專利名稱：：復(fù)合脂質(zhì)用作消化酶混合物藥劑中的穩(wěn)定化添加劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及復(fù)合脂質(zhì)作為消化酶混合物的水溶性藥劑中的穩(wěn)定性添加劑的用途，用于對(duì)抗由于濕氣的作用而引起的脂水解活性的降低。該消化酶混合物含有蛋白酶/脂酶混合物，特別是胰酶，該藥劑適于制備水溶液，它借助探針連續(xù)地注入到胃腸道內(nèi)。此外，本發(fā)明涉及含有脂酶和蛋白酶消化酶混合物，尤其是含有胰酶的消化酶混合物的水溶性藥劑。該藥劑可經(jīng)加入復(fù)合脂質(zhì)，以對(duì)抗由于濕氣而使脂水解活性下降，使藥劑變得穩(wěn)定化。該消化酶適于制備水溶液，它經(jīng)探針注入到哺乳動(dòng)物或人的胃腸道中。哺乳動(dòng)物、尤其是人由于慢性胰腺炎而引起的胰腺病變，胃手術(shù)后和肝或膽疾患引起的消化不良，會(huì)出現(xiàn)消化酶的缺乏。皆知，這種缺乏現(xiàn)象可用加入非體內(nèi)本身含有的胰酶的消化酶，例如胰酶、尤其是胰蛋白酶的混合物來治療，該胰蛋白酶可任選地含在脂酶添加物中。胰酶常規(guī)以固體劑型口服應(yīng)用?？诜r(shí)酶混合物發(fā)生不可逆地變性，是由于在胃中的胃酸和蛋白水解酶如胃蛋白酶的作用所致，因而需要用對(duì)胃液耐受的外殼包住酶混合物。這樣的包封可使酶混合物原封不動(dòng)地經(jīng)過胃而到達(dá)作用部位十二指腸，在十二指腸處，由于中性或弱堿性環(huán)境，使保護(hù)層破裂，酶釋放出來?？诜@樣的酶如同健康人體內(nèi)固有的胰酶那樣，可發(fā)揮酶促作用，尤其是淀粉酶、脂水解酶以及蛋白水解酶。在德國專利DOS42273854中例如敘述了用對(duì)胃液耐受的包蓋膜制成固態(tài)的胰酶微粒。對(duì)于消化功能不全、尤其是長時(shí)間處于消化功能不全的臥床患者，例如慢性胰腺病患者，希望在長時(shí)間內(nèi)服用液體劑型，例如經(jīng)探針連續(xù)用藥的方式，以代替固體劑型。含有胰酶的消化酶混合液的劑型迄今尚沒有供應(yīng)，系因這樣的酶混合液長時(shí)間放置是不穩(wěn)定的。尤其是在混合物中含有的脂酶由于混合物中含有的蛋白酶如胰蛋白酯或糜蛋白酶在水的存在下被水解而破壞，使脂酶活性迅速下降。因此，根據(jù)外界條件(溫度、pH值)，水性胰酶制劑在較短時(shí)間內(nèi)嚴(yán)重喪失了脂酶活性。為了適于經(jīng)探針連續(xù)向患者胃腸道給藥，含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物的、尤其是含胰酶制劑的消化酶混合物的水溶液在較長時(shí)間例如8小時(shí)內(nèi)應(yīng)是穩(wěn)定的。特別是在溶液中不能生成或含有會(huì)堵塞針頭的顆粒。對(duì)這樣的溶液的重要要求是，在消化酶中含有的全部酶要在用藥的過程中盡可能保持高的和不變的活性。此外，為了胃腸道內(nèi)連續(xù)用藥，必需用這樣適宜的溶液，它不得有細(xì)菌生長，例如在防止細(xì)菌生長的環(huán)境下保存，優(yōu)選用滅菌方法。因此，本發(fā)明的目的是，提供含有脂酶和蛋白酶的水溶性消化酶混合物的藥劑，它在潮濕的影響下是穩(wěn)定的，不會(huì)喪失脂質(zhì)水解的活性。這種藥劑在水性介質(zhì)中可溶，并長時(shí)間放置是穩(wěn)定的。本發(fā)明涉及復(fù)合脂質(zhì)作為穩(wěn)定化添加劑的應(yīng)用，用于在含有脂酶和蛋白酶的、特別是含胰酶的消化酶混合物的水溶性藥劑中對(duì)抗在潮濕影響下脂水解活性的降低，消化酶混合物適用于制成可借助探針連續(xù)灌入胃腸道中的水性藥劑。本發(fā)明還涉及穩(wěn)定化了的消化酶混合物的水溶性藥劑。本
發(fā)明內(nèi)容還有為制備適于探針連續(xù)給藥的消化酶混合物水溶液的藥盒。本發(fā)明適于作為穩(wěn)定化添加劑的復(fù)合脂質(zhì)一般不溶于丙酮。尤其是含磷的和無碳水化合物的磷脂以及含碳水化合物的且不含磷的糖脂，以及它們的混合物。磷脂或含有磷酸和糖脂的混合物有利地適用于此?？捎米靼幢景l(fā)明對(duì)含有脂酶和蛋白酶的、特別是胰酶制劑的消化酶混合物進(jìn)行穩(wěn)定化的添加劑的磷脂，尤其宜用具有藥用陽離子的、通式I的陰離子鹽式中R1為氫或具有10-25個(gè)碳原子的烷?；渫榛溈扇芜x含有1-4個(gè)雙鍵；R2為氫或具有10-25個(gè)碳原子的烷?；?，其烷基鏈可任選含有1-4個(gè)雙鍵；或當(dāng)R1不是氫時(shí)，R2也可是氫；R3是氫或低碳烷基，烷基可被氨基、低碳三烷銨基、在帶有氨基的碳原子上結(jié)合的羧基或者被羥基取代的環(huán)烷基等取代；R4是氫或具有10-25個(gè)碳原子的烷基，烷基上可任選地含有1-4個(gè)雙鍵；A為氧或NH。作為藥用陽離子，宜用銨離子、堿金屬-或堿土金屬陽離子，優(yōu)選用鈉、鉀或鈣，以及其它生理相容的一價(jià)或多價(jià)陽離子。若R3含有氮原子，則可形成季銨離子，后者也可作為陽離子，以致形成外部不帶電荷的內(nèi)鹽。若式I化合物中R1和/或R2是烷?；瑒t可為直鏈或支鏈，并且通常是直鏈的、含有10-25個(gè)、優(yōu)選為16-20個(gè)碳原子的?；?。烷酰基必要時(shí)可含有至多4個(gè)雙鍵。烷酰基尤其是長鏈脂肪酸如神經(jīng)酸、木蠟酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸或花生四烯酸的基團(tuán)。若取代基R3代表或含有低碳烷基，低碳烷基可為直鏈或支鏈的，含1-4個(gè)、優(yōu)選1-2個(gè)碳原子。若R3為羥基取代的環(huán)烷基，則它可為含3-6個(gè)碳原子的環(huán)，其上可被1個(gè)或多個(gè)羥基取代。優(yōu)選的是該環(huán)烷基含5-6個(gè)碳原子的環(huán)烷基，它?？杀涣u基取代?；鶊F(tuán)R3O優(yōu)選為羥基或被磷酸根酯化的一元或多元醇所產(chǎn)生的烷氧基，該一元或多元醇選自氨基乙醇，膽堿，絲氨酸，甘油和肌醇。若基團(tuán)R4為烷基，它可為直鏈或支鏈的，通常為含有10-25個(gè)、優(yōu)選為12-20個(gè)，尤其是15個(gè)碳原子的直鏈烷基。該烷基鏈還任選地含有最多4個(gè)、優(yōu)選2個(gè)、尤其是1個(gè)雙鍵。基團(tuán)A為氧或NH-基。用作磷脂的優(yōu)選為磷脂酸(1，2-二?；?sn-丙三醇-3-磷脂酸，磷脂酰膽堿(1，2-二?；?sn-丙三醇-3-磷酰膽堿)，磷脂酰乙醇胺(1，2-二?；?sn-丙三醇乙醇胺)，磷脂酰絲氨酸(1，2-二?；?sn-丙三醇-3-磷酰絲氨酸)和磷脂酰肌醇(1，2-二?；?sn-丙三醇-3-磷酰肌醇)，且當(dāng)這些磷脂來源于動(dòng)物例如雞蛋時(shí)，還為鞘磷脂和這些化合物的混合物。所提及的1，2-二?；字谝欢ǖ臈l件下、如磷脂酶的酶促影響下，可部分地水解。根據(jù)磷脂酶的性質(zhì)，可使1，2-二酰基磷脂中的R1、R2、R3或[R3OPO2]-被氫置換。當(dāng)磷脂分子中上述至少一個(gè)基團(tuán)被水解后，則生成所謂的溶血磷脂，尤其是溶血磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰肌醇，溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酸。這些溶血磷酸也適用作為本發(fā)明的添加劑，用來穩(wěn)定含有脂酶和蛋白酶、特別是胰酶制劑的消化酶混合物。用作糖脂的可以是植物中存在的式II的所謂植物糖脂及其混合物式中R5和R6各自獨(dú)立地為具有10-25個(gè)碳原子的烷酰基，烷基鏈上可任選含有1-4個(gè)雙鍵；或者R5和R6是氫，但R5和R6不能同時(shí)都是氫；R7是單-或雙糖基，糖選自D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖。若式II化合物中R5和R6為烷?；鶗r(shí)，可為直鏈或支鏈的，通常是含10-25個(gè)碳原子、優(yōu)選為16-20個(gè)碳原子的直鏈烷?；Ｍ轷；扇芜x地含有至多4個(gè)雙鍵。用作烷?；挠绕涫情L鏈脂肪酸，如棕櫚酸，棕櫚油酸，硬脂酸，油酸，亞油酸，亞麻酸或花生酸。R7基為單糖或雙糖基，是由D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖或D-果糖等糖分子組成，R7尤其優(yōu)選為D-半乳糖(即單半乳糖基-甘油二酯，MGDG)或二半乳糖(即二半乳糖基-甘油二酯，DGDG；1，2-二酰基-〔α-D-半乳糖基(1→6)-β-D-半乳糖基(1→3)〕-sn-丙三醇)。通式I的磷脂和通式II的糖脂分子中丙三醇主鏈的中間碳原子可為手性中心，可呈R-或S-構(gòu)型。本發(fā)明的式I和/或式II的化合物可以以其單個(gè)的立體異構(gòu)形式及其相應(yīng)的混合物形式應(yīng)用。按本發(fā)明，為了對(duì)含有脂酶和蛋白酶、特別是含有胰酶的消化酶混合物的藥劑進(jìn)行穩(wěn)定化，宜于用這樣的脂質(zhì)混合物它們可以從自然界獲得，是不同磷脂的混合物，并任選地有各種糖酯。天然磷脂混合物的優(yōu)選實(shí)例可提及卵磷脂。這些天然卵磷脂可來源于植物如大豆，向日葵，油菜籽，玉米或花生，也可來源于動(dòng)物或動(dòng)物制品，如蛋黃或腦組織，還可來源于微生物。天然來源的卵磷脂通常可由不同的供貨源買到。植物中獲得的卵磷酯、特別是大豆卵磷酯、尤其是富含磷脂的大豆卵磷脂，例如膦脂含量大約98％的大豆磷脂適于本發(fā)明的應(yīng)用目的。未經(jīng)處理的、植物中非富含磷脂的卵磷脂通常含有一定量的植物糖脂。自天然獲得的卵磷脂是各種磷脂的混合物，并且若來源于植物，也會(huì)含有糖脂，其組成不是單一的，而是取決于其來源的不同而改變。因而，除了上述的成分之外，還含有少量其它的磷脂。表1列出了一些未經(jīng)處理的、未富集的天然來源的市售卵磷脂的平均組成。表1一些卵磷脂的組成(％)</tables>本發(fā)明的穩(wěn)定化了的藥劑含有優(yōu)選含胰酶制劑的消化酶混合物。自哺乳動(dòng)物胰臟中分離的胰酶制劑可認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的胰酶，它的活性蛋白水解酶的含量可任選地通過對(duì)原來含有的蛋白酶-酶原的自動(dòng)裂解作用而提高。在本發(fā)明的穩(wěn)定化藥物制劑中含有胰酶制劑的消化酶混合物可優(yōu)選自哺乳動(dòng)物胰臟得到的胰酶制劑，尤其是豬胰酶制劑，它是各種消化酶的混合物。適于作為助消化劑而有益于人的營養(yǎng)的哺乳動(dòng)物的胰酶制劑。含有人類所必需的、并非永遠(yuǎn)足夠量的脂酶。因而這樣的胰酶制劑例如可添加入由微生物獲得的脂酶。這樣得到的胰酶-脂酶混合物是適宜的酶混合物。在從哺乳動(dòng)物中分離的胰酶中，存在有蛋白酶，當(dāng)胰酶不被進(jìn)一步預(yù)處理時(shí)，通常大部分是以可被裂解的、非活性的前體，即以酶原形式存在。因而為藥用目的，由本身已知的、適宜的沉淀方法自胰臟得到的粗胰酶制劑還要經(jīng)過一個(gè)水解處理(自溶作用)。在此處理過程中，酶原轉(zhuǎn)變成活性的蛋白酶。在該自溶地預(yù)處理過的胰酶(后面簡寫為F-胰酶制劑)中，存在特別高含量的活性蛋白酶，以致使該F-胰酶的脂解活性受到特別大的損害。本發(fā)明應(yīng)用的復(fù)合脂質(zhì)特別適宜于將含有F-胰酶的藥劑的脂水解活性穩(wěn)定化。意外地發(fā)現(xiàn)，脂酶活性的穩(wěn)定化不是通過使含在混合物中活性的蛋白酶失活實(shí)現(xiàn)的，用這樣的方式穩(wěn)定的酶混合物既有淀粉水解和脂質(zhì)水解活性，也有蛋白水解活性。在本發(fā)明保護(hù)性藥劑中含有的、含有胰酶的消化酶混合物除含有胰酶外，還含有這樣的脂酶，如在植物或微生物中所含有的脂酶、來自微生物的脂酶是由例如細(xì)菌或真菌發(fā)酵液而來，如霉菌類的根霉菌屬。在本發(fā)明保護(hù)性藥劑中的、含胰酶制劑的消化酶混合物中，另外的蛋白酶成分還可以是其它的動(dòng)物和植物蛋白酶。以及尤其是自微生物如細(xì)菌或真菌的蛋白酶，如霉菌中的曲霉屬中獲得的那些。無胰酶的消化酶混合物可含有作為脂酶的、可由植物或微生物中得到的那些。由微生物中得到脂酶可以是可自細(xì)菌或真菌如霉菌中的根霉菌屬得到的那些。在無胰酶的消化酶混合物中含有的蛋白酶可考慮用動(dòng)物或植物的蛋白酶，特別是來自微生物如細(xì)菌或真菌、例如由霉菌曲霉屬得到的蛋白酶。本發(fā)明的藥劑除含有消化酶混合物和復(fù)合的脂質(zhì)外，還含有其它的水溶性藥用助劑和/或添加劑。例如可含有載體物質(zhì)如碳水化合物如甘露糖醇，或可溶性蛋白以及防腐劑。本發(fā)明的消化酶混合物藥劑可以是水溶性粉劑，它除了含有胰酶(尤其是F-胰酶)外，還含有足夠量的復(fù)合脂質(zhì)，以穩(wěn)定因潮濕的影響所導(dǎo)致的脂水解活性下降，并且還任選地含有另外的已知的水溶性助劑和/或添加劑。為了制備水溶性粉劑，可將水不溶性成分去除。為此，將F-胰酯的水溶性成分用適當(dāng)?shù)囊阎腆w分離方法與不溶性的固體物質(zhì)分開，例如用離心或過濾法分開；得到的溶液任選地加入助劑和/或添加劑后，按照已知的方法進(jìn)行滅菌。然后將得到的澄清的、任選滅菌的溶液中的成分用已知方法進(jìn)行干燥例如冷凍干燥而得到固體。這樣得到的制劑適宜制備在數(shù)小時(shí)(例如至多8小時(shí))內(nèi)穩(wěn)定的無細(xì)菌生長的溶液，后者可用例如探針的方法給患者連續(xù)地經(jīng)胃腸道給藥。連續(xù)給藥是指不間斷地給以含有本發(fā)明藥劑的、必要時(shí)是滅菌的水溶液，給藥時(shí)間是一兩小時(shí)到數(shù)小時(shí)，至多8小時(shí)，大約過夜給藥。溶液的連續(xù)給藥可方便地經(jīng)探針給到消化道中，例如胃或小腸中。添加卵磷脂的作用主要取決于酶混合物中脂酶/蛋白酶的相對(duì)比例。例如這樣的酶混合物是適宜的脂酶/總蛋白酶的比例大約為5∶1到30∶1，測定各自的活性是按照“國際藥學(xué)聯(lián)盟”(以下簡稱FIP)規(guī)定的方法(參見R.瑞森和A.洛維斯藥物酶，科學(xué)出版公司，根特，1978，74-82頁，以后簡寫為“洛維斯”)，相對(duì)活性單位簡寫為FIP-E/g。按本發(fā)明，在含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物的、特別是含胰酶的消化酶混合物的藥劑中使用的復(fù)合脂質(zhì)添加劑的基本作用是使該藥劑穩(wěn)定化，以防止在濕氣的影響下脂水解酶活性的降低。濕氣主要指水性濕氣。它可為從消化酶混合物粉劑中含有的極少量的濕氣直至將此粉劑變成水性劑型的濕量。在制備和加工藥劑中所用的含胰酶的消化酶混合物時(shí)，按本發(fā)明的復(fù)合脂質(zhì)添加劑已被證明可在制備或獲得工藝步驟中有利地使脂水解活性穩(wěn)定化，因?yàn)樵谔幚磉^程中，它會(huì)導(dǎo)致脂酶發(fā)生失活。例如濕氣引起酶混合物活性的失活。在含有消化酶混合物的藥劑水溶液中，加入的復(fù)合脂質(zhì)尤其是卵磷脂的穩(wěn)定化作用還取決于制劑的pH值，本發(fā)明藥劑的pH范圍為3.5-9.0，優(yōu)選為4.0-7.0，尤其優(yōu)選的pH范圍是5.0-6.5。為了使消化酶混合物的水溶性藥劑中的脂水解活性達(dá)到明顯的穩(wěn)定化，并且為了用探針應(yīng)用此水溶液劑型的目的，要加入一定的起碼量的復(fù)合脂質(zhì)。本發(fā)明藥劑所用的消化酶混合物中應(yīng)具有的、以活性單位表示的脂酶含量通常是，當(dāng)只含有哺乳動(dòng)物胰臟分泌的脂酶時(shí)，例如為2000-200000FIP-E/g，而來自微生物的脂酶單獨(dú)應(yīng)用或與胰臟的酯酶合成時(shí)，則為2000-500000FIP-E/g。以固體的含胰酶制劑的消化酶混合物計(jì)，加入的復(fù)合脂質(zhì)的量至少為1％(重量)，例如為1-10％(重量)時(shí)，則可呈現(xiàn)顯著的穩(wěn)定化作用。加入較大量的復(fù)合脂質(zhì)也是可行的，但不會(huì)對(duì)脂水解活性有進(jìn)一步的穩(wěn)定性改善。因此，為了使胰酶或胰酶與外加的脂酶的混合物穩(wěn)定，加入的復(fù)合脂質(zhì)、尤其是卵磷脂宜加入至少1％(重量)、優(yōu)選為2-5％(重量)，尤其優(yōu)選為大約3％(重量)的卵磷脂。使用本發(fā)明的復(fù)合脂質(zhì)，可以使容易迅速降低脂酶活性的、含有消化酶混合物的藥劑水溶液穩(wěn)定化，以致使混合物中含有的脂酶的脂水解活性在較長時(shí)間內(nèi)只有微小的下降。這樣，在水溶液中經(jīng)加入卵磷脂而穩(wěn)定化的F-胰酶，在室溫下溫孵8小時(shí)，其脂水解活性是開始活性值的85％。用復(fù)合脂質(zhì)穩(wěn)定的水性F-胰酶溶液在24小時(shí)溫孵后，脂水解活性仍有開始值的50％。但沒有穩(wěn)定化的對(duì)照液在同樣條件下8小時(shí)后脂水解活性只有開始活性的20％以下。經(jīng)本發(fā)明對(duì)其水溶性藥劑的穩(wěn)定化，含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物可對(duì)抗在水性介質(zhì)中脂水解活性的降低，從而開辟了這樣的可能性即給患者的胃腸道中連續(xù)地輸入該消化酶混合物的水溶液。這樣的水溶液自然應(yīng)無細(xì)菌生長，最好是滅菌的。無菌生長的溶液例如可以加入防腐劑，以阻止細(xì)菌的繁殖。按本發(fā)明，將用來制備適宜于以探針的方法連續(xù)輸入到胃腸道中的水溶液，制成藥盒的形式，為對(duì)抗該水溶液中的脂水解酶活性下降而使之穩(wěn)定化，它是無細(xì)菌生長的水溶液，其特征在于，該藥盒含有以下成份a)水溶性固體的和無細(xì)菌生長的藥劑，藥劑為含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物，并可任選地含有足以使制成的水溶液穩(wěn)定化的復(fù)合脂質(zhì)、以防止脂水解酶活性的下降；和b)為了制備該水溶液所需的足夠量的無細(xì)菌生長的水性溶劑，后者除水外，還可含有生理可容性鹽和助劑，并且，若在a)項(xiàng)所列的固體藥劑中沒有足夠量的、用于使待制成的水溶液穩(wěn)定化、以防止脂水解活性下降的復(fù)合脂質(zhì)，則此處含有上述所需足夠量的復(fù)合脂質(zhì)。特別地，在藥盒中所用的固體配方a)為一種凍干的、含有脂酶和蛋白酶、并任選含有復(fù)合脂質(zhì)的消化酶混合物。該消化酶混合物優(yōu)選為含胰酶的消化酶混合物。沒有細(xì)菌生長的水溶液可通過添加本身已知的防腐劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯而得到。無細(xì)菌生長的滅菌溶液可通過已知的滅菌方法獲得。在藥盒中含有的脂質(zhì)可優(yōu)選地作為在消化酶混合物(成分a))中已經(jīng)含有的添加劑形式存在。為了制備已含有復(fù)合脂質(zhì)的消化酶混合物的粉劑，例如可將復(fù)合脂質(zhì)的任選無菌的溶液與消化酶混合物的任選無菌的溶液相混合，隨后再按照已知的方法如冷凍干燥使其干燥。為了能夠得到用探針應(yīng)用的溶液，須將含有復(fù)合脂質(zhì)和消化酶混合物的粉劑與藥盒中含有的溶劑。并任選地在乏菌或無菌條件下進(jìn)行混合。然而復(fù)合脂質(zhì)也可以已經(jīng)存在于溶劑(成分b))中，例如作為膠體而溶解。為了得到可用探針給藥的溶液，在這種情況下必須將含有復(fù)合脂質(zhì)的水溶液或膠體溶液與消化酶混合物(成分a))任選在無菌的條件下加以混合。實(shí)施例1.用大豆卵磷脂穩(wěn)定水性胰酶溶液的脂水解活性為了確定在胰酶制劑的水溶液中加入或不加入復(fù)合脂質(zhì)時(shí)脂水解活性的不同變化，進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)，并于30℃溫孵。按照“國際藥學(xué)聯(lián)盟/歐洲藥典”的方法(以后簡稱FIP/ph.Eur，參見Lauwers，第74-82頁)，由溫孵試樣來確定脂酶活性隨時(shí)間的變化。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測定方法可測定受試樣品在水解條件下對(duì)橄欖油甘油三酯水解的脂酶活性，并且在pH9條件下用氫氧化鈉滴定游離出的羧酸。這樣，試樣的脂酶活性可以用比較速度加以測定，即用該試樣水解橄欖油的速度與胰臟-對(duì)照粉末和同樣底物的懸浮液在同樣條件下的水解速度進(jìn)行比較。1.1.無卵磷脂添加物的脂酶穩(wěn)定性的研究79.35mg水溶性的、脂水解活性為50473FIP-E/g的凍干F-胰酶制劑溶解于4.0ml冰冷的純水(Nanopur巴恩司臺(tái)德廠出品)，用1NHCl調(diào)節(jié)pH為6.2，然后用純水稀釋到5.0ml。立即測定該起始的脂水解活性(“零分鐘試驗(yàn)”)其余的物料于30℃水浴中溫孵。采樣時(shí)要很好地混合該物料，用適宜的吸液管吸取，立刻與冰冷的脂酶溶劑稀釋，以使用于脂酶測定的體積為0.5～1.5ml、脂水解活性為8-16FIP-E/ml的試樣溶液可隨時(shí)供用。根據(jù)FIP/PhEru.的規(guī)定，脂酶溶劑是一種由10.0gNaCl，6.06g三-(羥甲基)-胺甲烷(簡寫為“Tris”)和4.9g馬來酸酐于900ml純水中組成的溶液，用4N氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH為7，然后用純水定容成1000ml。為了評(píng)價(jià)脂酶活性的時(shí)間過程，在15，30，60，120和180分鐘后，從該絕熱的物料中取樣，每個(gè)檢樣要在30分鐘以內(nèi)按照FIP/ph.Eur.(Lauwers，78頁)的方法測定其脂酶活性?！傲惴昼娫囼?yàn)”得到的、以FIP-E/ml單位表示的脂酶活性表示為100％，進(jìn)一步溫孵時(shí)間測定的活性值以該值的百分?jǐn)?shù)計(jì)，結(jié)果列于表2。1.2.有卵磷脂添加物的脂酶穩(wěn)定性的研究為了制備卵磷脂溶液，于室溫下將100mg大豆卵磷脂(Roth公司出品，磷脂含量大約為98％)與少量純水分散，然后稀釋成20.0ml。該混合物超聲攪拌大約2分鐘，直到成均勻的膠體溶液。然后將80.0mg水溶性的凍干的、脂水解活性為54694FIP-E/g的F-胰酶溶解于4.0ml的純水中，用1NHCl調(diào)節(jié)該溶液的pH至6.2，再加入0.4ml卵磷脂溶液(以使用的F-胰酶粉劑計(jì)，含卵磷脂2.0％)，在良好的混合下用冰冷卻的純水將該物料稀釋到5.0ml.按照1.1項(xiàng)所述，在各個(gè)溫孵時(shí)間取樣并測定脂水解活性，結(jié)果列于表2。表2.加或不加卵磷脂的胰酶水溶液的脂水解活性的變化2.胰酶的水制劑的脂水解活性在8小時(shí)后的穩(wěn)定性胰酶水制劑的脂水解活性的喪失取決于多種因素，如溫度、pH值、所含蛋白酶的蛋白水解的活性。經(jīng)加入復(fù)合脂質(zhì)如卵磷脂，經(jīng)25℃下8小時(shí)溫孵，可穩(wěn)定其脂酶活性。在下面的試驗(yàn)中，對(duì)于加或沒加復(fù)合脂質(zhì)的F-胰酶的水性懸浮液和水溶液在8小時(shí)內(nèi)的脂水解活性作了比較。2.1.溫孵物料的制備為了進(jìn)行對(duì)比研究了在加或不加入卵磷脂的情況下F-胰酶的澄清溶液和懸浮液。制備如下的水性制劑a)不加卵磷脂的胰酶溶液按照1.1項(xiàng)所述，將77.5mg水溶性的凍干的F-胰酶粉劑溶解于冰冷的純水中，用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.2。b)加入卵磷脂的胰酶溶液按照1.2項(xiàng)所述，將81.0mg水溶性的凍干的F-胰酶粉劑溶于水中，調(diào)節(jié)至pH為6.2之后，與0.94ml卵磷脂溶液混合，用冰冷的純水定容成5.0ml。c)無卵磷脂的胰酶懸浮液2.0gF-胰酶與100ml冰冷的純水中攪拌30分鐘，得到渾濁的懸浮液。d)有卵磷脂的胰酶懸浮液2.0gF-胰酶與100mg大豆卵磷脂(ROTH公司)混合，并在100ml冰冷的純水中攪拌30分鐘，得到渾濁的懸浮液。2.2實(shí)驗(yàn)過程從2.1項(xiàng)制備的冰冷的溶液或懸浮液中、在制備后立即取出用于測定脂水解初始活性的試樣(“0分鐘試樣”)然后其余的物料在試劑瓶中、在25℃溫孵8小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間內(nèi)，30分鐘后取樣，然后每小時(shí)取樣。原則上按1.1項(xiàng)所述取樣、稀釋并測定脂酶的活性。實(shí)驗(yàn)溫度與前述過程有偏差，現(xiàn)在為25℃。溫孵物料的“0分鐘試樣”的脂酶活性(以FIP-E/ml表示)作為100％，對(duì)其余溫孵時(shí)間取樣所測定的活性值表示為該值的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果列于表3和4內(nèi)。表3.加和不加卵磷脂時(shí)胰酶溶液在8小時(shí)內(nèi)脂酶穩(wěn)定性的變化樣品卵磷脂含量(％)pHt小時(shí)后脂水解的活性(％)00.512345678a)-6.2100726447363027242119b)5.86.2100979896989492898585</table>表4.有和沒有卵磷脂加入時(shí)胰酶懸浮液在8小時(shí)內(nèi)脂酶穩(wěn)定性的變化樣品卵磷脂含量(％)pHt小時(shí)后脂水解的活性(％)00.512345678c)-7.1100725643342925211816d)57.1100979792847772696460</table>3.加入復(fù)合脂質(zhì)后微生物的脂酶對(duì)抗微生物的蛋白酶的穩(wěn)定化下面的試驗(yàn)表示，在加入了復(fù)合脂質(zhì)后，在有活性微生物蛋白酶的存在下，微生物脂酶的活性也會(huì)被穩(wěn)定。為此制備3種試驗(yàn)溶液，它們分別含有微生物脂酶，微生物脂酶加微生物蛋白酶，以及加有卵磷脂的微生物脂酶加微生物蛋白酶。然后測定這些試驗(yàn)溶液的脂水解活性并列表加以比較。3.1試驗(yàn)溶液的準(zhǔn)備制備如下的溶液a)脂酶溶液245mg其活性為170000FIP-E/g的米根霉的脂酶(脂酶7-AP15，阿瑪諾制藥公司(株)，名古屋，日本)溶解于50ml冰冷的1％氯化鈉溶液。b)蛋白酶溶液390mg活性為7600FIP-E/g的曲霉屬蛋白酶(原酶6，阿瑪諾制藥公司(株)，名古屋，日本)溶解于25ml冰冷的1％氯化鈉溶液。c)卵磷脂溶液1g卵磷脂(ROTH廠出品，大豆純卵磷脂，磷脂含量約98％)用40ml純水(Nanopure，Barnstea公司出品)超聲振蕩約2分鐘成膠體溶液。于冰浴中由這個(gè)溶液制成總體積各為5ml的如下溫孵溶液。所有制得的溫孵溶液的pH值于37℃為6.5。表5.測定米根霉脂酶活性的溫孵溶液3.2試驗(yàn)過程制成后，由冰冷的溫孵液I、II、III立即取出用于測定起始活性(0分鐘試驗(yàn)樣品)。3個(gè)物料的其余部分于37℃水浴中保溫。取樣時(shí)物料要很好地混和，用適宜的移液管量取樣品液，立即按照1.1項(xiàng)所述用冰冷的脂酶溶劑稀釋。該樣品液制成一定量(如表6中“X”所示)并用1％氯化鈉溶液稀釋成5ml。由這樣的試驗(yàn)溶液中各使用0.5ml進(jìn)行脂酶活性試驗(yàn)。表6.制備試驗(yàn)溶液所取出的樣品量.3米根霉-脂酶活性的測定米根霉-脂酶的催化活性是用測定游離脂肪酸量確定的，脂肪酸是于pH7.0、37℃和一定的時(shí)間內(nèi)，在0.025％牛磺膽酸鈉的存在下，由橄欖油乳劑生成。為了保證能測定所有的脂肪酸，最后測定到pH9.0。用底物-乳劑滴定作空白試驗(yàn)。測定可以被滴定的、但不具有脂酶活性的物質(zhì)。受試物質(zhì)的米根霉-脂酶活性是通過對(duì)在同樣的水解條件下橄欖油乳劑被受試物質(zhì)懸浮液的水解速度與橄纜油乳劑被米根霉-脂酶對(duì)照品懸浮液水解的速度相比較而確定的。試劑1.水純水用Barnstead公司出品的“Nanopure”純水，以后用“純水”表示。2.阿拉伯膠溶液110g阿拉伯膠和12.5g氯化鈣于純水中攪拌(大約3小時(shí))溶解，定容到1000ml，離心。溶液裝入250ml塑料容器內(nèi)，-20℃保存。阿拉伯膠的規(guī)格德國藥典第10版/歐洲藥典，氯化鈣，分析純。3.底物乳劑130ml橄欖油與400ml阿拉伯膠溶液(2)用適當(dāng)?shù)臄嚢杵鞲咚贁嚢?5分鐘，使之乳化，溫度保持在30℃以下。乳劑中至少90％的油滴直徑小于3μm，且沒有大于10μm的油滴。該乳劑當(dāng)日用現(xiàn)制。橄欖油為德國藥典規(guī)格，冰柜中保存。4.0.5％(m/v)?；悄懰徕c溶液0.5g?；悄懰徕c(脂酶活化混合物，為共軛的沒食子酸與?；悄懰徕c的混合物)溶解于100ml純水中，該溶液當(dāng)天用現(xiàn)制。?；悄懰徕c(脂酶活化混合物)，規(guī)格FIP。5.1％(m/v)氯化鈉的純水溶液6.pH4.5緩沖液2g氯化鈉和9.2g磷酸二氫鈉溶解于大約950ml純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.5，用純水定容成1000ml。氯化鈉為分析純，磷酸二氫鈉NaH2PO4×H2O7.0.1N氫氧化鈉溶液對(duì)照懸浮液米根霉-脂酶對(duì)照樣品在緩沖液(6)中攪拌，用氯化鈉溶液(5)稀釋，直到該米根霉-脂酶溶液的活性為12-18單位(FIP-E/ml)。將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣(55000FIP-E/g)63mg于15分鐘內(nèi)于冰浴中溶解于20ml緩沖液(6)中。取該溶液10ml，于冰浴中用氯化鈉溶液(5)稀釋到100ml。取稀釋液0.5ml為試驗(yàn)液。米根霉-脂酶對(duì)照樣FIP(真菌-脂酶，F(xiàn)IP標(biāo)準(zhǔn))。受試液受試液用I、II和III。試驗(yàn)步驟在Radiometer公司的“pH-Stat”滴定系統(tǒng)的自動(dòng)滴定儀上，將pH-Stat-滴定的滴定終點(diǎn)調(diào)節(jié)在pH為7.0。向該反應(yīng)容器中加入12.0ml橄欖油乳劑，F(xiàn)IP(3)6.5ml純水(1)1.0ml?；悄懰徕c溶液(4)將混合物調(diào)節(jié)到37.0℃，用0.1N氫氧化鈉溶液(7)調(diào)節(jié)到pH7.0，然后將滴定管設(shè)定為“0”。當(dāng)要測定對(duì)照值時(shí)，加入0.5ml對(duì)照懸浮液，以使反應(yīng)開始，或當(dāng)要測定受試液中的脂酶活性時(shí)，則加入0.5ml受試液。10分鐘后，調(diào)節(jié)pH-Stat-滴定的終點(diǎn)至pH為9.0。當(dāng)pH值達(dá)到9.0(此過程的時(shí)間少于30秒鐘)時(shí)，滴定被中斷，記錄消耗的0.1N氫氧化鈉量。為了確定空白值，將對(duì)照懸浮液和受試液的滴定終點(diǎn)立即設(shè)定為pH9.0。用手操作法將反應(yīng)物料的pH值調(diào)節(jié)為pH7.0、然后加入0.5ml對(duì)照懸浮液或受試液后，立即滴定到pH為9.0。根據(jù)0.1N氫氧化鈉的消耗量，計(jì)算受試液的米根霉-脂酶活性的FIP-E/ml單位。以受試液I、II和III測得的脂酶起始活性的FIP-E/ml單位定為100％。繼續(xù)溫育1小時(shí)期間測定的活性值以基于起始值的百分計(jì)，列于表7中。表7.大豆卵磷脂對(duì)米根霉-脂酶活性的穩(wěn)定化</tables>4.藥物制劑的實(shí)施例A)20.0gF-胰酶溶于400ml水，加入1N鹽酸，以迅速調(diào)節(jié)pH到6.2。于此條件下、4℃萃取1小時(shí)。離心(53000g)澄清的、含有胰酶萃取液的上清液，過濾，濾液經(jīng)2μm孔徑濾器無菌過濾。B)1.0g大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿含量98％)溶于50ml水，置于磨口玻璃安瓿中，140℃滅菌45分鐘。C)A)項(xiàng)制備的胰酶萃取液400ml與B)項(xiàng)制備的卵磷脂溶液25ml，無冷卻和無菌條件下混和，混和液凍干，得到16g粉劑，該粉劑在無菌條件下以每份2.5g的量裝入100ml灌注瓶內(nèi)。5.作為藥用試劑盒的實(shí)施例5.1藥盒1A)40.0gF-胰酶溶解于400ml水，用1N鹽酸迅速調(diào)節(jié)pH至6.2，于此條件下、4℃萃取1小時(shí)。離心(53000g)該胰酶萃取液，過濾，濾液經(jīng)2μm孔徑濾器無菌過濾。萃取液于無菌條件下以每份25ml的量灌裝入100ml灌注瓶內(nèi)，凍干。B)2.0g大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿含量98％)溶解于20ml水，超聲均勻化。該膠體溶液于磨口玻璃安瓿中、140℃滅菌45分鐘。取12.5ml與1600ml無菌水混和后，以每份100ml的量裝入灌注瓶內(nèi)。應(yīng)用時(shí)，將A)項(xiàng)瓶內(nèi)的固體物質(zhì)溶解于B)項(xiàng)瓶中的溶液。5.2藥盒2A)40.0gF-胰酶溶解于800ml水，用1N鹽酸迅速調(diào)節(jié)pH至6.2。于此條件下、4℃萃取1小時(shí)，離心(53000g)澄清的胰酶萃取液，棄去沉淀。B)32.0g甘露糖醇溶解于200ml水中，與800mlA)項(xiàng)得到的胰酶萃取液混和，合并的溶液滅菌。C)5.0g大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿含量98％)溶解于50ml水，超聲均勻化。該膠體溶液于磨口玻璃安瓿中、140℃滅菌45分鐘。D)1000mlB)項(xiàng)得到的胰酶萃取液與16mlC)項(xiàng)得到的卵磷脂溶液在無菌條件下混和并凍干。得到的粉劑以每份10.0g于無菌條件下裝入200ml瓶內(nèi)。E)在無菌條件下將去離子和滅菌水200ml加到瓶內(nèi)。使用時(shí)將D)項(xiàng)粉劑瓶中的內(nèi)容物溶解于E項(xiàng)瓶中的水中。權(quán)利要求1.復(fù)合脂質(zhì)的用途，用作為在含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物的水溶性藥劑中對(duì)抗在濕氣的影響下脂水解活性降低的穩(wěn)定化添加劑，該消化酶混合物適于制備用探針向胃腸道連續(xù)給藥的水溶液。2.權(quán)利要求1的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其中，含脂酶和蛋白酶的消化酶混合物是含胰酶的消化酶混合物。3.權(quán)利要求2的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，復(fù)合脂質(zhì)作為穩(wěn)定化添加劑加到含有胰酶的消化酶混合物的藥劑中，該消化酶復(fù)合物除含有胰酶外，還另含有脂酶，該脂酶選自植物脂酶，細(xì)菌脂酶，和來自真菌培養(yǎng)物的脂酶。4.上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，磷脂，糖脂或它們的混合物被用作為復(fù)合脂質(zhì)。5.權(quán)利要求4的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，磷脂或含有它的脂質(zhì)混合物被用作為復(fù)合脂質(zhì)。6.權(quán)利要求5的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，通式I的、陰離子與生理相容的陽離子形成的磷脂鹽或它們的混合物用作為復(fù)合脂質(zhì)式中，R1為氫或具有10-25個(gè)碳原子的烷?；渫榛溈扇芜x含有1-4個(gè)雙鍵；R2為氫或具有10-25個(gè)碳原子的烷?；?，其烷基鏈可任選含有1-4個(gè)雙鍵；或當(dāng)R1不是氫時(shí)，R2也可是氫；R3是氫或低碳烷基，烷基可被氨基、低碳三烷銨基、在帶有氨基的碳原子上結(jié)合的羧基或者被羥基取代的環(huán)烷基等取代；R4是氫或具有10-25個(gè)碳原子的烷基，烷基上可任選地含有1-4個(gè)雙鍵；A為氧或NH。7.權(quán)利要求6的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，在通式I的磷脂中，R3選自如下基團(tuán)氫，氨基乙基，膽堿基，絲氨酸基，丙三醇基或肌醇基。8.權(quán)利要求7的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，所用的磷脂選自磷脂酸，磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，和鞘磷脂或它們的混合物。9.權(quán)利要求4的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，卵磷脂被用作為復(fù)合脂質(zhì)，它得自大豆，油菜籽，玉米，向日葵，花生，雞蛋或微生物。10.權(quán)利要求9的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，大豆卵磷脂用作復(fù)合脂質(zhì)。11.權(quán)利要求2-10中一項(xiàng)的復(fù)合脂質(zhì)的用途，其特征是，該脂質(zhì)被加入到在藥劑中使用的胰酶中，胰酶是在其制取或在對(duì)抗由于潮濕使藥劑中脂水解的活性下降、并使藥劑穩(wěn)定化的加工步驟中使用的胰酶。12.含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物的水溶性藥劑，該藥劑適用于制備借助探針向胃腸道連續(xù)注入的水溶液，其特征是，它含有為對(duì)抗由于潮濕的影響而使脂水解活性下降、并使其穩(wěn)定化的、足夠量的權(quán)利要求1-10中一項(xiàng)的復(fù)合脂質(zhì)。13.權(quán)利要求12的藥劑，其特征是，含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物是含有胰酶的消化酶混合物。14.權(quán)利要求13的藥劑，其特征是，消化酶復(fù)合物除含有胰酶外，還另含有脂酶，脂酶選自植物脂酶，細(xì)菌脂酶，和來自真菌培養(yǎng)物的脂酶。15.權(quán)利要求12-14中一項(xiàng)的藥劑，其特征是，它含有這樣數(shù)量的復(fù)合脂質(zhì)，它可穩(wěn)定制劑水溶液的脂水解活性，以致于在8小時(shí)內(nèi)使該水溶液的初始脂水解活性降低至多20％。16.權(quán)利要求15的藥劑，其特征是，它含有這樣數(shù)量的復(fù)合脂質(zhì)，使得在24小時(shí)內(nèi)制劑水溶液的脂水解初始活性至多降低50％。17.權(quán)利要求12-14中一項(xiàng)的藥劑，其特征是，為了對(duì)抗脂水解活性的降低并使其穩(wěn)定化，它含有濃度為1-10％(重量)、優(yōu)選為2-5％(重量)的復(fù)合脂質(zhì)，基于消化酶混合物計(jì)。18.權(quán)利要求12-17中一項(xiàng)的藥劑，其特征是，它含有的胰酶是經(jīng)自溶預(yù)處理的胰酶。19.用于制備消化酶混合物的水溶液的藥盒，該水溶液適用于借助探針向胃腸道連續(xù)注入，并是已為對(duì)抗脂水解活性降低而使其穩(wěn)定化了的、無細(xì)菌生長的，其特征是，它含有如下組成成份a)水溶性固體的和無細(xì)菌生長的藥劑，藥劑為含有脂酶和蛋白酶的消化酶混合物，并可任選地含有足以使制成的水溶液穩(wěn)定化的復(fù)合脂質(zhì)，以防止脂水解酶活性的下降；和b)為了制備該水溶液所需的足夠量的無細(xì)菌生長的水性溶劑，后者除水外，還可含有生理可容性鹽和助劑，并且，若在a)項(xiàng)所列的固體藥劑中沒有足夠量的、用于使待制成的水溶液穩(wěn)定化、以防止脂水解活性下降的復(fù)合脂質(zhì)，則此處含有上述所需足夠量的、根據(jù)權(quán)利要求1-10中一項(xiàng)的復(fù)合脂質(zhì)。20.權(quán)利要求19的藥盒，其特征是，固體制劑a)是凍干的、含有脂酶和蛋白酶并任選含有復(fù)合脂質(zhì)的消化酶混合物。21.權(quán)利要求20的藥盒，其特征是，凍干的消化酶混合物含有胰酶。全文摘要本發(fā)明敘述了復(fù)合脂質(zhì)、特別是卵磷脂的用途、它們用作為含有脂酶和蛋白酶、特別是含有胰酶的消化酶混合物的水溶性藥劑的穩(wěn)定化添加劑,以用來對(duì)抗由于潮濕的影響使脂水解活性的下降,該消化酶混合物用來制備借助于探針向胃腸道連續(xù)輸入的水溶液。文檔編號(hào)A61K38/46GK1174743SQ97117700公開日1998年3月4日申請(qǐng)日期1997年8月27日優(yōu)先權(quán)日1996年8月28日發(fā)明者M(jìn)·加勒申請(qǐng)人:索爾瓦藥物有限公司