專利名稱：抗肝炎病毒化合物及其制備方法和在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療病毒性肝炎化學藥物。
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus；HBV)引起急性和慢性肝炎。慢性HBV感染可導致肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌。盡管乙肝病毒疫苗已問世多年，然而，全世界仍有3億人口感染HBV，其中中國占75％。雖然干擾素已用于臨床，但僅有25％至40％的有效率。而且10％至40％的病人產生嚴重的副作用。近幾年來，許多學者致力于核苷類化合物的研究。實驗結果表明，某些核苷類化合物在體外具有抑制HBV DNA復制的作用。這些包括Ganciclovir，Acyclovir，Dideoxy cytidine(DddC)，F(xiàn)ialuridine(FIAU)，2’3’-dideoxy-3’thiacytidine(SddC)等。然而，Ganciclovir，Acyclovir和DddC抗HBV的活性不顯著，DddC尚有線粒體毒性。FIAU雖有較強的抗HBV活性，但長期應用之后，由于對線粒體DNA的毒性作用，會產生遲發(fā)毒性反應，如骨髓抑制，周圍神經(jīng)炎，甚至死亡。SddC雖然具有很強的體內外抗HBV DNA復制作用，但停藥后，HBV的復制又重新恢復。因此，研制高活性，無明顯毒性的抗HBV藥物仍然是一種難以對付的挑戰(zhàn)。
本發(fā)明目的在于提供具有明顯抗HBV DNA復制活性的化合物和其制備方法，以及該化合物在生產治療抗病毒性肝炎藥物中的應用的技術方案。
本發(fā)明提供的具有明顯抗HBV DNA復制活性的化合物是β-L-2’，3’-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)，其化學結構式為
本發(fā)明提供的β-L-2’，3’，-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)是按以下方法制取的
a.以D-谷氨酸(D-glutamic acid)為原料，在室溫下，用亞硝酸鈉(NaNO2)重氮化，以硼烷(BH3)還原，于咪唑(lmidazole)中，與TBDPSCI反應，得到產物1，即含TBDPS的五元環(huán)內酯；b.在-78℃下，將產物1與六甲醛硅胺烷(LiHMDS)作用后，在室溫下，用氯化四甲硅烷(TMSCI)置換，再與溴化苯醛硒(PhSeBr)在-78℃下作用，得到產物2，即具有立體選擇性的含苯醛硒的五元環(huán)內酯；c.將產物2與已二酸(BIBAL-H)，在甲苯(toluene)中，于-78℃條件下反應，再在0℃下，用乙酸酐(AC2O)乙酸化，得到產物3；d.產物3在-22℃下，與四硅烷-6-氯嘌呤(TMS-6-chloropurine)作用，得到產物4；e.將產物4在80℃下，經(jīng)氨化，在0℃下，氧化后得到產物5，即6-氨基嘌呤衍生物；f.產物5在四氫呋喃(THF)中，室溫下，用氟化四丁銨(TBAF)脫去TBDPS，得到目標產物6，即β-L-2’，3’-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)。
以本發(fā)明提供的β-L-2’，3’，-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)制成治療病毒性肝炎的抗肝炎病毒藥劑，可用于病毒性肝炎的治療。
本發(fā)明β-L-2’，3’，-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)的積極效果在于所提供的化合物β-L-2’，3’，-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)具有顯著抗HBV DNA復制的活性，且無生物毒性作用，該積極效果通過以下的篩選系統(tǒng)檢測得以證實1.主要試劑與材料蛋白酶K，tRNA，RNA酶，HindIII、BamH1、胎牛血清、WizardPlus Maxi-Preps DNA Purification System，QIAquick GelExtraction Kit，α-32P-dCTP，Nylon Membrane，Gene Amp PCRReagent Kit with Taq DNA Polymerase2.細胞培養(yǎng)本實驗所用細胞系用克隆的人HBV基因轉染的肝癌細胞株2.2.15。細胞以MEME培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)液含10％的胎牛血清及100微克/毫升的卡那霉素。細胞置37℃，含5％CO2的孵育箱中培養(yǎng)。
3.細胞的藥物處理2.2.15細胞以5×104/毫升/孔的密度接種在12孔培養(yǎng)板。每3天換一次培養(yǎng)液。第3次和第4次換液時，加系列倍比稀釋濃度的藥物(于1ml新鮮MEME中)。12天后終止培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液和細胞分別提取細胞外和細胞內HBV DNA。
4.HBV DNA的提取(1)細胞外HBV DNA的提取培養(yǎng)液中的病毒顆粒以聚乙烯乙二醇(PEG)4℃沉淀過夜，3000g離心30分鐘，沉淀物以提取緩沖液50℃下消化3小時，再以酚-氯仿抽提，乙醇洗滌，TE80溶解，貯存-20℃冰箱。
(2)細胞內HBV DNA的提取細胞溶解在DNA提取緩沖液，50℃水浴中孵育4小時，酚-氯仿抽提，HindIII消化，-20℃冰箱貯存。
5.DNA探針的制備(1)HBV DNA探針的制備含有HBV DNA全片段的質粒PBR322在大腸桿菌Ecoli中擴增后，以Bam H1酶切，以電泳分離，再以Prep-A-Genc DNA提純試劑盒提純。
(2)線粒體DNA探針的制備線粒體DNA探針以PCR法制備。所用的引物為引物I5’CCA TCA TCC ACA ACC TTA 3’引物II5’CAT TCG GGA GGA TCC TAT 3’6.Southern Blot提取的DNA樣本載于0.8％瓊脂糖凝膠，于TAE電泳緩沖液中，在180V條件下電泳2小時。經(jīng)變性、中和、轉膜，然后與α-32P-dCTP標記的HBV DNA探針在65℃條件下雜交過夜。洗滌后在-80℃冰箱中作放射自顯影。
7.抗HBV DNA復制的活性測定先將放射自顯影結果以DNA密度掃描儀Personal Densitometer掃描定量。
(1)細胞外抗HBV DNA復制根據(jù)與非藥物處理相比，松解環(huán)狀(Relaxed Circular；RC)DNA的量所占的百分比，作圖求出每種藥物抑制病毒半數(shù)的劑量即ID50。
(2)細胞內抗HBV DNA復制根據(jù)與非藥物處理相比，游離(Episomal)DNA與整合(Integrated)DNA的比值相當于對照樣本的百分比，作圖求出ID50。
8.毒性測定(1)細胞毒性將2.2.15細胞以104/2ml/孔的密度接種在24孔培養(yǎng)板。24小時后，以不同濃度的藥物處理。72小時后，以0.5％Methylene Blue固定染色30分鐘，洗滌后以1％的Sarkosyl溶解，在595nm讀出各樣本的光密度。根據(jù)與非藥物處理對照相比，計算出各濃度藥物抑制細胞生長的百分率，作圖求出各藥抑制細胞生長50％的濃度即TC50。
(2)線粒體毒性在細胞內抗HBV DNA復制活性檢測的基礎上，以0.4M的NaOH，42℃水浴中洗滌30分鐘，以去除標記的HBV DNA探針。同一張膜與α-32P-dCTP標記的線粒體DNA探針雜交。放射自顯影結果作DNA定量分析。根據(jù)與非藥物處理對照樣本相比，線粒體DNA與整合HBV DNA的量的比值相當于對照的百分數(shù)得出各藥濃度抑制線粒體DNA的百分率，作圖求出各種藥物抑制線粒體DNA50％的劑量。
9.結果(1)本發(fā)明化合物對HBV DNA復制有明顯的抑制作用細胞外抗HBV DNA檢測結果表明，從0.016至2μM濃度顯示出明顯的量效關系。ID50為0.2μM。細胞內抗HBV DNA檢測結果進一步證實細胞外的檢測結果，見下表。
不同濃度β-L-D4A對HBV DNA的抑制作用藥 物 濃 度未處理對 照2μM0.4μM0.08μM0.016μMHBV DNA 42.4505.8 1990.3 3079.4 2996.2抑制病毒百分率 98.683.1 33.60 0(％)(2)毒性作用細胞毒性檢測結果表明，本發(fā)明化合物對細胞的生長無明顯毒性作用，TC50為200μM。根據(jù)治療指數(shù)TI＝TC50/ID60，可求出其TI為1000。
對線粒體DNA的毒性檢測結果表明，本發(fā)明化合物對細胞內線粒體DNA無明顯毒性作用。
實施例本發(fā)明提供的β-L-2’，3’，-二去氫去氧呋喃腺苷的制取方法是首先，以D-谷氨酸(D-glutamic acid)為原料，在室溫下，用亞硝酸鈉(NaNO2)重氮化，以硼烷(BH3)還原，于咪唑(Imidazole)中，與TBDPSCI反應，得到產物1，即含TBDPS的五元環(huán)內酯，在-78℃下，產物1再與六甲醛硅胺烷(LiHMDS)作用后，在室溫下，用氯化四甲硅烷(TMSCI)置換，再與溴化苯醛硒(PhSeBr)在-78℃下作用，得到產物2，即具有立體選擇性的含苯醛硒的五元環(huán)內酯。后者與已二酸(BIBAL-H)，在甲苯(toluene)中，-78℃下反應，再在0℃下，用乙酸酐(AC2O)乙酸化，得到產物3，后者在-22℃下，與四硅烷-6-氯嘌呤(TMS-6-chloropurine)作用，得到產物4。產物4在80℃下，經(jīng)氨化，0℃下，氧化后得到產物5，即6-氨基嘌呤衍生物，后者在四氫呋喃(THF)中，室溫下，用氟化四丁銨(TBAF)脫去TBDPS，得到目標產物6，即β-L-2’，3’-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)。
本發(fā)明提供的β-L-2，3，-二去氫去氧呋喃腺苷，能有效地抑制乙肝病毒的復制，將其藥用，能效地治療乙型肝炎和預防原發(fā)性肝癌的發(fā)生，促使乙肝e抗原及乙肝表面抗原陰轉。本發(fā)明β-L-2，3，-二去氫去氧呋喃腺苷用于生產治療乙型肝炎藥物，可制成口服片劑、膠囊和靜脈注射針劑等在制藥上及治療上可接受的多種劑型，其應用的可行方案之一是制成片劑，每片含β-L-2，3，-二去氫去氧呋喃25毫克，用量為每天100-300毫克；方案之二是制成針劑每支含β-L-2，3，-二去氫去氧呋喃100毫克，用量為每天100-500毫克。
權利要求
1.抗肝炎病毒化合物，其特征在于該化合物是β-L-2’，3’-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)，其化學結構式為
2.根據(jù)權利要求1所述的抗肝炎病毒化合物，其特征在于它是以下述方法制取的
a.以D-谷氨酸(D-glutamic acid)為原料，在室溫下，用亞硝酸鈉(NaNO2)重氮化，以硼烷(BH3)還原，于咪唑(Imidazole)中，與TBDPSCI反應，得到產物1，即含TBDPS的五元環(huán)內酯；b.在-78℃下，將產物1與六甲醛硅胺烷(LiHMDS)作用后，在室溫下，用氯化四甲硅烷(TMSCI)置換，再與溴化苯醛硒(PhSeBr)在-78℃下作用，得到產物2，即具有立體選擇性的含苯醛硒的五元環(huán)內酯；c.將產物2與已二酸(BIBAL-H)，在甲苯(toluene)中，于-78℃條件下反應，再在0℃下，用乙酸酐(AC2O)乙酸化，得到產物3；d.產物3在-22℃下，與四硅烷-6-氯嘌呤(TMS-6-chloropurine)作用，得到產物4；e.將產物4在80℃下，經(jīng)氨化，在0℃下，氧化后得到產物5，即6-氨基嘌呤衍生物；f.產物5在四氫呋喃(THF)中，室溫下，用氟化四丁銨(TBAF)脫去TBDPS，得到目標產物6，即β-L-2’，3’-二去氫去氧呋喃腺苷(β-L-D4A)。
3.根據(jù)權利要求1、2所述的抗肝炎病毒化合物，其特征在于該化合物在制備治療病毒性肝炎藥物中的應用。
全文摘要
一種抗肝炎病毒化合物及其制備方法和在制藥中的應用,其特征在于該化合物是β－L－2’,3’－二去氫去氧呋喃腺苷(β－L－D4A),本發(fā)明化合物對HBV DNA復制有明顯的抑制作用,無生物毒性作用,將其藥用,能效地治療乙型肝炎和預防原發(fā)性肝癌的發(fā)生,促使乙肝e抗原及乙肝表面抗原陰轉。
文檔編號A61K31/70GK1245808SQ9811367
公開日2000年3月1日 申請日期1998年8月21日 優(yōu)先權日1998年8月21日
發(fā)明者林菊生 申請人:同濟醫(yī)科大學附屬同濟醫(yī)院