專利名稱：腫瘤疫苗及其制備方法
基于腫瘤細(xì)胞的治療用疫苗的開展主要是根據(jù)下列前提，在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在量或質(zhì)的區(qū)別；免疫系統(tǒng)原則上具有識別上述區(qū)別的能力；通過用疫苗進(jìn)行有效的特殊免疫作用，而可以刺激該免疫系統(tǒng)，并根據(jù)這種區(qū)別可以識別腫瘤細(xì)胞，由此，導(dǎo)致它們被推斥。
為了引起一個抗腫瘤應(yīng)答，至少必須滿足兩個條件第一，腫瘤細(xì)胞必須表達(dá)正常細(xì)胞中沒有的抗原或新抗原決定基。第二，必須使免疫系統(tǒng)進(jìn)行活化，以便對上述抗原進(jìn)行反應(yīng)。對腫瘤進(jìn)行免疫治療的一大難題是其低免疫原性，尤其是在人體中。就這點而言，令人驚奇的是，正如預(yù)料那樣，在惡性細(xì)胞中的大量基因變化導(dǎo)致肽-新抗原決定基的形成，它可被細(xì)胞毒素的T-淋巴細(xì)胞的MHC-I-分子范圍所識別。
最近，發(fā)現(xiàn)了與腫瘤有關(guān)的以及腫瘤特定的抗原，它們構(gòu)成新抗原決定基，而且由此應(yīng)構(gòu)成被免疫系統(tǒng)襲擊的潛在目標(biāo)。然而，它對免疫系統(tǒng)在消除表達(dá)這些新抗原決定基的腫瘤中并沒有成功，這明顯地，不是由于新抗原決定基缺乏。而是由于對該新抗原決定基的免疫性應(yīng)答不夠。
為了對細(xì)胞基的癌進(jìn)行免疫治療，應(yīng)該開展兩個一般的策略一方面所采用的免疫治療，它是使用腫瘤反應(yīng)性的T-淋巴細(xì)胞在體外擴張，并又重新引入病人中；另一方面是有效免疫治療，它使用腫瘤細(xì)胞，以期待對腫瘤抗原形成新的或更強的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致系統(tǒng)性的腫瘤應(yīng)答。
可以用各種不同方式制備基于有效免疫治療的腫瘤疫苗，例如，輻照混有免疫刺激物助劑的腫瘤細(xì)胞，如小棒狀桿菌屬(Corynebacterium parvum)或菌Calmetle Guerin(BCG)以引起抗腫瘤抗原的免疫反應(yīng)(Oettgen與Old，1991年)。
近幾年來，尤其是采用了基因改性的腫瘤細(xì)胞，以便對癌癥進(jìn)行有效的免疫治療。其中，引入到腫瘤細(xì)胞中的外來基因分成三個種類其中之一是使用基因改性的腫瘤細(xì)胞，以產(chǎn)生胞質(zhì)分裂素。腫瘤細(xì)胞和胞質(zhì)分裂素信號的局部重合，認(rèn)為是有一種激起抗腫瘤免疫性的刺激物。應(yīng)用這種策略的綜述可參閱Pardoll，1993年，Zatloukal等人，1993年，及Dranoff與Mulligan，1995年。
具有為分泌細(xì)胞分裂素，如IL-2，GM-CSF或IFN-γ，或者為表達(dá)共-刺激的分子的改性的腫瘤細(xì)胞已在動物試驗中表明，產(chǎn)生了有效的抗腫瘤免疫性(Dranoff等人，1993年；Zatloukal等人，1995年)。在具有明顯腫瘤，而且已發(fā)展為對腫瘤產(chǎn)生耐受力的人中，要完全檢測這一系列綜合的交替作用，以便產(chǎn)生有效的抗腫瘤反應(yīng)，是非常困難的。在人體上使用分泌細(xì)胞分裂素的腫瘤疫苗的實質(zhì)效用，至今尚未被證實。
另一類用于改性腫瘤細(xì)胞以作為腫瘤疫苗使用的編碼所謂的輔助蛋白，這種方法的目的在于，使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有抗原的細(xì)胞(新APCs)以便能直接產(chǎn)生腫瘤特定的T-淋巴細(xì)胞。這類方法的實例描述于Ostrand-Rosenberg，1994年。
腫瘤抗原(TAS)或由其衍生的肽的分離與識別，例如，已描述于Wolfel等人1994年a)與1994年b)；Garrel等人，1993年，Lehmann等人1989年，Tibbets等人，1993年，或國際專利申請文獻(xiàn)Wo 92/20356，Wo 94/05304，Wo94/23031，Wo 95/00159。這些方法，對使用腫瘤抗原作為腫瘤疫苗的免疫原是必要的，該免疫原可以是以蛋白質(zhì)形式，也可以肽形式存在。但是，上述的腫瘤抗原形式的腫瘤疫苗。對激起細(xì)胞的免疫應(yīng)答仍是不足以致免疫性，免疫應(yīng)答對清除帶腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞是必要的，助劑的共同施用僅對加強免疫應(yīng)答提供有限的可能性(Oettgen和Old，1991年)。
用于提高腫瘤疫苗效用的第三種有效免疫治療策略是，基于異基因化(外來的)自體的腫瘤細(xì)胞。這種概念是基于免疫系統(tǒng)和表達(dá)一個外來蛋白的腫瘤細(xì)胞反應(yīng)。并在這反應(yīng)過程中，也引起了一個針對這些腫瘤抗原(TAs)的免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答是由疫苗的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)的。
Zatloukal等人，在1993年提出了這些不同方法的綜述。其中，通過采用不同的基因，而使腫瘤細(xì)胞異化以便加強免疫原性。
三分子復(fù)合物在調(diào)節(jié)特定的免疫應(yīng)答時起了重要作用，該三分子復(fù)合物是由T-細(xì)胞-抗原受體，MHC(主要組織相容性復(fù)合物)分子與其配位體所組成的，它是一個由肽片段衍生的蛋白質(zhì)。
MHC-I-分子(或其對應(yīng)的人體分子，即HLAs)是具有嚴(yán)格特性的肽受體，它可以結(jié)合上百萬的不同的配位體。上述前提，可以由等位基因(Allel)特性的肽型主提供，它有下列的特性要求，根據(jù)MHC-I單模標(biāo)本，該肽具有一定的長度，該長度實質(zhì)上有8-10個氨基酸基團。通常兩個氨基酸位置是所謂“固定式”，它僅能由一個單氨基酸或具有緊密關(guān)系的側(cè)鏈的多氨基酸基團所占有。固定式氨基酸在肽中的確切位置以及特性要求隨HMC-I-單模標(biāo)本而變化。肽配位體的C-末端經(jīng)常是一個脂族的或有加載基團。此外，這種等位基因特性的MHC-I-肽-配位體型主，迄今是眾所周知的特別是，H-2Kd、Kb、Kk、Kkml、Db、HLA-A*0201、A*0205與B*2705。
在細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的范圍內(nèi)，會使有規(guī)則的、退化的與外來的基因產(chǎn)物，如病毒性蛋白質(zhì)或腫瘤抗原分解成小的肽。其中有一些構(gòu)成用于MHC-I-分子的潛在的配位體。這就為其由MHC-分子的呈現(xiàn)提供了前提，其結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)胞的免疫應(yīng)答的激發(fā)，雖然至今尚不能清楚地解釋，作為MHC-I-配位體的肽在細(xì)胞中是如何制備出來的。
為了加強免疫應(yīng)答而使用這種用于異化腫瘤細(xì)胞的一種方法，包括用誘變的化學(xué)試劑，例如從N-甲基-N′-亞硝基胍處理腫瘤細(xì)胞。它將導(dǎo)致，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)從細(xì)胞蛋白質(zhì)的突變的變異體衍生的新抗原，構(gòu)成外來的基因產(chǎn)物(Van Pel與Boon，1982年)。然而，因為該誘變的情況是隨機地分布在基因組上，因此，可期待使一些細(xì)胞，由于不同的誘變情況而表現(xiàn)不同的新抗原。這種方法在質(zhì)量方面與數(shù)量方面來看是難于控制的。
用一個或多個外來的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)染而異化腫瘤細(xì)胞的另一方法，例如，用一個不同單模標(biāo)本的外來MHC-I-分子或MHC-蛋白質(zhì)，對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后呈現(xiàn)在細(xì)胞表面上(EP-A20569678；Plautz等人，1993年；Nabel等人，1993年)。這種方法是基于上述概念，即當(dāng)以整體細(xì)胞疫苗形式使用時，腫瘤細(xì)胞根據(jù)表達(dá)的蛋白質(zhì)或由其衍生的肽而被識別為異種，或者當(dāng)自體的MHC-I-分子進(jìn)行表達(dá)時，通過提高細(xì)胞表面上的MHC-I-分子的量，而使腫瘤抗原的呈現(xiàn)達(dá)到最佳化。由此，用一個外來蛋白質(zhì)修飾腫瘤細(xì)胞?？墒乖摷?xì)胞在MHC范圍內(nèi)呈現(xiàn)來自外來蛋白質(zhì)的肽，并在MHC-肽-復(fù)合體識別范圍內(nèi)。產(chǎn)生了從“自體的”到“外來的”的變化。當(dāng)識別一個蛋白質(zhì)或肽為異種時，意味著在免疫識別過程中，不僅針對外來的蛋白質(zhì)，而且針對歸屬于腫瘤細(xì)胞的腫瘤抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。在上述過程中，呈現(xiàn)抗原的細(xì)胞(APCs)是活性的。它們處理存在于疫苗的腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)(包括TAs)以形成肽，而且作為配位體用于它們自己的MHC-I與MHC-II分子。上述活性的，加載肽的APCs移位到淋巴結(jié)中，其中一些未成熟的T-淋巴細(xì)胞識別來自APCS上的TA的肽，而且可將其用作克隆擴張的刺激物，換句話說，用于產(chǎn)生腫瘤特定的CTLs與T-輔助細(xì)胞。
本發(fā)明的目的在于，制備一個新的基于異化腫瘤細(xì)胞的腫瘤疫苗，借助于該疫苗引發(fā)一種有效的，細(xì)胞性抗-腫瘤免疫應(yīng)答。
為了達(dá)到上述目的，特作如下考慮，當(dāng)非惡性的，正常的體細(xì)胞忍受免疫系統(tǒng)時，該活體就藉助于免疫應(yīng)答與正常細(xì)胞作用，如該細(xì)胞合成對體呈異源的蛋白質(zhì)則導(dǎo)致病毒感染，并有免疫保護。其原因在于，MHC-I分子呈現(xiàn)來自異種蛋白異種肽，因而，免疫系統(tǒng)記錄了某些令人討厭的并對細(xì)胞產(chǎn)生異種性。排除該細(xì)胞，使APCs活化。并產(chǎn)生一種新的針對表達(dá)外來蛋白的細(xì)胞的特定的免疫性。
腫瘤細(xì)胞含有有關(guān)的特定的腫瘤抗原。然而，它們是非有效的疫苗。因為，其微小的免疫原性，對于免疫系統(tǒng)而言是可以忽略不計的。對比已知的方法，對腫瘤細(xì)胞不是加載了一個外來蛋白質(zhì)，而是加載一個外源肽。除了上述外來肽以外，細(xì)胞本身的腫瘤抗原將被該細(xì)胞識別為外來體。通過用一個肽異化后，可以達(dá)到通過外源肽引發(fā)的針對腫瘤抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
腫瘤細(xì)胞的微小免疫原性的原因，不是質(zhì)的問題，而是量的問題。對于一個由腫瘤抗原衍生的肽而言，它雖然由MHC-I分子所呈現(xiàn)，然而其濃度是太小，以致于不能激發(fā)細(xì)胞腫瘤特定的免疫應(yīng)答。增加在腫瘤細(xì)胞上的腫瘤特定性肽的量，也會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異化作用，從而導(dǎo)致對細(xì)胞的免疫應(yīng)答的激發(fā)。與此不同，該腫瘤抗原或由其衍生的肽，用一個編碼有關(guān)蛋白質(zhì)或肽的DNA轉(zhuǎn)染而呈現(xiàn)在細(xì)胞表面上，如描述于國際專利文獻(xiàn)Wo92/20356，Wo 94/05304，Wo 94/23031與Wo 95/00159，由此通過更簡化方式制備一種激發(fā)有效的免疫應(yīng)答疫苗。
Mandelboim等人，在1994年與1995年定義用腫瘤抗原衍生的肽培養(yǎng)RMA-S細(xì)胞，以便激發(fā)針對相應(yīng)病人自己的腫瘤抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答。Von Mandelboim等人提出以已知為RMA-S的細(xì)胞(Karre等人，1986年)用于腫瘤接種。它們被認(rèn)為能起APCs的作用。它們具有這樣的特性，即其在細(xì)胞表面上的HLA分子，由于在細(xì)胞的TAP-機構(gòu)中(“抗原性肽的轉(zhuǎn)移”，引起處理肽及其與HLA分子的結(jié)合)的缺陷，是空的。因此，該細(xì)胞被用于加載一個肽，并同時被用作外來的肽的表現(xiàn)工具。所達(dá)到的抗腫瘤效應(yīng)是基于對在細(xì)胞上呈現(xiàn)的肽的免疫應(yīng)答的激發(fā)，它提供與腫瘤細(xì)胞的抗原作用沒有直接關(guān)系的免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及對患者施用的腫瘤疫苗。它包括本身在HLA范圍表現(xiàn)由腫瘤抗原衍生的肽的腫瘤細(xì)胞，而且至少其中一部分在細(xì)胞表面上具有至少一個患者的MHC-I單膜標(biāo)本。并且它加載有一個或多個的肽a)和/或b)型，以致使得腫瘤細(xì)胞在有患者免疫系統(tǒng)的肽的范圍被識別為異源，并激發(fā)一種細(xì)胞免疫應(yīng)答。其中，上述的肽是，a)起MHC-T單膜標(biāo)本的配位體的作用，，它與患者及疫苗的腫瘤細(xì)胞是共同的，而不同于被患者細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)所衍生的肽，或是b)起MHC-I-單膜標(biāo)本的配位體的作用，它與病人及疫苗的腫瘤細(xì)胞是共同的，并且是從被患者細(xì)胞所表達(dá)的腫瘤抗原衍生的，而且存在于疫苗的腫瘤細(xì)胞上的濃度在病人的腫瘤細(xì)胞上表達(dá)時要高于由相同的腫瘤抗原衍生的肽的濃度。
根據(jù)國際慣例，把人體的MHC分子在下面稱為“HLA”(人體的白細(xì)胞抗原)。
術(shù)語“細(xì)胞的免疫應(yīng)答”是指細(xì)胞毒性的T-細(xì)胞免疫性，這是由于產(chǎn)生腫瘤特定性細(xì)胞毒性的CD8-陽性的T-細(xì)胞與CD4-陽性的輔助-T-細(xì)胞而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的破壞。
首先，由腫瘤細(xì)胞所得的本發(fā)明疫苗的作用主要基于在腫瘤細(xì)胞上存在的腫瘤抗原的免疫原性活性被肽所加強。
下列的a)型的肽，以下也稱為“外來肽”或“異源肽”。
在本發(fā)明的一個實施方案中，疫苗的腫瘤細(xì)胞是自體的。它們是取自要治療處理的患者的細(xì)胞，然后在體外用a)和/或b)型肽進(jìn)行處理。必要時進(jìn)行失活，然后又對患者施用(制備自體的腫瘤疫苗的方法描述于專利文獻(xiàn)Wo94/21808，其內(nèi)容列入本文作為參考)。
在本發(fā)明的一個實施方案中的腫瘤細(xì)胞是異源的。也就是說，它不是來源于要治療處理的患者。當(dāng)考慮經(jīng)濟時，利用異源細(xì)胞特別優(yōu)先。為各個患者分別制備個人的疫苗是費人力和昂貴的。此外，對各個患者，在體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞也是困難的，以致于不能得到足夠量的腫瘤細(xì)胞，以制備疫苗。用異源腫瘤細(xì)胞，則要注意對患者的HLA-亞型必須匹配。
在使用a)型的外來肽時，在異源腫瘤細(xì)胞的情況下，它是一個或多個細(xì)胞系的細(xì)胞，其中至少一個細(xì)胞系表達(dá)一個或多個腫瘤抗原。這些腫瘤抗原與要治療處理的患者的腫瘤抗原是相同的。也就是說，腫瘤疫苗將對患者的腫瘤適應(yīng)癥相匹配。由此可以確保，由表現(xiàn)MHC-I的外來肽對疫苗的腫瘤細(xì)胞激發(fā)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤特定的CTLs與T-輔助細(xì)胞的擴張。它同樣針對患者的腫瘤細(xì)胞，因為它們表達(dá)同一個腫瘤抗原，如同疫苗的細(xì)胞一樣。
當(dāng)用本發(fā)明的腫瘤疫苗治療處理一個患有乳腺癌轉(zhuǎn)移的女患者，該轉(zhuǎn)移瘤表明是Her2/新突變(Allred等人，1992年；Peopoles等人，1994年；Yoshino等人，1994年a)；Stein等人，1994年；Yoshino等人，1994年b)；Fisk等人，1995年；Han等人，1995年)，所用疫苗包括與女患者的HLA-單膜標(biāo)本相匹配的異源腫瘤細(xì)胞，作為腫瘤抗原它們也同樣表達(dá)突變的Her 2/neu。最近，分離出大量的腫瘤抗原，并澄清它們與一個或多個的癌癥的關(guān)系。關(guān)于這種腫瘤抗原的另外實例有ras，(Fenton等人，1993年；Gedde Dahl等人，1992年；Jung等人，1991年；Morishita等人，1993年；Peace等人，1991年；Skipper等人，1993年)，MAGE腫瘤抗原(Boon等人，1994年；Slingluff等人，1994年；Van der Bruggen等人，1994年；Wo 92/20356)；Carrel等人，1993年也提出了有關(guān)各種腫瘤的綜述。
本發(fā)明范圍內(nèi)可使用的已知的腫瘤抗原以及由其衍生的肽綜述于表中。
通常，患者的腫瘤抗原在制定診斷和治療計劃過程中，是用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如使用基于有特性的CTLs測試法，測定出其腫瘤抗原的特性。此外，這種測定方法已由Herin等人，1987年；Coulie等人，1993年；Cox等人，1994年；Rivoltini等人，1995年；Kawakami等人，1995年所描述并已描述于專利文獻(xiàn)Wo/14459。這些文獻(xiàn)也描述各種不同的腫瘤抗原或由其衍生的肽抗原決定基。在細(xì)胞表面上出現(xiàn)的腫瘤抗原也可以用基于抗體的免疫測定法予以鑒測。如果該腫瘤抗原是酶，例如酪氨酸酶，則也可以用酶測定法予以檢測。
據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，可以使用自體的和異源的腫瘤細(xì)胞的混合物作為疫苗的原料。本發(fā)明的這個實施方案特別適用于，當(dāng)由患者表達(dá)的腫瘤抗原是未知時，或者僅部分表征時，和/或當(dāng)異源的腫瘤細(xì)胞僅表達(dá)患者的某些腫瘤抗原時。通過加入，經(jīng)外來肽處理過的自生腫瘤細(xì)胞，能確保，至少疫苗中的部分腫瘤細(xì)胞包含有盡可能多的患者自己的腫瘤抗原。異源腫瘤細(xì)胞是在一個或多個MHC-I單模標(biāo)本中與患者相匹配的那些。
對于a)與b)型的肽而言，根據(jù)結(jié)合到一個MHC-I分子的必要性而限定，其順序是取決于要給予疫苗的患者的HLA-亞型。測定患者的HLA-亞型，因而就創(chuàng)造了對合適的肽的選擇或設(shè)計提供了最重要的條件。
使用本發(fā)明的以自體腫瘤細(xì)胞形成存在的腫瘤疫苗時，通過患者中遺傳決定的HLA分子的特性，而自動產(chǎn)生HLA-亞型。患者的HLA-亞型可以用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如微-淋巴毒性試驗方法(HLC-試驗，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法)檢測[Practical lmmunol(實踐免疫學(xué))，1989年]。該MLC試驗基于這樣的原則，首先向患者血液中分離出的淋巴細(xì)胞中，在有家兔補體(c)的存在下，加入對特定HLA分子的抗血清或單克隆的抗體。這時，溶解陽性細(xì)胞，并吸收指示染料。而未受損的細(xì)胞保留不被染色。
為了確定患者的HLA單模標(biāo)本，還可以使用RT-PCR(Curr.Prot.Mol.Biol第2和15章)。為此，取患者的血樣，并從中分離出RNA。首先，使該RNA經(jīng)受反轉(zhuǎn)錄。導(dǎo)致形成患者的cDNA。該cDNA作為基質(zhì)用于和引物對的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該引物對特定性地引起DNA片段的放大作用，它代表一個確定的HLA單模標(biāo)本。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)后呈現(xiàn)一個DNA區(qū)帶?；颊弑磉_(dá)相應(yīng)的HLA分子。如沒有呈現(xiàn)出區(qū)帶，則，該患者是陰性。對每個患者至少要兩個區(qū)帶。
在應(yīng)用本發(fā)明的異源疫苗時，使用的細(xì)胞中，至少一部分是對患者的至少一個HLA-亞型匹配?？紤]到盡可能廣泛地應(yīng)用本發(fā)明的疫苗。優(yōu)選使用不同的細(xì)胞系混合物作為原料。常常發(fā)現(xiàn)表達(dá)兩種或三種不同的HLA-亞型。其中尤其是考慮HLA-A1與HLA-A2。用一個基于表達(dá)這些單模標(biāo)本的異源腫瘤細(xì)胞的混合物的疫苗，可以覆蓋廣泛的患者。為此，可以覆蓋約70％的歐洲人口(Mackiewicz等人，1995年)。
本發(fā)明所用的肽的定義，通過HLA-亞型，確定了其固定式氨基酸及其長度；確定的固定式的位置和長度確保，肽適于進(jìn)入有關(guān)的HLA分子的肽結(jié)合的孔槽中并存在于構(gòu)成疫苗的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上，以致使得該細(xì)胞被識別為外來的。由此引起，對免疫系統(tǒng)的激發(fā)，并引起對患者腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
適用于本發(fā)明范圍內(nèi)的a)型外來肽的肽，可在很大范圍內(nèi)得到。它們的順序可以從天然存在的免疫原性蛋白質(zhì)或其細(xì)胞的分裂產(chǎn)物，如病毒性或細(xì)菌性肽衍生，或者從對患者異生的腫瘤抗原衍生而得到。
適用的外源肽可以選自基于文選已知的肽順序，例如Rammensee等人，1993年，F(xiàn)alk等人，1991年，對不同的HLA-型主所描述的肽。從不同來源的免疫原蛋白質(zhì)衍生的肽，它們適于各個HLA-亞型的分子的結(jié)合位點。對于具有有免疫原活性的蛋白質(zhì)的部分順序的肽，根據(jù)已知的或仍要確定的多肽順序而確定適于備用的肽，通過順序比較并考慮HLA特定的需求而進(jìn)行確定。對于合適的肽，例如，在Rammensee等人，1993年；Falk等人，1991年，Rammen see，1995年；以及Wo 91/09869(HIV-肽)中所發(fā)現(xiàn)的，此外，由腫瘤抗原衍生的肽，描述于國際專利申請Wo 95/00159，Wo94/05304中。有關(guān)肽的這些參考文獻(xiàn)和文章列入本文作為參考。
異源肽的優(yōu)選備用者是已表明有免疫原性的肽。也就是由已知的免疫原，例如疫毒的或細(xì)菌蛋白衍生出來的肽。由于其免疫原性，這種肽在MLC試驗中，呈現(xiàn)強烈的反應(yīng)。
不使用原始的肽，即由天然蛋白的不變的衍生的肽，不管基于原始肽順序所規(guī)定的固定位置及長度使用最低條件而可以按需要進(jìn)行變異；在這種情況下，據(jù)本發(fā)明也可以使用合成肽，它是根據(jù)相對于MHC-I-配位體的要求而設(shè)計的。因此，例如可以從H2-Kd-配位體Leu Phe Glu Ala Ila GluGly Phe Ile(LFEAIEGFI)開始而這樣轉(zhuǎn)變不固定氨基酸，以使其獲得Phe PheIle Glv Ala Leu Glu Glu Ile(FFIGALEEI)順序的肽，此外，該固定式的氨基酸第9定位上的Ile可以被Leu代替。
在本發(fā)明領(lǐng)域中可用的肽是a)型和/或b)型的肽可以是從腫瘤抗原衍生，也就是說，可以從在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的蛋白衍生出來的。并且它不呈現(xiàn)于相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞上或僅以極低的濃度呈現(xiàn)。
該肽的長度最好與必要的固定式氨基酸一起相當(dāng)于結(jié)合到MHC-I分子所必要的8-10個氨基酸的最低順序。必要時，該肽也可以在C-和/或N-末端上延長，只要這種延長不損害結(jié)合能力就行，也就是說上述延長的肽可以在最低順序上進(jìn)行細(xì)胞處理。
據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，可以用具有陰性加載的氨基酸的肽進(jìn)行延長，或者在肽中可以在不是固定式氨基酸的位置中加入陰性加載的氨基酸，以便使肽能與聚陽離子，如多賴氨酸上，形成靜電結(jié)合。
用于本發(fā)明范圍內(nèi)的術(shù)語“肽”，包括更大的蛋白片段或整個蛋白質(zhì)。它確保在使用APCs后要處理進(jìn)入適合MHC-分子的肽。
在本實施方案中，使用的抗原，不是以肽的形式，而是以蛋白或蛋白片段，或者以蛋白與蛋白片段的混合物形式存在。該蛋白提供抗原或腫瘤抗原，由該抗原在處理后衍生得到片段。被細(xì)胞吸取的蛋白或蛋白片段進(jìn)行處理，然后在MHC范圍中能呈現(xiàn)免疫效應(yīng)子細(xì)胞。因而可以激發(fā)或加強免疫應(yīng)答(Braciale與Braciale，1991年，Kovacsovics Bankowski和Rock，1995年；York與Rock，1996年)。
在使用蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的情況下，用化學(xué)分析方法(用埃德曼(Edman)降解或質(zhì)譜儀方法測定處理過的片段，參照由Rammensee等人，1995年的綜述文章及其所引用的原始文獻(xiàn))，或用生物分析方法(APCs激起T-細(xì)胞的能力，它是專門用于處理的片段)都證實處理的最終生成物的同一性。
原則上，可以用多個步驟選擇適于作為外源肽的肽一候選者通常，優(yōu)選是在連續(xù)試驗中，首先使候選者，在肽結(jié)合試驗中，測定其在MHC-I分子上的結(jié)合能力。
較適用的檢驗方法例如是基于流動式血細(xì)胞計數(shù)法的FACS分析方法[Flow Cytometry(流動血細(xì)胞計數(shù)法，1989年；FACS Vantage TM用戶指南，1994年；CELL QuestTM用戶指南，1994年]。其中，用熒光染料，例如，用FITC(熒光素異氰硫酸鹽)，標(biāo)記肽，并加到表達(dá)MHC-I分子的腫瘤細(xì)胞上。在流體中，各個細(xì)胞被一定波長的激光所激發(fā)；測定所發(fā)射的熒光，后者是取決于結(jié)合在細(xì)胞上的肽的量。
用于測定結(jié)合肽量的另一方法是Scatchard印跡法。其中使用被I125或稀土金屬離子(如，銪)標(biāo)記的肽。在4℃下，用30-240分鐘將不同的，限定濃度的肽加載在細(xì)胞上。為了測定肽與細(xì)胞的非特定的相互作用，將過量的未標(biāo)記的肽加入到一些樣品中。以抑制標(biāo)記肽的特定的相互作用。然后，洗滌該細(xì)胞以除去任何非特定的細(xì)胞結(jié)合的物質(zhì)。結(jié)合細(xì)胞的肽量可以通過所發(fā)出放射性在閃爍計數(shù)器，或者通過適用于測定長壽命熒光的光度計，進(jìn)行測定。然后，用標(biāo)準(zhǔn)方法評定所得的數(shù)據(jù)。
在第二步驟中，檢測具有優(yōu)良結(jié)合能力的候選者的免疫原性。
由蛋白質(zhì)衍生的，其免疫原活性未知的異源肽的免疫原性，可以通過MLC試驗方法測定。在該試驗中能引起劇烈反應(yīng)的，優(yōu)選地可以和不同的肽連續(xù)進(jìn)行的肽，使用具有已知免疫原活性的肽作為標(biāo)準(zhǔn)，是適合于本發(fā)明目的。
用于測定其免疫原性的結(jié)合MHC-I的肽候選者的另一個可能的測試方法，包括檢測肽對T2-細(xì)胞的結(jié)合情況。這種試驗是基于T2-細(xì)胞的特性(Alexander等人，1989年)或者RMA-S-細(xì)胞的特性(Karre等人，1986年)它們在TAP-肽-轉(zhuǎn)移機理中是缺陷性的，當(dāng)它們加到在MHC-I范圍內(nèi)存在的肽上僅表現(xiàn)穩(wěn)定的MHC-I分子。在該試驗中，使用用HLA-基因，例如用HLA-A1-和/或HLA-A2-基因轉(zhuǎn)染的T2-細(xì)胞或RAM-S-細(xì)胞。用良好的MHC-I-配位體的肽作用該細(xì)胞，通過在MHC-I范圍呈現(xiàn)以使它們被免疫系統(tǒng)識別為外來的。這些肽引起HLA-分子可以大量地呈現(xiàn)在細(xì)胞表面上?？刂萍?xì)胞表面上的HLAs，例如，可以憑借單克隆抗體，使其有可能證實為適用的肽。(Malnati等人，1995年；Sykulev等人，1994年)。這里也可以適當(dāng)使用已知具有良好HLA或MHC結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)肽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，疫苗的自體的或異源的腫瘤細(xì)胞也可以具有多個具有不同順序的異源肽。在這種情況下，一方面這種所用的肽由于它們結(jié)合到不同的HLA-亞型上而可以是相互不同，這樣，就可以得到一個病人或一大群病人的多個的或全部的HLA-亞型。疫苗可以以輻照形式施用。
另外，必要時是附加的，有關(guān)呈現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞上的異源肽的變化性，該變化包括結(jié)合到一個確定的HLA-亞型上的肽，在其對HLA-結(jié)合不是關(guān)鍵的順序上有不同，例如由不同來源的蛋白，例如病毒性的和/或細(xì)菌性的蛋白衍生的。這類變化性，能使接種的生物體具有更大的異源化的范圍，從而可期望強化免疫應(yīng)答的刺激。
在本發(fā)明的實施方案中，其中腫瘤疫苗由各種不同細(xì)胞系的異源腫瘤細(xì)胞，可能另外的自體腫瘤細(xì)胞混合物所組成的。所有的腫瘤細(xì)胞可以用同一個肽或多個肽進(jìn)行處理，或者不同源的腫瘤細(xì)胞也可具有不同的異源肽。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)所實施的實驗中，可以用由流行性感冒病毒凝血素衍生的并且是H2-Kd-配位體的，其順序為Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly PheIle的病毒性肽作為a)型的外源肽。下面劃線的是固定式氨基酸。
用這種天然的病毒性肽作為外源肽制備腫瘤疫苗，并以動物模式(黑素瘤模式與結(jié)腸癌模式)進(jìn)行試驗。
為制備腫瘤疫苗還可以使用另一個其順序為Ala Ser Asn Glu Asn MetGlu Thr Met的病毒性肽，它們是由流感病毒的核蛋白衍生的，是HLA-1-單模標(biāo)本H2-Kb-的配位體(Rammensee等人，1993年；下面劃線的是固定式氨基酸)。在另一個黑素瘤模式中，證實了疫苗的保護作用。
還可以制備另一種疫苗，通過異化具有其順序為Phe Phe Ile Gly Ala LeuGlu Glu Ile(FFIGALEEI)的外源肽的腫瘤細(xì)胞。它是一個迄今在自然界尚未發(fā)現(xiàn)的合成肽。在選擇順序時，必須注意到，要滿足有關(guān)用作H2-Kd型的，MHC-I-分子配位體的適應(yīng)性的要求。按照有效免疫治療概念，用于生產(chǎn)抗腫瘤免疫性的肽的適應(yīng)性是在老鼠結(jié)腸癌CT-26(對鼠系Balb/c是同源的)上證實。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，該腫瘤疫苗也可含有自體的和/或異源的腫瘤細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞，它們用細(xì)胞質(zhì)分裂素基因轉(zhuǎn)染。在專利文獻(xiàn)Wo94/21808和Schmidt等人，1995年(已作為參考文獻(xiàn))，描述了高效的腫瘤疫苗。通過所謂的“轉(zhuǎn)鐵蛋白感染”的DNA-遷移方法，用IL-2表達(dá)媒介制備(該方法基于受體-媒介的-細(xì)胞內(nèi)攝作用，而且使用一個細(xì)胞配位體，特別是轉(zhuǎn)鐵蛋白，它用于復(fù)合DNA的，與聚陽離子，如多賴氨酸共軛以及一個內(nèi)滲作用有效劑，如腺病毒)。
最好是，肽處理腫瘤細(xì)胞與表達(dá)胞質(zhì)分裂素的細(xì)胞以1∶1的比例相互混合。如每1×106細(xì)胞中產(chǎn)生4000單位IL-2的IL-2疫苗和1×106肽處理的腫瘤細(xì)胞混合。如此制得的疫苗可以用于兩次處理。其最佳劑量為1000～2000單位IL-2(Schmmidt等人，1995年)。
通過用經(jīng)肽處理過的腫瘤細(xì)胞與胞質(zhì)分裂素疫苗結(jié)合時，有利于這兩種疫苗型作用的結(jié)合。
用通常方法加工處理上述細(xì)胞以及本發(fā)明的疫苗制劑。例如，描述于“癌細(xì)胞生物治療，1991年”或在Wo 94/21808文獻(xiàn)中。
另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)一種對病人使用的，包括腫瘤細(xì)胞的腫瘤疫苗。
按照本發(fā)明該方法的特點在于，用一個或多個的肽處理腫瘤細(xì)胞，該腫瘤細(xì)胞本身在HLA范圍呈現(xiàn)由腫瘤抗原衍生的肽，并且其至少部分表達(dá)至少病人的一個MHC-I-單模標(biāo)本，該肽是a)起作為MHC-I-單模標(biāo)本的配位體的作用，該MHC-I-單模標(biāo)本是與病人及疫苗的腫瘤細(xì)胞共同的，該肽與從被病人的細(xì)胞所表達(dá)蛋白衍生的肽是不同的。
b)起作為MHC-I-單模標(biāo)本的配位體的作用，該MHC-I-單模標(biāo)本是與病人及疫苗的腫瘤細(xì)胞是共同的，并從被病人細(xì)胞所表達(dá)的腫瘤抗原衍生的。
在有有機聚陽離子存在下，以一個或多個a)和/或b)型肽培育腫瘤細(xì)胞，直至該肽要這樣結(jié)合到該腫瘤細(xì)胞，以致在有腫瘤細(xì)胞的范圍內(nèi)被病人的免疫系統(tǒng)識別為外來的。而且激發(fā)一個細(xì)胞免疫應(yīng)答。
該肽的用量最好是每1×105～2×107細(xì)胞約為50-160微克。當(dāng)使用b)型肽時，其濃度也可以高些，對于這種肽，主要的是其在疫苗的腫瘤細(xì)胞上的濃度，可以比由同一個腫瘤抗原衍生的肽在病人的腫瘤細(xì)胞上的濃度更高些，其程度可使疫苗的腫瘤細(xì)胞被識別為外來的，并激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。
適用的聚陽離子可以是同系的有機聚陽離子，如多賴氨酸，多精氨酸，多烏氨酸，或者是異種的，是有兩個或更多的不同的陽性加載的氨基酸的聚陽離子，這些聚陽離子可以具有不同的鏈長。此外，還可以是非肽的合成聚陽離子，如聚乙烯亞胺，聚陽離子性質(zhì)的天然的結(jié)合DNA的蛋白例如組蛋白或臭精蛋白及類似物，或者其片段，以及精胺，或亞精胺。適用于本發(fā)明的有機聚陽離子也包括聚陽離子性的脂類(Felgner等人，1994年；Loeffler等人，1993年；Remy等人，1994年；Behr等人，1994年)，此外，還有市場上可買到的如轉(zhuǎn)染子(Transfectam)，Lipofectamin或Lipofectin。
所用的聚陽離子最好是其鏈長為30-300賴氨酸基團的多賴氨酸(PL)。
相對于肽的所需的聚陽離子量可以按經(jīng)驗確定。當(dāng)使用多賴氨酸和a)型的異源肽時，多賴氨酸(PL)相對于肽的重量比例大約為1∶4～1∶12。
上述培育的時間通常是30分鐘至4小時。這取決于達(dá)到肽的最高加載量的時間。該加載量可以用FACS分析法監(jiān)測。根據(jù)這種方法可以獲知所需的培育時間。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，加入至少部分共軛的多賴氨酸。最好有一部分多賴氨酸是與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)共軛結(jié)合的(即轉(zhuǎn)鐵蛋白-多賴氨酸-共軛體。TfpL，對此，可考慮Wo 94/21808的公開)，其中，PLTfpL的重量比例約為1∶1。
不與轉(zhuǎn)鐵蛋白共軛，多賴氨酸也可和其他蛋白共軛例如專利文獻(xiàn)Wo94/21808所述的作為內(nèi)在化因素的細(xì)胞配位體。
必要時，也可以在DNA參與的情況下，處理腫瘤細(xì)胞。該DNA優(yōu)選是以質(zhì)粒存在，質(zhì)粒，最好是沒有編碼功能性真核蛋白的順序。也就是以空介質(zhì)形式存在。原則上，任何通用的，功能性的質(zhì)粒都可以用作DNA。
DNA的用量，對必要時部分地與蛋白共軛結(jié)合的聚陽離子量的比例，例如相對于pL，TfpL或pL與TfpL的混合物的比例，大約是1∶2～1∶5。
培育的時間，相對于腫瘤細(xì)胞量，和/或肽量的聚陽離子的量和性質(zhì)，或者聚陽離子以什么比例或如何共軛，或與何種蛋白共軛最好，DNA存在的優(yōu)點及其用量等等都可以根據(jù)經(jīng)驗確定。為此，各個制備參數(shù)是可改變的，此外，在相同的條件下將肽施加到腫瘤細(xì)胞上并檢測該肽如何有效地結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上。為此，合適的方法是FACS分析方法。
本發(fā)明的方法不僅適用于處理腫瘤細(xì)胞，也適用于處理其他細(xì)胞。
除了腫瘤細(xì)胞外，自體的成纖維細(xì)胞也就是病人固有的成纖維細(xì)胞系的細(xì)胞，或者來自與病人的HLA-亞型匹配的成纖維細(xì)胞系的細(xì)胞，或者用相應(yīng)的MHC-I-基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都可以用本發(fā)明的方法加載一個或多個由患者腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的腫瘤抗原所衍生的肽。這樣處理和輻照的成纖維細(xì)胞可以用作腫瘤疫苗，也可與肽處理的腫瘤細(xì)胞混合使用而作為腫瘤疫苗。
在本發(fā)明的另一個實施方案，可以用本發(fā)明方法處理枝狀細(xì)胞代替成纖維細(xì)胞。這種枝狀細(xì)胞是皮膚的APCs。它們可以有選擇地在體外加載。也就是在體外，將從病人分離出的細(xì)胞以一個或多個肽混合，該肽是從病人的腫瘤抗原衍生而得的，并與病人的MHC-I分子或MHC-II分子相結(jié)合。在本發(fā)明的另一個實施方案中，這些細(xì)胞也可在體內(nèi)用肽加載。為此，優(yōu)選地皮下注射由肽，聚陽離子和必要時的DNA組成的復(fù)合物。因為枝狀細(xì)胞特別是在皮膚中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，該肽和用于轉(zhuǎn)移到CT-26細(xì)胞的TfpL或pL，并和用于轉(zhuǎn)移到M-3細(xì)胞的TfpL及非功能性質(zhì)粒復(fù)合。在CT-26細(xì)胞系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，用產(chǎn)生有效抗腫瘤免疫性的肽異化的，輻照的腫瘤疫苗75％接種的試驗老鼠能消除腫瘤的免疫攻擊，這導(dǎo)致在全部對照動物中形成腫瘤，它們或沒有給予疫苗，或所給予的疫苗沒有異源肽。在M-3細(xì)胞體系中同樣的異源肽，在一個用于人類情況的實驗中就腫瘤形成而論在對有機體更為嚴(yán)格的條件下進(jìn)行試驗。用異源膠溶(xenopeptisierfen)的，輻照的M-3細(xì)胞接種有轉(zhuǎn)移瘤的鼠。87.5％經(jīng)接種的鼠可以清除其轉(zhuǎn)移瘤。而所有未經(jīng)接種處理的鼠以及給予沒有異源肽的疫苗的老鼠中8只有7只患有腫瘤。
還發(fā)現(xiàn)，據(jù)本方法的系統(tǒng)性的腫瘤疫苗的系統(tǒng)免疫應(yīng)答的程度取決于加到腫瘤細(xì)胞上肽所用的方法。當(dāng)通過多賴氨酸/轉(zhuǎn)鐵蛋白使肽加到細(xì)胞上時，其功效比用肽對細(xì)胞進(jìn)行24個小時培育時的功效(“脈動”)要更明顯?；旌嫌须暮洼椪找呙绲闹鷦┮彩菬o效的。轉(zhuǎn)鐵蛋白感染作用(transferrinfection)，應(yīng)確保肽在細(xì)胞中更有效的吸取，或用多賴氨酸/轉(zhuǎn)鐵蛋白加載使肽仍然粘著在細(xì)胞膜上，因而物理地接近MHC-I分子并可以與之結(jié)合，由于其強烈的親合力，它可以取代弱結(jié)合的細(xì)胞性肽。
附圖附

圖1a-c用外源肽處理的M-3細(xì)胞的FACS分析，附圖1d用FITC-肽處理的M-3細(xì)胞的縮微照片，附圖2a，b用加載外源肽的M-3細(xì)胞的疫苗治療帶有M-3-黑素瘤轉(zhuǎn)移的DBA/2老鼠的情況，附圖3a用于制備腫瘤疫苗的外源肽的滴定，附圖3b載有外源肽的腫瘤細(xì)胞的腫瘤疫苗與分泌IL-2的腫瘤疫苗的比較，附圖4a用載有外源肽的結(jié)腸癌細(xì)胞制備的疫苗進(jìn)行予免疫作用而對Balb/c老鼠的防護作用。
附圖4b在系統(tǒng)的免疫性中T-細(xì)胞的參與研究，附圖5用載有外源肽的黑素瘤細(xì)胞的疫苗進(jìn)行予免疫作用，以對C57BL/6J老鼠的防護。
在下列實例中，如無特別指明就使用下列的物質(zhì)與方法鼠的黑素瘤細(xì)胞素細(xì)胞系Cloudman S91(克隆M-3；ATCCNo.CCL53.1)是由ATCC獲得的。
黑素瘤細(xì)胞系B16-F10(Fidler等人，1975年)是由NIH DCT TumorDepository(腫瘤貯存所)獲得的。
轉(zhuǎn)換蛋白-多賴氨酸的共軛體是按Wo 94/21808所描述，由含有DNA的轉(zhuǎn)染復(fù)合物實施的。
在一個肽合成器上(具有反饋監(jiān)視器的433A型，Applied Biosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng))，F(xiàn)oster市，加拿大)，用Tenta Gel S PHB(Rapp，Tubingen)作為固定相，使用Fmoc方法(HBTU-活化，F(xiàn)astmocTM，比例為0∶25mmol)合成肽LFEAIEGFI，F(xiàn)FIGALEEI，LPEAIEGFG和ASNENMETM，將肽溶解于其pH＝7.3的1M TEAA中。并用反相色譜法在一個Vydac C 18-柱中純化。該順序是用快速質(zhì)譜法(Flugzeitmassenspektrometrie)，在一個MATLasermat(Finnigan，San Jose，加拿大)上證實的。
使用Wo 94/21808中所述方法，測試用有效于防止形成轉(zhuǎn)移瘤的癌疫苗的效果(治療的鼠模式)，以及進(jìn)行預(yù)防性鼠模式的試驗。其中所用的試驗鼠模式是DBA/2鼠模式與Balb/c鼠模式。
實施例1通過各種方法，用外源肽處理的M-3-細(xì)胞的比較FACS分析。
在示于圖1的研究中，表明一個情況下是用TfPL/DNA復(fù)合物將外源肽LFEAIEGFI加到M-3-細(xì)胞上。(“轉(zhuǎn)加載”，圖1a)，另一個情況是用肽培育細(xì)胞(“脈動”，圖1b)，最后一個情況是混有肽的助劑加到細(xì)胞上(附圖1c)。
為了進(jìn)行轉(zhuǎn)載，將160微克的FITC-標(biāo)記的異源肽LFEAIEGFI或未標(biāo)記的對照肽，和3微克的轉(zhuǎn)換蛋白/多賴氨酸(TfPL)，10微克pL及6微克PSP 65(Boehringer，不含LPS)在500毫升的HBS緩沖液中混合，室溫下30分鐘后，把上述溶液放入裝有20毫升DMEM介質(zhì)中(10％FCS，20mM葡萄糖)有1.5×106M-3細(xì)胞的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并在37℃下培育。3個小時后，將上述細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并用PBS/2mM EDTA分離。然后，再懸浮在1毫升的PBS/5％FCS中，以進(jìn)行FACS分析。
在37℃下，使用裝在20毫升DMEM中的1-2×106細(xì)胞和450微克肽(FITC-標(biāo)記的或未標(biāo)記的)使細(xì)胞與肽的脈動3小時。
在FACS分析前，使從培養(yǎng)瓶分離的106細(xì)胞與100微克的FITC-標(biāo)記的肽在1毫升的PBS/5％FCS中，在室溫下培育30分鐘以進(jìn)行助劑混合。用PBS/5％FCS交替洗滌細(xì)胞，并再次分析。根據(jù)制造商的說明，用裝有5W氬激光的FACS Vantage儀器(Becton Dickinson)，設(shè)置在100mW的458nm進(jìn)行FACS分析。上述FACS分析測定結(jié)果示于圖1a-1c。圖1d顯示了經(jīng)細(xì)胞離心的M-3細(xì)胞的縮微照片其中上圖表明經(jīng)復(fù)合(“轉(zhuǎn)載”)而得肽的細(xì)胞；而下圖表明，用肽培育(“脈動”)的細(xì)胞，并使用DAP1對核進(jìn)行復(fù)染。
載有含肽的復(fù)合物的M-3細(xì)胞，與未須處理的細(xì)胞或只用多賴氨酸處理的細(xì)胞相比較，表明其熒光位移幾乎有2個10的冪。這表明借助TfpL/DNA復(fù)合物，肽有效轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上(圖1a)。用肽培育(“脈動”)其作用很小，可由熒光移位下降到只有1個10的冪而看到，這在熒光顯微術(shù)中實際上是不可檢測的(圖1d)。當(dāng)助劑混合的情況下，經(jīng)洗滌后肽已消失(圖1c)，這表明肽的結(jié)合是可忽略不計的。
實施例2用加載外源肽的黑(素)瘤細(xì)胞的疫苗治療有黑(素)瘤轉(zhuǎn)移的DBA/2-鼠(治療性鼠模式)。
a)由M-3細(xì)胞制備腫瘤疫苗。
將160微克的異源肽LFEAIEGFI和3微克的轉(zhuǎn)鐵蛋白/多賴氨酸(TfpL)，10微克pL和6微克Psp 65(不含LPS)，在500微升的HBS緩沖液中混合。在室溫下靜置30分鐘后，把上述溶液加入裝有在20毫升的DMEM介質(zhì)(10％FCS，20mM葡萄糖)中的1.5×106M-3細(xì)胞的T75細(xì)胞培育瓶中，并在37℃下培育。3小時后，向上述細(xì)胞液中加入15毫升的新鮮介質(zhì)并在37℃下與5％CO2中培育過夜。在使用前4小時，用20Gy輻照該細(xì)胞。疫苗按Wo 94/21808中所述制備。
b)腫瘤疫苗的有效性。
把腫瘤疫苗(劑量105細(xì)胞/試驗動物)經(jīng)皮下注射，在一周內(nèi)分兩次注入到染有5天轉(zhuǎn)移瘤的6-12周齡的成年DBA/2鼠內(nèi)(經(jīng)皮下注入104的活性M-3細(xì)胞而產(chǎn)生)。共用8只鼠進(jìn)行試驗。試驗結(jié)果示于圖2a；其中8只中有7只的鼠經(jīng)施用疫苗后治愈，該疫苗含有通過TfPL/DNA復(fù)合物而加載到腫瘤細(xì)胞上的肽。在對比試驗中，使用了一種通過培育(在37℃下，3小時，“脈動”)而將肽LFEAIEGFI(400微克或4毫克)加到細(xì)胞上的疫苗。對于給以有400微克肽的疫苗的動物中，8只有3只的鼠保持不患腫瘤。當(dāng)含有有4毫克肽處理的細(xì)胞的疫苗時，只有1只鼠治愈。如果只在其本身用輻照的M-3細(xì)胞，以及加載不含肽的復(fù)合物的細(xì)胞的對照實驗則每種情況下8只中只有1只動物沒有患腫瘤。對一組什么也不進(jìn)行處理的對照試驗動物，所有的動物都患有腫瘤。
為了一方面研究疫苗的制備方法的關(guān)聯(lián)，另一方面，研究肽的順序，還須進(jìn)行另一組試驗。在這組試驗中要使用一個高致瘤性的M-3細(xì)胞變體。在這試驗中，測試了處理方法的重要性。在制備疫苗中，使用多賴氨酸/轉(zhuǎn)鐵蛋白，沒有將肽加載到細(xì)胞上，而僅僅與細(xì)胞混合而成助劑。在控制肽順序方面，將肽的固定式氨基酸放在第2與第9位置上，即苯基丙氨酸與異亮氨酸各被脯氨酸及甘氨酸所代替，以形成肽Leu Pro Glu Ala Ile Glu Glg PheGly(LPEAIEGFG)，這種肽缺乏對H2-Kd結(jié)合能力。至少每周監(jiān)測一次轉(zhuǎn)移灶的形成。該試驗結(jié)果示于圖2b中。通過使用TfpL/DNA復(fù)合物，使細(xì)胞加載LFEAIEGFI而制備的疫苗，能治愈8個試驗鼠中的6個。與此相反，當(dāng)肽LFEAIEGFI與細(xì)胞僅僅混合而制備出的疫苗，或含有一種，通過具有改性的，不結(jié)合到HLA型主的肽LPEAIEGFG的TfPL/DNA復(fù)合物加載的細(xì)胞，所制備的疫苗，則試驗中的8只老鼠有7只患腫瘤。在對照試驗組中，僅用輻照的M-3細(xì)胞處理的，或什么也不進(jìn)行處理，則全部都患腫瘤。
c)研究在疫苗中肽加入量的影響。
如同在a)所述，制備含有肽的復(fù)合物，其中含有50，5或0.5微克的有效肽LFEAIEGFI，并加載到M-3細(xì)胞。作為比較，使用一種分泌最佳IL-2劑量的IL-2疫苗(參閱d))。將該疫苗接種在有五天轉(zhuǎn)移瘤的DBA/2鼠上。具有50微克肽的疫苗治愈了8只中的6只鼠，當(dāng)疫苗中有5微克肽時，可治愈8只中的4只鼠，同樣在IL-2疫苗中，而含有0.5微克的肽的疫苗只能治愈8只中的2只鼠，試驗結(jié)果示于圖3a上。
實施例3在預(yù)防性鼠模式中，含自外源肽的疫苗和由分泌IL-2的腫瘤細(xì)胞制成的腫瘤疫苗進(jìn)行比較。
在對照試驗中，兩組試驗動物(各8只)，其中一組施用實例2a)中描述的疫苗，另一組施用分泌IL-2的M-3細(xì)胞的疫苗(按Wo 94/21808所述的方法制備，每只動物的IL-2劑量為2000單位)，在一周內(nèi)免疫處理二次。在最后一次接種疫苗后一周，隨著腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增長，形成對側(cè)的腫瘤(“免疫抗原劑量”，其劑量如圖3b中所示)。發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明的腫瘤疫苗進(jìn)行的予免疫處理勝過用IL-2疫苗處理的結(jié)果用IL-2疫苗接種的天然鼠，只能防護劑量為105的活性高致瘤性細(xì)胞(M-3-W)。在3×105細(xì)胞的免疫抗原劑量時該疫苗的能力則已耗盡。因此，有這種范圍的腫瘤，可以有效地用加載外源肽的腫瘤細(xì)胞疫苗進(jìn)行予免疫而制止。
實施例4在預(yù)防性試驗鼠中，通過用由加載外源肽的結(jié)腸癌細(xì)胞的疫苗，進(jìn)行免疫處理，而防護Balb/c鼠。
a)CT-26疫苗的制備把160微克的異源肽LFEAIEGFI或FFIGALEEI與12微克的pL或3微克的轉(zhuǎn)鐵蛋白/多賴氨酸，加上10微克多賴氨酸進(jìn)行混合。并在室溫下，在500微升HBS緩沖液中復(fù)合30分鐘。接著轉(zhuǎn)移到裝有4毫升DMEM介質(zhì)(10％FCS，20mM葡萄糖)中有1.5×106CT-26細(xì)胞的T75細(xì)胞培育瓶中。然后，在37℃在5％CO2下培養(yǎng)。經(jīng)4小時后，將細(xì)胞用PBS洗滌。加入15毫升的新鮮介質(zhì)。并在37℃在5％CO2下培育過夜。在使用前4個小時，用100Gy輻照該細(xì)胞。疫苗按Wo94/21808所述制備。
b)測試腫瘤疫苗對CT-26免疫抗原劑量的防護作用的效果。
通過皮下注射，一周內(nèi)兩次對6-12周齡的Balb/c鼠進(jìn)行免疫接種(細(xì)胞劑量105/鼠)。每一組試驗中有8只鼠(或其中，用pL加載細(xì)胞的實驗中是7只試驗鼠)。在最后一次免疫接種后一周。使用5×104親本CT-26細(xì)胞的施加到對側(cè)腫瘤。作為比較試驗。其中的疫苗不是使用TfpL/DNA復(fù)合物的方法制備，并如實例2中所述進(jìn)行對比試驗以及對照試驗。至少每周一次檢測腫瘤免疫抗原劑量的生長。肽LFEAIEGFI的試驗結(jié)果示于圖4a中，8只中的6只試驗鼠受到防護。在肽FFIGALEEI的情況下(未在圖4a中示出)8只中有4只試驗鼠受到防護。
c)T-細(xì)胞在腫瘤疫苗活性中的參與為了檢測T-細(xì)胞在CT-26疫苗引起的系統(tǒng)免疫性中的參與，在進(jìn)行疫苗接種前24個小時，在另一個試驗中，通過靜脈注射500微克的單克隆抗體GK1.5(ATCC TIB 207)以除去CD4-細(xì)胞，并通過靜脈內(nèi)注射500微克的單克隆抗體2.43(ATCC TIB 210)以除去CD8+細(xì)胞。進(jìn)行一個陽性的對照試驗組，得到?jīng)]有除去CD4+細(xì)胞與CD8+細(xì)胞的疫苗。試驗結(jié)果示于圖4b中通過除去T細(xì)胞的所有動物，全部發(fā)生腫瘤的事實說明T-細(xì)胞的參與。
實施例5通過用加載外源肽的黑素瘤細(xì)胞的疫苗進(jìn)行予免疫處理而防護C57BL/6J試驗鼠(預(yù)防性鼠模式)。
本試驗中采用C57BL/6J系的試驗鼠(每組為8只)。并且用與所用的鼠系同源的細(xì)胞B16-F10(NIH.DCT，腫瘤保藏所；Fidler等人，1975年)作為黑素瘤細(xì)胞。
所有的試驗組的動物在一周內(nèi)兩次進(jìn)行皮下注射，每只鼠接種105B16-F10細(xì)胞的疫苗。
在一組試驗中，用順序為ASNENMETM的肽加載輻照過的B16-F10細(xì)胞而制備疫苗。如實施例2中所述的由M-3細(xì)胞制備疫苗。
在平行試驗中，使用分泌IL-2或分泌GM-CSF的B16-F10細(xì)胞(按Wo 94/21808中所述方法制備)作為予接種疫苗。該疫苗對每只動物產(chǎn)生1000單位的IL-2或200ng的GM-CSF。
一對照組在其予免疫中，接受經(jīng)輻照，但未處理過的B16-F10細(xì)胞。
在進(jìn)行最后一次疫苗接種后一周，使用1×104活性，經(jīng)輻照的B16-F10細(xì)胞的動物形成腫瘤，然后觀測腫瘤增長情況。
本試驗的結(jié)果示于圖5中，其中，表明加載有外源肽的腫瘤細(xì)胞顯示出對腫瘤形成的最佳防護作用。
表肽順序 MHC單模標(biāo)本 抗原 參者文獻(xiàn)SPSYVYHQF Ldgp70，內(nèi)生的 Huang和Pardoll，1996MuLVFEQNTAQAKbConnexin37Mandelboim，等人.，1994FEQNTAQPKbConnexin37Mandelboim，等人.，1994SYFPEITHI KdJAKl Rammensee，等人.，1995EADPTGHSY HLA-A1 MAGE-1Rammensee，等人.，1995EVDPIGHLY HLA-A1 MAGE-3Rammensee，等人.，1995YMNGTMSQV HLA-A2+酪氨酸酶 Rammensee，等人.，1995HLA-A0201MLLALLYCL HLA-AO201 酪氨酸酶 Rammensee，等人.，1995AAGIGILTV HLA-AO201 Melan A/Martl Rammensee，等人.，1995YLEPGPVTA HLA-AO201 pmel17/gp100 Rammensee，等人.，1995ILDGTATLRL HLA-AO201 pmel17/gp100 Rammensee，等人.，1995SYLDSGIHF HLA-A24 B-Catenin Robbins，等人.，1996AINNYAQKL DbSV-40大小 Lill，等人.，1992CKGVNKEYL 的T-抗原QGINNLDNLNLDNLRDYLEEKLIVVLF HLA-B44 MUM-1 Coulie，等人.，1995ACDPHSGHFV HLA-A2突變的CDK4 Wolfel，等人.，1995AYGLDFYIL HLA-A24 p15，未知功能 Robbins，等人.，1995KTWGQYWQV HLA-A2gp100 Kawakami和YLEPGPVTARosenberg，1995HMTEVVRHC HLA-A2突變的p53 Houbiers，等人.，1993KYICNSSCM Kd突變的p53 Noguchi，等人.，1994GLAPPQHEI HLA-A2突變的p53 Stuber，等人.，1994LLGRNSEEMLLPENNVLSPL HLA-A2野生型p53 Theobald，等人.，1995RMPEAAPPVLLGRNSFEVLLGRDSFEV HLA-A2突變的p53 Theobald，等人.，1995
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權(quán)利要求
1.給藥病人的腫瘤疫苗，其特征是，它含有腫瘤細(xì)胞，該腫瘤細(xì)胞本身在HLA范圍呈現(xiàn)由腫瘤抗原衍生的肽，而且其中至少部分在細(xì)胞表面上表明至少有一個病人的MHC-I單模標(biāo)本，以及該細(xì)胞要加載一個或多個的a)型和/或b)的肽，以致使該腫瘤細(xì)胞在有肽的范圍內(nèi)被病人的免疫系統(tǒng)識別為外來的，而且激發(fā)一種細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中該肽是a)起MHC-I單模標(biāo)本的配位體的作用，它與病人及疫苗的腫瘤細(xì)胞是共同的，該肽不同于由病人細(xì)胞所表達(dá)的蛋白衍生的肽，或是b)起MHC-I單模標(biāo)本的配位體的作用，它與病人及疫苗的腫瘤細(xì)胞是共同的，并由病人細(xì)胞表達(dá)的腫瘤抗原衍生的，而且在疫苗的腫瘤細(xì)胞上的濃度在病人的腫瘤細(xì)胞上表達(dá)時要高于由相同的腫瘤抗原衍生的肽的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的腫瘤疫苗，其特征是，它含有自體的腫瘤細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的腫瘤疫苗，其特征是，它含有異源腫瘤細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的腫瘤疫苗，其特征是，該異源腫瘤細(xì)胞是一個或多個的細(xì)胞系，其中至少一個細(xì)胞系表達(dá)一個或多個的腫瘤抗原，該抗原是與要治療的病人的腫瘤抗原相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中之一的腫瘤疫苗，其特征是，它是由自體細(xì)胞及異源細(xì)胞的混合物所組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的腫瘤疫苗，其特征是，該a)型或b)型肽是一個HZ-Kd配位體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的腫瘤疫苗，其特征是，該a)型或b)型肽是一個HZ-Kb的配位體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，6或7的腫瘤疫苗，其特征是，該a)肽是一個天然的免疫原蛋白或其細(xì)胞破裂產(chǎn)物衍生的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的腫瘤疫苗，其特征是，該a)肽是一個病毒性蛋白衍生的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的腫瘤疫苗，其特征是，該肽是由一個流感病毒蛋白衍生的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的腫瘤疫苗，其特征是，該肽具有Leu Phe Glu AlaIle Glu Gly Phe Ile順序。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的腫瘤疫苗，其特征是，該肽具有Ala Ser Asn GluAsn Met Glu Thr Met的順序。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的腫瘤疫苗，其特征是，該a)型肽是由細(xì)菌性蛋白衍生的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的腫瘤疫苗，其特征是，該a)型肽是由對病人異源的腫瘤抗原衍生的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的腫瘤疫苗，其特征是，該a)型肽是一個合成肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的腫瘤疫苗，其特征是，該肽具有Phe Phe Ile GlyAla Leu Glu Glu Ile順序。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中之一的腫瘤疫苗，其特征是，該腫瘤細(xì)胞用具有不同順序的多個肽處理的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的腫瘤疫苗，其特征是，該肽由于結(jié)合在不同的HLA-亞型上而是不同的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的腫瘤疫苗，其特征是，該肽在其對HLA結(jié)合不是起決定性的順序方面，是有區(qū)別的。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中之一的的腫瘤疫苗，其特征是，它含有用一個胞質(zhì)分裂基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的腫瘤疫苗，其特征是，該細(xì)胞分裂素是IL-2和/或IFN-γ。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中之一的腫瘤疫苗，其特征是，它含有用一個b)型肽處理的成纖維細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中之一的腫瘤疫苗，其特征是，它也含有用一個b)型肽和/或一個與MHC-II分子結(jié)合的肽所處理的枝狀細(xì)胞。
24.制備一種給藥病人的，含有腫瘤細(xì)胞的腫瘤疫苗的方法，其特征是，用一個或多個肽處理腫瘤細(xì)胞，該細(xì)胞本身在HLA范圍呈現(xiàn)由腫瘤抗原衍生的肽，而且其中至少部分表達(dá)至少一個病人的MHC-I單模標(biāo)本，該肽是a)起MHC-I單模標(biāo)本的配位體作用，它與病人及疫苗的腫瘤細(xì)胞是共同的，而且與由病人細(xì)胞所表達(dá)的蛋白衍生的肽是不同的，b)起MHC-I單模標(biāo)本的配位體的作用，它與病人及疫苗的腫瘤細(xì)胞是共同的，并由病人細(xì)胞所表達(dá)的腫瘤抗原衍生的，在有有機聚陽離子參與的情況下，該腫瘤細(xì)胞與一個或多個的a)型和/或b)型肽進(jìn)行培育，其培育的時間和要達(dá)到的量要使肽結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上，并使它們在有腫瘤細(xì)胞的范圍內(nèi)被病人的免疫系統(tǒng)識別為外來的，而且激發(fā)一種細(xì)胞免疫應(yīng)答。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其特征是，該聚陽離子是多賴氨酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其特征是，該多賴氨酸具有約30-300的賴氨酸基因。
27.根據(jù)權(quán)利要求24-26中之一的方法，其特征是，該聚陽離子至少以部分共軛方式存在。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其特征是，該聚陽離子是與轉(zhuǎn)鐵蛋白共軛的。
29.根據(jù)權(quán)利要求24-27中之一的方法，其特征是，在有DNA參與的情況下，處理該細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其特征是，該DNA是一個質(zhì)粒。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的方法，其特征是，該DNA，必要時與蛋白部分共軛的聚陽離子的比例約為1∶2～1∶5。
32.根據(jù)權(quán)利要求29-31中之一的方法，其特征是，該細(xì)胞是黑素瘤細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其特征是，每1×105～2×107細(xì)胞中使用約50～160微克的a)型和/或b)型肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求24-32中之一方法對成纖維細(xì)胞的應(yīng)用，其中，使用一個由病人腫瘤抗原衍生的b)型肽作為肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求24-33中之一方法對枝狀細(xì)胞的應(yīng)用，其中，其中使用一個由病人的腫瘤抗原衍生的b)型肽和/或結(jié)合到病人MHC-II分子上的肽作為肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤疫苗及其制備方法。腫瘤疫苗包含腫瘤細(xì)胞,其中至少部分,在其細(xì)胞表面上含有至少一個病人的MHC－I－單模標(biāo)本,并且該細(xì)胞加載有一個或多個的結(jié)合到MHC－I分子的肽,以致使這些腫瘤細(xì)胞在有肽的范圍內(nèi)被病人的免疫系統(tǒng)識別為外來的,而且激發(fā)一種細(xì)胞免疫應(yīng)答。加載是在有聚陽離子,如多賴氨酸參與下進(jìn)行的。
文檔編號A61P35/00GK1202931SQ96198493
公開日1998年12月23日 申請日期1996年11月21日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月23日
發(fā)明者沃爾特·施米特, 馬克斯·伯恩斯蒂爾, 塔馬斯·施韋格霍弗, 彼得·斯坦雷恩, 邁克爾·布希里 申請人:貝林格爾·英格海姆國際有限公司