CEA，于37℃固定化2小時。除去CEA后用PBS洗凈，再用5％的牛血清白蛋白封閉。用PBS洗凈后，以50μl/孔的標準，添加用1％牛血清白蛋白稀釋至各濃度的脂質(zhì)體溶液，于4℃反應90分鐘。用PBS洗凈后，以100μl/孔的標準添加2％含有triton×100的PBS，于37℃培養(yǎng)30分鐘，使羧基熒光素從脂質(zhì)體中溶出。取一部分用PBS稀釋，在激發(fā)波長492nm、熒光波長520nm進行熒光測定，比較與抗原板結(jié)合的脂質(zhì)體量。
其結(jié)果如圖2所示，使用Ac-S-PEG-Suc將SH導入抗體而制得的免疫脂質(zhì)體顯示出較高的結(jié)合活性。
實施例3用含有馬來酰亞胺的熒光色素熒光素馬來酰亞胺(フナコシ)代替實施例2的脂質(zhì)體，制成復合體。即，在0.35ml的2.5mg/ml熒光素馬來酸酐酰亞胺中添加3.8mg/ml DMSO溶液，取5μl一邊添加到實施例2所示的SH-PEG-抗CEA抗體(0.1M磷酸緩沖液pH6.0，1mM EDTA溶液)中一邊攪拌，于25℃反應30分鐘。
反應后，利用經(jīng)過PBS平衡化的PD-10(ファルマシァ公司)，通過凝膠過濾除去未反應的熒光素馬來酰亞胺。算出495nm和280nm時熒光素馬來酰亞胺的導入率，相當于1分子抗體導入0.9分子的熒光素馬來酰亞胺。在人體胃癌細胞株MKN45中添加本熒光標識抗體，將50μg/ml上述混合物在冰冷條件下混合入人體血清中，歷時1小時。用PBS充分洗凈后，通過熒光測定計觀察其與癌細胞的結(jié)合。其結(jié)果如圖3所示，本復合體與癌細胞結(jié)合而顯現(xiàn)出熒光。
實施例4將20mg(4μmol)PEG二琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(日本油脂サンブラィト4001PEG平均分子量5000)溶于1ml氯仿中。一邊攪拌PEG溶液一邊在其中滴加4μmol溶于脫水甲醇的巰基乙胺鹽酸鹽(Sigma)。然后添加72mM三乙胺(脫水甲醇中)56μl。在氮氣氛圍中于室溫下反應7小時后，通過茚三酮反應可確認消耗了氨基，它與茚三酮為負反應的二琥珀酰亞胺PEG發(fā)生了反應。在氮氣流下干燥所得的SH-PEG-琥珀酰亞胺，再將其溶于1ml脫水甲醇。過濾不溶物，用于以下與抗體的反應。
將3.9mg/ml人體γ球蛋白溶于50mM磷酸緩沖液(pH7.5)、1mM EDTA中，取0.5ml，在其中邊攪拌邊添加48.7μlPEG衍生物，于37℃振蕩1小時。通過使用了經(jīng)過0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)、1mMEDTA平衡化的セファデックスG75柱的凝膠過濾色譜法對未反應的PEG衍生物和抗體進行處理。用上述緩沖液展開，收集最初溶出的抗體部分，與實施例1同樣對導入的巰基量進行定量。其結(jié)果是，1mol抗體中導入了0.75mol巰基。
與實施例2同樣，與脂質(zhì)體結(jié)合，用SDS電泳法對所得脂質(zhì)體進行解析，確認其與抗體的結(jié)合。
實施例5羧基熒光素漏出比較與實施例2同樣，制得結(jié)合了抗體，并封入了0.1M羧基熒光素的脂質(zhì)體，使其再與巰基化的聚乙二醇(日本專利公開公報平4-346918號)反應，制得結(jié)合了抗體和聚乙二醇的免疫脂質(zhì)體。用經(jīng)過20mM磷酸緩沖液、0.3MNaCl平衡化的PD-10柱進行凝膠過濾，除去未封入的羧基熒光素。然后在37℃培養(yǎng)，測定從脂質(zhì)體中漏出的羧基熒光素量。
羧基熒光素的漏出由Shahinian等(BBA 1239(1995)157)發(fā)明的方法進行定量。即，培養(yǎng)后，在一定時間后從脂質(zhì)體中取樣，用上述緩沖液稀釋，測定熒光量(激發(fā)波長為492nm，熒光波長為520nm)。同時，將脂質(zhì)體加入2％SDS中，測定可溶化(破壞)后的熒光量。被封入的羧基熒光素可以自身消光，熒光強度反映了從脂質(zhì)體中漏出的羧基熒光素量，因此通過兩者的比可算出漏出量。
如圖4所示，抗體-PEG-脂質(zhì)體與非修飾的脂質(zhì)體(EMC-脂質(zhì)體)顯現(xiàn)出同等的穩(wěn)定性，甚至更好。
Shahinian等發(fā)明的方法(BBA 1239(1995)157)顯示在PEG前端導入馬來酰亞胺基的脂質(zhì)體(馬來酰亞胺-PEG-脂質(zhì)體或抗體結(jié)合-PEG-脂質(zhì)體)比沒有PEG部分的EMC-PE脂質(zhì)體的漏出更多，但本方法制得的脂質(zhì)體與EMC-脂質(zhì)體的穩(wěn)定性相當，甚至更好。
實施例6與實施例2同樣，制得封入了羧基熒光素的抗體結(jié)合脂質(zhì)體。在脂質(zhì)體反應液中添加使用分子量為6000的PEG制得的巰基化的聚乙二醇(日本專利公開公報平4-346918號)。然后，在100mg脂質(zhì)中添加溶于0.1M磷酸緩沖液(pH6.0)、1mMEDTA中的巰基化的聚乙二醇2.5μmol，于10℃反應1晚。反應后，通過瓊脂糖CL6B(ファルマシァ公司)采用凝膠過濾色譜分離法分離除去巰基化的聚乙二醇和未封入的羧基熒光素。
然后，與實施例2同樣，測定內(nèi)封入固定了抗原的96孔塑料板上的結(jié)合量的羧基熒光素的熒光量。其結(jié)果是，經(jīng)過巰基化的聚乙二醇編碼的抗體結(jié)合脂質(zhì)體如圖6所示，作為通過Ac-S-PEG-Suc在抗體中導入SH制得的免疫脂質(zhì)體，顯現(xiàn)出較高的結(jié)合活性。
實施例7除了使用以下所示的封入了阿霉素的脂質(zhì)體作為脂質(zhì)體，人體IgC作為抗體之外，其他與實施例5同樣制得結(jié)合了抗體和PEG的封入了阿霉素的脂質(zhì)體(PEG免疫脂質(zhì)體)。作為對照，制備只結(jié)合了巰基化的PEG的脂質(zhì)體(PEG脂質(zhì)體)和兩者都不結(jié)合的脂質(zhì)體(脂質(zhì)體)。
在100mg由二棕櫚酰磷脂膽堿(DPPC)/膽固醇(CHOL)/馬來酰亞胺基己酰二棕櫚酰磷脂乙醇胺18/10/0.5(摩爾比)組成的固形脂質(zhì)混合物中添加1ml 0.3M檸檬酸緩沖液(pH4.0)，用渦流攪拌機水合，制得多層狀脂質(zhì)體，然后，依次利用裝有孔徑為200nm和100nm的聚碳酸酯膜的擠壓機(日油脂質(zhì)體)于60℃加溫，加壓過濾，制得經(jīng)過整粒的脂質(zhì)體。接著，用1M NaOH中和所得的脂質(zhì)體溶液后，添加脂質(zhì)重量的1/10重量的阿霉素(協(xié)和發(fā)酵)，封入97％以上的阿霉素就制得封入了阿霉素的脂質(zhì)體。
為了比較各脂質(zhì)體在血中的滯留性，從雄性BALB/c鼠的尾靜脈注入2mg/kg阿霉素，經(jīng)過不同的時間后處死，取血漿。通過Konno等的方法(Cancer Res.474471(1987))用鹽酸-乙醇萃取后，通過熒光測定對阿霉素量進行定量。
此外，游離的阿霉素在給藥后迅速從血漿中消失，在上述條件下不能夠檢出，被檢出的阿霉素量反映了各脂質(zhì)體的情況。
其結(jié)果如圖7所示，本方法制得的結(jié)合了抗體和PEG的封入了阿霉素的脂質(zhì)體在血液中顯現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。
實施例8從體外對封入阿霉素，且使用了本發(fā)明的二價反應性水溶性高分子衍生物的免疫脂質(zhì)體對腫瘤細胞的抗腫瘤活性進行驗證。以對人體大腸癌具有反應性的人體抗體為例，如下所示，確認本免疫脂質(zhì)體對靶細胞具有選擇性的抗腫瘤效果。
·大腸癌反應性1-3-1抗體利用常用方法對IgG進行種類轉(zhuǎn)換，將CHO細胞中發(fā)現(xiàn)的日本專利公開公報平5-304987號記載的人體大腸癌反應性人體單克隆抗體1-3-1通過胃蛋白酶的消化(參考日本專利公開公報平4-346918號)作為F(ab＇)片斷使用。
為了確認抗體的反應性，用FITC制備上述熒光標識的抗體，通過熒光測定計測定其對人體大腸癌細胞DLD-1(大日本制藥株式會社制)和作為正常細胞的來源于人體臍帶血管內(nèi)的皮細胞的SV-3T細胞(Agrec.Biol.Chem.55(11),2847-2853,1991)的反應性。
即，用BSA溶液(含有1％BSA的PBS)將本熒光抗體的濃度調(diào)整為50μg/ml，加入細胞中，在冰上反應1小時。用BSA洗滌1次后，添加最終濃度為2μg/ml的3,8-二氨基-5-[3-(二乙基甲基氨合)丙基]-6-苯基菲啶鎓二碘化物(PI)，用熒光測定計進行測定(FACScanベクトンディッキンソン)。
用靶向操作選擇生細胞，即PI陰性細胞，表示FITC的熒光強度的平均波道值與作為背景值的不含各種細胞的抗體時的值的差如圖8所示。
可確認1-3-1抗體比SV-3T細胞對DLD-1細胞具有更高的反應性。
·免疫脂質(zhì)體的制作與實施例7同樣，制得封入了阿霉素的PEG免疫脂質(zhì)體。
·細胞增殖抑制活性(Cytotoxicity)用健康成人的血清依次稀釋本免疫脂質(zhì)體，制得換算成阿霉素的濃度為40μ/ml的稀釋系列。將它們加入細胞中，于37℃培養(yǎng)1小時后，在培養(yǎng)基中洗滌1次，于37℃進行培養(yǎng)。在コン フルェント時間，通過MTT試驗(J.Immunol.Methods,65 55(1983))計測沒有添加脂質(zhì)體的對照試樣的細胞數(shù)。各脂質(zhì)體濃度的細胞數(shù)是相對于對照物的細胞數(shù)為100％的數(shù)。
圖9表示對人體DLD-1細胞和SV-3T細胞增殖的抑制活性。本免疫脂質(zhì)體對作為靶細胞的大腸癌DLD-1細胞顯現(xiàn)出特異的抑制效果，即本免疫脂質(zhì)體具有抗腫瘤效果。
將本發(fā)明的二價反應性水溶性高分子衍生物與配體和脂質(zhì)體等活性物質(zhì)混合，使它們反應就能夠容易地獲得配體-高分子-活性物質(zhì)構(gòu)型的復合體。本發(fā)明的水溶性高分子衍生物能夠防止配體活性的降低，還能夠減弱其對活性物質(zhì)的影響。
本發(fā)明的制備方法是在抗體等配體與PEG等高分子衍生物結(jié)合后再結(jié)合微膠粒，不需要在熱力學不穩(wěn)定的微膠粒中導入過量的PEG等高分子衍生物，所以，不受到它們的影響，就能夠制得配體結(jié)合體。
本發(fā)明中，在微膠粒中封入藥物等的情況下，能夠減少內(nèi)封物的漏出，此外，還能夠?qū)乖葮俗R分子顯現(xiàn)出較高的結(jié)合活性。
圖1表示在抗體中導入Ac-S-PEG-Suc，通過脫保護基處理生成巰基。
橫軸表示抗體與Ac-S-PEG-Suc反應時的摩爾比，縱軸表示由此生成的相當于1分子抗體的巰基分子數(shù)。白圈表示與Ac-S-PEG-Suc反應后用羥胺脫保護基的抗體，黑圈表示沒有用羥胺進行脫保護基處理的抗體。
圖2表示在抗CEA抗體中通過Ac-S-PEG-Suc或SATA導入巰基，與抗體結(jié)合，并封入了羧基熒光素的脂質(zhì)體的結(jié)合活性。各免疫脂質(zhì)體和沒有結(jié)合抗體的脂質(zhì)體在CEA固定化板上反應，洗凈后通過熒光對結(jié)合在板上的脂質(zhì)體量進行測定。橫軸表示各脂質(zhì)體量(脂質(zhì)量)，縱軸表示激發(fā)波長為492nm、熒光波長為520nm時的熒光強度。
圓圈表示使用了通過Ac-S-PEG-Suc導入了巰基的抗體的免疫脂質(zhì)體，正方形表示通過SATA導入了巰基的抗體的免疫脂質(zhì)體，×表示沒有結(jié)合抗體的脂質(zhì)體。
圖3表示通過Ac-S-PEG-Suc導入了巰基的抗體和熒光素馬來酰亞胺結(jié)合后的熒光抗體對MKN45癌細胞的結(jié)合活性。
與細胞反應后用熒光測定計解析。圖中a表示未與熒光抗體反應的細胞群，b表示與熒光抗體反應的細胞群。橫軸表示熒光量。縱軸表示細胞數(shù)。
圖4表示從使用了Ac-S-PEG-Suc的免疫脂質(zhì)體(白圈)中漏出的內(nèi)封羧基熒光素和從相應的非修飾脂質(zhì)體(黑色正方形)中漏出的羧基熒光素的比較情況。
縱軸表示殘存于脂質(zhì)體的羧基熒光素的％，橫軸表示培養(yǎng)時間。
圖5表示本發(fā)明的結(jié)合了配體的微膠粒的制作方法。A表示配體中的官能團，A＇表示與A具有反應性的基團，B與導入微膠粒粒子的反應性基團B＇和B″有特異的反應性。
圖6表示在抗CEA抗體中通過Ac-S-PEG-Suc或SATA導入巰基，與抗體結(jié)合，然后封入經(jīng)過巰基化的聚乙二醇編碼的羧基熒光素形成的脂質(zhì)體的結(jié)合活性。橫軸表示各脂質(zhì)體量(脂質(zhì)量)，縱軸表示激發(fā)波長492nm、熒光波長520nm時的熒光強度。圓圈表示使用通過Ac-S-PEG-Suc導入了巰基的抗體的免疫脂質(zhì)體，正方形表示使用通過SATA導入了巰基的抗體的免疫脂質(zhì)體，×表示沒有結(jié)合抗體的脂質(zhì)體。
圖7表示血中濃度推移的變化?？v軸表示血漿中的阿霉素濃度，橫軸表示時間。各點表示一組四只老鼠的平均值和SD值。圖中，圓圈表示使用通過Ac-S-PEG-Suc導入了巰基的抗體的免疫脂質(zhì)體，正方形表示只結(jié)合了巰基化PEG的脂質(zhì)體，×表示連巰基化的PEG也沒有結(jié)合的單脂質(zhì)體。
圖8表示1-3-1抗體對DLD-1細胞和SV-3T細胞的反應性?？v軸表示平均波道數(shù)與作為背景值的不含抗體時的值的差。
圖9表示實施例8所得的免疫脂質(zhì)體對DLD-1細胞和SV-3T細胞的細胞增殖抑制活性。縱軸表示添加脂質(zhì)體試樣時的細胞數(shù)(MTT試驗的吸光度)，以100％為基準。橫軸表示作為脂質(zhì)體濃度的阿霉素濃度?！醣硎綝LD1細胞的增殖率，○表示SV-3T的增殖率。
權(quán)利要求
1．一種二價反應性水溶性高分子衍生物，其特征在于，具有可與氨基反應的部位及巰基部分或S-乙酰基巰基部分。
2．如權(quán)利要求1所述的水溶性高分子衍生物，其特征還在于，由下式(Ⅰ)表示，
式中，S表示巰基部分或S-乙?；鶐€基部分，P表示水溶性高分子，N表示可與氨基反應的部位，R1和R2表示任意的連接基團，R1及/或R2不是必須的。
3．如權(quán)利要求1或2所述的高分子衍生物，其特征還在于，水溶性高分子為生物分解性聚合物或聚乙二醇。
4．如權(quán)利要求1～3的任一項所述的高分子衍生物，其特征還在于，水溶性高分子為聚乙二醇。
5．如權(quán)利要求1～4的任一項所述的高分子衍生物，其特征還在于，可與氨基反應的部位為琥珀酰亞胺基。
6．一種復合體，其特征在于，通過權(quán)利要求1～5的任一項所述的高分子衍生物，由配體和活性物質(zhì)結(jié)合而成。
7．如權(quán)利要求6所述的復合體，其特征還在于，由下式(Ⅱ)表示，
式中，L表示活性物質(zhì)，A表示配體，S、R1、P、R2和N如前所述。
8．如權(quán)利要求6或7所述的復合體，其特征還在于，所述的活性物質(zhì)選自低分子藥物、標記分子、蛋白質(zhì)、微膠粒和脂質(zhì)體。
9．如權(quán)利要求8所述的復合體，其特征還在于，所述的活性物質(zhì)為脂質(zhì)體或微膠粒。
10．權(quán)利要求6～9的任一項所述的復合體，其特征還在于，所述的配體為抗體。
11．如權(quán)利要求6～10的任一項所述的復合體，其特征還在于，所述的活性物質(zhì)上還結(jié)合了具有活性物質(zhì)和反應性的一價水溶性高分子衍生物。
12．一種醫(yī)藥組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求6～11的任一項所述的復合體。
13．如權(quán)利要求12所述的醫(yī)藥組合物的應用，其特征在于，它被用作為診斷劑組合物。
14．一種診斷劑組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求6～11的任一項所述的復合體。
15．如權(quán)利要求6～11的任一項所述的復合體的制備方法，其特征在于，首先使權(quán)利要求1～5的任一項所述的二價反應性水溶性高分子衍生物與配體結(jié)合，然后在上述水溶性高分子衍生物的另一端與活性物質(zhì)結(jié)合。
16．如權(quán)利要求15所述的制備方法，其特征還在于，包括進一步結(jié)合具有活性物質(zhì)和反應性的一價反應性水溶性高分子衍生物的步驟。
17．如權(quán)利要求15或16所述的制備方法，其特征還在于，通過配體的氨基使二價反應性水溶性高分子衍生物與配體結(jié)合。
18．如權(quán)利要求15～17的任一項所述的制備方法，其特征還在于，通過二價反應性水溶性高分子衍生物的巰基部分使二價反應性水溶性高分子衍生物和活性物質(zhì)與微膠粒的巰基反應性部分結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及可連接配體和脂質(zhì)體活性物質(zhì)的水溶性高分子衍生物,提供了能夠減少配體活性的降低,減弱對活性物質(zhì)的影響的二價反應性水溶性高分子衍生物。本發(fā)明還涉及具有可與氨基反應的部位和巰基部分或S－乙?；鶐€基部分的二價反應性水溶性高分子衍生物、通過該高分子衍生物使配體和活性物質(zhì)結(jié)合的復合體、含有該復合體的醫(yī)藥·診斷劑組合物及上述復合體的制備方法。此外,制備復合體時,不需要在熱力學不穩(wěn)定的活性物質(zhì)中導入過量的高分子衍生物,即提供了對活性物質(zhì)沒有影響的制備方法。
文檔編號A61P35/00GK1214348SQ9811951
公開日1999年4月21日 申請日期1998年9月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月17日
發(fā)明者田川俊明, 鈴木勉, 矢田信久, 長池一博, 平川容子, 細川齊子 申請人:三菱化學株式會社