專利名稱：定向細(xì)胞毒性蒽環(huán)型類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明部分得到政府支助而完成。政府對(duì)本申請(qǐng)有一定的權(quán)利。
本發(fā)明屬于靶向抗癌蒽環(huán)型(anthracycline)衍生物化學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，它涉及與肽激素，如LH-RH、鈴蟾肽和促生長(zhǎng)素抑制素類似物共價(jià)連接的阿霉素(DOX)或其道諾糖胺(daunosamine)修飾的衍生物(DM-DOX)。這些共價(jià)結(jié)合物定向于具有肽激素類似物受體的各種腫瘤。
在Schally、Janaky和Bajusz的于1995年9月6授權(quán)公開的EP0450461B1中揭示了在第六位上具有細(xì)胞毒部分的LH-RH類似物。
在Nett和Glode的于1990年9月7日公開的WO90/09799中描述了用于損傷促性腺激素的GnRH(LH-RH)類似物。該申請(qǐng)描述了用于損傷促性腺激素的與LH-RH類似物相連的毒素，如蓖麻毒蛋白，并且因而治療依賴于性激素的癌癥。在沒有說明連接化學(xué)的情況下也提到了LH-RH阿霉素衍生物。
在Schally等于1990年4月6日提出的美國(guó)專利申請(qǐng)和于1993年7月15日再次提出的系列申請(qǐng)08/076,846中描述了細(xì)胞毒性促生長(zhǎng)素抑制素類似物。
A.V.Schally在《抗癌藥物》(Anti-Cancer Drugs)5，115-130(1994)的綜述中詳細(xì)說明了許多種腫癌的細(xì)胞膜上的LH-RH、鈴蟾肽或促生長(zhǎng)素抑制素類似物的受體的存在。
G.Weckbecker在他在《Farmac.Ther.》60，245-264(1993)中的綜述中列出了一些表明在一些正常和腫癌組織中促生長(zhǎng)素抑制素類似物的受體和受體亞型存在的依據(jù)。
在N.Bunnett《腸肽生物化學(xué)和生理學(xué)》423-445(1994)編者J.Walsh和G.J.Dockray，Raven Press，紐約和E.Spindell在《激素研究的最新進(jìn)展》48，(1993)(Academic Press)的綜述中討論了鈴蟾肽樣肽和在各種正常和腫癌組織中鈴蟾肽/GRP受體的存在。
阿霉素(DOX)是目前使用最廣且非常有效的抗癌劑。然而，一些腫瘤根本不對(duì)它發(fā)生反應(yīng)，且它的應(yīng)用還受多重抗藥性(MDR)和心臟毒性以及嗜中性細(xì)胞減少癥的限制，這是由于慢性治療的結(jié)果。為了克服這些缺陷并進(jìn)一步開發(fā)蒽環(huán)型抗生素結(jié)構(gòu)中存在的巨大的殺腫瘤潛力，已描述了數(shù)千種合成衍生物，包括它們與各種載體大分子相連的靶向類似物。
DOX和其類似物的大部分情況描述在《阿霉素》中，David W.Henry，ACS Symposium Series，NO.30，《腫瘤化學(xué)治療》，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)，pp.15-57(1976)和《阿霉素》，F(xiàn)ederico Arcamone，AcademicPress(1981)中。
Mosber等美國(guó)專利4,464,529(1984年8月7日)中描述了具有抗腫瘤活性的具有高度活性、烷基化、非交叉抗性的3′-脫氨基-3′-(3″-氰基-4″-嗎啉基)-DOX和其衍生物。在《藥物化學(xué)雜志》1984，27，638-645中還描述了這些“高度有效的嗎啉基蒽環(huán)型”的合成和生物學(xué)評(píng)價(jià)。
在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88卷，pp.4845-4849，1991年6月中，Gao等描述了通過道諾紅菌素衍生物的DNA序列的甲醛介導(dǎo)的烷基化作用。
在《藥物化學(xué)雜志》35，3208-3214(1992)中描述了具有潛在烷基化取代基的蒽環(huán)型類似物。
在1989年12月12日由Pharmacia Carlo Erba提出的歐洲專利434960中描述了用于DOX的道諾糖胺氮烷基化的α，ω-二碘化合物的應(yīng)用及新的嗎啉基DOX衍生物的形成。
在Israel等的美國(guó)專利4,299,822(1981年11月10日)中N-三氟乙?；⒚顾?14O-半戊二酸酯和-半己二酸酯被公開，作為具有改善水溶性的N-三氟乙?；⒚顾?14O-戊酸酯(AD-32)的類似物。
Horton和Priebe(抗生素雜志，XXXVI，1211-1215)描述了一些與14-OH母體類似物相比，在抗癌活性上沒有很大變化的不同蒽環(huán)型類似物的14-O-酯。
在設(shè)計(jì)靶向化學(xué)治療劑技術(shù)中，尋求下面的目標(biāo)1.載體分子和化學(xué)治療劑之間穩(wěn)定的連接，直至達(dá)到靶。
2.在結(jié)合物中載體分子保留生物特性，例如保留結(jié)合特性。
3.在結(jié)合物中化學(xué)治療劑保留藥物學(xué)活性，例如保留細(xì)胞毒活性。
4.作為結(jié)合的結(jié)果，產(chǎn)生相對(duì)于未結(jié)合部分更強(qiáng)活性和/或較低外周毒性的類似物。
在Sela等的美國(guó)專利4,263,279(1981年4月21日)中描述了通過道諾糖胺部分的NaIO4氧化作用及隨后的包括載體分子的伯胺的還原性烷基化而進(jìn)行的DOX的結(jié)合作用。
如在《生物化學(xué)生物物理研究通訊》1981，102，1048-1054中所描述的，順烏頭酸間隔區(qū)被用來借助于pH敏感鍵將道諾糖胺的氮與大分子載體相連。
Zunino等(1981)《Tumori》67，521-524和《歐洲癌癥臨床研究》20，421-425中描述了14-溴道諾紅菌素和蛋白或多聚-L-氨基酸之間酯鍵和C-N連接的形成。
如《生物結(jié)合物化學(xué)》1990 1(5)，325-330所描述的，嗎啉代-DOX(高活性的DOX的道諾糖胺修飾類似物)借助于可水解(溶菌體(1ysosomotrop)，pH敏感)腙連接與抗體結(jié)合，涉及細(xì)胞毒試劑的C-13氧代官能團(tuán)。
如《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》1982 79，626-629中所描述，亮氨酸殘基的羧酰胺鍵對(duì)酶降解的敏感性被成功地用于包含“間隔臂”肽的DOX結(jié)合物中，該“間隔臂”肽優(yōu)選A1a-Leu-Ala-Leu，其中羧基末端Leu?；疍OX中的道諾糖胺的氮，氨基末端Ala通過二羧酸間隔區(qū)與載體相連。
如《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》1992 89，927-976所描述的，DOX的道諾糖胺氮通過戊二酸間隔區(qū)被?；殡S著嚴(yán)重的細(xì)胞毒活性的喪失而與LH-RH類似物相連。
與根據(jù)本發(fā)明的化合物在治療各種人類腫瘤中的應(yīng)用相關(guān)的其它參考文獻(xiàn)1.Schally等(1996)，用GnRH類似物治療矛盾和前景，編者，F(xiàn)ilicori，M.和Flamigni，C.(Parthenon，Carnforth，U.K.)pp.33-44。
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所有提到的引用文獻(xiàn)被本文引作參考。
本發(fā)明化合物為新的靶向細(xì)胞毒性肽激素，其包含與肽激素，如LH-RH、鈴蟾肽和促生長(zhǎng)素抑制素類似物結(jié)合的蒽環(huán)型細(xì)胞毒性劑，如DOX或DM-DOX。這些細(xì)胞毒肽激素結(jié)合物被設(shè)計(jì)用來治療具有結(jié)合物特異性受體的腫瘤，如乳腺癌，卵巢癥，子宮癌，前列腺癌，胰腺癌，結(jié)腸癌，胃癌和肺癌。本文使用的一些這種(未結(jié)合)蒽環(huán)型細(xì)胞毒性劑本質(zhì)上是新的，并且是高效的，然而對(duì)于它們被以未結(jié)合物形式使用時(shí)，它們的毒性水平太高。
在尋找新的高活性的非交叉抗性的適宜于與肽載體形成共價(jià)結(jié)合物的DOX類似物中開發(fā)出了本發(fā)明提出的道諾糖胺修飾的DOX類似物。
通過使用二羧酸間隔區(qū)如戊二酸實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的以共價(jià)連接的其組成成員生物活性充分保留的結(jié)合物的形成。間隔區(qū)的一個(gè)羧基與DOX或DM-DOX的14-OH基形成一個(gè)酯鍵，間隔區(qū)的另一個(gè)羧基與肽載體的精心選擇的游離氨基形成一個(gè)羧酰胺鍵。
本發(fā)明化合物用下面通式表示Q14-O-R-P(I)其中Q為通式
Q14表示在14位上具有側(cè)鏈的Q殘基，R為H或-C(O)-(CH2)n-C(O)-和n＝0-7，R′為NH2或芳香、飽和或部分飽和的5或6元雜環(huán)化合物，其具有至少一個(gè)環(huán)氮原子，并任選具有與所述環(huán)的相鄰碳原子結(jié)合以形成二環(huán)體系的丁二烯殘基，P為H或肽部分，適宜地為L(zhǎng)HRH、鈴蟾肽或促生長(zhǎng)素抑制素類似物，但不排除其它生理活性肽。特別希望的是對(duì)腫瘤細(xì)胞受體具有親和性的LHRH類似物，尤其是在6位具有D-Lys殘基的那些類似物，以及縮短的促生長(zhǎng)素抑制素和鈴蟾肽類似物。然而當(dāng)R′為NH2時(shí)，R和P不為H。當(dāng)R和P為H時(shí)，那么R′不為NH2。
在本工作的過程中發(fā)現(xiàn)了一種新的合成反應(yīng)。不僅發(fā)現(xiàn)阿霉素及其衍生物可借助于二羧酸殘基在14位上偶聯(lián)以產(chǎn)生新的藥物學(xué)有效的結(jié)合物，而且提供了一種新的途徑來從相鄰和分離，即α，β-或α，γ-羥基伯胺形成部分飽和的雜環(huán)殘基。本發(fā)明特殊的應(yīng)用在于在糖諾糖胺糖上形成2″-吡咯啉基和1″，3″-四氫吡啶基。然而，此反應(yīng)還具有更廣的應(yīng)用。當(dāng)相鄰或分離的羥基胺與鹵素取代的醛反應(yīng)時(shí)，可形成5和6元部分飽和的雜環(huán)殘基，其中鹵素取代的醛在醛碳和具有鹵素基團(tuán)的碳原子之間具有2或3個(gè)殘基。這些殘基可均為亞甲基，或可包括雜原子如氧。此反應(yīng)在三個(gè)階段發(fā)生。合適地在極性惰性無水有機(jī)溶劑中，非常大量過量的鹵代醛與羥基胺的酸加成鹽反應(yīng)，由此通過醛基與羥基和氨基縮合形成了五元噁唑烷環(huán)(或六元1，3-四氫噁嗪環(huán))。將該產(chǎn)物與有機(jī)堿反應(yīng)，適宜地為叔胺，其中在前面鹵代醛的鹵素部分與噁唑烷或1，3-四氫噁嗪環(huán)的仲胺基之間消除氫鹵酸以通過5或6元環(huán)的加入形成稠合環(huán)結(jié)構(gòu)。接著用弱酸(適宜的有機(jī)酸)如冰醋酸中和堿。用酸的水溶液(適宜地為有機(jī)酸)處理打開稠合環(huán)的噁唑烷或1，3-四氫噁嗪部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，根據(jù)起始的醛，含有氮的最終環(huán)可包含至少一個(gè)上述另外的雜原子。反應(yīng)通式可說明如下
其中X′為鹵素，適宜地為溴或碘，優(yōu)選碘，Y為CH2、OCH2、CH2-CH2，Z不存在或?yàn)镃H2。
當(dāng)Z不存在時(shí)，作為反應(yīng)的第一個(gè)步驟，醛部分形成5元惡唑烷環(huán)。當(dāng)Z為CH2時(shí)，醛部分形成6元1，3-四氫噁嗪環(huán)。雖然這些環(huán)的形成是熟知的，但與通過鹵代烷烴側(cè)鏈在堿性介質(zhì)如叔胺的無水介質(zhì)中進(jìn)行的閉環(huán)結(jié)合，該反應(yīng)是新的出人意外的。附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1為對(duì)于不同劑量水平的本發(fā)明化合物和DOX，雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌體積的變化。
圖2為對(duì)于不同劑量水平的本發(fā)明的某化合物、現(xiàn)有技術(shù)中的化合物DOX和對(duì)照物，雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌的體積變化。
圖3為一些細(xì)胞毒LHRH類似物對(duì)患有雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌的小鼠存活的影響。
圖4為在用現(xiàn)有技術(shù)中的激動(dòng)劑和本發(fā)明的某化合物治療期間，帶有大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌移植物的雄性哥本哈根大鼠的腫瘤體積圖。
圖5為用某種本發(fā)明的化合物和相應(yīng)的細(xì)胞毒性LH-RH類似物治療，對(duì)患有Dunning R-3327-H前列腺癌的大鼠的腫瘤體積的影響。
圖6為用本發(fā)明的某化合物和相應(yīng)的細(xì)胞毒性LH-RH類似物治療，對(duì)患有Dunning R-3327-H前列腺癌的哥本哈根大鼠的體重的影響。
圖7為通過用本發(fā)明的某化合物和DOX治療所獲得的對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制。優(yōu)選實(shí)施方案的描述當(dāng)在R′被某些優(yōu)選基團(tuán)取代時(shí)，Q殘基具有Q1至Q8亞殘基的含義，其中Q2至Q8為新的細(xì)胞毒性殘基。
R′具有產(chǎn)生如下列括號(hào)中的所示的Qx殘基的含義NH2(Q1)，吡咯烷-1-基(Q2)，異二氫氮雜茚-2-基(Q3)，3-吡咯啉-1-基(Q4)，3-吡咯烷酮-1-基(Q5)，2-吡咯啉-1-基(Q6)，3-哌啶酮-1-基(Q7)或1，3-四氫吡啶-1-基(Q8)。
因此，如果R-P為H，-R′為-NH2，則Q1為DOX，如果R-P為H，-R′為吡咯烷-1-基，則Q2為3′-脫氨基-3′-(吡咯烷-1″-基)-阿霉素(Q2)；如R-P為H，-R′為異二氫氮雜茚-2-基，則Q3為3′-脫氨基-3′-(異二氫氮雜茚-2″-基)-阿霉素(Q3)，如果R-P為H，-R′為3-吡咯啉-1-基，則Q4為3′-脫氨基-3′-(3″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素(Q4)；如果R-P為H，-R′為3-吡咯烷酮-1-基，則Q5為3′-脫氨基-3′-(3″-吡咯烷酮-1″-基)-阿霉素(Q5)；如果R-P為H，-R′為2-吡咯啉-1-基，則Q6為3′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素(Q6)，如果R-P為H，-R′為3-哌啶酮-1-基，則Q7為3′-脫氨基-3′-(3″-哌啶酮-1″-基)-阿霉素(Q7)；如果R-P為H，-R′為1，3-四氫吡啶-1-基，則Q8為3′-脫氨基-3′-(1″，3″-四氫吡啶-1″-基)-阿霉素(Q8)。
利用烷基化作用在5元環(huán)中摻入道諾糖胺氮原子的化合物體外活性比在6元環(huán)摻入道諾糖胺氮原子的它們的對(duì)應(yīng)物高10-50倍(這些對(duì)比物為Q5和Q7以及Q6和Q8)。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，在式Q14-O-R-P物質(zhì)中，R和P不為氫。在P不為氫時(shí)，為P1、P2和P3，適宜地P1為L(zhǎng)H-RH激動(dòng)劑載體、LH-RH拮抗劑載體或縮短的LH-RH類似物載體，P2為縮短的促生長(zhǎng)素抑制素類似物，P3為鈴蟾肽拮抗劑。
適宜地，P1為Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd，其中Xxx為氫或二氨基取代基，如A2Bu或A2Pr，其中Aaa為Glp，那么Bbb為His，Ccc為Trp，和Ddd為Gly-NH2，Aaa為Ac-D-Nal(2)，Ac-D-Phe或AcD-Phe(4Cl)，那么Bbb為D-Phe(4Cl)或D-Phe，Ccc為D-Pal(3)和D-Trp，Ddd為D-Ala-NH2；并且當(dāng)Aaa-Bbb-Ccc為Ac，那么Ddd為-NH
其中當(dāng)Aaa為D-Phe，那么Bbb為Tyr，Ccc為Val，Ddd為Thr或Trp；當(dāng)Aaa為D-Trp，那么Bbb為Phe，Ccc和Ddd為Thr，和P3為Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuBbb-NH2其中Aaa為不存在，D-Tpi或D-Phe，Bbb為(CH2-NH)Leu，(CH2-NH)Phe，(CH2-NH)Trp，(CH2-N)Tac或(CH2-N)DM-Tac。
在本發(fā)明LH-RH結(jié)合類似物的新化合物中，通過如式VII所列的二羧酸間隔區(qū)，細(xì)胞毒基團(tuán)Q與LH-RH類似物上的D-Lys側(cè)鏈或與其上的Xxx基團(tuán)相連Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)m(Q14-O-R)n-Leu-Arg-Pro-Ddd(VII)其中m為1或0，n為1或2，前提是當(dāng)m為1，即(Xxx)為A2Bu或A2Pr時(shí)，n為1或2，當(dāng)m為0，即(Xxx)為H時(shí)，n為1。
在本發(fā)明促生長(zhǎng)素抑制素結(jié)合類似物的新化合物中，通過如下式VIII所列的二羧酸間隔區(qū)，細(xì)胞毒基團(tuán)Q與促生長(zhǎng)素抑制素類似物的氨基末端相連
在本發(fā)明鈴蟾肽拮抗劑結(jié)合類似物的新化合物中，通過如式IX所列的間隔區(qū)，細(xì)胞毒基團(tuán)Q與鈴蟾肽拮抗劑的氨基末端相連。
Q14-D-R-Aaa-Gln-Trp-Ala-VaL-Gly-His-LeuBbb-NH2(IX)本發(fā)明尤其優(yōu)選的具體實(shí)例為含有Q1和Q6作為細(xì)胞毒基團(tuán)，戊二酸(n＝3)作為與Q1(阿霉素)或Q6(2-吡咯啉并阿霉素)形成14-O-酯鍵并與肽載體形成羧酸胺鍵的二羧酸間隔區(qū)的那些肽結(jié)合物。
本發(fā)明的最優(yōu)選的具體實(shí)例為下式的細(xì)胞毒LH-RH類似物
1.Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q114-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；2.Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q614-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；下式的細(xì)胞毒性促生長(zhǎng)素抑制素類似物
和下式的細(xì)胞毒性鈴蟾肽拮抗劑類似物9. Q114O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2；10.Q614-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH211.Q114-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2；和12.Q614-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2.
在與相鄰或分離的，即α，β-或α，γ-羥胺的氮形成部分飽和雜環(huán)的新方法中，使用大量過量，適宜地為過量30倍的鹵代醛，在無水惰性有機(jī)極性非羥基(非質(zhì)子的)溶劑，適宜地為二甲基甲酰胺中進(jìn)行反應(yīng)的第一個(gè)步驟，其中4-碘丁醛和5-碘戊醛為尤其有效的。然而，本發(fā)明不局限于此，溴可被用來代替碘。此反應(yīng)以及后續(xù)步驟可在室溫下進(jìn)行。
使用過量，適宜地為過量2-4倍的有機(jī)堿進(jìn)行堿化反應(yīng)步驟。叔胺如三烷基胺適用于此目的。
通過在水存在下，用有機(jī)酸處理將由此形成的二環(huán)打開以釋放相鄰或分離的羥基，可使用稀釋的含水三氟乙酸，適宜地為在惰性有機(jī)溶劑如乙腈中的溶液。通過減壓除去揮發(fā)物，用己烷萃取過量的鹵代化合物，并在HPLC中純化殘余物來純化產(chǎn)物。
縮寫為了描述本發(fā)明的肽和它們的衍生物，使用肽化學(xué)技術(shù)中普遍接受并在由IUPACIUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的常用的氨基酸縮寫(歐洲生物化學(xué)雜志，138，9-37(1984))。
各氨基酸殘基的縮寫以氨基酸的俗名為基礎(chǔ)，例如Glp為焦谷氨酸，His為組氨酸，Trp為色氨酸等。除非另有說明，縮寫指的是L異構(gòu)體形式的氨基酸，如Ser為L(zhǎng)-絲氨酸，D-Lys為D-賴氨酸。
本發(fā)明非常見氨基酸的縮寫如下D-Nal(2)為D-3-(2-萘基)丙氨酸，D-Pal(3)為D-3-(3-吡啶基)丙氨酸，D-Phe(4Cl)為D-4-氯苯丙氨酸。
根據(jù)常規(guī)書寫肽序列，其中N-末端氨基酸位于左邊，C-末端氨基酸位于右邊，如Glp-His-Trp。
式Leu(CH2-NH)Leu-NH2描述位于亮氨酸和肽序列C末端的亮氨酰胺殘基之間的被還原的肽鍵。
使用的其它縮寫為A2Bu二氨基丁酸A2Pr二氨基丙酸BN鈴蟾肽BOP試劑苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽DIPEAN，N-二異丙基乙胺DM-DOX道諾糖胺修飾的阿霉素DMFN，N-二甲基甲酰胺DMTac5，5-二甲基-噻唑烷-4-羧酸DOX阿霉素Fmoc9-芴基甲氧羰基glt-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-，戊二酰基Glt2O戊二酸酐HOBt1-羥基苯并三唑HO-glt-OH戊二酸HOSuN-羥基琥珀酰亞胺HPLC高效液相色譜TFA三氟乙酸Tac噻唑烷-4-羧酸Tpi2，3，4，9-四氫-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚-3-羧酸使用裝有168型二極管陣列檢測(cè)儀的Beckman分析型HPLC系統(tǒng)和System Gold色譜軟件(Beckman)來監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)并檢查本發(fā)明化合物的純度。使用的柱為DynamaxC-18(250×4.6mm；孔大小300；顆粒大小12μm)。溶劑體系由兩種成分組成(i)0.1％TFA水溶液，和(ii)0.1％TFA的70％含水乙腈的溶液，并以1分鐘增加1％(ii)的線性梯度形式使用以監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)。用于檢查純度，該體系以等梯度形式使用。
使用Beckman342型半制備HPLC體系來分離和純化本發(fā)明的化合物。柱為Aquapore Octyl(250×10mm；孔大小300；顆粒大小15μm)。溶劑體系為與上面分析型HPLC中的相同。分析使用Bruker ARX300 NMR分光計(jì)(300MHz 1H頻率，75MHz13C頻率)和電子噴射質(zhì)譜儀Finnigan-MAT TSQ 7000來鑒定阿霉素衍生物的結(jié)構(gòu)。肽載體的合成通常以藥物學(xué)可接受的非毒性鹽如酸加成鹽的形式將本發(fā)明的化合物給藥。酸加成鹽的例子為氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、單寧酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、藻酸鹽，pamoate、蘋果酸鹽、抗壞血酸鹽、酒石酸鹽等。如果以片劑形式給予活性成分，該片劑可包含藥物學(xué)可接受稀釋劑，包括粘合劑如黃蓍膠、玉米淀粉或明膠，崩解劑如藻酸及潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂。
如果需要以液體形式給藥，甜味劑和/或增香劑可被用作藥物學(xué)可接受稀釋劑的一部分，靜脈注射可以等滲生理鹽水、磷酸緩沖液等形式完成。
藥物組合物通常包含與常規(guī)的藥物學(xué)可接受載體相結(jié)合的肽。通常，當(dāng)靜脈給藥時(shí)，劑量為每千克宿主體重為約1-約100微克肽；口服劑量將更高?？傊ǔＲ耘c使用其它LHRH、促生長(zhǎng)素抑制素和鈴蟾肽類似物的臨床治療相同方式來進(jìn)行使用這些肽的治療。
這些肽可被通過經(jīng)靜脈、皮下、肌肉內(nèi)、口服、鼻內(nèi)或陰道對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行給藥以通過與特異受體結(jié)合而獲得生物激素作用。在LHRH類似物的情況下，這些作用包括可逆的生殖腺活動(dòng)的抑制，在促生長(zhǎng)素抑制素類似物的情況下，抑制胃腸機(jī)能。有效劑量隨給藥形式和被治療的哺乳動(dòng)物的具體種類而變化。一個(gè)典型的劑型實(shí)例為含有該肽的生理鹽水溶液，施用該溶液以提供約0.1-2.5mg/kg體重范圍內(nèi)的劑量?？梢怨腆w形式或液體形式進(jìn)行肽的口服給藥。
可通過任何肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行本發(fā)明肽載體的合成。適宜方法的總匯可在M.Bodanszky，《肽合成原理》，Springer-Verlag，Heidelberg，1984中找到。固相肽合成方法可在J.M.Stewart和J.D.Young的教科書，《固相肽合成》，PierceChem.CO.，Rockford，IL，1984(第二版)中以及G.Barany等的綜述《國(guó)際肽和蛋白質(zhì)研究雜志》30，705-739(1987)中查找到。
本發(fā)明所采用的LH-RH類似物載體的合成詳細(xì)描述在美國(guó)專利5,258,492(Sandor Bajusz和Andrew V.Schally，1993年11月2日)的實(shí)施例中以及Bajusz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，1637-1641(1988)和86，6318-6322(1989)和Janaky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，1023-1027和972-976(1992)的論文中。
本發(fā)明所采用的促生長(zhǎng)素抑制素類似物載體的合成詳細(xì)描述在美國(guó)專利4,650,787(1987年3月17日，Andrew V.Schally和RenZ.Cai.)的實(shí)施例中。對(duì)合成的描述也可在Cai等，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 83，1896-1900(1986)和Proc.Natl.Sci.USA 84，2502-2506(1987)的論文中查找到。
本發(fā)明所采用的鈴蟾肽拮抗劑載體的合成詳細(xì)描述在Coy等，《生物化學(xué)雜志》263，5056-5060(1988)和264，14691-14697(1989)和Cai等，《肽》13，267-271(1992)和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，12664-12668(1994)的論文中。
本發(fā)明所采用的阿霉素衍生物的合成及它們與不同肽載體的結(jié)合物的形成在下面實(shí)施例中進(jìn)行了詳細(xì)描述，其中這些實(shí)施例意在說明而不起限制作用。實(shí)施例1N-Fmoc-Dox14-O-半戊二酸酯的制備和分離將50mg(86μmol)DOX鹽酸鹽溶解在1ml DMF中，并加入30mg(90μmol)Fmoc-Osu，接著加入31μl(180μmol)DIPEA。攪拌3小時(shí)后，分析型HPLC檢測(cè)反應(yīng)完成。在Speed Vac高真空蒸發(fā)器中讓溶劑蒸發(fā)干，并借助于與0.1％TFA水溶液的摩擦將殘余物結(jié)晶。將結(jié)晶過濾并用冷乙醚洗滌一次以除去痕量過量的Fmoc-Osu。在干燥器中干燥后，獲得質(zhì)量為62mg，98％純度的N-Fmoc-Dox。產(chǎn)率94％。
在存在26.1μL(150μmol)DIPEA時(shí)，將該中間體與11.4mg(100μmol)Glt2O的1ml無水DMF溶液反應(yīng)過夜。在Speed Vac中將溶劑蒸發(fā)掉，并借助于與0.1％(v/v)TFA水溶液的摩擦將殘余油狀物固化。如分析型HPLC所檢測(cè)的，由此得到的粗物質(zhì)含有70％N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯，20％未反應(yīng)的N-Fmoc-DOX和10％其它不純物。此粗產(chǎn)物可不經(jīng)進(jìn)一步純化而用于制備肽DOX結(jié)合物。當(dāng)此粗物質(zhì)溶解于含0.1％TFA的20ml 60％乙腈水溶液中并上樣于半制備性HPLC時(shí)，獲得了45.7mg 98％純度的N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯終產(chǎn)物(收率64％)。實(shí)施例23′-脫氨基-3′-(吡咯烷-1″-基)阿霉素TFA鹽(Q2)和其14-O-半戊二酸酯(AN-193)TFA鹽的制備和分離將50mg(86μmol)DOX鹽酸鹽溶解在lml DMF中，并加入171μl(1.3mmol)15倍過量的1，4-二碘丁烷，接著加入45μl(260μmol)3倍過量的DIPEA。室溫下將反應(yīng)混合物攪拌過夜。如分析型HPLC所檢測(cè)，在16小時(shí)后反應(yīng)完成。在Speed Vac中蒸發(fā)掉溶劑，將殘余油狀物溶解在3ml 0.1％TFA的水溶液中，用乙醚萃取以除去過量的1，4-二碘丁烷。接著將含水提取物上樣至HPLC中，獲得質(zhì)量為41.6mg，98％純度的DOX衍生物(產(chǎn)率68％)。
幾乎如實(shí)施例1所描述，將由此獲得的41.6mg(58μmol)3′-脫氨基-3′-(吡咯烷-1″-基)-阿霉素TFA鹽(Q2)與1.2當(dāng)量Glt2O的無水DMF溶液反應(yīng)。產(chǎn)率為35％(16.9mg)，純度為98％。實(shí)施例33′-脫氨基-3′-(異二氫氮雜茚-2″-基)阿霉素TFA鹽(Q3)的制備和分離將50mg(86μmol)DOX鹽酸鹽溶解在1ml DMF中，加入226mg(1.3mmol)15倍過量的α，α′-二氯-鄰二甲苯，接著加入45μl(260μmol)3倍過量的DIPEA和催化量的Nal。16小時(shí)后，用Speed Vac除去溶劑，并將殘余物溶解在3ml 0.1％TFA水溶液中，用3ml乙醚萃取以除去過量的鹵代化合物。將由此獲得的粗物質(zhì)上樣至HPLC。純化后，獲得36mg，98％純度的最終產(chǎn)物(產(chǎn)率55％)。實(shí)施例43′-脫氨基-3′-(3″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素TFA鹽(Q4)的制備和分離將50mg(86μmol)DOX鹽酸鹽溶解在1ml DMF中，并加入136.8μl(1.3mmol)15倍過量的順-1，4-二氯-2-丁烯(Aldrich)，接著加入45μl(260μmol)3倍過量的DIPEA。16小時(shí)后，在Speed Vac中除去溶劑，將殘余物溶解在3ml 0.1％TFA水溶液中，并用3ml己烷萃取以除去過量的鹵代化合物。將由此獲得的粗物質(zhì)上樣至HPLC。純化后，獲得22.6mg 98％純度的最終產(chǎn)物(產(chǎn)率37％)實(shí)施例51-氯-4-溴-2-丁酮(C4H6ClBrO)和1-氯-5-溴-2-戊酮(C5H8ClBrO)的制備和分離在乙醚中，將100.8μl(1mmol)3-溴丙酰氯(Aldrich)與過量的重氮甲烷反應(yīng)。1小時(shí)后，洗脫醚溶液并在TLC進(jìn)行斑點(diǎn)試驗(yàn)。通過Merck Art NO.5554預(yù)涂敷硅膠60 F254的薄層色譜鋁片被用作固定相，CHCl3∶MeOH 95∶5(V/V)作為流動(dòng)相。為了斑點(diǎn)試驗(yàn)，在洗脫后，將2，4-二硝基苯肼試劑(Vogel實(shí)驗(yàn)有機(jī)化學(xué)教材，P.1061，第三版，Longmans，紐約)被噴射至TLC片上。由形成的重氮甲基酮衍生物顯示出Rf為0.3的黃色斑點(diǎn)。接著在乙醚中將醚溶液與無水HCl反應(yīng)，將重氮甲基酮轉(zhuǎn)化為所需最終產(chǎn)物1-氯-4-溴-2-丁酮。該產(chǎn)物在相同的溶劑體系中使用上述斑點(diǎn)試驗(yàn)試劑，顯示出氧代化合物特征性的黃色斑點(diǎn)，Rf為0.8。在溶劑蒸發(fā)后，將粗產(chǎn)物上柱(15cm長(zhǎng)，2.5cm直徑)，其中柱填充有15g硅膠，Merck，9385級(jí)，230-400目，孔大小60。液體流動(dòng)相為純CHCl3?；旌虾兴枳罱K產(chǎn)物的級(jí)份(以上面詳細(xì)描述的斑點(diǎn)試驗(yàn)為特征)并蒸發(fā)至干燥。獲得質(zhì)量為1.5g的清亮油狀物。收率＝80％。
除了采用4-溴丁酰氯代替3-溴丙酰氯外，幾乎與用于1-氯-4-溴-2-戊酮相同的方法從4-溴丁酰氯制備1-氯-5-溴-2-戊酮。獲得1.6g清油，收率＝80％。實(shí)施例63′-脫氨基-3′-(3″-吡咯烷酮-1′-基)阿霉素TFA鹽(Q5)的制備和分離將50mg(86μmo1)DOX鹽酸鹽溶解在1ml DMF中，并加入241mg(1.3mmol)15倍過量的1-氯-4-溴-2-丁酮，接著加入45μl(260μmol)3倍過量的DIPEA。16小時(shí)后，在Speed Vac中除去溶劑，并將殘余物溶解在3ml 0.1％TFA水溶液中，用3ml己烷萃取以除去過量的鹵代化合物。將由此獲得的粗物質(zhì)上樣至HPLC。純化后，獲得20.6mg 98％純度的最終產(chǎn)物(產(chǎn)率33％)。實(shí)施例73′-脫氨基-3′-(3″-哌啶酮-1″-基)-阿霉素TFA鹽(Q7)的制備和分離將50mg(86μmol)DOX鹽酸鹽溶解在1ml DMF中，并加入260mg(1.3mmol)15倍過量的1-氯-5-溴-2-戊酮，接著加入45μl(260μmol)3倍過量的DIPEA。16小時(shí)后，在Speed Vac中除去溶劑，并將殘余物溶解在3ml 0.1％TFA水溶液中，用3ml己烷萃取以除去過量的鹵代化合物。將由此獲得的粗物質(zhì)上樣至HPLC中。純化后，獲得18mg 95％純的最終產(chǎn)物(產(chǎn)率28％)。實(shí)施例84-碘丁醛和5-碘戊醛的制備和分離將1.3mL(10mmol)2-(3-氯丙基)-1，3-二氧戊環(huán)(4-氯-正丁醛乙二醇縮醛)溶解在200ml含30g(200mmol，20倍過量)Nal的丙酮中。將溶液回流24小時(shí)，接著蒸發(fā)至干燥。使用100mL乙醚從無機(jī)固體殘余物中萃取有機(jī)物。接著用50mL H2O，50mL5％Na2S2O3水溶液將醚溶液洗滌-次，并用50mL H2O洗滌3次。真空除去乙醚，將殘余油狀物溶解在3mL 50％乙酸水溶液中。1小時(shí)后，將100ml乙醚加至溶液中，通過用50mL H2O洗滌3次除去乙酸以及乙二醇。在TLC上純CHCl3中以Rf為0.8將主要產(chǎn)物洗脫。用于醛功能團(tuán)的斑點(diǎn)試驗(yàn)與實(shí)施例5中對(duì)于酮所描述的相同。接著除去乙醚，并將黑色油狀物上柱(15cm長(zhǎng)，2.5cm直徑)，其中該柱裝填有15g硅膠，Merck，9385級(jí)，230-400目，孔大小60。液體流動(dòng)相為CHCl3。混合含有最終產(chǎn)物(以上面詳細(xì)描述的斑點(diǎn)試驗(yàn)來特征)的級(jí)份并蒸發(fā)至干燥。獲得1.6g黃色油狀物。產(chǎn)率80％。
幾乎以相同方法從2-(4-氯丁基)-1，3-二氧戊環(huán)(5-氯-正戊醛乙二醇縮醛)(Fluka)獲得5-碘戊醛。獲得1.65g黃色油狀物。產(chǎn)率80％。實(shí)施例93′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素TFA鹽(Q6的制備和分離將50mg(86μmol)DOX鹽酸鹽溶解在1ml DMF中，并加入515mg(2.6mmol)30倍過量的4-碘丁醛，接著加入45μl(260μmol，3倍過量)DIPEA。1小時(shí)后，將100μl冰醋酸加入反應(yīng)混合物中，接著將該反應(yīng)混合物滴加至5ml 0.1％TFA的70％乙腈水溶液中(HPLC體系的溶劑ii)。將溶液用2mL 0.1％TFA水溶液稀釋，接著在Speed Vac中除去乙腈。將產(chǎn)生的溶液用己烷萃取以除去過量的鹵代化合物。將由此獲得的物質(zhì)上樣至HPLC。純化后，獲得52mg 98％純度的最終產(chǎn)物。(產(chǎn)率85％)。實(shí)施例103′-脫氨基-(1″，3″-四氫吡啶-1″-基)-阿霉素TFA鹽(Q8)的制備和分離將50mg(86μmol)DOX鹽酸鹽溶解在1mL DMF中，并加入552mg(2.6mmol)30倍過量的5-碘戊醛，接著加入45μl(260μmol)3倍過量的DIPEA。1小時(shí)后，將100μl冰醋酸加入到反應(yīng)混合物中，接著將該反應(yīng)混合物滴加至5ml 0.1％TFA的70％乙腈水溶液中(HPLC體系的溶劑ii)。將溶液用2mL 0.1％TFA水溶液稀釋，接著在Speed Vac中除去乙腈。將產(chǎn)生的溶液用己烷萃取以除去過量的鹵代化合物。將由此獲得的物質(zhì)上樣至HPLC。純化后，獲得46mg 98％純度的最終產(chǎn)物。(產(chǎn)率75％)。實(shí)施例11含DOX的細(xì)胞毒性LH-RH激動(dòng)劑類似物的制備和分離([D-Lys6(DOX14-O-glt)]LH-RH，Q114gL)將60mg(37.5μmol)[D-Lys6]LH-RH和52mg(64％純度，37.5μmol)N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯(參見實(shí)施例1)溶解在1mL DMF中，并加入22mg(50μmol)BOP試劑(Aldrich)、13.5mg(100μmol)HOBt及52μl(300μmol)DIPEA。室溫下攪拌1小時(shí)后反應(yīng)完畢。將溶劑蒸發(fā)，用3mL乙酸乙酯將殘余油狀物結(jié)晶并接著用3mL乙酸乙酯洗滌兩次。隨后將90mg粗固體物質(zhì)溶解在3mL DMF中并加入300μl派啶。5分鐘后，將反應(yīng)置于冰浴中，并通過加入300μl TFA、700μl吡啶和2mL DMF的混合物將其酸化。在將溶劑蒸發(fā)后，通過乙酸乙酯將殘余油狀物固化。將由此獲得的粗固體溶解在含0.1％TFA(i)的1mL 70％乙腈水溶液中，并用3mL 0.1％TFA水溶液(ii)稀釋，上樣至半制備性HPLC。獲得40mg(14.8μmol)98％純度的最終產(chǎn)物。產(chǎn)率48％。實(shí)施例12。
含2-吡咯啉并DOX的細(xì)胞毒性LH-RH激動(dòng)劑類似物的制備和分離([D-Lys6(2-吡咯啉并DOX14-O-glt)]LH-RH，Q614gl)將11.2mg(5μmol)Q114gl(參見實(shí)施例11)溶解在200μl DMF中，并加入30mg(150μmol，30倍過量)4-碘丁醛(實(shí)施例8)，接著加入3μl(17μmol)DIPEA。1小時(shí)后，反應(yīng)完畢(參見實(shí)施例9)，向反應(yīng)混合物中加入10μl冰醋酸，接著將反應(yīng)混合物滴加至1mL 0.1％TFA的70％乙腈水溶液。接著將該溶液用1mL 0.1％TFA水溶液稀釋，并真空除去乙腈。隨后將剩余水溶液用1mL己烷萃取，并上樣至HPLC。獲得質(zhì)量為7.6mg、99％純度的最終產(chǎn)物。(產(chǎn)率66％)。實(shí)施例13含DOX的細(xì)胞毒性促生長(zhǎng)素抑制素類似物的制備和分離
將20mg(14.5μmol)D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-VaL-Cys-Thr-NH2(Proc.NatL.Acad.Sci.USA1986，pp.1986-1990)和20mg(64％純度，14.5μmol)N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯(實(shí)施例1)溶解在200μl DMF中，并加入8.8mg(20μmol)BOP試劑(Aldrich)、5.4mg(40μmol)HOBt以及17μl(100μmol)DIPEA。室溫下，攪拌1小時(shí)后，反應(yīng)完畢。在真空除去溶劑后，殘余物用乙酸乙酯結(jié)晶。接著將該固體物質(zhì)溶解在1mL DMF中，并加入100μl哌啶。7分鐘后，將反應(yīng)置于冰浴中，并通過加入100μl TFA、300μl吡啶和2mL DMF的混合物將其酸化，在溶劑蒸發(fā)后，殘余油物用乙酸乙酯固化。將由此獲得的粗固體溶解在含0.1％TFA(i)的1mL 70％乙腈水溶液中，并用3mL 0.1％TFA水溶液(ii)稀釋，上樣至半制備性HPLC。獲得9.7mg(5.1μmol)95％純度的最終產(chǎn)物。實(shí)施例14含2-吡咯啉-1-基-DOX的細(xì)胞毒性促生長(zhǎng)素抑制素類似
Q614gS)將
4mg，5μmol)溶解在100μl DMF中，并加入2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-半戊二酸酯(4.1mg，5μmol)，接著加入BOP試劑(4.4mg，10μmol)、HOBt(100μmol)和DIPEA(50μmol)。室溫下，攪拌2小時(shí)后，用20μl AcOH酸化反應(yīng)混合物，并用含0.1％TFA的500μ1 70％乙腈水溶液稀釋，再進(jìn)一步用700μl 0.1％TFA水溶液稀釋，上樣至HPLC。獲得3.9mg(產(chǎn)率40％)的99％純度的最終產(chǎn)物。
如實(shí)施例9中所述，通過將DOX14-O-半戊二酸酯與4-碘丁醛反應(yīng)來制備2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-半戊二酸酯。
如實(shí)施例11所述，從N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯，通過裂解Fmoc保護(hù)基制備DOX14-O-半戊二酸酯。(產(chǎn)率40％)。實(shí)施例15含DOX的細(xì)胞毒性鈴蟾肽拮抗劑的制備和分離(DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2，Q114gB)將20mg(15.8μmol)Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2(國(guó)際肽蛋白質(zhì)研究雜志38，1991，pp.593-600)和22mg(64％純度，15.8μmol)N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯(實(shí)施例1)溶解在200μl DMF中，并加入8.8mg(20μmol)BOP試劑(Aldrich)、5.4mg(40μmol)HOBt以及17μl(100μmol)DIPEA。室溫下，攪拌1小時(shí)后，反應(yīng)完畢。在真空除去溶劑后，殘余物用乙酸乙酯結(jié)晶。接著將該固體物質(zhì)溶于1mL DMF中，并加入100μl哌啶。5分鐘后，將反應(yīng)置于冰浴中，并通過加入100μLTFA、300μL吡啶和2mL DMF的混合物將其酸化。在溶劑蒸發(fā)后，殘余油狀物用乙酸乙酯固化。將由此獲得的粗固體溶解在含0.1％TFA(i)的1mL 70％乙腈水溶液中并用3mL 0.1％TFA水溶液(ii)稀釋，上樣至半制備型HPLC。獲得13.5mg(7.1μmol)98％純度的最終產(chǎn)物，產(chǎn)率45％。實(shí)施例16含2-吡咯啉-1-基DOX的細(xì)胞毒性鈴蟾肽拮抗劑類似物的制備和分離2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2，Q614gB將9.5mg(5μmol)Q114gB(實(shí)施例15)溶解在200μl DMF中，并加入30mg(150μmol，30倍過量)4-碘丁醛(實(shí)施例8)，接著加入3μl(17μmol)DIPEA。1小時(shí)后，反應(yīng)完畢(實(shí)施例9)，將10μl冰醋酸加入反應(yīng)混合物中，接著將反應(yīng)混合物滴加至1mL 0.1％TFA的70％乙腈水溶液中。將該溶液用1mL 0.1％TFA水溶液稀釋，真空除去乙腈。隨后將殘余的水溶液用1mL己烷萃取，上樣至HPLC。獲得6mg 98％純度的最終產(chǎn)物。(產(chǎn)率60％)。體外細(xì)胞毒活性的測(cè)定從Dr.Gunter Berndhardt(德國(guó)Regensburg大學(xué))獲得MXT雌激素依賴型小鼠乳腺癌細(xì)胞系，在測(cè)定本發(fā)明化合物的抗增殖活性中所采用的所有其它細(xì)胞系從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。
為了評(píng)價(jià)類似物的活性，以通過結(jié)晶紫染色細(xì)胞來定量測(cè)定生物量為基礎(chǔ)，采用微滴定平板的比色細(xì)胞毒性分析，其中生物量的定量與細(xì)胞數(shù)目的確定極為相關(guān)(Reile等；分析生物化學(xué)187，262-267，1990；Bernhardt G.等，癌癥研究與臨床腫瘤雜志(1992)，118，35-43；Spruss Th.等，癌癥研究與臨床腫瘤雜志117，435-443，1991；Gillies R.J.，分析生物化學(xué)雜志，159，109-113，1986；Kueng，W.等；分析生物化學(xué)，182 16-19，1989)。分析方法在96孔平板上接種細(xì)胞1至2天后，將培養(yǎng)基換成含待測(cè)試化合物的新鮮培養(yǎng)基和僅用作對(duì)照培養(yǎng)物的新鮮培養(yǎng)基。在培養(yǎng)一段不同的時(shí)間后，將細(xì)胞用戊二醛固定，并4℃下貯存在胎牛血清(FBS)中直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。將細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，并用70％乙醇水溶液提取結(jié)合的染料。分別用ELA Reader(Bio-Tek Instruments)或Biomek1000(Beckman)測(cè)定590nm或600nm處的光密度。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表八個(gè)培養(yǎng)孔的平均值。用T/C＝(T-C0)/(C-C0)來計(jì)算T/C值，其中T＝處理組培養(yǎng)物的光密度，C＝對(duì)照組(未處理)培養(yǎng)物的光密度，C0＝培養(yǎng)開始時(shí)培養(yǎng)物的光密度(t＝0)。實(shí)施例17DOX的道諾糖胺修飾衍生物的體外細(xì)胞毒活性表17-1表明在體外阿霉素及其道諾糖胺修飾衍生物對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系的影響。
其道諾糖胺N被結(jié)合至具有反應(yīng)活性功能團(tuán)的五元環(huán)中的細(xì)胞毒性基團(tuán)活性比它們類似的六元環(huán)對(duì)應(yīng)物高5-50倍，例如3-吡咯啉-1-基-DOX(Q5)和3-哌啶-1-基-DOX(Q7)以及2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)和1，3-四氫-吡啶-1-基-DOX(Q8)。
表17-1在體外阿霉素和其道諾糖胺修飾的衍生物對(duì)MCF人乳腺癌細(xì)胞系的作用
在96孔平板上將細(xì)胞培養(yǎng)于含5％HI-DCC-FBS(熱失活葡聚糖包被活性炭處理的胎牛血清)的IMEM培養(yǎng)基中。通過結(jié)晶紫染色法確定處理和對(duì)照平板中的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目，并以T/C值表示，其中T/C＝(T-C0/C-C0)×100[T＝處理組培養(yǎng)物的吸光率，C＝對(duì)照培養(yǎng)物的吸光率，C0＝培養(yǎng)開始時(shí)的培養(yǎng)物的吸光率(t＝0)。測(cè)得的吸光率與細(xì)胞數(shù)目成正比]。較低的T/C值說明由于處理而導(dǎo)致的癌細(xì)胞存活的減少。即75表示與對(duì)照100％相比，75％的細(xì)胞存活或25％抑制。實(shí)施例18
DOX在LH-RH激動(dòng)劑肽結(jié)合物Q114gL中和超活性2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)在LH-RH激動(dòng)劑肽結(jié)合物Q614gL中的體外細(xì)胞毒活性的充分保留。
表18-1表明在體外，分別與其與LH-RH激動(dòng)劑類似物的結(jié)合物[D-Lys6]LH-RH(Q114gL和Q614gL)相比，阿霉素和其道諾糖胺修飾衍生物2-吡咯啉-1-基-阿霉素(Q6)對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系及MXT雌激素依賴小鼠乳腺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響。表18-1
在96孔平板上，將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在含5％HI-DCC-FBS的IMEM培養(yǎng)基中。將MXT細(xì)胞培養(yǎng)在含0.6g/L L-谷氨酰胺和10％FBS中的RPMI1640培養(yǎng)基中。*如表17-1所示進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例19表19-1表明本發(fā)明含DOX的促生長(zhǎng)素抑制素類似物的體外細(xì)胞毒活性被充分保留。
表19-1在體外含阿霉素的細(xì)胞毒性促生長(zhǎng)素抑制素類似物對(duì)MIIA PaCa-2人胰癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的作用
在96孔平板上，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。
實(shí)施例20在體外，含阿霉素的鈴蟾肽拮抗劑的細(xì)胞毒類似物對(duì)CFPAC-1人胰癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響表20-1表明本發(fā)明含DOX的鈴蟾肽拮抗劑類似物的體外細(xì)胞毒活性被充分保留。表20-1
在24孔平板上，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中。
*Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-N)-Leu-NH2
*D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-N)-Tac-NH2激素衍生物被保留的結(jié)合特性。實(shí)施例21與載體肽[D-Lys6]LH-RH相比，細(xì)胞毒性LH-RH激動(dòng)劑類似物Q114gL(帶有阿霉素的[D-Lys6]LH-RH)和Q614gL(帶有2-吡咯啉-1-基-阿霉素的[D-Lys6]LH-RH)的激素活性及受體結(jié)合能力表21-1
表21-1中*如S.Vigh和A.V.Schally，《肽》5，241-247(1984)中所描述，在分散的大鼠垂體細(xì)胞超灌注系統(tǒng)中確定LH對(duì)類似物的反應(yīng)。
**如B.Szoke等，《肽》，15(2)，359-366(1994)中所描述，在使用[125I]標(biāo)記的[D-Trp6]LH-RH作為放射性配體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中測(cè)定類似物與大鼠垂體LH-RH受體和人乳腺癌受體的結(jié)合親和性。結(jié)合親和性用IC50值表示，即抑制50％的放射性配體的特異性結(jié)合所需的未標(biāo)記類似物的濃度。實(shí)施例22如Carlson等所描述，促生長(zhǎng)素抑制素類似物抑制生長(zhǎng)激素(GH)從灌注的大鼠垂體釋放，“釋放促甲狀腺素的激素刺激而促生長(zhǎng)素抑制素抑制生長(zhǎng)激素從灌注的大鼠腺垂體釋放”，《內(nèi)分泌學(xué)》，94，1709(1974)。因此，該方法被用來將本發(fā)明的細(xì)胞毒促生長(zhǎng)素抑制素類似物與它們的母體載體分子在它們的激素活性方面進(jìn)行比較。
分別與其細(xì)胞毒衍生物Q114gS98-1(DOX14-O-glt-S-98-1)和Q114gS121(DOX14-O-glt-S-121)相比，通過促生長(zhǎng)素抑制素類似物S-98-1
和S-121
對(duì)人生長(zhǎng)激素釋放激素(hGH-RH(1-29)NH2)的抑制誘導(dǎo)從超灌注的大鼠垂體細(xì)胞中釋放生長(zhǎng)激素。
在大鼠垂體超灌注系統(tǒng)中，以1nM促生長(zhǎng)素抑制素和同時(shí)1nMhGH-RH(1-29)NH2的劑量給藥3分鐘。再保持注入促生長(zhǎng)素抑制素類似物6分鐘。在灌注促生長(zhǎng)素抑制素期間(0分鐘)及給藥結(jié)束后30、60和90分鐘時(shí)測(cè)定GH對(duì)1nM hGH-RH(1-29)NH2的3分鐘給藥的反應(yīng)。數(shù)據(jù)示于表22-1中。表22-1
以占在給予促生長(zhǎng)素抑制素類似物之前，由注入3分鐘1nMhGH-RH(1-29)NH2所誘導(dǎo)的GH釋放的百分?jǐn)?shù)來表示。實(shí)施例23使用細(xì)胞毒性鈴蟾肽拮抗劑對(duì)受體結(jié)合的研究如前面(1)所描述，使用Bio-Rad Enzymobead Radio碘化試劑盒進(jìn)行[Tyr4]BN(Sigma)的放射碘化作用和分離單碘化[125I-Tyr4]BN。用Kris等(3)方法的改進(jìn)方法(2)，在24孔平板中使用鋪滿的Swiss 3T3細(xì)胞(從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得)進(jìn)行標(biāo)記的[Tyr4]BN的結(jié)合及由細(xì)胞毒鈴蟾肽拮抗劑類似物Q614gB的取代。接種3-5天后，將鋪滿的細(xì)胞用Hanks′平衡鹽溶液(HBSS)洗滌兩次，并在總體積為0.5ml的結(jié)合緩沖液中(含有50mM HEPES，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，5mM MgCl2和100ug/ml桿菌肽的DMEM，pH7.4)，在不存在或存在幾種濃度的未標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物(Q614gB或BN)的情況下，在37℃下將其與50pM[1251-Tyr4]BN保溫30分鐘。測(cè)定存在1uM未標(biāo)記配體時(shí)的非特異性結(jié)合。在用含0.1％BSA(pH＝7.4)的冰冷HBSS洗滌三次后，將細(xì)胞用0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA溶液洗脫并轉(zhuǎn)移至試管中。用γ-計(jì)數(shù)器(Micromedic Systems Inc，Huntsville，AL)測(cè)定放射性。使用McPherson(4)的放射配體結(jié)合分析程序評(píng)價(jià)結(jié)合數(shù)據(jù)。示于表23-1中的Ki值根據(jù)Cheng和Prusoff(5)公式計(jì)算得出。
1.Halmos等，癌癥通訊，85，111-118(1994)2.Cai，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112664-12668，(1994)3.Kris，等，生物化學(xué)雜志，26211215-11220，(1987)4.McPherson，G.A.藥物學(xué)方法雜志，14213-228，(1985)5.Cheng和Prusoff，生物化學(xué)藥理學(xué)，223099-3108，(1973)表23-1與鈴蟾肽比較，細(xì)胞毒性鈴蟾肽拮抗劑Q614gB(2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-leu-ψ-(CH2-N)Leu-NH2與Swiss 3T3細(xì)胞系中的鈴蟾肽受體的特異性結(jié)合的鑒定
與單獨(dú)的細(xì)胞毒基團(tuán)比較，激素結(jié)合物的有效性和細(xì)胞毒性實(shí)施例24用2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)細(xì)胞毒性LH-RH激動(dòng)劑類似物Q614gL(與Q614-O-半戊二酸酯相連的[D-Lys6]LH-RH)和(DOX)處理雌激素依賴性的MXT小鼠乳腺癌(KS-49)為了比較細(xì)胞毒性阿霉素衍生物Q6和其被靶向細(xì)胞毒性肽結(jié)合物Q614gL以及熟知的抗腫瘤劑DOX的腫瘤抑制活性，并確定最佳給藥方式和無毒劑量，將LH-RH受體陽性MXT(3.2)ovex腫瘤塊(1mm3)移植入雌性B6D2F1小鼠中。移植1天后，將小鼠隨機(jī)分成五個(gè)動(dòng)物組并開始處理。將化合物溶于0.1％三氟乙酸(pH2)中并腹膜內(nèi)給藥。分組、處理方案及劑量以及平均存活時(shí)間示于表24-1中。結(jié)果總結(jié)在表24-2和圖1中。
表24-2表明Q6和細(xì)胞毒性LH-RH類似物Q614gL處理對(duì)腫瘤體積及患有雌激素依賴性乳腺癌的小鼠的存活時(shí)間的作用。如表24-2所示，在第1，2，7，8，14和15天(組2)給藥1.25nmo1 Q6產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒性，平均存活時(shí)間為17.4天，明顯短于未處理對(duì)照組。相比之下，相同劑量的Q614gL(組6)產(chǎn)生30.8天的平均存活時(shí)間，這明顯長(zhǎng)于未處理對(duì)照組。也可通過比較組2(在16天時(shí)為1065mm3)和組6(在31天時(shí)為863mm3)的平均最終腫瘤體積來證明Q614gL比Q6高的功效。
在不同處理方案中，其中一周中五天給予0.5nmol藥物并連續(xù)給藥三周，比較Q6和Q614gL來證明相似的結(jié)論。
毒性劑量的阿霉素(總量1560nmol，平均存活時(shí)間20天)不能根除腫瘤，而用非毒性劑量(總量7nmol，平均存活時(shí)間＞31天)的Q614gL處理導(dǎo)致5只中2只動(dòng)物存活，并且腫瘤沒有發(fā)展。
表24-1
*從第9天至第12天，將劑量提高到2.5nmol從第9天至第12天，將劑量提高到5.0nmol*存活表24-2
**使用Duncan’s檢驗(yàn)，與對(duì)照數(shù)據(jù)相比存活時(shí)間明顯較長(zhǎng)(p＜0.01)，存活時(shí)間明顯較短(p＜0.01)或(p＜0.05)。實(shí)施例25僅用(DOX)、細(xì)胞毒LH-RH類似物T-107和Q114gL處理，對(duì)雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌的作用(KS-55)試驗(yàn)化合物Q114gL與[D-lys6]LH-RH相連的阿霉素14-O-半戊二酸酯T-107與[D-lys6]LH-RH相連的N-戊二酰-阿霉素Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.89.pp.972-976(1992))；和DOX分析如下進(jìn)行為了確定最大耐受劑量并比較效果，將MXT(3.2)ovex腫瘤塊(1mm3)皮下移植入雌性B6D2F1小鼠。移植1天后，將小鼠隨機(jī)分成五個(gè)動(dòng)物組，用腹膜內(nèi)單次注射處理它們。分組和注射示于表25-1中。此表還表明當(dāng)測(cè)量體積時(shí)仍患有腫瘤的小鼠的數(shù)目和各組的平均存活時(shí)間。腫瘤體積變化示于圖2中。化合物溶解在0.1％TFA(pH2.0)中。在第10，13，17和20天時(shí)測(cè)量腫瘤體積。
如表25-1和圖2所示，劑量為850nmol/20g小鼠的T-107，(即與[D-Lys6]LH-RH相連的N-戊二酰-DOX)在抑制腫瘤生長(zhǎng)中完全無效。相反，劑量為非毒性劑量650nm/20g小鼠的Q114gL(與[D-Lys6]LH-RH相連的14-O-戊二酰-DOX)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制(圖)。單劑為650nmol/20g小鼠的單獨(dú)的DOX具有很高的毒性(平均存活時(shí)間13.6天)并且功效明顯較差于Q114gL(圖2)。
表25
*存活時(shí)間明顯短于對(duì)照組(p＜0.01)**與對(duì)照組相比，存活時(shí)間明顯較長(zhǎng)(p＜0.01)或*(p＜0.05)(在第2天意外死亡的一只小鼠從這兩組中除去)。實(shí)施例26細(xì)胞毒性LH-RH類似物對(duì)雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌的作用(KS-47)用于處理的物質(zhì)在一個(gè)以前的實(shí)驗(yàn)中，日劑量為20nmol的Q2處理17天對(duì)腫瘤生長(zhǎng)僅具有中等抑制作用，并在為40nmol劑量時(shí)具有毒性(平均存活時(shí)間為14.6天)。選擇了日劑量為30nmol用于本實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)比較Q214gL(與[D-Lys6]LH-RH相連的Q2)、Q2(吡咯啉-1-基-阿霉素)、[D-Lys6]LH-RH和[D-Lys6]LH-RH+Q2的功效和毒性。
將MXT(3.2)ovex腫瘤塊(1mm3)移植入雌性B6D2F1小鼠中。移植1天后通過每天腹膜內(nèi)注射開始處理并持續(xù)12天。如表26-1所示，所有組接受等摩爾量的化合物。在第10、14和18天測(cè)量腫瘤并計(jì)算腫瘤體積。數(shù)據(jù)示于表26-1和圖3中。
用每日劑量為30nmol的道諾糖胺修飾的阿霉素類似物Q2(吡咯啉-1-基-DOX)劑量對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制作用(腫瘤體積在第14天時(shí)為144mm3，而對(duì)照組為1391mm3)，但在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之前，殺死了所有動(dòng)物，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性(平均存活17.9天)。類似地，Q2與[D-Lys6]LH-RH混合(混合物)產(chǎn)生強(qiáng)的腫瘤抑制作用(腫瘤體積，在第14天時(shí)為80mm3)，但平均存活時(shí)間(18.5天)明顯短于未處理對(duì)照組(23.1天)。作為用Q214gL(與[D-Lys6]LH-RH共價(jià)結(jié)合的Q2)的處理結(jié)果，兩個(gè)動(dòng)物死亡，一個(gè)在第16天，另一個(gè)在第26天死亡。從8個(gè)存活動(dòng)物中，僅一個(gè)在第18天最后的測(cè)量中腫瘤發(fā)展，并且它們均看來很健康，但后來它們均開始長(zhǎng)出腫瘤。該組的平均存活時(shí)間明顯較長(zhǎng)(28.3天)于對(duì)照組。單獨(dú)用[D-Lys6]LH-RH類似物處理不影響腫瘤生長(zhǎng)。
該實(shí)驗(yàn)表明Q214gL比細(xì)胞毒性基團(tuán)Q2具有更高的功效和較低的外周毒性是由于細(xì)胞毒基團(tuán)與靶向載體LH-RH類似物的共價(jià)結(jié)合的結(jié)果。
表26-1細(xì)胞毒LH-RH類似物對(duì)雌激素依賴性MXT小鼠乳腺癌生長(zhǎng)及患有腫瘤的小鼠的存活時(shí)間的作用
所有的日劑量為30nmol摩爾當(dāng)量明顯短于對(duì)照組(p＜0.05)*用Duncan’s檢驗(yàn)測(cè)得明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(p＜0.01)。
實(shí)施例272-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)和細(xì)胞毒LH-RH激動(dòng)劑類似物Q614gL(與[D-Lys6]LH-RH相連的Q614-O-半戊二酸酯)對(duì)雄激素依賴性大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌生長(zhǎng)的作用。
將患有激素依賴性Dunning R-3327-H前列腺癌的雄性哥本哈根大鼠用Q614gL，一種由與2-吡啉啉-1-基-阿霉素相連的激動(dòng)劑[D-Lys6]LH-RH組成的促黃體生成素釋放激素(LH-RH)的新細(xì)胞毒類似物進(jìn)行處理。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將2-吡咯啉-1-基-阿霉素以50nmol/kg的濃度作為單一藥物(Q6)和與[D-Lys6]LH-RH的未結(jié)合混合物或與載體[D-Lys6]LH-RH結(jié)合(Q614gL)的形式給藥。第二次以50nmol/kg單獨(dú)的基團(tuán)Q6或與[D-Lys6]LH-RH混合給藥后，所有大鼠死亡，表示全身毒性癥狀，而用細(xì)胞毒LH-RH結(jié)合物Q614gL處理的所有動(dòng)物存活。使用150nmol/kg Q614gL的總劑量處理5周后，將腫瘤從實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的8.35±1.7cm3的最初體積減至4.47±0.8cm3，而對(duì)照組的腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，并測(cè)得為17.84±2.2cm3。用Q614gL的治療還明顯降低了腫瘤的重量和腫瘤的負(fù)擔(dān)。在設(shè)計(jì)用來比較Q6和Q614gL的功效和毒性的第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，治療方案由3次給予25nmol/kg Q6或25nmol/kg和50nmol/kg Q614gL組成。當(dāng)處理開始時(shí)，所有組的腫瘤體積在3.9-4.5cm3之間。處理5周后，用50nmol/kg Q614gL處理的大鼠中的腫瘤減少至2.3±0.51cm3，然而與未處理動(dòng)物的15.6±2.2cm3相比，25nmol/kg Q6仍然具有毒性，并僅可將最終腫瘤體積減少至6.76±1.4cm3，類似于用25nmol/kg Q614gL獲得的結(jié)果(6.74±cm3)。樣本的組織學(xué)評(píng)價(jià)表明僅在Q614gL處理組中有顯著的有絲分裂細(xì)胞的減少。在未處理的Dunning腫瘤樣本的膜上檢測(cè)到具有高結(jié)合能力的LH-RH受體，但在用Q614gL處理后，未能發(fā)現(xiàn)LH-RH的結(jié)合位點(diǎn)，AN-201和Q614gL的腫瘤生長(zhǎng)的抑制還與EGF受體的結(jié)合能力的顯著降低相關(guān)。如圖4-6所示，靶向的細(xì)胞毒LH-RH類似物Q614gL為一種有效的抗腫瘤劑，它導(dǎo)致大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌的衰退。我們的研究還表明細(xì)胞毒LH-RH類似物Q614gL比摻入的抗腫瘤基團(tuán)(Q6)的毒性更小，并且在抑制腫瘤生長(zhǎng)中明顯更具活性。實(shí)施例27的圖說明圖4，實(shí)驗(yàn)I在由3次使用50nmol/kg激動(dòng)劑[D-Lys6]LH-RH和50nmol/kg細(xì)胞毒LH-RH類似物Q614gL組成的處理期間，有大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌移植物的雄性哥本哈根大鼠的腫瘤體積，垂直線表示SEM。借助于Duncan’s新的多范圍檢驗(yàn)，與對(duì)照相比*p＜0.05；**p＜0.01。由箭頭表示的處理在第1、8和29天進(jìn)行。
+用Q6作為單一藥物或與[D-Lys6]LH-RH的未結(jié)合混合物處理的動(dòng)物在第二周死亡。在這兩組中顯示了在第8天記錄的腫瘤的體積。
圖5實(shí)驗(yàn)II用25nmol/kg2-吡咯啉-1-基-阿霉素(Q6)、25hmol/kg和50nmol/kg細(xì)胞毒LH-RH類似物Q614gL處理，對(duì)患有Dunning R-3327-H前列腺癌的大鼠的腫瘤體積的影響。垂直線表示SEM。與對(duì)照相比*p＜0.05；**p＜0.01。由箭頭表示的處理在第1、8和29天時(shí)進(jìn)行了3次。圖6，實(shí)驗(yàn)II用25nmol/kg 2-吡咯啉-1-基-阿霉素(Q6)、25nmol/kg和50nmo1/kg細(xì)胞毒LH-RH類似物Q614gL處理，對(duì)患有Dunning R-3327-H前列腺癌的哥本哈根大鼠的體重的影響。垂直線表示SEM。與對(duì)照相比*p＜0.05；**p＜0.01。由箭頭表示的處理在第1、8和29天時(shí)進(jìn)行了3次。實(shí)施例28對(duì)阿霉素(DOX)和定向細(xì)胞毒性LH-RH激動(dòng)劑類似物Q114gL(與DOX14-O-半戊二酸酯相連的[D-Lys6]LH-RH)對(duì)OX-1063人卵巢癌在裸鼠中生的作用的對(duì)比研究人上皮卵巢癌細(xì)胞系OV-1063來自一57歲老年婦女卵巢的轉(zhuǎn)移性乳頭狀囊狀腫瘤(Horowitz等(1985)腫瘤學(xué)42，332-337)。將1千萬個(gè)OV-1063細(xì)胞皮下注射到三個(gè)裸鼠中去讓腫瘤生長(zhǎng)。將1mm3的這些腫瘤塊移植至60個(gè)動(dòng)物中以用于體內(nèi)抑制生長(zhǎng)的研究。實(shí)驗(yàn)的目的是證實(shí)作為在OV-1063上存在LH-RH受體的結(jié)果，LH-RH的細(xì)胞毒結(jié)合物比它所含的細(xì)胞毒基團(tuán)DOX更為有效且毒性更小。因此，將細(xì)胞毒LH-RH結(jié)合物的作用與DOX、DOX與載體分子的混合物、單獨(dú)的載體以及未處理的對(duì)照組的作用進(jìn)行比較。將化合物溶解在0.9％氯化鈉水溶液中(生理鹽水)。
將平均腫瘤大小為約15mm3的小鼠分成六個(gè)組，其中每組9只動(dòng)物，并在腫瘤移植七天后接受下面的處理組1，生理鹽水；組2，Q114gL，劑量為700nmol/20g動(dòng)物；組3，Q114gL，劑量為413nmol/20g動(dòng)物(對(duì)于DOX的最大耐受劑量，MTD)；組4,413nmol/20g動(dòng)物(MTD)的DOX；組5,700nmol/20g DOX與700nmol/20g[D-Lys6]LH-RH的混合物；組6，載體激動(dòng)劑類似物[D-Lys6]LH-RH，劑量為700nmol/20g動(dòng)物。
OV-1063受體分析表明LH-RH的高親和性結(jié)合位點(diǎn)的存在。
結(jié)果如圖7所示，用413nmol/20g劑量的Q114gL處理(組3)獲得了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的強(qiáng)的抑制作用。動(dòng)物沒有顯示嚴(yán)重的毒性癥狀。與之相比，使用413nmol/20g(12mg/kg，MTD，組4)相同劑量的DOX的處理在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后仍存活的三個(gè)動(dòng)物中沒有產(chǎn)生明顯的腫瘤生長(zhǎng)的抑制。由于毒性，三個(gè)動(dòng)物在第5天死亡，6個(gè)動(dòng)物在第9天死亡。在較高劑量時(shí)(700nmol/20g，組2)，Q114gL顯示出非常強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用(圖7)。9只動(dòng)物中的兩只死于毒性，1只死于偶然。6只存活動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)從體重減少約20％中恢復(fù)過來。在組6中，將相同的大劑量(700nmol/20g)DOX與700nmol/[D-lys6]LH-RH混合。由于嚴(yán)重毒性產(chǎn)生的結(jié)果，這組所有動(dòng)物在第5天時(shí)死亡。
結(jié)論我們的結(jié)果清楚地表明由于在上皮卵巢癌OV-1063的細(xì)胞中存在LH-RH受體，靶向細(xì)胞毒性LH-RH結(jié)合物Q114gL比其所含的細(xì)胞毒基團(tuán)阿霉素(Q1)顯示出更低的毒性和更高的抗腫瘤活性。
權(quán)利要求
1.式I化合物Q14-O-R-P(I)其中Q具有下面描述的化學(xué)結(jié)構(gòu)
其中-R-為H或-C(O)-(CH2)n-C(O)-，n為0-7，R′選自NH2、具有至少一個(gè)環(huán)氮的芳香或氫化的5或6元雜環(huán)，并且該雜環(huán)具有與所述環(huán)的相鄰碳原子結(jié)合形成雙環(huán)體系的丁二烯殘基，及P為H或肽，前提是R′為NH2時(shí)，R和P不為H，當(dāng)R和P為H時(shí)，R′不為NH2。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R′選自NH2、吡咯烷-1-基、異二氫氮雜茚-2-基、3-吡咯啉-1-基、3-吡咯烷酮-1-基、2-吡咯啉-1-基、3-哌啶酮-1-基、1，3-四氫-吡啶-1-基，及P為P1、P2和P3，其中P1選自下式的LH-RH類似物Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd其中(Xxx)為氫、A2Bu或A2Pr，其中當(dāng)Aaa為Glp，那么Bbb為His，Ccc為Trp，Ddd為Gly-NH2，當(dāng)Aaa為Ac-D-Nal(2)，那么Bbb為D-Phe(4Cl)，Ccc為D-Pal(3)，D-Trp，Ddd為D-Ala-NH2，和當(dāng)Aaa-Bbb-Ccc為Ac，那么Ddd為-NH-CH2-CH3，其中基團(tuán)Q14-O-R與D-Lys殘基的游離氨基或當(dāng)A2Bu或A2Pr存在于(Xxx)時(shí)與其至少一個(gè)游離氨基形成羧酰氨基鍵，P2為下式促生長(zhǎng)素抑制素類似物
其中當(dāng)Aaa為D-Phe時(shí)，那么Bbb為Tyr，Ccc為Val，Ddd為Thr或Trp，當(dāng)Aaa為D-Trp時(shí)，那么Bbb為Phe，Ccc和Ddd為Thr，其中基團(tuán)Q14-O-R與Aaa殘基的末端氨基形成羧酰氨基鍵，P3為下式鈴蟾肽拮抗劑類似物Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu Bbb-NH2其中Aaa不存在，或?yàn)镈-Tpi或D-Phe，Bbb為(CH2-NH)Leu，(CH2-NH)Phe或(CH2-NH)Trp或(CH2-N)Tac其中基團(tuán)Q14-O-R與Aaa殘基存在時(shí)的末端氨基或其不存在時(shí)與Gln的末端氨基形成羧酰氨基鍵。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中n＝3。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中R′為NH2。
5.權(quán)利要求3的化合物，其中R′為2-吡咯啉-1-基。
6.權(quán)利要求4的化合物，其中P為P1。
7.權(quán)利要求5的化合物，其中P為P1。
8.權(quán)利要求4的化合物，其中P為P2。
9.權(quán)利要求5的化合物，其中P為P2。
10.權(quán)利要求4的化合物，其中P為P3。
11.權(quán)利要求5的化合物，其中P為P3。
12.權(quán)利要求1的化合物，其中-R和-P為H，R′不為NH2。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中-R′為吡咯烷-1-基。
14.權(quán)利要求12的化合物，其中-R′為異二氫氮雜茚-2-基。
15.權(quán)利要求12的化合物，其中-R′為3-吡咯啉-1-基。
16.權(quán)利要求12的化合物，其中-R′為3-吡咯啉酮-1-基。
17.權(quán)利要求12的化合物，其中-R′為2-吡咯啉-1-基。
18.權(quán)利要求12的化合物，其中-R′為3-哌啶酮-1-基。
19.權(quán)利要求12的化合物，其中-R′為為1，3-四氫吡啶-1-基。
20.下式的權(quán)利要求1的化合物Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q114-O-glt)-Arg-Leu-Pro-Gly-NH2其中Q114為阿霉素-14-基。
21.下式的權(quán)利要求1的化合物Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-lys(Q614-O-glt)-Arg-Leu-Pro-Gly-NH2其中Q614為3′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素-14-基。
22.下式的權(quán)利要求1的化合物
其中Q14為阿霉素-14-基。
23.下式的權(quán)利要求1的化合物
其中Q614為3′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素-14-基。
24.下式的權(quán)利要求1的化合物
其中Q114為阿霉素-14-基。
25.下式的權(quán)利要求1的化合物
其中Q614為3′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素-14-基。
26.下式的權(quán)利要求1的化合物
其中Q114為阿霉素-14-基。
27.下式的權(quán)利要求1的化合物
其中Q614為3′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素-14-基。
28.下式的權(quán)利要求1的化合物Q114-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-leu(CH2- NH)Leu-NH2其中Q114為阿霉素-14-基。
29.下式的權(quán)利要求1的化合物Q614-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-leu(CH2-NH)Leu-NH2其中Q614為了3′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素-14-基。
30.下式的權(quán)利要求1的化合物Q114-O-glt-D-Tpi-Gln Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2其中Q114為阿霉素-14-基。
31.下式的權(quán)利要求1的化合物Q614-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2其中Q614為3′-脫氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素-14-基。
32.包含權(quán)利要求1化合物和其藥物可接受載體的組合物。
33.一種治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，包括對(duì)需要所述治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1化合物。
34.權(quán)利要求20和21的化合物在治療具有LH-RH受體的各種人類腫瘤中的應(yīng)用，其中腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、前列腺癌、胰癌和結(jié)腸癌。
35.權(quán)利要求22-27化合物在治療具有所述促長(zhǎng)素抑制素類似物受體的各種人類腫瘤中的應(yīng)用，其中腫瘤包括乳腺癌、胃癌、胰癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞型和非小細(xì)胞型肺癌、腎細(xì)胞癌、骨癌和腦腫瘤。
36.權(quán)利要求28-31化合物在治療具有GRP和鈴蟾肽類肽受體的各種人類腫瘤中的應(yīng)用，其中腫瘤包括乳腺癌、胃癌、胰癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞型和非小細(xì)胞型肺癌和腦腫瘤。
37.一種將α，β或α，γ-羥伯胺的伯氨基的氮轉(zhuǎn)化為在具有5-6個(gè)原子的含氮的單不飽和雜環(huán)化合物的氮的方法，包括下面的步驟a)將所述羥胺與過量鹵代醛反應(yīng)，該鹵代醛具有醛碳、帶有鹵素的碳，并且在醛碳和帶有鹵素的碳之間具有2或3個(gè)選自CH2、CH2CH2和OCH2的殘基，b)相對(duì)于羥胺，加入過量的有機(jī)堿，c)用弱酸中和所述堿，和d)用稀釋酸水溶液處理。
38.權(quán)利要求38的方法，其中步驟a)在非質(zhì)子反應(yīng)惰性有機(jī)溶劑中進(jìn)行。
39.權(quán)利要求30的方法，其中步驟a)在極性非羥基反應(yīng)惰性有機(jī)溶劑中進(jìn)行。
40.權(quán)利要求30的方法，其中溶劑為二甲基甲酰胺。
41.權(quán)利要求30的方法，其中醛選自ω-溴-和ω-碘-丁醛和-戊醛。
全文摘要
本發(fā)明屬于靶向抗癌蒽環(huán)型衍生物的化學(xué)領(lǐng)域。更具體地說,它涉及與肽激素如LH－RH、鈴蟾肽和促生長(zhǎng)素抑制素的類似物共價(jià)結(jié)合的阿霉素(DOX)或其道諾糖胺修飾的衍生物(DM－DOX)。這些共價(jià)結(jié)合物靶向于具有肽激素類似物受體的各種腫瘤。本發(fā)明的化合物由通式Q
文檔編號(hào)A61K31/7028GK1202903SQ96198605
公開日1998年12月23日 申請(qǐng)日期1996年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月27日
發(fā)明者A·V·沙利, A·A·納吉, R－Z·凱 申請(qǐng)人:Asta藥物股份公司