專利名稱：治療肺炎鏈球菌感染的方法
本申請根據(jù)35U.S.C.§5119(e)，請求了1996,10,18提交的美國臨時專利申請60/028812的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
乳鏈菌肽是一種細菌素，由食物級的生物體產(chǎn)生的抗微生物物質(zhì)，它是類似于抗生素(或本文是lanthnocins)組中的一員，該組中還包括枯草菌素、表皮素、gallidermin、pep5、肉桂霉素、耐久霉素和血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽。
乳鏈菌肽由乳球菌屬lactis亞種(Lactococcus lactis)所產(chǎn)生，lactis屬于蘭斯菲爾德血清學分類的組N[Mattick,A.T.R．和A.Hirsch,1947柳葉刀2,5]。乳鏈菌肽是由34個氨基酸殘基構(gòu)成的肽，它含五環(huán)結(jié)構(gòu)，被硫醚橋鍵所交聯(lián)，形成了羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸。半胱氨酸硫氫基與由絲氨酸或蘇氨酸形成的脫氫側(cè)鏈縮合得到了這些硫醚，是對乳鏈菌肽前體肽進行翻譯后修飾的結(jié)果。
據(jù)報道，乳鏈菌肽作為陽離子表面活性劑，其活性被陰離子洗滌劑所中和[Ramseier,H.R.1960 Arch.Mikrobiol,37,57]，乳鏈菌肽在分子水平作用于細胞質(zhì)膜，并抑制肽聚糖的生物合成[Reisinger等，1980 Arch.Microbiol.127,187]。乳鏈菌肽對植物性細菌的作用最可能是肽插入脂質(zhì)體雙層后，質(zhì)膜依賴電壓的去極化結(jié)果，可能是鄰近的乳鏈菌肽分子相互作用形成了臨時的孔或通道。最近對乳鏈菌肽的分子性質(zhì)和它的生物合成機理進行了廣泛的綜述[Jung,G．和H.-G.Sahl 1991乳鏈菌肽和新穎的抗生素，ESCOM科學出版社，Leiden]。
乳鏈菌肽被認為具有窄譜活性，通常僅對特定的革蘭氏陽性菌有作用，但與螯合劑結(jié)合時，乳鏈菌肽對革蘭氏陰性菌具有出乎意料的活性，對革蘭氏陽性菌有增強的活性(美國專利5,135,910；5,217,950；和5,260,271，授予Blackburn等)。乳鏈菌肽已被用作抗微生物食品防腐劑，其安全性被JEFCA和系統(tǒng)地管理食品添加劑使用的各個國家機構(gòu)，包括美國、英國和歐共體所接受。
發(fā)明綜述本發(fā)明涉及由對抗生素或?qū)Χ喾N藥物有耐藥性的細菌病原體感染的疾病的預防治和治療方法。本發(fā)明方法適用于對抗生素有耐藥性的鏈球菌屬的細菌株。具體的是，本發(fā)明涉及用極低的、無毒濃度的乳鏈菌肽對抗生素或?qū)Χ喾N藥物有耐藥性的菌種，肺炎鏈球菌，一般稱為“肺球菌”的防治方法。
在本發(fā)明范圍里被治療的，由肺炎鏈球菌導致的細菌感染包括肺球菌腦膜炎、菌血癥、肺炎、中耳炎等。該方法用乳鏈菌肽和其它含羊毛硫氨酸細菌素(lanthocins)，及其由基因工程或半合成化學產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變體。
本發(fā)明詳述細菌感染，特別是醫(yī)院里獲得的細菌感染更難以治療，部分是由于對目前使用的抗生素有耐藥性的臨床分離物的選擇。另外，耐β-內(nèi)酰胺-抗生素和耐多種藥物的肺炎鏈球菌的菌株是集中表現(xiàn)問題的細菌菌株。肺炎鏈球菌(以前也稱為肺炎雙球菌，也通常稱為“肺炎球菌”)是一種革蘭氏陽性菌，它是美國和世界范圍里疾病和死亡的主要原因。在美國，肺炎鏈球菌每年引起了約3,000例腦膜炎，50,000例菌血癥，500,000例肺炎和7,000,000例中耳炎(疾病控制和防治中心，MMWR1996；45(RR-1):1-2)。
雖然臨床上定義為“肺炎”的疾病會由各種生物體引起，主要由肺炎鏈球菌引起(特別是在社區(qū)里健康的個體)。肺炎鏈球菌也是引起兒童中耳炎(急性和慢性)的主要原因，特別是自從全世界兒童對流感嗜血桿菌免疫后，至少在發(fā)展中國家里它是該年齡組中腦膜炎的主要原因(疾病控制和防治中心，同上，J.O.Klein,APUA newsletter 14(2):1-4,1996)。
鑒于對年長者推薦對肺炎鏈球菌免疫，但仍未充分使用。目前可得的疫苗不能有效地在兩歲以下兒童引起反應。(疾病控制和防治中心，同上)。
傳統(tǒng)上，肺炎球菌疾病用青霉素或紅霉素進行治療，但頭孢菌素和新的大環(huán)內(nèi)酯物的用處增多。但是，耐青霉素和耐多個藥物的菌株在美國出現(xiàn)并在一些地區(qū)傳播(疾病控制中心，同上，和J.O.Klein，同上)。此外，高度產(chǎn)生毒素的組A鏈球菌株難以治療{Anonymous 1994 Morbidity Mortality Weekly Report43:401)難以治療，通常導致病人快速死亡。很清楚需要新穎的抗微生物劑來抵抗這些感染，所述的抗微生物劑對多重耐藥性細菌有活性，或更為有效或作用更迅速。
如美國共同待批申請08/667,650所揭示，以前已顯示乳鏈菌肽為體外抗革蘭氏陽性菌的致病菌株，包括對多種藥物有耐藥性的肺炎球菌的潛在的殺菌劑。雖然，乳鏈菌肽原則上可被用于這樣的場合需要抗微生物劑，在初級動物模型研究中，生物素是有效的[Mattick,A.T.R．和A.Hirsch,1947柳葉刀(Lancet)2,5；Bavin,E.M．等，1952柳葉刀1:127；Gowans,J.L．等1952 Brit.J.Pharmacol.7:438；Hirsch,A．和A.T.R.Mattick 1949柳葉刀ⅱ:190]，據(jù)發(fā)現(xiàn)，乳鏈菌肽不足以用來開發(fā)成人體治療的藥物或獸藥。但是，本發(fā)明基于我們的發(fā)現(xiàn)乳鏈菌肽對動物的肺炎球菌感染在出乎意料低的劑量下有強大的活性，并出乎意料地發(fā)現(xiàn)，乳鏈菌肽在皮下給藥時對這類感染有杰出的活性。
現(xiàn)有技術(shù)也知道，在小鼠感染模型研究中肺炎球菌的某些菌株是致命的。事實上，與其它細菌種類的致命菌株，如金黃色葡萄球菌相比，需要接種極低量的這些肺炎鏈球菌的菌株以在小鼠中產(chǎn)生致命的感染。另外，通常觀察到小鼠需要高劑量的抗微生物劑以治療或防治由肺炎鏈球菌引起的感染，這在抗微生物劑的體外活性基礎上是可預見到的。特別是，實驗顯示在小白鼠中以抗微生物劑治療急性肺炎鏈球菌感染所需的劑量較治療急性金黃色葡萄球菌為高，即使抗微生物劑在體外對肺炎鏈球菌的活性明顯比對金黃色葡萄球菌為大。例如，在最近關于糖肽抗生素的出版物中，小鼠中50％有效劑量(毫克/kg總劑量)與體外最小抑制濃度(MIC)(微克/毫升)的比，對于金黃色葡萄菌變化范圍從0.4到2，對于肺炎鏈球菌變化范圍為3.6至25(Glodstein等，Antimicrob.Agents Chemother.39:1580-1588,1995)。
我們實驗顯示在急性小鼠感染模型中，乳鏈菌肽對肺炎鏈球菌的高致命菌株的活性出乎意料地比對金黃色葡萄球菌的活性高。
然而在現(xiàn)有技術(shù)里也已報道當靜注(i.v.)或腹腔內(nèi)給藥(i.p.)時，乳鏈菌肽在動物體，人對抗金黃色葡萄球菌感染和生膿鏈球菌感染有效，當皮下(s.c.)給藥時，乳鏈菌肽沒有效果或效果不佳。(Hirsch等，柳葉刀ⅱ:190-193,1949和Bavin等，柳葉刀ⅰ:127-129,1952)。根據(jù)作者的意見，皮下給藥時，幾乎沒有或沒有乳鏈菌肽被吸收進入血液，大量藥物留在兔子的注射處(Bavin等，同上)。在肌注(i.m.)后觀察到一些乳鏈菌肽的吸收，但沒有該途徑給藥有效的數(shù)據(jù)(Bavin等，同上)。通過腹腔內(nèi)途徑給藥，據(jù)報道乳鏈菌肽作為抗微生物劑的活性可與青霉素一樣(Bavin等，同上)。
我們的實驗顯示，乳鏈菌肽當皮下給藥時在小鼠的肺炎球菌感染模型中顯示了出乎意料和令人驚奇的高活性。此外，我們觀察到，當靜注給藥時，乳鏈菌肽比青霉素或萬古霉素的活性更高。我們已進一步顯示，在小鼠模型中當乳鏈菌肽類似物經(jīng)靜脈內(nèi)給藥時是有活性的。
這些發(fā)現(xiàn)顯示，不僅乳鏈菌肽，而且該類lanthocin抗微生物肽的其它相關的物質(zhì)，包括由基因工程或半合成化學產(chǎn)生的這些分子產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變體，它們可用于預防或治療人體和動物由肺炎球菌引起的感染。當非靜注途徑給予乳鏈菌肽是有效的事實使社區(qū)獲得性感染的治療變得能實施。
這些肽的有效藥物制劑包括水溶液，它適合活性劑經(jīng)靜脈內(nèi)(i.v.)、肌注(i.m.)、皮下(s.c.)、鼻內(nèi)、鞘內(nèi)或腹腔內(nèi)(i.p.)給予途徑進行非胃腸道給藥，結(jié)果讓血液和組織濃度超過活性劑的最小抑制濃度(MIC)，這樣能有效地減少細菌滴度以預防、治療或減輕感染。此外，可以預計lanthocin抗微生物劑能與另外的抗微生物劑同時或依次共同給藥，以更有效地提供廣譜的抗菌治療，特別是用于在開始治療前缺乏特異性診斷的情況下。
這些發(fā)現(xiàn)顯示，不僅乳鏈菌肽，而且其它該類lanthocin抗微生物肽相關的組成，包括枯草菌素；epidermin；gallidermin；肽5；肉桂霉素；耐久霉素和血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制酶及其由基因工程或半合成化學產(chǎn)生的這些分子的結(jié)構(gòu)變體應當可用于防治或治療人體和動物體由耐抗生素的細菌引起的感染。
實施例1細菌株。在體外和感染實驗里使用肺炎鏈球菌Felton和金黃色葡萄球菌Smith。
最小抑制濃度(MIC)。如前所述(國家委員會的臨床實驗室標準，1990，許可標準M7-A2，對需氧生長的細菌進行稀釋抗微生物敏感性試驗的方法，第2版，國家委員會的臨床實驗室標準，美國賓夕法尼亞)，用肉湯微稀釋方法測定MIC。對肺炎鏈球菌使用陽離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯，培養(yǎng)基用5％胎牛血清供給。在稀釋液里使用牛血清白蛋白(0.02％)；最終濃度為0.01％)以防止乳鏈菌肽粘附在塑料的微滴定器壁上。
在各種實驗里，金黃色葡萄球菌Smith的乳鏈菌肽的MIC在1-2微克/毫升之間改變，而肺炎鏈球菌Felton的MIC在0.06-0.25微克/毫升之間改變。
鼠腹腔內(nèi)感染的模型。金黃色葡萄球菌在小牛肉浸液肉湯里生長，用稀釋于含5％(w/v)Difco細菌學上的粘液素的肉湯中的106菌落形成單位(CFU)進行腹腔內(nèi)感染每個鼠。肺炎鏈球菌Felton菌株在Difco腦心浸液肉湯(BHI)里生長，每個鼠被用BHI稀釋的103CFU腹腔內(nèi)感染。小鼠被劃分成5個一組。對一組的5個鼠不作任何處理，作為對照組。其它組的鼠接受不同劑量的乳鏈菌肽。靜注(通過尾靜脈在0.1毫升5％葡萄糖里進行注射)或皮下注射(在0.2毫升5％葡萄糖里)進行給藥。對每個小鼠進行兩次注射，第一次在感染后10分鐘里，第二次在5小時后。對小鼠觀察5天，以記錄死亡或不良癥狀。靜注在0.1毫升5％注射用葡萄糖里的不同劑量的萬古霉素或青霉素。
實施例2乳鏈菌肽對感染了金黃色葡萄球菌小鼠的作用。
如上述實施例1所述進行這些實驗。結(jié)果如下表1所示。
表1靜注乳鏈菌肽對小鼠里的金黃色葡萄球菌敗血病的作用
在感染后10分鐘里對小鼠進行靜脈注射；在一些情況下，在感染后5小時注射第二次。注射給予抗感染劑在0.1毫升5％右旋糖/小鼠/治療。
如表1所示，以10毫克/kg/注射劑量靜脈給予乳鏈菌肽在預防小鼠死亡上100％有效。5mg/kg/注射劑量的效果稍差(83％)。
實施例3靜脈注射乳鏈菌肽對小鼠的肺炎鏈球菌感染的作用。
如上述實施例2所述進行實驗。結(jié)果如表2a、2b、2c和2d所示。
表2a靜注乳鏈菌肽對肺炎鏈球菌的作用<
p><p>*對小鼠進行靜注，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時。給予抗感染劑在0.1ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
表2b靜注青霉素對肺炎鏈球菌的作用
*對小鼠進行靜注，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時。給予抗感染劑在0.1ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
表2c靜注萬古霉素對肺炎鏈球菌的作用
*對小鼠進行靜注，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時。給予抗感染劑在0.1ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
如表2a所示，靜注給予乳鏈菌肽在最低試驗劑量下(1.25mg/kg/注射)能100％的有效地預防小鼠死亡。如表2b和2c所示，通常用于治療革蘭氏陽性菌感染的化合物，青霉素和萬古霉素在小鼠感染模型里的效果不如乳鏈菌肽有效?，F(xiàn)已報道，所用的肺炎鏈球菌菌株對兩種抗生素完全敏感青霉素和萬古霉素的MIC各自是0.016和0.5微克/毫升(Goldstein等，同上)。
由于表2a實驗里實驗的乳鏈菌肽的最低劑量可100％預防感染小鼠死亡，所以，用較低劑量再進行試驗。
表2d低劑量靜注乳鏈菌肽對肺炎鏈球菌的作用
*對小鼠進行靜注，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時。給予抗感染劑在0.1ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
從表2d可見，低達0.078mg/kg/劑量可100％預防小鼠感染。
實施例4含氨基酸取代基的變化的乳鏈菌肽分子對小鼠細菌感染的作用除了如前述實施例所述進行細菌感染和治療研究外，在治療方案里用變化的分子代替乳鏈菌肽外，這里試驗兩種變化的分子His27Lys，其中通常在成熟的乳鏈菌肽的27位上存在的組氨酸已被賴氨酸代替；His27Lys-His31Lys，其中在乳鏈菌肽在成熟肽的27位和31位上兩個組氨酸被賴氨酸所代替。這些氨基酸替代通過nisA基因里的編碼改變來導入，它編碼了肽的主要結(jié)構(gòu)(Kuipers等，1996,Antonie Van Leeuwenhoek 69:161-169；Rollema等，1995,Appl.Environ.Microbiol.61:2873-2878；Kuipers等，1992,J.Biol.Chem.267:24340-24346；U.S.專利5,516,682，授予Hansen)。
表3a變化的乳鏈菌肽，His27Lys對小鼠的金黃色葡萄球菌敗血病的作用
*對小鼠進行靜注，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時。給予抗感染劑在0.1ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
從表3a可見，在成熟肽的27位上含賴氨酸的乳鏈菌肽變體在5和10mg/kg/劑量下對金黃色鏈球菌感染各自有75和100％的保護作用。這很相似于用相同劑量乳鏈菌肽發(fā)生的情況。
表3b變化的乳鏈菌肽，His27Lys對小鼠的肺炎鏈球菌敗血病的作用
對小鼠進行靜注，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時。給予抗感染劑在0.1ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
如表3b所示，變化的分子His27Lys對小鼠里的肺炎鏈球菌感染極為有效。
表3c變化的乳鏈菌肽，His27Lys-His31Lys對小鼠的肺炎鏈球菌敗血病的作用
<p>*對小鼠進行靜注，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時。給予抗感染劑在0.1ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
如表3c所示，變化的分子His27Lys-His31Lys對小鼠里的肺炎鏈球菌感染極為有效。
實施例4顯示，在成熟的乳鏈菌肽的27位的組氨酸被賴氨酸代替，或肽的27和31位上的組氨酸都被賴氨酸代替的變化的肽分子對動物感染模式里的葡萄球菌和鏈球菌都有活性。
實施例5皮下注射乳鏈菌肽對小鼠中肺炎鏈球菌感染的作用如實施例2所述進行實驗。結(jié)果如表4a和4b所示。
表4a與萬古霉素相比，皮下注射乳鏈菌肽對肺炎鏈球菌的作用<
對小鼠進行皮下注射，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時(接種量約103)。給予抗感染劑在0.2ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
如表4a所示，以4mg/kg/注射皮下給予乳鏈菌肽時預防小鼠死亡的有效性達80％，更高劑量給予達到100％有效。與2-4mg/kg/注射的萬古霉素相比，僅60％有效。
也對皮下給予較低劑量的乳鏈菌肽進行試驗。
表4b低劑量皮下給予乳鏈菌肽對肺炎鏈球菌的作用
對小鼠進行皮下注射，一次在感染后10分鐘，一次在感染后5小時。給予抗感染劑在0.2ml的5％右旋糖/小鼠/處理。
如表4b所示，以低達2.5mg/kg/處理的劑量皮下給予乳鏈菌肽時預防感染動物死亡的有效性達100％,0.625mg/kg/處理的劑量保護83％的動物免于死亡。
權(quán)利要求
1．一種殺死耐抗生素或耐多種藥物的肺炎鏈球菌的病原性微生物菌株的方法，包括對需要這類治療的哺乳動物以超過其最小抑制濃度的量給予有效量的lanthocin抗微生物劑，或?qū)Ψ窝祖溓蚓灿行У乃念愃莆铩?br> 2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中l(wèi)anthocin抗微生物劑通過皮下注射給予。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中抗微生物劑給藥范圍約0.078mg/kg/劑量到約20mg/kg/劑量。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中抗微生物劑給藥范圍為約0.625mg/kg/劑量到約10mg/kg/劑量。
全文摘要
本發(fā)明涉及殺死導致人體和動物疾病的耐抗生素病原性細菌的方法。具體的是,該方法涉及殺死耐抗生素或耐多個藥物的肺炎鏈球菌菌株。該方法用諸如乳鏈菌肽或其變體的lanthocin作為殺細菌劑。
文檔編號A61P31/04GK1233186SQ97198849
公開日1999年10月27日 申請日期1997年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月18日
發(fā)明者B·P·戈爾茨坦 申請人:Ambi股份有限公司