專(zhuān)利名稱(chēng)：：硫－35標(biāo)記單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體，尤其是關(guān)于一種核素35S標(biāo)記單克隆抗體及其制備方法。腦膠質(zhì)瘤為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病例占腦腫瘤的50％左右，它的特點(diǎn)是腫瘤中約30％的細(xì)胞參與增殖，70％的細(xì)胞雖然不參與增殖活動(dòng)，但具有增殖力，需要時(shí)即可轉(zhuǎn)入增殖群，細(xì)胞周期時(shí)間約2-3天。腦膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤邊緣常是正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞交織存在的場(chǎng)所，依然存在血腦屏障，致使許多化療藥物不能到達(dá)。腦膠質(zhì)瘤患者的死亡率和手術(shù)復(fù)發(fā)率高，是惡性度較高的腫瘤。放射治療會(huì)在射線(xiàn)殺傷腫瘤的同時(shí)殺傷正常細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道在60Gy照射劑量時(shí)病人生存時(shí)間有增加，但在70-80Gy照射劑量時(shí)有可能超過(guò)腦的最大耐受量，使生存率反而下降?，F(xiàn)在采用γ刀技術(shù)，雖然大大改善了射線(xiàn)的劑量分布，但只能是改善?？傊?，由于腦膠質(zhì)瘤為惡性腫瘤，病人復(fù)發(fā)率和死亡率都很高。世界各國(guó)均在尋找更好的治療方法。自從1975年應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體的研究成功以來(lái)[KohlerG.etal.Nature，1975；256405]，應(yīng)用單抗來(lái)研究腫瘤相關(guān)抗原，使腫瘤免疫學(xué)研究出現(xiàn)了新的飛躍，用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體作為治療腦腫瘤有較好的前景。碘-131標(biāo)記單克隆抗體首先被研究(ZanintakyMR，etal.CancerRes.1989；492807)。后來(lái)又公布了碘-131標(biāo)記單克隆抗體SZ39(YangW.L.，etalChineseMed.J.1988；101(12)919)。但由于I-131的γ射線(xiàn)和β射線(xiàn)的能量較高，使醫(yī)護(hù)人員和病人正常組織受到較大的損傷，同時(shí)由于體內(nèi)脫鹵酶的存在和作用，使I-131容易從單克隆抗體上脫落下來(lái)，非但使藥物失效并因I-131濃集在甲狀腺造成危害。因此，碘-131標(biāo)記的單克隆抗體不能作為治療藥物推廣使用。近年來(lái)，國(guó)際上趨向采用發(fā)射α和β粒子的放射性核素進(jìn)行導(dǎo)向放療。R.G.Fairchild等報(bào)道(R.G.Fairchildetal，RadiationOncologyBiol.Phys.，1989；17(2)337-343)以35S標(biāo)記硫氧嘧啶治療黑色素瘤荷瘤鼠，治療量為48.1-370MBq，小劑量可產(chǎn)生抑瘤效果，大劑量可使腫瘤消退。另?yè)?jù)報(bào)道(G.R.Gottschalketal，CancerRes.1959；191070)，20.7-34.3GBqNa235SO4治療病人未引起放射性疾病，僅有可逆性白細(xì)胞減少?？梢?jiàn)從射線(xiàn)殺傷力及安全性考慮，35S有希望應(yīng)用于導(dǎo)向放療。為此，采用單克隆抗體為導(dǎo)向物，將35S標(biāo)記引入到腫瘤部位，即對(duì)S-35標(biāo)記的單克隆抗體及其應(yīng)用于制備治療腦膠質(zhì)瘤的醫(yī)藥制品，是一個(gè)很有意義的科研工作。本發(fā)明目的是提供一種35S標(biāo)記單克隆抗體SZ39，它能良好地保持單克隆抗體的免疫活性，并能與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異結(jié)合，其35S標(biāo)記物放射化學(xué)純度可達(dá)99％，放射性比活度可高達(dá)51.8MBq/mg，能有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明另一目的是提供35S標(biāo)記單克隆抗體SZ39的制備方法，該方法首先用硫-35標(biāo)記的硫酸與苯胺合成35S-對(duì)氨基苯磺酸，然后用硫-35標(biāo)記的對(duì)氨基苯磺酸與單克隆抗體SZ39進(jìn)行交聯(lián)而成35S-對(duì)氨基苯磺酸與單克隆抗體SZ39的交聯(lián)物。本發(fā)明又一目的是提供35S標(biāo)記單克隆抗體SZ39可應(yīng)用于制備治療人腦膠質(zhì)瘤的醫(yī)藥制品。本發(fā)明是一種硫-35標(biāo)記單克隆抗體SZ39(35S-McAb-SZ39)，它是由35S-對(duì)氨基苯磺酸和單克隆抗體SZ39交聯(lián)而成的放射性標(biāo)記的35S-對(duì)氨基苯磺酸與單克隆抗體SZ39的交聯(lián)物。McAb-SZ39屬于IgG2亞類(lèi)，重鏈分子量為55KD，免疫轉(zhuǎn)移電泳證實(shí)，McAb-SZ39抗體識(shí)別抗原為膠瘤細(xì)胞膜上MW180000的糖蛋白(參見(jiàn)楊偉廉，中華神經(jīng)外科雜志1988；4(4)234)，該單抗效介較高，經(jīng)1∶10000稀釋后，ELISA測(cè)定對(duì)靶細(xì)胞仍呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。免疫組化、免疫熒光及ELISA法測(cè)定結(jié)果顯示，McAb-SZ39絕大多數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和顱內(nèi)惡生膠質(zhì)瘤呈強(qiáng)結(jié)合反應(yīng)，而與其它被檢測(cè)腫瘤及腫瘤細(xì)胞系無(wú)反應(yīng)。組織特異性測(cè)定顯示McAb-SZ39與正常淋巴細(xì)胞，ABO型紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板骨髓細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞及肝、脾、肺、胰、子宮、胃、食道、大腦、小腦、皮膚、橫紋肌等12種正常人體細(xì)胞組織均無(wú)反應(yīng)，由此可見(jiàn)，McAc-SZ39對(duì)人腦膠質(zhì)瘤能特異結(jié)合。35S標(biāo)記的單克隆抗體SZ39，既保持了McAb-SZ39與人腦膠質(zhì)瘤結(jié)合的特異性，又有35S核素發(fā)射純?chǔ)律渚€(xiàn)線(xiàn)性能量轉(zhuǎn)移高的特點(diǎn)，35S發(fā)射的β粒子最大能量為0.167Mev，組織中最大射程為300μm，約為30個(gè)細(xì)胞直徑的殺傷范圍。對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力強(qiáng)，而對(duì)正常細(xì)胞組織及周?chē)藛T無(wú)損害。在對(duì)荷人膠質(zhì)瘤裸小鼠的實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)其對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制率在用藥5天后就高達(dá)30％以上。因此，35S標(biāo)記McAb-SZ39用于制備放射性導(dǎo)向治療人腦膠質(zhì)瘤的醫(yī)藥制品有著良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明硫-35標(biāo)記單克隆抗體SZ39的制備方法以H235SO4為初始物質(zhì)的核素硫-35標(biāo)記McAb-SZ39路線(xiàn)示意圖如下制備方法分二步進(jìn)行一、35S-對(duì)氨基苯磺酸的制備將H235SO4加入苯胺中，再加入H2SO4作為載體進(jìn)行反應(yīng)，H235SO4加入量極微，對(duì)苯胺而言可以忽略，苯胺與H2SO4的克分子比例為1∶1-4，反應(yīng)溫度175-185℃，反應(yīng)時(shí)間38-60小時(shí)。反應(yīng)得粗產(chǎn)物用板層析分離，得35S-對(duì)氨基苯磺酸Rf值為0.36，35S-苯氨硫酸鹽Rf值為0。放射生板層析掃描圖(圖1)顯示35S-苯氨硫酸鹽轉(zhuǎn)換成35S-對(duì)氨基苯磺酸的轉(zhuǎn)換率。將制得的35S-對(duì)氨基苯磺酸與對(duì)氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)品在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定光譜圖，證實(shí)兩者光譜圖相一致(見(jiàn)圖2)。二、硫-35標(biāo)記單克隆抗體SZ39的制備采用碳二亞胺(CDC)法將35S-對(duì)氨基苯磺酸與單抗SZ39交聯(lián)成35S標(biāo)記McAb-SZ39交聯(lián)物。將上面制得的35S-對(duì)氨基苯磺酸加入到單抗SZ39和碳二亞胺的磷酸緩沖液(PH＝7.4)中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。35S-對(duì)氨基苯磺酸與單抗SZ39的克分子比例為1∶1.2，單抗SZ39與CDC的重量比為1∶10，在12-25℃溫度范圍內(nèi)攪拌反應(yīng)，時(shí)間15-45分鐘，標(biāo)記單抗反應(yīng)完畢后，裝透析袋對(duì)蒸餾水透析。然后用液體閃爍譜儀測(cè)定放射性強(qiáng)度，根據(jù)放射性投料量計(jì)算出放射化學(xué)產(chǎn)率。根據(jù)單抗的化學(xué)量計(jì)算出35S標(biāo)記McAb-SZ39的放射性比活度。并用高壓液相色譜鑒定35S標(biāo)記單克隆抗體的放射化學(xué)純度，用ELISA方法檢測(cè)35S標(biāo)記單克隆抗體SZ39的免疫活性，它稀釋至1∶10000仍呈陽(yáng)性。碳二亞胺法方法簡(jiǎn)便，只要調(diào)節(jié)好反應(yīng)液中單抗SZ39和碳二亞胺一定比例，反應(yīng)就能很好進(jìn)行，由于反應(yīng)在溫和條件下進(jìn)行，又無(wú)需調(diào)節(jié)PH，使單抗活性不受PH變化影響，且免疫活性保持時(shí)間長(zhǎng)，在二周內(nèi)無(wú)變化。本發(fā)明35S標(biāo)記單抗SZ39在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行治療的實(shí)驗(yàn)。以荷瘤裸小鼠為模型，即將人腦膠質(zhì)瘤NHG-1皮下移植裸小鼠為模型，給藥方法均為腹腔注射，103.6MBq/只小鼠，實(shí)驗(yàn)分三組進(jìn)行1)35S-McAb-SZ39治療組；2)35S-IgG治療組；3)空白對(duì)照組。在裸小鼠接種后7天給藥，連續(xù)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量腫瘤的短徑(a)和長(zhǎng)徑(b)，以公式計(jì)算腫瘤體積＝a2×b/2，計(jì)算各組腫瘤大小。再按下列算式求出35S-McAb-SZ39治療組與35S-IgG治療組對(duì)空白對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率(I)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，103.6MBq劑量的35S-McAb-SZ39對(duì)荷瘤鼠腦膠質(zhì)瘤具有明顯的抑制作用，給藥后5天即可使腫瘤生長(zhǎng)阻滯，腫瘤生長(zhǎng)抑制率大于30％，具有腫瘤治療所必須的殺傷力。而35S-IgG因缺乏單抗的特異濃聚作用，抑制作用不明顯。這主要是因?yàn)?5S-McAb-SZ39中單抗將35S核素特異性地帶到腫瘤部位，而35S核素產(chǎn)生的β衰變釋放的能量殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)35S標(biāo)記的單克隆抗體SZ39，既保持了單克隆抗體SZ39與人腦膠質(zhì)瘤結(jié)合力強(qiáng)的特性，又有35S核素線(xiàn)性能量轉(zhuǎn)移高對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力強(qiáng)的特點(diǎn)。與131I-McAb-SZ39相比較，又顯示其安全有效的特點(diǎn)。131I-McAb由于體內(nèi)脫鹵酶的存在，I-131很容易從McAb上脫落下來(lái)，達(dá)不到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，而35S-McAb中35S不易脫落，并由于35S的核素發(fā)射能量為0.167Mev的純?chǔ)律渚€(xiàn)，最大射程為細(xì)胞直徑的30倍，它對(duì)正常細(xì)胞組織和周?chē)藛T無(wú)損傷，不像I-131發(fā)射較大能量的γ和β射線(xiàn)，可對(duì)正常細(xì)胞組織和周?chē)藛T有較多的輻射損傷。此外，35S-McAb-SZ39的制備方法簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和，其產(chǎn)物免疫活性保持時(shí)間長(zhǎng)，二周內(nèi)無(wú)變化?？傊?，本發(fā)明35S-McAb-SZ39，因其對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的導(dǎo)向性和較大的殺傷力，應(yīng)用于制造治療人腦膠質(zhì)瘤的放射性醫(yī)藥制品有良好的前景。本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。圖1是顯示35S-苯氨硫酸鹽轉(zhuǎn)換成35S-對(duì)氨基苯碳酸轉(zhuǎn)換率的放射性板層析掃描圖。圖2是35S-對(duì)氨基苯磺酸和對(duì)氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜比較圖。實(shí)施例135S-對(duì)氨基苯磺酸的制備。取113MBqH235SO4加入到含有0.05mM苯胺的反應(yīng)瓶中，再加入0.05mM硫酸，反應(yīng)瓶用水泵減壓抽干封管，在170℃溫度下反應(yīng)，時(shí)間為60小時(shí)。開(kāi)封后加入40μlNaCl飽和水溶液溶解，用硅膠GF板(20×20cm)展開(kāi)分離，展開(kāi)劑為正丁醇∶乙醇∶水(120∶30∶50)，在Rf＝0.36處得到35S-對(duì)氨基苯磺酸純品，計(jì)算其轉(zhuǎn)換率為58％。用UV-240紫外分光光度計(jì)測(cè)定紫外光譜圖，證實(shí)與對(duì)氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖相一致(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例235S-對(duì)氨基苯磺酸的制備。取113MBqH235SO4加入到含有0.05mM苯胺的反應(yīng)瓶中，再加入0.025mM硫酸，反應(yīng)瓶用水泵減壓抽干封管，在185℃溫度下反應(yīng)，時(shí)間為38小時(shí)。開(kāi)封后加入400μlNaCl飽和水溶液溶解，用硅膠GF板(20×20cm)展開(kāi)分離，展開(kāi)劑為正丁醇∶乙醇∶水(120∶30∶50)，在Rf＝0.36處得到35S-對(duì)氨基苯磺酸純品，計(jì)算其轉(zhuǎn)換率為64％。用UV-240紫外分光光度計(jì)測(cè)定紫外光譜圖，證實(shí)與對(duì)氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖相一致(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例335S-對(duì)氨基苯磺酸的制備。取113MBqH235SO4加入到含有0.05mM苯胺的反應(yīng)瓶中，再加入0.0125mM硫酸，反應(yīng)瓶用水泵減壓抽干封管，在180℃溫度下反應(yīng)，時(shí)間為45小時(shí)。開(kāi)封后加入40μlNaCl飽和水溶液溶解，用硅膠GF板(20×20cm)展開(kāi)分離，展開(kāi)劑為正丁醇∶乙醇∶水(120∶30∶50)，在Rf＝0.36處得到35S-對(duì)氨基苯磺酸純品，計(jì)算其轉(zhuǎn)換率為62％。用UV-240紫外分光光度計(jì)測(cè)定紫外光譜圖，證實(shí)與對(duì)氨基苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖相一致(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例435S標(biāo)記單抗SZ39交聯(lián)物的制備將828MBq35S-對(duì)氨基苯磺酸，40μl0.9％氯化鈉溶液加入到200μl含有6mg單克隆抗體SZ39和60mg碳二亞胺(CDC)的PH7.4磷酸緩沖溶液中，在12℃水浴下攪拌反應(yīng)45分鐘進(jìn)行交聯(lián)，然后裝透析袋對(duì)蒸餾水透析4次。產(chǎn)物用液體閃爍儀測(cè)量放射性強(qiáng)度為310.8MBq，計(jì)算放射化學(xué)產(chǎn)率為37.4％。用ELISA方法檢測(cè)其免疫活性，顯示35S-McAb-SZ39能良好保持單克隆抗體的免疫活性，1∶10000稀釋時(shí)免疫活性仍為陽(yáng)性。用HPLC測(cè)定其放射化學(xué)純度為99％，其35S標(biāo)記單克隆抗體的放射性比活度為51.8MBq/mg。實(shí)施例535S標(biāo)記單抗SZ39交聯(lián)物的制備將393MBpq35S-對(duì)氨基苯磺酸，40μl0.9％氯化鈉溶液加入到200μl含有4mg單克隆抗體SZ39和40mg碳二亞胺(CDC)的PH7.4磷酸緩沖溶液中，在20℃水浴下攪拌反應(yīng)30分鐘進(jìn)行交聯(lián)，然后裝透析袋對(duì)蒸餾水透折4次，產(chǎn)物用液體閃爍儀測(cè)量放射性強(qiáng)度為136.9MBq，計(jì)算放射化學(xué)產(chǎn)率為34.9％。用ELISA方法檢測(cè)其免疫活性，顯示35S-McAb-SZ39能良好保持單克隆抗體的免疫活性，1∶10000稀釋時(shí)免疫活性仍為陽(yáng)性。用HPLC測(cè)定其放射化學(xué)純度為99％，其35S標(biāo)記單克隆抗體的放射性比活度為34.2MBq/mg。實(shí)施例635S標(biāo)記單抗SZ39交聯(lián)物的制備將1422MBq35S-對(duì)氨基苯磺酸，400μl0.9％氯化鈉溶液加入到200μl含有12mg單克隆抗體SZ39和120mg碳二亞胺(CDC)的PH7.4磷酸緩沖溶液中，在25℃水浴下攪拌反應(yīng)15分鐘進(jìn)行交聯(lián)，然后裝透析袋對(duì)蒸餾水透析4次。產(chǎn)物用液體閃爍儀測(cè)量放射性強(qiáng)度為481.0MBq，計(jì)算放射化學(xué)產(chǎn)率為33.8％。用ELISA方法檢測(cè)其免疫活性，顯示35S-McAb-SZ39能良好保持單克隆抗體的免疫活性，1∶10000稀釋時(shí)免疫活性仍為陽(yáng)性。用HPLC測(cè)定其放射化學(xué)純度為99％，其35S標(biāo)記單克隆抗體的放射性比活度為40.0MBq/mg。實(shí)施例735S-McAb-SZ39在荷人腦膠質(zhì)瘤裸鼠體內(nèi)的治療實(shí)驗(yàn)將體重為20±0.2克，鼠令為6-8周的裸小鼠(雌雄兼用)分成三組(A)空白對(duì)照組(5只)，(B)35S-McAb-SZ39治療組(5只)，(C)35S-IgG治療組(3只)，在裸小鼠皮下接種人腦膠質(zhì)瘤NHG-1，7天后分別腹腔注藥，35S-McAb-SZ39治療組和35S-IgG治療組注射劑量均為104.6MBq/只，對(duì)照組注射同體積生理鹽水。在給藥當(dāng)天及5、12、20、26天時(shí)測(cè)量腫瘤的短徑(a)和長(zhǎng)徑(b)，計(jì)算出各組腫瘤體積平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，列于表1。表1各治療組腫瘤體積(mm3)變化情況</tables>X±SD，Δ與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)n＝實(shí)驗(yàn)裸鼠數(shù)由表1可以看出，35S-McAb-SZ39治療組的荷瘤裸小鼠腫瘤體積明顯小于35S-IgG治療組和空白對(duì)照組的腫瘤體積。按公式計(jì)算各治療組腫瘤生長(zhǎng)抑制率列于表2表2各治療組腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)*二組間有顯著差異(P＜0.05)從表2中可以看出，35S-IgG治療組對(duì)腫瘤雖然也有些抑制，但抑制率很小，而35S-McAb-SZ39治療組5天后抑制率在30％以上，26天時(shí)抑制率達(dá)49.9％與35S-IgG治療組有顯著差異。權(quán)利要求1.一種硫-35標(biāo)記單克隆抗體SZ39，其特征在于它是由35S-對(duì)氨基苯磺酸和屬于IgG2亞類(lèi)并具有55KD重鏈分子量的單克隆抗體SZ39交聯(lián)而成的放射性35S標(biāo)記的對(duì)氨基苯磺酸與單克隆抗體SZ39的交聯(lián)物。2.一種硫-35標(biāo)記單克隆抗體SZ39的制備方法，其特征在于該方法分二步進(jìn)行a.制備35S-對(duì)氨基苯磺酸，將H235SO4加入苯胺中，再加入作為載體的H2SO4進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度175-185℃，反應(yīng)時(shí)間38-60小時(shí)，苯胺與H2SO4克分子比例為1∶1-4，b.采用碳二亞胺(CDC)法將35S-對(duì)氨基苯磺酸與單抗SZ39交聯(lián)成35S標(biāo)記的對(duì)氨基苯磺酸與單克隆抗體SZ39的交聯(lián)物，35S-對(duì)氨基苯磺酸與單克隆抗體SZ39克分子比例為1∶1-2，單克隆抗體SZ39與CDC的重量比為1∶10，反應(yīng)溫度為12-25℃，反應(yīng)時(shí)間為15-45分鐘。3.如權(quán)利要求1所述的硫-35標(biāo)記單克隆抗體SZ39，其特征在于它可應(yīng)用于制造治療人腦膠質(zhì)瘤的放射性醫(yī)藥制品。全文摘要一種硫－35標(biāo)記的單克隆抗體SZ39(文檔編號(hào)A61K51/02GK1194271SQ9811070公開(kāi)日1998年9月30日申請(qǐng)日期1998年3月11日優(yōu)先權(quán)日1998年3月11日發(fā)明者吳元芳,周楨堂,張雨龍,莊道玲,要福增申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所