一種腫瘤細(xì)胞疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種抗腫瘤細(xì)胞疫苗及其制備方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為本領(lǐng)域治療腫瘤提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了一種新型的腫瘤細(xì)胞疫苗的制備方法。該方法是由脂多糖刺激腫瘤細(xì)胞得到腫瘤細(xì)胞疫苗。本發(fā)明制備腫瘤細(xì)胞疫苗的方法能夠有效地制備出各種來源的腫瘤細(xì)胞疫苗，且制得的腫瘤細(xì)胞疫苗注射入機體后可誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，特別是促進CD8陽性T細(xì)胞的激活和增殖，特異殺傷腫瘤細(xì)胞，從而起到預(yù)防和治療腫瘤的目的。此外本發(fā)明方法簡便，重復(fù)性強，成本低，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種腫瘤細(xì)胞疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種抗腫瘤細(xì)胞疫苗及其制備方法。
技術(shù)背景
[0002]腫瘤作為一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，其治療方法包括手術(shù)，化療，放療等多種方法，但是其治療效果往往不甚理想。近年來，腫瘤細(xì)胞疫苗作為一種有潛力的新型的針對腫瘤治療及預(yù)防的手段已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注。
[0003]腫瘤細(xì)胞自身含有多種已知和未知的抗原，雖然可以引起機體的免疫反應(yīng)，但是由于腫瘤細(xì)胞的免疫原性低，通常情況下所引起的免疫反應(yīng)都不足以抵抗腫瘤細(xì)胞的侵襲。因此，增強腫瘤細(xì)胞的免疫原性成為腫瘤疫細(xì)胞苗的亟待解決的關(guān)鍵問題?，F(xiàn)在，增強腫瘤細(xì)胞的免疫原性的方法主要有以下幾種:(I)通過基因工程修飾腫瘤細(xì)胞，如向腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入相關(guān)細(xì)胞因子的基因或與抗原提成有關(guān)的分子基因；(2)將腫瘤細(xì)胞與相關(guān)細(xì)胞因子共同培養(yǎng)，如GM-CSF、TNF- α、IFN- y、IL-12等；(3)添加免疫佐劑等。
[0004]脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是內(nèi)毒素，在革蘭氏陰性菌感染及疾病演化中起重要作用。LPS具有復(fù)雜的生物活性，可以引起機體強烈的免疫反應(yīng)，LPS刺激細(xì)胞可以啟動細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈，激活NF-κ B、MAPK、p38等信號通路，啟動基因轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)和釋放多種細(xì)胞因子，如CCL3、CCL5、CXCL8、CXCLlO等。而射線輻照是一種常用的滅活細(xì)胞的方法，在制備腫瘤疫苗中經(jīng)常被使用。
[0005]目前還沒有使用輻射照射滅活經(jīng)LPS刺激的腫瘤細(xì)胞制備成腫瘤細(xì)胞疫苗的報道，而本領(lǐng)域也需要提供新的有效的腫瘤疫苗以供選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為本領(lǐng)域治療腫瘤提供一種新的有效選擇。
[0007]本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了一種新型的腫瘤細(xì)胞疫苗的制備方法。該方法是由脂多糖刺激腫瘤細(xì)胞得到腫瘤細(xì)胞疫苗。
[0008]進一步的，該方法包括以下步驟:
[0009]I)、在含有脂多糖的培養(yǎng)基中刺激培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期；
[0010]2)、收集步驟I)處理后的腫瘤細(xì)胞,清洗去除LPS ；
[0011]3)、在無菌條件下輻照滅活腫瘤細(xì)胞，得到腫瘤細(xì)胞疫苗。
[0012]其中，上述方法中所述的含有脂多糖的培養(yǎng)基中的脂多糖的濃度為0.01~
10μ g/ml。優(yōu)選的，所述含有脂多糖的培養(yǎng)基中的脂多糖的濃度為I μ g/ml。
[0013]進一步的，上述方法在輻照滅活腫瘤細(xì)胞前，將清洗后的細(xì)胞重懸，按疫苗的最終使用濃度要求調(diào)整濃度。優(yōu)選的，調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度至IXIO6~IXIOVlOOμ I。
[0014]其中，上述方法中輻照滅活的輻照劑量為50~lOOGy。
[0015]其中，上述上述方法中用含有脂多糖的培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的時間為6~96h。優(yōu)選的，刺激培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的時間為48h。[0016]其中，上述方法中所述的腫瘤為:血液腫瘤、黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肉瘤、胃癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等。所述血液腫瘤主要包括白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及淋巴瘤。
[0017]本發(fā)明還提供了一種腫瘤細(xì)胞疫苗。該腫瘤細(xì)胞疫苗是上述的腫瘤細(xì)胞疫苗制備方法所制備而成。
[0018]本發(fā)明還同時提供了上述的腫瘤細(xì)胞疫苗在制備抗腫瘤藥物中的用途。進一步的，所述的抗腫瘤藥物的劑型為注射劑。
[0019]為了研制一種新型的更為有效的腫瘤細(xì)胞疫苗，本發(fā)明使用LPS刺激體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，然后經(jīng)過射線輻照滅活。分別通過預(yù)防性免疫和治療性免疫實驗證明，本發(fā)明方法可以有效提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)，對腫瘤有預(yù)防和治療效果。提供一種有前景的腫瘤預(yù)防和治療的手段。本發(fā)明中的脂多糖可選用各種來源的脂多糖，一般的是革蘭氏陰性菌來源的脂多糖。在本發(fā)明后附的實例中，優(yōu)選使用的是大腸桿菌來源的脂多糖。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明腫瘤細(xì)胞疫苗的制備方法可用于各種腫瘤細(xì)胞進行疫苗的制備，包括但不限于商品化的細(xì)胞株、實驗室改造的細(xì)胞株、腫瘤裂解物、實體瘤分離的單個細(xì)胞等。同時，本發(fā)明方法可以適用于各種腫瘤細(xì)胞疫苗的制備，并不只限于本發(fā)明實施案例中使用的細(xì)胞類型和種類。 [0021]本發(fā)明方法制備得到的腫瘤疫苗，可馬上使用，也可在_80°C保存?zhèn)溆?。推薦現(xiàn)制備現(xiàn)使用。
[0022]使用的輻照所采用的放射線種類可包括X射線，Y射線，同位素放射源射線Co6°等；只要達(dá)到規(guī)定的劑量，滅活腫瘤細(xì)胞即可。輻照可在細(xì)胞計數(shù)前，也可在細(xì)胞計數(shù)后。輻照時，按要求是要將細(xì)胞放置于非金屬容器中。
[0023]更具體的，本發(fā)明腫瘤疫苗制備方法包括以下步驟:①在培養(yǎng)基中加入LPS，體外培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞處于對數(shù)增長期；所述LPS濃度推薦I μ g/ml ;②離心收集步驟①所述的腫瘤細(xì)胞，至少清洗3遍，清洗干凈即可；主要為了避免殘存LPS的影響；③將步驟②凈化處理的腫瘤細(xì)胞重懸，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為最終使用濃度；細(xì)胞終濃度推薦為
IX IO6~I X 107/100 μ I ;④將步驟③所述的腫瘤細(xì)胞移至非金屬容器中，放射線輻照，得到的即為該腫瘤疫苗；輻照劑量推薦50~IOOGy得到本發(fā)明腫瘤細(xì)胞疫苗。
[0024]本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，上述步驟①中所述的培養(yǎng)是指含有滿足正常細(xì)胞生長所需物質(zhì)的培養(yǎng)基(如1640培養(yǎng)基等常規(guī)的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基)對細(xì)胞進行培養(yǎng)，加入LPS共同培養(yǎng)時間推薦為48h。培養(yǎng)基只要是適合細(xì)胞生長，并不只限于本發(fā)明所涉及的培養(yǎng)基種類。
[0025]步驟②要對細(xì)胞進行清洗，推薦使用無菌生理鹽水或者PBS，但并不只限于這些溶劑，可以使用各種不引起機體過敏反應(yīng)的具有緩沖能力的溶劑；清洗收集細(xì)胞離心推薦轉(zhuǎn)速為 1000rpm/min, 3 ~5min。
[0026]輻照時優(yōu)選的的方式是由金屬銅片至于輻射源和腫瘤細(xì)胞之間隔絕產(chǎn)熱的低能射線，且低劑量長時間照射以達(dá)到滅活至無增殖能力的效果，不破壞腫瘤細(xì)胞為佳。最好能保持細(xì)胞的完整性和免疫原性。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明提供了有上述的方法制備得到的腫瘤細(xì)胞疫苗。
[0028]本發(fā)明腫瘤細(xì)胞疫苗可放在_80°C保存?zhèn)溆?，在需要用的時候融化使用，也可制備后立即使用。本發(fā)明所提供腫瘤疫苗可以通過皮下、腹腔或肌肉等方式注射給藥，對個體進行免疫，以抑制腫瘤的生成與生長。當(dāng)然也可以采用本領(lǐng)域的其他可用方式進行免疫，或者是多種方式的組合。
[0029]本發(fā)明腫瘤細(xì)胞疫苗制劑，可以有不同的免疫時間間隔。可以給藥一次，也可以多次。具體實施過程中可以根據(jù)實際情況改變或者調(diào)整免疫次數(shù)和免疫時間點。比如在預(yù)防性免疫時，采用第0，14，28天共3次的免疫時間間隔的給藥方式。比如在治療性免疫時，采用每周一次的免疫時間間隔。
[0030]實現(xiàn)本發(fā)明的目的之三的技術(shù)方案是:上述所述腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。在作為抗腫瘤藥物使用時，本發(fā)明腫瘤細(xì)胞疫苗可單獨使用或與其它抗腫瘤藥物、抗體、疫苗或方法等聯(lián)合使用，如放療、熱療等，但不僅限于這些方法。
[0031]本發(fā)明方法的有益效果在于:本發(fā)明制備腫瘤細(xì)胞疫苗的方法能夠有效地制備出各種來源的腫瘤細(xì)胞疫苗，且制得的腫瘤細(xì)胞疫苗注射入機體后可誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，特別是促進CD8陽性T細(xì)胞的激活和增殖，特異殺傷腫瘤細(xì)胞，從而起到預(yù)防和治療腫瘤的目的。實驗證明本發(fā)明方法制得的多種腫瘤細(xì)胞疫苗都表現(xiàn)出了很好的預(yù)防和治療效果，并且具有較好的安全性。此外本發(fā)明方法簡便，重復(fù)性強，成本低，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0032]圖1是本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞疫苗的制備工藝中的一個較為詳細(xì)的流程示意圖。
[0033]圖2顯示了 LPS刺激后的腫瘤細(xì)胞疫苗在小鼠淋巴瘤E.G7移植瘤模型中具有顯著的抗腫瘤作用。
[0034]圖3顯示了 LPS刺激后的腫瘤細(xì)胞疫苗可以誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的特異性CTL反應(yīng)。
[0035]圖4顯示了經(jīng)LPS刺激后的腫瘤細(xì)胞疫苗免疫后，分離小鼠脾臟中的T淋巴細(xì)胞用于細(xì)胞過繼治療，也表現(xiàn)出很好地抗腫瘤效果。
[0036]圖5顯示了 LPS刺激后的腫瘤細(xì)胞疫苗可以顯著延長E.G7荷瘤小鼠的存活時間。
[0037]圖6顯示了 LPS刺激后的腫瘤細(xì)胞疫苗可以顯著降低小鼠E.G7移植瘤的成瘤率。
[0038]圖7顯示了 LPS刺激后的腫瘤細(xì)胞疫苗在小鼠黑色素瘤B16-F10移植瘤模型中具有明顯的抗腫瘤作用。
[0039]圖8顯示了 LPS刺激后的腫瘤細(xì)胞疫苗可以顯著延長B16-F10荷瘤小鼠的存活時間。
[0040]圖9顯示了 LPS刺激后的腫瘤細(xì)胞疫苗可以顯著減少小鼠結(jié)腸癌CT26腹腔瘤模型中腹腔腫瘤結(jié)節(jié)，具有很好的抗腫瘤作用。
【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的描述說明。以下實施中將進一步說明該腫瘤細(xì)胞疫苗的制備和使用方法，本發(fā)明包括但不限于以下實施中所列舉的具體方法步驟。
[0042]實施例1:LPS刺激的淋巴瘤細(xì)胞疫苗的制備[0043]1、實驗材料和試劑
[0044]小鼠腫瘤細(xì)胞一EG.7 淋巴瘤細(xì)胞(購自 American Type Culture Collection,ATCC，
[0045]CRL-2113)，1640 培養(yǎng)基(購自 Gibco 公司,A10491-01)，LPS(購自 Sigma 公司，L4005-100MG)。
[0046]2、實驗步驟
[0047]體外培養(yǎng)(本實例中為1640+10% FBS)小鼠腫瘤細(xì)胞(本實例中的腫瘤細(xì)胞為小鼠淋巴瘤細(xì)胞EG.7)，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩組:一組加入I μ g/ml LPS刺激培養(yǎng)；一組使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。48h后，用無血清和無抗生素的雙無培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3遍，收集細(xì)胞與離心管中，以雙無的培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至I X 107/ml,75Gy輻照滅活。其中加入了 LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)的為實驗組(EG.7/LPS)，使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的為對照組(EG.7);另外設(shè)置生理鹽水同為對照組(saline)。
[0048]實施例2:淋巴瘤細(xì)胞疫苗預(yù)防小鼠移植瘤的生存與生長
[0049]1、實驗材料和試劑
[0050]小鼠腫瘤細(xì)胞同實施例1，6_8周齡雌性SPF級C57小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)
[0051]2、實驗步驟
[0052]C57 小鼠隨機分為 3 組(saline, EG.7，EG.7/LPS)，每組 10 只，saline:對照組；EG.7:未刺激的腫瘤細(xì)胞疫苗；EG.7/LPS:LPS刺激的腫瘤細(xì)胞疫苗；分別在各組小鼠的左背側(cè)皮下注射疫苗，分為3點注射，以開始第一次免疫的時間為第O天，然后分別在第14天、21天免疫第2次和第3次，第28天時在小鼠的右側(cè)皮下接種小鼠淋巴瘤細(xì)胞3 X IO6/只，建立小鼠移植瘤模型，每3天測量一次小鼠的腫瘤體積。實驗結(jié)果顯示，見圖2，與對照組(salline)和未經(jīng)LPS刺激的腫瘤細(xì)胞疫苗組(EG.7)相比，LPS刺激的腫瘤細(xì)胞疫苗組(EG.7/LPS)的腫瘤生長明顯得到抑制，其中有半數(shù)左右未成瘤。
[0053]實施例3:淋巴瘤細(xì)胞疫苗刺激腫瘤特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷功能
[0054]1、實驗材料和試劑
[0055]小鼠同實施例2，小鼠腫瘤細(xì)胞同實施例1，淋巴細(xì)胞分離液(購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，DKW33-R0100)，Na251CrO4 (購自四川大學(xué)同位素實驗室)，70 μ m尼龍網(wǎng)過濾器(購自BD Falcon公司,352350),圓底96孔板(購自康寧公司,costar3599)
[0056]2、實驗步驟
[0057]細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷功能檢測采用51Cr釋放試驗檢測
[0058]小鼠免疫同實施例2中所述，第28天時每組隨機取3只小鼠。無菌條件下解剖小鼠，分離脾臟，使用70 μ m尼龍網(wǎng)過濾器碾磨分散脾臟細(xì)胞，加入淋巴細(xì)胞分離液分離制備單個脾臟淋巴細(xì)胞。將分離的脾臟淋巴細(xì)胞用培養(yǎng)基清洗3遍，離心后重懸，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至lXlOVml，獲得的淋巴細(xì)胞即為效應(yīng)細(xì)胞。
[0059]收集體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞E.G7，細(xì)胞計數(shù)，用培養(yǎng)基將腫瘤細(xì)胞的濃度調(diào)整至
IX IOVml，取200 μ I細(xì)胞，加入100 μ CiNa251CrO4, 37°C孵育2h進行標(biāo)記，清洗3次后，細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至lX105/ml，獲得的51Cr標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞即為靶細(xì)胞。
[0060]將靶細(xì)胞懸液加入圓底96孔板中，每孔100μ 1，設(shè)3個副孔，按照表1的不同比例加入效應(yīng)細(xì)胞:
[0061]表1
[0062]
【權(quán)利要求】
1.腫瘤細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，是由脂多糖刺激腫瘤細(xì)胞得到腫瘤細(xì)胞疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于包括以下步驟: . 1)、在含有脂多糖的培養(yǎng)基中刺激培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期； . 2)、收集步驟I)處理后的腫瘤細(xì)胞,清洗去除LPS； .3)、在無菌條件下輻照滅活腫瘤細(xì)胞，得到腫瘤細(xì)胞疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述含有脂多糖的培養(yǎng)基中的脂多糖的濃度為0.01~10 μ g/mlo
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述含有脂多糖的培養(yǎng)基中的脂多糖的濃度I μ g/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:在輻照滅活腫瘤細(xì)胞前，將清洗后的細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸，按疫苗的最終使用濃度要求調(diào)整濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:調(diào)整至腫瘤細(xì)胞濃度為IX 106~.1Χ 107/100 μ I。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，輻照滅活的輻照劑量為50~.1OOGy.
8.根據(jù)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于用含有脂多糖的培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的時間為2~96h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8任一項所述的制備方法，其特征在于:所述的腫瘤為:血液腫瘤、黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肉瘤、胃癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等。
10.腫瘤細(xì)胞疫苗，其特征在于由權(quán)利要求1~9任一項所述的方法制備而成。
11.權(quán)利要求10所述的腫瘤細(xì)胞疫苗在制備抗腫瘤藥物中的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于所述的抗腫瘤藥物的劑型為注射劑。
【文檔編號】A61P35/00GK103920145SQ201410190510
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】魏于全, 沈國波, 李昱立, 黃爽 申請人:四川大學(xué)