專利名稱：方法及其所用的新化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的化合物及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用。尤其是，本發(fā)明提供了新的大分子，它們的制備方法，其藥物學(xué)配制品及其作為抗流感藥劑的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種新的用于檢測所有類型的A型和B型流感病毒的診斷方法。發(fā)明背景甲型和乙型流感病毒是急性呼吸道疾病的主要致病源，僅在美國每年就導(dǎo)致估計約3-5千萬例感染。甲型流感曾導(dǎo)致大型的流行疫情，如1919年致死上百萬人的“西班牙流感”。流感產(chǎn)生難以控制的疾病，導(dǎo)致顯著的發(fā)病率，并且由于二次感染在老年和虛弱的病人中死亡率增大。疫苗由于抗原漂變而不斷的過時，因而免疫在預(yù)防感染中只有約70％的效率。由官方管理部門確認(rèn)的治療流感的藥物只有金剛烷胺和金剛乙胺，它們在抗乙型流感上無效，并且已知有嚴(yán)重的副作用。
許多病毒性和細(xì)菌型感染會產(chǎn)生與流感類似的癥候。對呼吸道病毒的快速鑒定可使得醫(yī)生在疾病早期就能采用最為適當(dāng)?shù)闹委?。例如，早期而?zhǔn)確的診斷可以確定抗菌治療方法和對兒童和老人的住院治療。
對臨床材料中的病毒鑒定的實驗室試驗已經(jīng)廣為應(yīng)用，并已有各種不同的檢測方法。Marcel Dekker 1992年在教科書“病毒感染的實驗室診斷”中概括討論了對許多種病毒所使用的檢測方法，其中也包括流感病毒。
許多測試可以診斷甲型和乙型流感病毒。鑒定流感病毒的傳統(tǒng)方法有利用細(xì)胞培養(yǎng)，它具有高靈敏度和特異性。但不幸地是，細(xì)胞培養(yǎng)，分離和鑒定流感病毒所需要的時間要2至10天，因而在指導(dǎo)醫(yī)生做出準(zhǔn)確治療上沒有實際意義。因為流感病毒感染通常是自我限制的，所以診斷必須快速才能使治療有效。
另外，對于細(xì)胞培養(yǎng)法檢測流感，最近已有一些特異針對甲型流感的快速直接測試。單克隆免疫熒光測驗(IFA)已有報道(Spada,B.等，病毒學(xué)方法，1991 33 305)，并且至少已有一種快速酶免疫測驗(EIA)(Ryan-Poirier,K.A.等，臨床微生物學(xué)雜志，1992 30 1072)。一些對這些快速檢測甲型流感的方法的比較已有報道；例如見Leonardi,G.P.等，(臨床微生物學(xué)雜志，1994 32 70)建議與培養(yǎng)分離一起進行直接樣本測試，從而可以鑒定病毒及時確定治療和控制感染的方法，并監(jiān)測社會中流行的流感病毒株的抗原結(jié)構(gòu)。
IFA方法據(jù)報道費工費力并且要求相當(dāng)?shù)募夹g(shù)技能，得出的結(jié)果常常難以解釋。另一方面，EIA(Directigen FLU-A；Becton Dickinson微生物系統(tǒng))方法會給出大量的假陽性結(jié)果，且該測試被建議只用于實驗中，作為直接免疫熒光測試(Waner,J.L.等，臨床微生物雜志，1991 29 479)的補充或替代。
現(xiàn)有的快速流感檢測除了上述的問題之外，這些方法還存在其他的基本缺陷。首先，已有的檢測中沒有一種能夠檢測乙型流感。其次，如果一個快速免疫檢測方法基于使用一種甲型流感蛋白的抗體，那么在對該抗原蛋白結(jié)構(gòu)經(jīng)過漂變后的新型病毒株檢測時將會產(chǎn)生嚴(yán)重的問題。甲型流感病毒正是聞名于它嗜好這種的變化。
其他類型的流感病毒的快速檢測在一系列專利說明書中已有描述(例如參見Liav,A等，PCT專利申請?zhí)?2/12256)。該方法涉及流感神經(jīng)氨酸酶的產(chǎn)色底物的應(yīng)用。就是說，該檢測基于觀察一種顏色，此顏色是在流感神經(jīng)氨酸酶切斷一個特異的唾液酸-染料的綴合分子時形成的。該技術(shù)看來只能提供有限的特異性，因為它不能夠方便的區(qū)分病毒的神經(jīng)氨酸酶和該酶的其他形式，尤其是細(xì)菌的神經(jīng)氨酸酶。該方法也由于病毒神經(jīng)氨酸酶相對慢的活性而只具有較低的靈敏度。
甲型和乙型流感具有兩種主要的表面糖蛋白，紅細(xì)胞凝聚素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，它們都是感染所必需的。據(jù)信，HA對病毒附著細(xì)胞是必需的，而NA對于病毒從細(xì)胞表面釋放是必需的。在每個病毒顆粒的表面典型地?fù)碛屑s600個HA三聚體和大約50個拷貝的NA四聚體。因此HA和NA在尋找抗流感病毒藥物中都是引人注意的潛在的目標(biāo)，然而至今作用于任何這些位點的抗流感藥物也沒有在臨床上應(yīng)用。
流感病毒的血細(xì)胞凝聚素結(jié)合細(xì)胞表面受體上的含有唾液酸的糖蛋白和糖脂，從而起始病毒附著細(xì)胞和后續(xù)的感染過程。病毒顆粒附著細(xì)胞膜的結(jié)合強度可能基于多個拷貝的流感HA與細(xì)胞表面多個唾液酸基團的相互作用。
利用此多價相互作用的概念，一些研究人員曾報道了含有兩個或多個唾液酸衍生物的大分子的合成，將其作為血細(xì)胞凝聚素抑制劑。雖然發(fā)現(xiàn)了一些HA的強抑制劑，但是沒有一種多價大分子在體內(nèi)表現(xiàn)出能夠防止流感的感染。Whitesides和其合作者在最近的文章中(美國化學(xué)協(xié)會雜志，1996 118 3789-3800；醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，1995 384179-4190)總結(jié)了這些利用設(shè)計流感血細(xì)胞凝聚素抑制劑的方法所獲得的不同效果。
有幾種已知的NA的抑制劑，其中大部分是神經(jīng)氨酸的相近類似物，該酶的天然底物，如2-脫氧-2,3-雙脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)(Meindl等，病毒學(xué)，1974 58 457-63)。國際專利申請?zhí)朩O91/16320描述了幾種DANA的類似物，在體內(nèi)和體外都很有活性，能夠抗甲型和乙型流感的神經(jīng)氨酸酶。其中的一種化合物(化合物Ⅰ，標(biāo)作GG167或4-胍基-Neu5Ac2en)用于臨床實驗，并顯示出對流感治療的希望。(Hayden,F.G.等，美國醫(yī)學(xué)協(xié)會雜志，1996 275 295)?；衔?Ⅰ)GG167
最近，在Luo等的5,453,533號美國專利和Gilead Sciences,Inc的5,512,596號美國專利描述了具有神經(jīng)氨酸酶抑制劑活性的芳香類化合物，在Gilead Sciences,Inc的WO96/26933號國際專利申請中及C.Kim等在美國化學(xué)學(xué)會雜志1997 119 681中描述了化合物(Ⅰ)的類似物，特別是在側(cè)鏈的第六個碳連著乙醚的化合物。
雖然幾個研究小組曾試圖找到更簡單的或更有效的化合物(Ⅰ)的類似物，但是時至今日的報道(如，Bamford M.J.，化學(xué)學(xué)會雜志Perkin Trans.I,1995,1181)表明化合物(Ⅰ)的任何改變，尤其在甘油側(cè)鏈上的改變，都可能降低結(jié)合神經(jīng)氨酸酶的特性。此外，與HA的情形相反，不存在神經(jīng)氨酸酶的已知的大分子或聚合物抑制劑。含有唾液酸的聚合物在Bovin等的5,571,836號美國專利中有所描述，但是這些化合物是設(shè)計用作抗原或的用作紅細(xì)胞凝聚素結(jié)合物的合成聚唾液酸糖苷(polysialosides)。
發(fā)明概述在首先的一個方面，本發(fā)明提供了大分子化合物，其附著有一個或多個結(jié)合流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性位點的分子；這些分子在此記作“神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物”。優(yōu)選地，神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物通過一個間隔基或連接基團與該分子相連，從而神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物在空間上不受大分子骨架的阻礙。此神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物可以是任何可結(jié)合流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性位點的因子，條件是不被該酶所切割。該結(jié)合并不要求是不可逆的，但結(jié)合基團必須具有高結(jié)合親和力，優(yōu)選地為1O-6M或更小的IC50。
本發(fā)明還特別涉及一類新的化合物，以及它們作為治療和檢測甲型和乙型流感的藥物或作為診斷試劑的應(yīng)用。尤為特別的是，本發(fā)明涉及的大分子附著有神經(jīng)氨酸(唾液酸)衍生物，它可以結(jié)合甲型和乙型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶，并且它還可以任選地具有其他的功能，從而可使該化合物與一個表面相結(jié)合，或者用作一種可檢測標(biāo)記。
意外地，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)化合物(Ⅰ)通過唾液酸結(jié)構(gòu)的第7位官能化時，它可以附著到大的合成或天然聚合物上而抑制甲型和乙型流感的神經(jīng)氨酸酶的復(fù)合物，這就可以防止或抑制流感的感染。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)許多這種化合物(Ⅰ)或類似的化合物在第7位通過一個適當(dāng)?shù)拈g隔基連接不同的大分子時，每個唾液酸基團的平均結(jié)合率沒有明顯降低，并非摧毀化合物(Ⅰ)的流感神經(jīng)氨酸酶結(jié)合特性。因此通過結(jié)合神經(jīng)氨酸酶，該大分子緊密地結(jié)合病毒，而且可能因為復(fù)合物的大小和空間效應(yīng)，流感病毒毒粒的感染性被降低了。此種大分子化合物能夠選擇性地結(jié)合兩種流感病毒，而且能同時結(jié)合于一個表面或一個可檢測的連接基團，因而該化合物還可以用于甲型和乙型流感病毒的檢測。
本發(fā)明的大分子化合物的生物活性和本發(fā)明的診斷方法都是基于利用該大分子的配基(該配基可特異結(jié)合流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性位點)或者該化合物的官能化衍生物作為結(jié)合和/或檢測試劑而用于臨床樣本中流感病毒的鑒定。術(shù)語“神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物”在下文中是指這些化合物和它們的官能化衍生物。本發(fā)明的方法和化合物在不論是否存在有與流感病毒神經(jīng)氨酸酶非特異結(jié)合的化合物時都可以運用。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了式(Ⅱ)的化合物(X-Y)n-M-(Z)m(Ⅱ)其中，X是結(jié)合神經(jīng)氨酸酶的2,3-脫氫唾液酸衍生物(2)，它通過一個間隔基團Y在第7位與一個大分子M相連，Z是大分子上一個任選的另外的取代基。
結(jié)合神經(jīng)氨酸酶的部分X是一個如式(2)所示的唾液酸衍生物
其中間隔基團Y與W基團相連，且其中R代表疊氮基基團，非取代的或取代的胍基基團，或者非取代的或取代的氨基基團；R2代表COCH3,COCF3,SO2CH3或SO2CF3；W代表O(C=O)NH,O(C=S)NH,NH(C=O)NH，或NH(C=S)NH，并且它通過NH與基團Y相連m為一個在0至1000之間的整數(shù)，以及n為一個在0至1000之間的整數(shù)。
間隔基團Y為一個由選自碳，氮，氧和硫原子組成的最大可達1000個原子的任意取代鏈。
大分子M是一個分子量在104至107之間的合成或天然的聚合物，蛋白，抗體或酶。
Y基團通常與大分子M共價結(jié)合，但也可以通過非共價附著結(jié)合，例如當(dāng)M為抗生物素蛋白而Y具有一個末端生物素基團時。
第二個和任選的取代基Z可以是一個結(jié)合血細(xì)胞凝聚素的基團，如一個2-連接的唾液酸衍生物，或者一個可作用為可檢測標(biāo)記的基團，如生物素或熒光分子，或者可以是結(jié)合抗體的半抗原。該任選的取代基Z也可以是一種酶如辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)，它們可用作流感的檢測。另外基團Z也可以是一個帶有能適于將大分子結(jié)合于一個表面的末端官能性的基團，如NH2,SH,CO2H,CHO，或CH=CH2。
本發(fā)明的另一個實施方案中提供了如式(ⅡA)所示的神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物(X′-Y)n-M-(Z)m(ⅡA)其中X′為一個結(jié)合神經(jīng)氨酸酶的如式(2a)的環(huán)己烯衍生物，
它通過乙醚側(cè)臂連接，R,R2,Y,n和m如前面對式(2)的定義，且R1和W′是親脂性的C1-C12烷基或亞烷基基團，它們?nèi)芜x地被一個或多個鹵素原子或烷氧基，鹵化烷氧基或任意取代的芳香基基團所取代。
合適的間隔基團Y包括，但不限于，氨烷基基團，(聚)氨基酸，線性肽，寡糖和多糖，聚乙二醇單位，和氨基-二烷基脲，它們的每一種可以單獨使用也可以聯(lián)合使用。典型的間隔基團Y具有一個末端氨基基團，從而可形成酰胺或者席夫堿與大分子M相連接。
胍基或氨基基團R的合適的取代基包括甲基，乙基，烯丙基，氨基，氰基或硝基。
合適的大分子M包括蛋白，酶，抗體，水溶性合成聚合物如聚丙烯酸和聚丙烯酰胺，多糖和多聚氨基酸。尤其合適于診斷應(yīng)用的大分子包括牛血清白蛋白(BSA)，辣根過氧化物酶(HRP)，抗生物素蛋白和相關(guān)的蛋白如鏈霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白(neutravidin)，和免疫球蛋白。
特別適合應(yīng)用于流感治療的本發(fā)明的化合物的大分子包括多聚糖，合成聚合物如聚丙烯酰胺，聚乙二醇，多元酸，聚脲，聚酯，聚酰胺和各種共聚物如N-(2-羥基-丙基)甲基丙烯酰胺(HMPA)，它已知可安全地施用于人體。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可知道其他的藥物學(xué)上適用的聚合物。
一組優(yōu)選的本發(fā)明的化合物含有化合物(Ⅱ)，其中X是式(2)的一個GG167衍生物，其中R為胍基，R2為乙?；?，W為基團O(=CO)NH而間隔基Y是一個由6至60個碳，氮和氧原子組成的鏈。
式(Ⅱ)的大分子是甲型和乙型流感神經(jīng)氨酸酶的抑制劑并具有抗流感活性。因此本發(fā)明的地第二個方面就是提供了一種治療甲型或乙型流感的藥物組合物，它含有本發(fā)明的化合物，優(yōu)選地是式(Ⅱ)或者式(ⅡA)的化合物，或是其藥物學(xué)可接受的衍生物，以及藥學(xué)可接受的載體。
第三個方面，提供了一種哺乳動物包括人的流感感染的治療方法，所含的步驟包括對需治療的動物施用有效劑量的本發(fā)明的化合物，優(yōu)選地是式(Ⅱ)或者式(ⅡA)的化合物，或是其藥物學(xué)可接受的衍生物。
在第四個方面，還提供了本發(fā)明的化合物，優(yōu)選地是式(Ⅱ)或者式(ⅡA)的化合物在制備治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的化合物還可以聯(lián)合其他的治療劑使用，例如其他抗感染劑，尤其是其他抗病毒劑。因此本發(fā)明進一步提供了一種藥物組合物，它包括本發(fā)明的化合物，優(yōu)選地是式(Ⅱ)或式(ⅡA)的化合物或其藥物學(xué)可接受的鹽或其衍生物，以及一或多種治療學(xué)上的活性試劑，尤其是抗病毒劑，以及藥物學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明還在另一方面提供了一種檢測流感病毒的方法，其步驟包括將懷疑感染所測病毒的樣品與本發(fā)明的化合物相混合，該化合物能夠特異結(jié)合流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性位點。
本發(fā)明的方法可應(yīng)用于所有類型的甲型流感和乙型流感。
為檢測流感，可通過共價健或者非特異結(jié)合將本發(fā)明的化合物(Ⅱ)附著于一個表面。間隔基團Y應(yīng)當(dāng)足夠長，以使神經(jīng)氨酸酶結(jié)合單位X暴露于大分子M的表面而對病毒顆粒起作用。
對于流感的檢測，本發(fā)明的方法可利用化合物(Ⅱ)進行選擇性捕獲而濃縮病毒，進而通過方便的常規(guī)方法檢測病毒，檢測方法本身不需有選擇性。例如，結(jié)合物(Ⅱ)可以連接于一種支持材料上，如膜或聚合物，這樣當(dāng)樣品通過支持物時，病毒顆粒將會被選擇性地捕獲和濃縮。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案在于，Z基團的末端具有可與一個表面相結(jié)合的官能性。各種合適的這類官能性為本領(lǐng)域所熟知。
另外，可使用一種選擇性檢測方法；樣品中的病毒顆?？梢员焕绶翘禺惖夭东@，然后與含有可檢測標(biāo)記Z的一個大分子神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物(Ⅱ)相接觸，在適當(dāng)?shù)臈l件下該結(jié)合物選擇性地附著于病毒表面上的流感神經(jīng)氨酸酶。然后利用任何方便的方法檢測此可檢測標(biāo)記。對于一些檢測系統(tǒng)，可以很方便地將樣品集中于一個特定區(qū)域，例如在一個表面上的一個點或一條線上。這可以用各種方法達到，如，可將樣品懸浮或非選擇性地捕獲到一個濾膜或其他的支持材料上，然后與上述的標(biāo)記的結(jié)合物相接觸。
在另一個方面，本發(fā)明可聯(lián)合使用選擇性捕獲和選擇性檢測，從而提供一種簡單靈敏的兩步法來檢測流感病毒。其根據(jù)是流感病毒在其球形表面上典型地分布有約一百個神經(jīng)氨酸酶分子(White,D.O.,現(xiàn)代微生物免疫學(xué)觀點，1974 63 1-48)，并因而可同時附著于一個以上的結(jié)合物。
因此，神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物化合物(Ⅱ)可以附著于一個支持物上，例如在多孔膜長度方向上的一個狹窄條帶上。然后將測試的樣品置于該膜的的另一端，并使其流過結(jié)合的化合物條帶。試樣中存在的流感病毒顆粒將被該膜結(jié)合的化合物(Ⅱ)捕獲并因此留在該窄帶上。在測試的第二步中，使附著于另一個神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物(Ⅱ)的可檢測標(biāo)記在該膜上流過結(jié)合了流感病毒顆粒的條帶。然后通過膜上結(jié)合化合物的位置上所觀察到的變化表示出流感病毒的存在。值得考慮的是，本發(fā)明的方法和化合物很適合與5418135號美國專利中Miller等描述的Biostar光學(xué)免疫試驗(OAI)平臺一起應(yīng)用。
大量的合適的檢測系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知，例如，生物素-鏈霉抗生物素蛋白，酶系統(tǒng)如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，熒光系統(tǒng)，化學(xué)熒光系統(tǒng)，膠體金，放射性標(biāo)記和凝集系統(tǒng)。值得考慮的是本發(fā)明的化合物(Ⅱ)包被的膠體金將是一個尤為方便的檢測標(biāo)記。類似地，利用大分子M是辣根過氧化物酶的本發(fā)明的化合物，有望形成一個理想的簡易流感檢測。熟練人員通過常規(guī)的反復(fù)實驗，可方便地選擇合適的檢測系統(tǒng)并優(yōu)化檢測條件。
式(Ⅱ)所示的本發(fā)明的化合物及其藥學(xué)適用的鹽和衍生物，可以通過包括下面所述的各種方法制備。下面所概括的制備方法構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明的詳細(xì)描述現(xiàn)通過參照下面這些非限制性的實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)的描述。
本發(fā)明的化合物的實例包括那些如式(3)所表示的化合物，其中M是一個蛋白，如表1中所列。
表1
<p>本發(fā)明化合物的實例更進一步包括那些如式(4)所表示的化合物，其中M是抗生物素蛋白，它非共價地結(jié)合于基團X-Y，還具有共價連接的配基Z，如表2所列。
表2
M是合成聚合物的本發(fā)明的化合物更進一步的實例包括那些如式(5)所表示的化合物，如表3所示，其中在唾液酸基團(2)上的取代是R2=Ac,R=胍基，W是OCONH。
表3
<p>M是葡聚糖骨架(分子量500,000)的本發(fā)明的化合物更進一步的實例包括那些如式(6)所代表的，如表4中所示的化合物，其中神經(jīng)氨酸酶結(jié)合基團(2)上的取代是R2=Ac,R=胍基，W是OCONH。式(6)中整數(shù)n,m和p給出被特定基團取代的葡萄糖單位在葡聚糖骨架中的百分?jǐn)?shù)，即當(dāng)n,m和p加起來不足100時，其余的葡聚糖骨架由非取代的葡萄糖單位所組成。還應(yīng)當(dāng)記住，對于結(jié)合于葡聚糖骨架每個單位上的不同的配基，有三個可能的附著點。
表4
本發(fā)明化合物更進一步的實例包括這樣的化合物，即其大分子M是一個葡聚糖或者聚丙烯酸骨架，并且其中唾液酸基團(2)上的取代為R2=Ac,R=胍基W=OCONH，其中額外的取代基Z可以是例如苯甲基基團，生物素分子或者含有熒光素的基團。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將能夠理解本文所指的治療延及到預(yù)防以及對已確定的感染或癥狀的治療。治療優(yōu)選地在感染之前或感染同時進行，并持續(xù)到病毒不再存在于呼吸道中為止。本發(fā)明的化合物合適的劑量通常在0.1至100mg/Kg/天范圍中，優(yōu)選地在0.2至20mg/Kg/天范圍中。
合適的治療每天進行1-4次并持續(xù)到感染后3-7天。所需要的劑量可以一次單一劑量或以適當(dāng)?shù)拈g隔分開的劑量施用。
作為治療應(yīng)用，雖然本發(fā)明的化合物可能以粗化學(xué)試劑給藥，但是通常優(yōu)選地是作為一種藥物配制品而提供活性成分。因此本發(fā)明提供了一種藥物配制品，它含有式(Ⅱ)的化合物或其藥物學(xué)可接受的鹽或衍生物，以及一個或多種藥物學(xué)可接受的載體以及任選的其他的治療和/或預(yù)防藥劑。藥物學(xué)配制品包括那些用于口腔，鼻腔或局部施用的產(chǎn)品或以適于吸入或噴入呼吸道的形式存在。該配制品可以在合適時方便地以不連續(xù)的劑量單位提供，并可以通過任何制藥領(lǐng)域所熟知的方法制備。
本發(fā)明的化合物通?？梢匀芤夯驊乙夯蚋煞鄣男问绞┯?。按照本發(fā)明的方法施用于呼吸道時，神經(jīng)氨酸酶抑制劑可通過呼吸道用藥所使用的任何方法和配制品施用。
溶液和懸液通常是水相的，例如單獨用水制備或者用水和一種生理學(xué)可接受的共溶劑(例如乙醇，丙二醇，聚乙二醇如PEG400)制備。此溶液或懸液可另外加有其他賦型劑例如防腐劑(如潔爾滅)，增溶劑/表面活性劑如聚山梨酸酯(如Tween80)，緩沖劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑(如氯化鈉)，吸收增強劑和粘度增強劑。懸液可另外加有懸浮劑(例如微晶纖維素，羧甲基纖維素鈉)。
溶液或懸液可通過方便的設(shè)施用于鼻腔，例如利用滴管，吸管或噴霧器。該配制品可以單一劑量或多個劑量的形式提供。噴霧可以通過例如使用計量微化噴霧泵進行。呼吸道施用也可以利用氣霧劑配制品，其中化合物與一種適當(dāng)?shù)耐七M劑如氯化碳氟(CFC)或者其他適當(dāng)?shù)臍怏w一起提供在一個壓力包裝內(nèi)。
另外，該化合物也可以干粉形式提供，例如化合物處于合適的基質(zhì)如乳糖，淀粉，淀粉衍生物和聚乙烯吡咯烷酮中的混合粉劑。因而粉劑可在鼻腔中形成凝膠。在用于呼吸道施用的配制品包括鼻內(nèi)配制品中，該化合物通常具有較小的顆粒尺寸，例如5微米或更小的尺寸。這樣大小的顆粒尺寸可通過本領(lǐng)域所熟知的方法獲得。
本發(fā)明的化合物通過幾個步驟制備，第一步通常是合成式X-Y所示結(jié)合神經(jīng)氨酸酶的唾液酸衍生物，這里的X和Y如上所定義。
在第7位具有適當(dāng)?shù)墓倌苄缘耐僖核嵫苌?2)的合成方法在9516276.4號英國專利申請和PCT/AU97/00190號國際專利申請中有描述。
合適的唾液酸衍生物X-Y的實例列在表5中，其中基團R2,R和W如上所述為基元X上的取代基。
表5
<p>本發(fā)明的化合物制備的第二步涉及神經(jīng)氨酸酶結(jié)合單位X-Y附著于大分子M上。對于單位X-Y與蛋白類型的大分子M的共價連接，通常通過所熟知的標(biāo)準(zhǔn)的交叉偶聯(lián)方法(如，S.S.Wong，“蛋白質(zhì)綴合與交聯(lián)的化學(xué)”CRC Press,1991；G.T.Hermanson，“生物綴合技術(shù)”Academic Press,1996)進行綴合。
對于合成聚合物，單位X-Y可以加到一個預(yù)制的帶有適當(dāng)?shù)幕钚匀〈木酆衔锕羌苌?。例如，如果基團Y具有一個末端氨基官能性，則它可與一個聚丙烯酸骨架上的活化的酯取代基反應(yīng)?；蛘?，帶有合適的可聚合取代基如末端烯烴的單位X-Y可以聚合或優(yōu)選地與另一個烯烴共聚，形成大分子骨架。例如見R.Roy，糖科學(xué)與糖技術(shù)趨勢，1996,8,79-99；N.V.Bovin和H.J.Gabius，化學(xué)協(xié)會評論，1995 413。
實施例1 GG167-牛血清白蛋白-生物素綴合物(3a)的制備(a)5-乙酰胺基-7-(6′-(6″-氨己酰)氨己基)-氨甲酰氧基-4-胍基-2,3,4,5-四脫氧-D-丙三基-D-半乳糖-非-2-烯酰吡喃糖酸(2b)(7-(6-氨己酰)氨基-己基氨甲酰氧基-GG167)的制備將6-(叔丁氧碳酰氨基)己酸(34mg,147μmol)溶于丙酮(2.5ml)，水(100μl),N-甲基嗎啉(4μl,36μmol)和三乙胺(21μl,147μmol))的混合物中。溶液于-12℃預(yù)冷，然后加入氯甲酸異丁酯(21μl,161μmol)。攪拌溶液12分鐘。
將甲基-5-乙酰氨基-7-(6′-氨己基)-氨甲酰氧基-4-胍基-8,9-單碳酰二氧基-2,3,4,5-四脫氧-D-丙三基-D-半乳糖-非-2-烯酰吡喃糖酸-三氟乙酸酯溶于含有三乙胺(40μl,287μmol)的水/丙酮(1∶1,2ml)中。此基本溶液于0℃預(yù)冷并作為單獨的一部分加入到前面的反應(yīng)混合物中。將該混合物保溫至室溫并攪拌4小時。
減壓除去溶劑。粗產(chǎn)物溶于甲醇/水(1∶1,4ml)，然后加入三乙胺(1ml)。在氬氣下將溶液攪拌過夜。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去溶劑，殘留物用甲醇溶解并吸附于硅膠(1.5g)上。在硅膠(10g)上進行層析，用乙酸乙酯/異丙醇/水(100/75/25)洗脫，得到產(chǎn)物(53mg,77μmol,84％)。
1H n.m.r.(CD3OD,200MHz)δ5.67(d,J2.6Hz,1H)；5.03(m,1H)；4.62(m,1H)；4.49(m,1H)；4.23(m,1H)；4.12(m,1H)；3.77(m,1H)；3.62(m,1H)；3.12(m,6H)；2.22(t,J8Hz,2H)；2.0(5,3H)；1.5(m,23H).
將t-Boc保護的蔗糖溶于乙酸乙酯/甲苯中并蒸發(fā)干燥。將該物質(zhì)溶于三氟乙酸(3ml)并在氬氣下室溫攪拌1小時。減壓除去溶劑，殘留的三氟乙酸先與二氯甲烷然后與3份的水/甲醇共蒸發(fā)而除去。然后將樣品溶于水，過濾并冷凍干燥而得到tris TFA鹽的產(chǎn)物(141mg,152μmol)。
質(zhì)譜(FAB):588(M+1)1H n.m.r.(CD3OD,300MHz)δ5.92(d,J2.6Hz,1H)；5.01(m,1H)；4.60(dd,J10,3Hz,1H)；4.44(dd,9,3Hz,1H)；4.23(m,1H)；4.05(m,1H)；3.67(dd,13,4Hz,1H)；3.52(dd,13,7Hz,1H)；3.16(m,5H)；2.96(t,8Hz,2H)；2.25(t,8Hz,2H)；2.00(s,3H)；1.7-1.3(m,14H).
(b)GG167衍生物(2b)和牛血清白蛋白-(6-氨己酰生物素)綴合物的制備蛋白偶聯(lián)緩沖液0.1N NaHCO3/0.2M NaCl透析緩沖液20mM KH2PO4/0.15M NaCl,pH6.5將BSA-(己酰生物素)8(3mg,43nmol,Pierce)溶于偶聯(lián)緩沖液(7.5ml)中并輕輕攪拌30分鐘。
將雙-(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)辛二酸酯(12mg,21μmol,Pierce)溶于偶聯(lián)緩沖液(1ml)中并直接加入到在偶聯(lián)緩沖液(1.5ml)中的實施例1(a)的化合物(2b)(19.5mg,21μmol)的基本溶液中。攪拌7.5分鐘進行反應(yīng)。將BSA-生物素溶液逐滴地加入到衍生化的GG167溶液中，混合物置于室溫攪拌1.5小時。冷凍干燥溶液，重新溶于3.0ml水中并對透析緩沖液(3×1.5L，纖維素管，12000MW截留)透析。
將混合物冷凍干燥，再溶于2.5ml水中并在PD-10柱(Pharmacia)上脫鹽，然后冷凍干燥得到產(chǎn)物(3a)(2.5mg)。
根據(jù)胍基基團的比色試驗(Sakaguchi反應(yīng)，見加拿大化學(xué)雜志，1958 36 1541)來測定蔗糖的摻入(每個蛋白分子30個GG167單位)。
實施例2牛血清γ球蛋白-(6-氨己酰生物素)18-(GG167-7-氨甲酸酯-1,6-二氨己烷-6-氨己酰胺-辛二酰胺)60(3b)的制備將牛血清γ球蛋白(3mg,20nmol,Sigma)溶于偶聯(lián)緩沖液(1ml)中并攪拌30分鐘。
將處于偶聯(lián)緩沖液中的N-羥基硫代琥珀酰亞氨基-N-生物素酰-6-氨己酸酯(1.8mM,280μl,0.5μmol)加入到上述蛋白溶液中，室溫下攪拌1小時進行反應(yīng)。
然后用偶聯(lián)緩沖液將反應(yīng)混合物稀釋至7.5ml并與雙(N-羥基硫代琥珀酰亞氨基)-辛二酸酯和實施例1(a)的GG167-7-氨甲酸酯-1,6-二氨己烷-6-氨己酰胺在與實施例1(b)中相同的條件下反應(yīng)。
冷凍干燥的γ球蛋白綴合物(3b)的產(chǎn)量為2.5mg。
實施例3化合物2c與辣根過氧化物酶(HRP)的綴合物3f的制備化合物2c與HRP的偶聯(lián)依照熟知的過氧化物氧化方法進行(參見G.T.Hermanson，“生物綴合技術(shù)”Academic Press,1996 472)，從而產(chǎn)生化合物3f。
將HRP(IV-A型，Sigma Aldrich P-6782,5mg,114nmol)溶于乙酸鈉/氯化鈉緩沖液(5mM/150mM,pH4.5,500μl)。在其中加入新鮮制備的過氧化鈉溶液(88mM，在乙酸鈉/氯化鈉緩沖液中，50μl,4.4nmol)，室溫下置于黑暗處反應(yīng)20分鐘。將混合物在用乙酸鈉緩沖液(5mM,pH4.5)預(yù)平衡的PD-10柱(Pharmacia Biotech,SephadexG25)上層析，洗脫產(chǎn)物凍干。
在4℃將氧化的HRP溶于含有化合物2c(3.9mg,3.75μmol)的碳酸鈉緩沖液(0.2M,pH9.5,1ml)中，置于4℃下反應(yīng)過夜。加入氰氫硼化鈉溶液(5M，在1N NaOH中，10μl,50μmol)并于4℃下反應(yīng)過夜。加入乙醇胺溶液(1M,pH9.5,50μl,50μmol)置于室溫下反應(yīng)30分鐘。然后在用蒸餾水預(yù)平衡的PD-10柱上層析，洗脫物凍干從而得到暗褐色粉末狀的HRP-化合物2c的綴合物。
實施例4蛋白-GG167綴合物3c,3d和3g-3j的制備利用雙(N-羥基硫代琥珀酰亞氨基)-辛二酸酯，按照類似實施例1中(b)部分所述的方法，將適當(dāng)?shù)牡鞍着c化合物2c或2g偶聯(lián)，制備化合物3c,3d和3g-3j。
實施例5抗生物素蛋白與GG167-生物素綴合物間的生物素?；瘡?fù)合物(4d)的制備(a)5-乙酰氨基-7-(6′-(6″-(6_-生物素酰氨己酰)-三氨己酰)氨己基)-氨甲酰氧基-4-胍基-2,3,4,5,-四脫氧-D-丙三基-D-半乳糖-非-2-烯酰吡喃糖酸(2e)的制備通過利用Boc-保護的四(6-氨己酸)按照類似實施例1中所述的方法進行。
(b)在室溫下將抗生物素蛋白(3mg,0.0445μmol)溶于化合物(2e)(0.5mg,0.434μmol)的水溶液(500μl)中2小時。再向得到的溶液中加入硫代-N-羥基琥珀酰亞氨基-己酰氨基-生物素(Pierce#21335)(1000μg,1.798μmol)和碳酸氫鈉水溶液(1000μg,11.9μmol)(240μl)。整個混合物置于室溫下45分鐘，然后置于透析帶中(截留分子量12,000)，依次對50mM NaHCO3溶液(4×250ml)和水(8×250ml)透析，每次浸泡時間45分鐘。最后在室溫下對500ml水透析過夜。用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)透析后得到的溶液至pH6.5-7.0，然后凍干得到白色固體狀題述復(fù)合物(4c)(3mg,89％)。該復(fù)合物含有通過四個抗生物素蛋白結(jié)合位點結(jié)合的四個GG167-生物素分子，且抗生物素蛋白骨架被大約八至十個共價結(jié)合的生物素配基取代。此復(fù)合物的圖示如

圖1，其中A代表抗生物素蛋白，B代表生物素而S代表GG167蔗糖分子。
實施例6被不同的GG167-配基取代的聚丙烯酰胺(5a)-(5e)的制備(a)聚(N-(丙烯酰氧基)琥珀酰亞胺)(pNAS)按照Ferruti等(聚合物，1972,13,462頁)所述從N-(丙烯酰氧基)琥珀酰亞胺制備得到。pNAS的1H n.m.r.光譜和紅外光譜與以前文獻中所報道的相一致。這批pNAS的樣品通過在室溫下用濃氨水處理幾個小時而將其轉(zhuǎn)化成聚丙烯酰胺，通過粘度測量法發(fā)現(xiàn)透析過的聚丙烯酰胺的分子量大約為50,000。
(b)按照下面對化合物(5c)所描述的一般方法，從這批pNAS制備摻入不同的GG167衍生物的聚丙烯酰胺(5a)-(5e)。
將溶于二甲基甲酰胺(DMF,0.5ml)中的pNAS(10mg,59μmol的NAS)溶液加入到化合物(2f)(3.8mg,6.2μmol)在DFA(0.5ml)中的溶液中，于室溫下攪拌。加入三乙胺(10μl,70μmol)，澄清液在室溫下攪拌過夜，然后于65℃加熱5小時，再次于室溫下攪拌過夜。將稀氨水(6ml 3％的溶液)加入到反應(yīng)混合物中，并將澄清的溶液在室溫下放置24小時。反應(yīng)混合物經(jīng)減壓蒸發(fā)干燥，將殘留物重溶于水(3ml)，置于透析帶中(截留MW12,000)對水(500ml,pH6)透析24小時。凍干溶液得到白色固體狀的含有GG167的聚丙烯酰胺(5c)(5mg)。1H nmr光譜顯示出下列顯著的信號(D2O)δ5.7,4.4-4.6,4.1,3.3-3.7,3.0,2.0-2.5,1.9,1.1-1.8。通過對唾液酸質(zhì)子積分(δ5.7-3.2)與聚合物和間隔鏈積分(δ1.0-3.2，減去1.9的N-乙酰峰)的比較，估計出GG167單位的摻入水平大約為10％。
實施例7同時含有GG167配基和生物素配基的聚丙烯酰胺51的制備將pNAS(170mg,1mmol的NAS)(MW50000左右)在DMF(3ml)中的溶液在室溫下攪拌，加入化合物2a(TFA鹽，30mg,50μmol)和N-6-氨己基-生物素酰胺(7mg,20μmol)在DMF(2ml)的溶液中。加入三乙胺(50μl)并將反應(yīng)混合物在20℃下攪拌24小時。在反應(yīng)混合物中加入稀氨水(20ml,5％)并繼續(xù)攪拌24小時。反應(yīng)混合物經(jīng)蒸發(fā)干燥，將殘留物重溶于10ml水，置于透析帶中(截留MW12,000)對水(1×4L)透析2天。通過Sakaguchi胍基顏色測驗在透析帶內(nèi)保留的液體中得出陽性結(jié)果，而在透析帶外的水的濃縮樣品中沒有陽性反應(yīng)。將透析帶內(nèi)的液體凍干得到霜狀蓬松固體51(71mg)。通過NMR積分估計出聚合物中的配基水平，它與起始的胺幾乎完全摻入相一致。
實施例8含有GG167的聚丙烯酰胺5i,5k,5m和5n的制備化合物5i,5k,5m和5n的制備按照實施例7中所述的類似程序，分別將帶有適當(dāng)?shù)腉G167衍生物(2a或2c)的pNAS與芐胺，N-6-氨己基-熒光素或者氨基乙硫醇反應(yīng)。在化合物5i和5k(也包括化合物5h和5j)的制備中使用了較高分子量(＞200Kd)的pNAS。
實施例9帶有多個GG167(7-羥基氨甲酰己氨基-羰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en)(3.5mole％)和N-芐基氨甲基氧基(16.8mole％)取代基的葡聚糖(MW500kD)的制備
在葡聚糖(MW500,000)(100mg,0.617mmol(基于MW162的單元))的DMSO(5ml)溶液中加入p-硝基苯基氯甲酸酯(510mg,2.53mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(309mg,2.53mmol)。混合物在氮氣下攪拌，先于室溫下1小時，再于35-40℃下3小時。得到的溶液與芐胺(12.5,0.11mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(40mg,0.327mmol)在嘧啶中的溶液(5ml)合并。反應(yīng)混合物于室溫中在液氮下攪拌16小時。然后真空蒸發(fā)干燥。殘留物于50℃在2％的碳酸鉀溶液(25ml)攪拌3小時，得到澄清的溶液，然后用3M HCl調(diào)節(jié)至pH7。得到的溶液于室溫下對水透析3天，凍干得到經(jīng)1H-nmr(D2O)檢測含有16.8mole％羥基氨甲酰亞甲苯的白色固體狀芐基化葡聚糖(95mg,83.4％)。
在芐基化葡聚糖(5mg,0.027mmol)的DMSO(0.25ml)溶液中加入p-硝基苯基氯甲酸酯(12.8mg,0.063mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(7.8mg,0.063mmol)。溶液在氬氣下于室溫攪拌1小時，再在35-40℃攪拌3小時。然后與化合物2a(0.5mg,0.00105mmol)在嘧啶(0.25ml)和DMSO(2.5ml)混合物中的溶液混合。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16小時，然后真空蒸發(fā)干燥。殘留物在1％的碳酸鉀溶液(5ml)中強烈攪拌4.5小時，得到澄清的溶液，然后用3M HCl調(diào)節(jié)至pH7.5，于室溫下對水透析24小時，最后凍干得到白色固體狀題述聚合物(4.4mg,82％)。1H-nmr(D2O)表明聚合物在載體上每100個葡萄糖單位中含有16.8個芐胺分子和3.5個化合物2a分子。估測的聚合物分子量為623Kda，一個單位的7-氨基己基氨基羰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en的平均分子量為5770。
實施例10葡聚糖/500kD上多價GG167(7-羥基乙酰氨基己基氨基羰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en)(3mole％)，N-芐基乙酰氨基-2-氧基(17mole％)和2-羥乙酸酯(20％)的制備
在冰浴的葡聚糖(MW500,000)(50mg,0.308mmol(基本單位MW162))的水(0.3ml)溶液中加入氫氧化鉀(138mg,2.46mmol)的水(0.1ml)溶液?；旌衔镌?-5℃攪拌20分鐘，然后加入氯乙酸(102mg,1.07mmol)。得到的混合物于70-80℃攪拌20分鐘，然后再在室溫攪拌2小時。反應(yīng)混合物用甲醇(25ml)稀釋，過濾收集白色沉淀并用新鮮的甲醇(25ml)洗滌，干燥。整個過程重復(fù)一次得到白色的固體，經(jīng)滴定測得含有40mole％的羥乙酸鉀(52mg,84％)。
在乙酸聚合物(10mg,0.05％mmol)的水(0.4ml)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)鹽酸碳化二亞胺(16mg,0.08mmol)和硫代-N-羥基琥珀酰亞胺(17.4mg,0.08mmol)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0分鐘，然后與芐胺(12.8mg,0.118mmol)在甲醇(0.2ml)中的溶液混合。得到的混合物在室溫下攪拌3小時，再真空濃縮干燥。殘留物在含有NaHCO3(50mg)的水(10ml)中50℃攪拌至澄清，對水透析3天，凍干后得到白色固體產(chǎn)物(9mg,86％),1H-nmr表明含有17mole％的羥乙酰氨基亞甲苯。
在該聚合物(5mg,0.0239mmol)的水(0.2ml)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)鹽酸碳化二亞胺(8mg,0.04mmol)和硫代-N-羥基琥珀酰亞胺(8.7mg,0.04mmol)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0分鐘，然后與化合物2a(1mg,0.0021mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(3mg,0.024mmol)在嘧啶(0.1ml)中的溶液混合。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時，再蒸發(fā)干燥。殘留物在1％NaHCO3溶液(5ml)中攪拌至澄清，對水透析24小時，凍干溶液后得到白色固體狀的題述聚合物(4.5g,84％)。
酸滴定和1H-nmr(D2O)表明聚合物中載體上每100個葡萄糖單位含有17mole％的芐胺，3mole％的GG167(7-氨基己基氨基羰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en)和20mole％的乙酸酯。聚合物的分子量估計為683KDa，一個聚合的7-氨基己基氨基羰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en的平均MW為7420。
實施例11氧化型葡聚糖/500kDa上聚合的多價-7-{6′-{6″-[6_-(6_′-(6_″-氨己酰)-氨己酰-)氨己酰-]氨己酰-}-氨己基}-氨甲酰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en(14mole％)的制備在冰浴的葡聚糖(MW500,000)(20mg,0.123mmol(基本單位MW162))的水(0.4ml)溶液中滴加高碘酸鈉(15.6mg,0.073mmol)的水(0.4ml)溶液。反應(yīng)混合物在5℃攪拌2小時，再在室溫下攪拌2小時。得到的混合物用水(1.2ml)稀釋并在Sephadex G-25(10ml)柱上層析，用水(3ml)洗脫柱子。洗脫液凍干得到白色固體狀的部分氧化的葡聚糖(18mg,90％)。
在上述氧化的葡聚糖(3mg,0.018mmol)的水(0.6ml)溶液中加入碳酸氫鈉(15mg,0.178mmol)和化合物2c.TFA鹽(6mg,0.0057mmol)。整個混合物在室溫下攪拌1小時，再在冰浴下攪拌。在這一冷的混合物中加入部分氰氫硼化鈉(100mg,1.59mmol)。反應(yīng)混合物冰浴攪拌1小時，在5℃放置16小時，然后用更多的氰氫硼化鈉(100mg,1.59mmol)處理，在5℃攪拌1小時，再在室溫攪拌2小時，最后對水透析24小時并冷凍干燥，得到白色固體的題述聚合物(3mg)。
1H-nmr(D2O)表明每個部分氧化的葡聚糖分子中含有430個分子的7-{6′-{6″-[6_-(6_′-(6_″-氨己酰)-氨己酰-)氨己酰-]氨己酰-}-氨己基-氨甲酰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en(化合物2c)。因而聚合物的分子量估計為860KDa，每個單位的4-胍基-Neu5Ac2en的平均MW為2000。
實施例12聚賴氨酸/70-150KDa上的聚合-多價7-辛二酸氨酰-己基-氨甲酰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en(5mole％)的制備將7-氨己基-氨甲酰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en(化合物2a,6.4mg,0.0135mmol)和二琥珀酰亞氨基辛二酸酯(5mg,0.0135mmol)的嘧啶(0.1ml)和DMF(0.1ml)的混合溶液在30℃下攪拌3小時，然后真空蒸發(fā)干燥。殘留物用乙醚(10ml×3)溶解干燥得到活化的酯。再與聚賴氨酸HBr鹽(MW70,000-150,000)(10mg,0.0485mmol)在水(0.4ml),DMSO(0.25ml),DMF(0.6ml)，和嘧啶(0.4ml)的混合物的溶液合并。所得的混合液再室溫下攪拌10小時，再對水透析72小時。然后用水(10ml)稀釋，加熱至50℃，然后過濾。過濾液冷凍干燥得到白色固體狀題述聚合物(5mg)。
1H-nmr(D2O)表明聚合物載體上每100個賴氨酸單位中含有5個分子的7-辛二酸氨酰-己基氨甲酰氧基4-胍基-Neu5Ac2en。因而一個聚合的4-胍基-Neu5Ac2en的平均MW為5140。
實施例13聚谷氨酸/50-100KDa上的聚合-多價7-{2′-[2″-(2_-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙基}-氨甲酰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en(3.2mole％)的制備在聚谷氨酸鈉鹽(MW50,000-100,000)(10mg,0.0657mmol)的水(0.6ml)溶液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(9.6mg,O.050mmol)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(10.9mg,O.050mmol)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?5分鐘，然后與7-{2′-[2″-(2_-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙基}-氨甲酰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en.TFA鹽(化合物2d,4.1mg,0.0081mmol)在水(0.1ml)和嘧啶(0.1ml)中的溶液混合。所得混合物在室溫下攪拌2小時，再對水透析3天，最后凍干得到白色固體狀題述聚合物(9.5mg)。
1H-nmr(D2O)表明聚合物中載體上每100個谷氨酸單位含有3.2個分子的7-{2′-[2″-(2_-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙基}-氨甲酰氧基-4-胍基-Neu5Ac2en。每個聚合的4-胍基-Neu5Ac2en的平均MW為5250。
實施例14與化合物2c和辣根過氧化物酶綴合的N-羥乙基聚丙烯酰胺的制備將化合物(2c)的TFA鹽(6mg,0.0057mmol)加入到pNAS(見實施例6的b部分)(20mg,0.118mmol的NAS)的DMF(1ml)溶液中。將三乙胺(20μl)加入到此澄清的溶液中，在室溫下攪拌3天。將上述的反應(yīng)混合物的一半加入到辣根過氧化物酶(17mg)的水(4ml)溶液中，混合物在4℃放置幾天。將乙醇胺(0.5ml 10％的水溶液)加入到混合物中抑制剩余的聚丙烯酸活化的酯。2小時后混合物對水透析3天，然后將透析后的液體凍干得到蓬松的暗褐色粉狀的聚合綴合物。
實施例15本發(fā)明的化合物與流感病毒神經(jīng)氨酸酶結(jié)合的測定兩種甲型流感病毒和一種乙型流感病毒用于測試本發(fā)明化合物結(jié)合病毒流感神經(jīng)氨酸酶的能力。甲型流感病毒的重排株是A/NWS/34-tern/Australia/G70C/75(H1N9)或A/NWS/Tokyo/3/67/H1N2，乙型流感病毒株是B/Victoria/02/87。神經(jīng)氨酸酶試驗按照文獻(Potier,M.，等，分析生物化學(xué)，1979 94 287)中的程序進行。測出的抑制常數(shù)(IC50)總結(jié)于表6中。
這些大分子的抑制常數(shù)的計算是基于每個附著的GG167衍生物單位的分子量所進行的，如具有與10％的丙烯酰胺單位結(jié)合的GG167衍生的分子的聚丙烯酰胺5c的分子量定為1293。表6本發(fā)明的化合物對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合常數(shù)
實施例16利用化合物4d在ELISA板上檢測流感病毒將大約1×108pfu/ml的甲型流感病毒NWS/G70C的磷酸緩沖鹽(PBS)病毒溶液(50μl)直接加入到96孔ELISA平板(Dyatech)的孔中，于4℃放置過夜以使病毒結(jié)合。洗滌后將平板以標(biāo)準(zhǔn)的程序用PBS-Tween20封閉，然后將化合物4d的連續(xù)稀釋液加入ELISA平板上各行的孔中，GG167單位的濃度從1μM開始降至10-10M。作為對照，將連續(xù)稀釋的生物素?；膯慰寺】?神經(jīng)氨酸酶NC10抗體(L.C.Gruen，免疫學(xué)方法雜志，1994 168 91)加入到ELISA平板的另一行中。溫育1小時后洗滌平板除去未結(jié)合的化合物，然后用鏈霉抗生物素蛋白-HRPO(Boehringer-Mannheim)檢測病毒，以ABTS(Sigma)作為顯色底物溫育大約30分鐘。
約10-9M的化合物4d的濃度就可檢測到病毒，并且隨著化合物濃度的增加，可觀察到增強的信號。因此大約每孔中5×106的病毒顆粒就能夠被化合物4d檢測到。生物素?；目贵w給出了相類似的信號水平。
實施例17流感病毒和化合物3a的復(fù)合物的捕獲和檢測為了用GG167-生物素衍生物包被病毒顆粒，將10μl的NWS/G70C甲型流感病毒(1×108pfu/ml)與不同濃度的化合物3a一起在ELISA平板上間隔行的孔中預(yù)溫育1小時。使用半對數(shù)稀釋的化合物3a,GG167單位的濃度從1μM開始降至0.00001M。然后將病毒-化合物的復(fù)合物轉(zhuǎn)移至一塊已經(jīng)預(yù)先包被好抗生物素蛋白的ELISA平板上，溫育1小時捕獲。平板用PBS-Tween20洗滌，捕獲的病毒用針對病毒血細(xì)胞凝聚素的多克隆兔抗體按照標(biāo)準(zhǔn)的程序進行檢測。
0.1μM濃度的化合物3a得出了最佳的結(jié)果，它能夠檢測出106pfu的病毒。化合物濃度越高，信號越弱，這可能是由于一些抗生物素蛋白的位點被游離的化合物3a封閉了，而在低濃度下(＜0.001μM)，檢測信號也弱，這可能是因為沒有足夠的化合物來完全結(jié)合所有的病毒顆粒。
實施例18利用鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶直接檢測流感病毒-GG167-蛋白-生物素綴合物按照實施例17中所述的類似程序，利用化合物4d，用鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶替代抗-血細(xì)胞凝聚素抗體，直接地檢測結(jié)合的病毒。
實施例19利用本發(fā)明的大分子抑制流感的血細(xì)胞凝聚作用按照文獻中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如參見美國化學(xué)協(xié)會雜志，1997119 4103及其中所引用的文獻)，檢測了本發(fā)明的化合物對流感病毒株X-31(H3N2),G70C和Tokyo A的血細(xì)胞凝聚作用(HAI)的抑制能力。在12個微滴定平板的孔中，用2倍連續(xù)稀釋的聚合的GG167綴合物的PBS溶液進行HAI試驗。將病毒PBS懸液稀釋至4HA單位，加入到孔中。4℃下2小時后，每孔中加入0.5％雞紅細(xì)胞懸液。4℃下1小時后，測定阻止雞紅細(xì)胞凝聚的最低抑制物濃度。結(jié)果總結(jié)于表7中。
表7
實施例20利用本發(fā)明的大分子抑制流感病毒的復(fù)制按照文獻中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如參見Watanabe等，病毒學(xué)方法雜志，1994,48,257)，檢測了本發(fā)明的化合物對甲型流感病毒復(fù)制的抑制能力。試驗利用MDCK細(xì)胞進行，結(jié)果列于表8中。結(jié)果以50％的抑制細(xì)胞毒素效應(yīng)(ID50(μg/ml))時化合物的最低濃度來表示，是利用回歸分析程序?qū)Π雽?shù)曲線擬合計算得出的。結(jié)果表明在抗病毒活性上所有附著有GG167衍生物的大分子都強于未被其取代的骨架分子。結(jié)果還顯示多數(shù)聚合的化合物比其單體配基(化合物2c)更具活性，尤其是在根據(jù)GG167單位的摩爾濃度進行計算時。每一個化合物的治療指數(shù)是以最小細(xì)胞毒藥物濃度(MTC)除以ID50而計算出的。
表8
顯然對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，本發(fā)明以一些細(xì)節(jié)加以描述，是出于闡明和理解的目的。在本文所公開的發(fā)明概念的范圍內(nèi)，對所描述的實施方案和方法可以做出修改和變化。
本文引用的文獻列于下頁中，供參考。
權(quán)利要求
1．一種大分子化合物，所說的化合物附著有一個或多個可結(jié)合流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性位點而不被神經(jīng)氨酸酶所切割的分子(神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物)。
2．如權(quán)利要求1所述的大分子化合物，其中神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物通過一個間隔基或連接基團附著于該分子，從而神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物在空間上不被該大分子的骨架所阻礙。
3．如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的大分子化合物，其中神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物具有的10-6M或更低的IC50。
4．如權(quán)利要求1至3任一項所述的大分子化合物，其中神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物為一種唾液酸衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的大分子化合物，其中唾液酸化合物是唾液酸結(jié)構(gòu)的第7位被官能化的化合物(Ⅰ)化合物(Ⅰ)GG167
6．式(Ⅱ)所示的如權(quán)利要求1至5任一項所述的大分子化合物，(X-Y)n-M-(Z)m(Ⅱ)其中，X是結(jié)合神經(jīng)氨酸酶的2,3-脫氫唾液酸衍生物(2)
它通過一個間隔基團Y在第7位與大分子M相連，Z是該大分子上一個任選的另外的取代基，其中間隔基團Y與W基團相連，且其中R代表疊氮基基團，非取代的或取代的胍基基團，或者非取代的或取代的氨基基團；R2代表COCH3,COCF3,SO2CH3或SO2CF3；W代表O(C=O)NH,O(C=S)NH,NH(C=O)NH或NH(C=S)NH，并且它通過NH附著于基團Y；m為一個在0至1000之間的整數(shù)；以及n為一個在0至1000之間的整數(shù)，間隔基團Y為一個由選自碳，氮，氧和硫的原子組成的最大可達1000個原子的任意取代鏈；以及大分子M是一個分子量在104至107之間的合成或天然的聚合物，蛋白，抗體或酶，其與間隔基團Y共價地或非共價地連接。
7．式(ⅡA)所示的如權(quán)利要求1至3任一項所述的大分子化合物，(X′-Y)n-M-(Z)m(ⅡA)其中X′為一個結(jié)合神經(jīng)氨酸酶的如式(2a)所示的環(huán)己烯衍生物，
它通過乙醚側(cè)臂連接，R,R2,Y,n和m如權(quán)利要求6中的定義，R1和W′是親脂性的C1-C12烷基或亞烷基基團，它們?nèi)芜x地被一個或多個鹵素原子或烷氧基，鹵化烷氧基或任意取代的芳香基基團所取代。
8．如權(quán)利要求6或7所述的大分子化合物，其中的Z是一個結(jié)合血細(xì)胞凝聚素的基團。
9．如權(quán)利要求6或7所述的大分子化合物，其中的Z是一個用作可檢測標(biāo)記的基團。
10．如權(quán)利要求6或7所述的大分子化合物，其中的Z是生物素或熒光分子。
11．如權(quán)利要求6或7所述的大分子化合物，其中的Z是一種檢測試驗中適用的酶。
12．如權(quán)利要求6或7所述的大分子化合物，其中的Z是一個帶有可適合于將該大分子結(jié)合于一個表面的末端官能性的基團。
13．如權(quán)利要求12所述的大分子化合物，其中的Z是NH2,SH,CO2H,CHO，或CH=CH2。
14．如權(quán)利要求6至13任一項所述的大分子化合物，其中的間隔基團Y選自氨烷基基團，(聚)氨基酸，線性肽，寡糖和多糖，聚乙二醇單位，氨基二烷基脲，其中每一種可以單獨使用也可以聯(lián)合使用。
15．如權(quán)利要求14所述的大分子化合物，其中的Y是末端氨基基團。
16．如權(quán)利要求6至15任一項所述的大分子化合物，其中的大分子M選自蛋白，酶，抗體，水溶性合成聚合物，多糖，聚氨基酸。
17．如權(quán)利要求6至15任一項所述的大分子化合物，其中的大分子M選自牛血清白蛋白(BSA)，辣根過氧化物酶(HRP)，抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，和免疫球蛋白。
18．如權(quán)利要求6至15任一項所述的大分子化合物，其中的大分子M選自多糖，聚丙烯酰胺，聚乙二醇，聚脲，多元酸，聚酯，聚酰胺和N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺(HMPA)，所述的大分子是藥物學(xué)可接受的。
19．如權(quán)利要求6至18任一項所述的大分子化合物，其中的R是被甲基，乙基，烯丙基，氨基，氰基或硝基取代的胍基或氨基基團。
20．如權(quán)利要求6所述的大分子化合物，其中的X一個式(2)所示的化合物，其中R為胍基，R2為乙酰基，W為基團O(=CO)NH而間隔物Y是一個由6至60個碳，氮和氧原子組成的鏈。
21．一種流感病毒的檢測方法，其步驟包括將懷疑感染所說病毒的樣品與權(quán)利要求1至20任一項所述的能夠特異結(jié)合流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性位點的化合物相混合。
22．如權(quán)利要求21所述的方法，其中的化合物通過共價結(jié)合或者非特異結(jié)合附著于一個表面，且其中的間隔基團Y的長度足以使神經(jīng)氨酸酶結(jié)合單位X暴露于大分子M的表面而對病毒顆粒起作用。
23．如權(quán)利要求21或22所述的方法，其是一種選擇性捕獲試驗，選擇性檢測試驗，或者選擇性捕獲-選擇性檢測聯(lián)合試驗。
24．一種治療甲型或乙型流感的藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物及藥學(xué)可接受的載體，優(yōu)選地是如權(quán)利要求1至7,13,14和18至20中任一項所述的化合物，或其藥物學(xué)可接受的衍生物，其中該化合物具有對神經(jīng)氨酸酶小于5μg/ml的ID50。
25．如權(quán)利要求24所述的組合物，其中該化合物是如權(quán)利要求6或7所述的化合物。
26．如權(quán)利要求24或25所述的組合物，其進一步含有一種或多種其它的藥學(xué)活性劑。
27．如權(quán)利要求24或25所述的組合物，其中其它的藥學(xué)活性劑是一種抗病毒劑。
28．一種治療哺乳動物包括人的流感病毒感染的方法，其包括對需要此種治療的動物施用有效量的本發(fā)明的化合物的步驟，該化合物優(yōu)選地是如權(quán)利要求1至7,13,14和18至20中任一項所述的化合物，或其藥物學(xué)可接受的衍生物，其中該化合物具有對神經(jīng)氨酸酶小于5μg/ml的ID50。
29．如權(quán)利要求1至7,13,14和18至20中任一項所述的化合物在制備治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用，其中該化合物具有對神經(jīng)氨酸酶小于5μg/ml的ID50。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的大分子，它們的制備方法，其藥物學(xué)配制品及其作為抗流感藥劑的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種新的用于檢測所有類型的甲型和乙型流感病毒的診斷方法。本發(fā)明的大分子化合物上連接有一個或多個分子(神經(jīng)氨酸酶結(jié)合物)，它們與流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性位點結(jié)合但不被神經(jīng)氨酸酶所切斷。
文檔編號A61P31/16GK1238783SQ97199728
公開日1999年12月15日 申請日期1997年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月14日
發(fā)明者菲利浦·A·瑞斯, 凱斯·杰奧弗里·沃森, 吳文揚, 蓓蒂·金, 蓋伊·Y·克里普納 申請人:百奧塔科學(xué)管理有限公司