專利名稱：基于內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原的腫瘤疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及腫瘤免疫疫苗的制備，可應(yīng)用于腫瘤治療以及預(yù)防其復(fù)發(fā)的藥品。
背景技術(shù)：
手術(shù)方法和化學(xué)療法對(duì)腫瘤治療的有限性，使得針對(duì)腫瘤患者的新治療方法的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)變得迫切。現(xiàn)在，人們特別關(guān)注抗血管生成療法，其原理M于抑制肺瘤血管的生長(zhǎng)。
腫瘤的發(fā)展有兩個(gè)主要階段血管前期和血管期。在第一個(gè)階段，腫瘤通過(guò)擴(kuò)散作用從病人血管中獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣而生長(zhǎng)，這使得腫瘤的生長(zhǎng)被限制在不足幾個(gè)立方毫米的空間之內(nèi)。接下來(lái)腫瘤的生長(zhǎng)需要過(guò)渡至第二個(gè)階段，這個(gè)階#爻為月中瘤血管化(tumor vascularisation) (Folkman J" "What is evidence thattumors are angiogenesis dependent " J. Natl. Cancer Inst" 1990, v.82, 4-6)。血管的出現(xiàn)極大地加強(qiáng)了肺瘤的營(yíng)養(yǎng)，這導(dǎo)致腫瘤的快速生長(zhǎng)，并增大了其轉(zhuǎn)移的可能性(Hanahan D., Folkman J. "Patterns and emerging mechanisms of theangiogenic switch during tumorigenesis". Cell, 1996， v. 86, 353-364 )?？寡苌晌镔|(zhì)的應(yīng)用可預(yù)防肺瘤血管生長(zhǎng)以及相應(yīng)地抑制生長(zhǎng)的第二階萃爻。
預(yù)防腫瘤生長(zhǎng)， 一個(gè)眾所周知的方法是給患者接種疫苗以克服針對(duì)位于血管內(nèi)膜上內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的免疫耐受性。細(xì)胞和體液的細(xì)胞毒作用引起內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，這阻礙了肺瘤血管的形成，并進(jìn)而破壞了惡性細(xì)胞。已知有各種制備這種疫苗的抗原的方法；和本發(fā)明最接近的是基于適當(dāng)?shù)膬?nèi)皮細(xì)胞抗原的疫苗。
文獻(xiàn)資料表明獲得疫苗的方法是基于對(duì)異種內(nèi)皮細(xì)胞的利用，即使用另一生4勿物種的內(nèi)皮細(xì)月包(Wei Y" "Immunotherapy of tumors with xenogeneic
4endothelial cells as a vaccine", Nature Medicine, 2000, v. 6， 1160-1166)。這些疫苗的缺點(diǎn)是異種抗原的存在以及實(shí)際上壓載抗原(ballast antigens)的存在，這
從已知的基于異體抗原的疫苗來(lái)源來(lái)看，這種疫苗是由同一物種的其他生物細(xì)胞產(chǎn)生的(如Scappaticci F.A., Nolan G.P" "Induction of anti-tumor immunityin mice using a syngeneic endothelial cell vaccine" Anticancer Res., 2003, v. 23，1165-1672，文章作者比較了內(nèi)皮細(xì)胞疫苗的不同變種)。疫苗中異體抗原的出現(xiàn)，也會(huì)降低對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原免疫反應(yīng)的強(qiáng)度及特異性。
最接近的類似物在Okaji Y等的論文中有描述("Vaccination with autologousendothelium inhibits angiogenesis and metastasis of colon cancer throughautoimmunity", Cancer Sci.， 2004, v. 95, 1， 85-90)。后一種方法應(yīng)用了內(nèi)皮細(xì)月包。上述方法使用了自身內(nèi)皮細(xì)胞，即從免疫后的機(jī)體中分離的細(xì)胞或來(lái)源于遺傳基因相同的機(jī)體的細(xì)胞(例如同系老鼠的細(xì)胞)。這樣的疫苗可產(chǎn)生強(qiáng)度最高和特異性最佳的免疫反應(yīng)，這決定了其治療效果。但是，所有的來(lái)源于整體的細(xì)胞的疫苗都包含有大量的壓載物質(zhì)(ballastmaterial),即胞漿蛋白、碳水化合物和脂類。壓載物(Ballast substances)可明顯減少疫苗中抗原的量，而這些抗原才是免疫系統(tǒng)的潛在的作用目標(biāo)(胞內(nèi)抗原不能影響免疫系統(tǒng))。應(yīng)該注意到， 一種已知的制備疫苗的方法不會(huì)引起對(duì)腫瘤血管中內(nèi)皮細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的目的是提供一種制備基于內(nèi)皮細(xì)胞抗原的腫瘤疫苗的方法，以克服機(jī)體對(duì)肺瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫耐受性。本發(fā)明的基礎(chǔ)在于正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺瘤內(nèi)皮細(xì)胞之間公知的區(qū)別。其中，正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生理?xiàng)l件下處于的靜息狀態(tài)；而腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞是處于激活，即指處于活躍地增殖和轉(zhuǎn)移的狀態(tài)。已知與正常組織血管中的內(nèi)皮細(xì)胞相比，激活的內(nèi)皮細(xì)胞中許多特異性蛋白的表達(dá)增多，如avP3(Gladson C丄.et al.， Am. J. Pathol., 1996， v. 148,1423-1434), E-選擇素(E畫(huà)selectin) (Volm M. et al., Clin. Cancer Res" 2000， v. 6,3236-3240)，內(nèi)皮糖蛋白(endoglin) (Burrows F. et al., Clin. Cancer Res" 1995， v.1, 1623-1634),內(nèi)皮p垂液酸蛋白(endosyalin) (Takahashi K. et al., J. Clin. Invest"1994， v. 93, 2357-64)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGF-receptor) (Boocock C.et al., J. Natl. Cancer Inst., 1995, v. 87, 506-516)。 一些蛋白表達(dá)譜的差異可以從專利 US2006210975 , US2005142138 , US2006127902和國(guó)際申諱-WO2004091383中得知。本發(fā)明的重點(diǎn)是內(nèi)皮細(xì)胞表面的差異，特別是嗜中性細(xì)月包素(neutrophillins )、整合素(integrins)、受體(receptors)等，這些4吏4尋抗原對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)WO2004001004)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所達(dá)到的技術(shù)效果在于通過(guò)克服了機(jī)體對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫耐受性，而破壞胂瘤血管，從而提高了對(duì)腫瘤疾病的治療效果。也就是說(shuō)克服免疫耐受性就是針對(duì)激活內(nèi)皮細(xì)胞的，這使得損害特異性地針對(duì)腫瘤血管。
上述技術(shù)效果，可通過(guò)本發(fā)明所提供的利用內(nèi)皮細(xì)胞制備腫瘤疫苗的方法而實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，用蛋白酶對(duì)活的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行不使細(xì)胞死亡的處理；收集釋放的抗原；經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后對(duì)所述活的細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)處理，該段間隔的時(shí)間足以使得細(xì)胞表面抗原恢復(fù)；積聚表面抗原直至達(dá)到滿足疫苗接種的劑量；控制制備的疫苗質(zhì)量。
激活的所述內(nèi)皮細(xì)胞可以為從腫瘤血管中新分離的內(nèi)皮細(xì)胞。
如果從肺瘤血管分離的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量不夠，本發(fā)明所提供方法也可以包括通過(guò)培養(yǎng)來(lái)增殖所述內(nèi)皮細(xì)胞的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
所述激活的內(nèi)皮細(xì)胞可從腫瘤血管中分離，并在能保持其激活狀態(tài)的條件下培養(yǎng)。
所述內(nèi)皮細(xì)胞的激活可通過(guò)與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)維持。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述內(nèi)皮細(xì)胞的激活狀態(tài)可以通過(guò)與腫瘤組織片段進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)維持。
根據(jù)本發(fā)明的另 一實(shí)施例，激活的所述內(nèi)皮細(xì)胞取自病人自身腫瘤血管。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施例，激活的所述內(nèi)皮細(xì)胞可取自不同患者的腫瘤血
6所述內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)也可通過(guò)體外與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)而激活。 所述內(nèi)皮細(xì)胞可由患者自身的腫瘤細(xì)胞激活。
根據(jù)本發(fā)明的另 一實(shí)施例，所述內(nèi)皮細(xì)胞可被其他患者的腫瘤細(xì)胞激活。 內(nèi)皮細(xì)胞可由適當(dāng)?shù)姆瘟黾?xì)胞系激活。
根據(jù)本發(fā)明的另 一實(shí)施例，所述內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)可通過(guò)體外加入激活因子 來(lái)激活。在這種情況下，所述內(nèi)皮細(xì)胞可由至少一種激活因子激活。特別是4皮
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)激活。
根據(jù)本發(fā)明的另 一實(shí)施例，所述內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)體外加入來(lái)自腫瘤細(xì)胞培 養(yǎng)的條件培養(yǎng)液而激活。
免疫應(yīng)答可以通過(guò)在表面抗原中加入佐劑而實(shí)現(xiàn)。


以下通過(guò)具體實(shí)施方式
和附圖來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。

如下 圖1為本發(fā)明疫苗制備的大體流程圖2為第一和第二實(shí)^^組以及對(duì)照組中，BALB/c小鼠中肝癌細(xì)胞H22的 生長(zhǎng)曲線圖(腫瘤直徑用士標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)；
圖3為第一組(A)、第二組(B)和對(duì)照組(C)的小鼠腫瘤組織的組織 切片，以及相應(yīng)的血管生成指數(shù)(AI);腫瘤血管壁呈深色(與彩色照片中的 棕色相對(duì)應(yīng))。
具體實(shí)施例方式
圖l所示為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
?；畹膬?nèi)皮細(xì)胞分離自通過(guò)活檢或手術(shù) 取得的肺瘤組織。將活的內(nèi)皮細(xì)胞用于原代培養(yǎng)激活的內(nèi)皮細(xì)胞。需要時(shí)對(duì)細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)以達(dá)到足夠數(shù)量。
本發(fā)明所述方法，不僅可以通過(guò)使用初始就處于激活狀態(tài)的腫瘤血管內(nèi)皮 細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可通過(guò)使用處于靜息狀態(tài)的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞，還可以通過(guò)使 用采用各種方式激活的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。
7本發(fā)明中，接下來(lái)至關(guān)重要的一步，是在溫和(不使細(xì)胞死亡)的條件下 用蛋白酶處理活的細(xì)胞。
為了得到滿足疫苗接種劑量的抗原，將胰蛋白酶處理細(xì)胞的程序重復(fù)若干 次，其間間隔幾小時(shí)到幾天，此段時(shí)間對(duì)表面抗原的修復(fù)是必須的。疫苗積聚 是通過(guò)特定疫苗制備的特定工藝進(jìn)行的，即，這些抗原可以根據(jù)其組成進(jìn)行純 化、濃縮、分析，也可進(jìn)行修飾或與佐劑混合以增強(qiáng)免疫原性。
根據(jù)本發(fā)明所述的制備抗原疫苗的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn) -具有自體疫苗的所有優(yōu)點(diǎn)，即其相對(duì)于特定患者具有特異性； -具有多價(jià)疫苗的所有優(yōu)點(diǎn)，即抗原多樣性；
-在免疫接種后，內(nèi)皮細(xì)胞(最好使用激活的內(nèi)皮細(xì)胞)表面抗原疫苗的 富集，可以克服免疫接種帶來(lái)的對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫耐受性；
-本方法可通過(guò)積聚抗原而得到滿足疫苗接種劑量的抗原，而不是通過(guò)內(nèi) 皮細(xì)胞的增殖。這是非常重要的，因?yàn)樵隗w外增殖期間原代細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)逐漸改 變其抗原結(jié)構(gòu)，使其無(wú)法用于疫苗接種。
根據(jù)本發(fā)明得到的表面抗原，其實(shí)際應(yīng)用取決于表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面 (包括腫瘤)的蛋白質(zhì)片段的特征，也就是說(shuō)氨基S^列及其修飾(如糖基化) 的特征。根據(jù)本發(fā)明所得到的激活的內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原，其應(yīng)用是由表達(dá)于內(nèi) 皮細(xì)胞表面，即腫瘤血管呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)片段的特征所決定的。
眾所周知，腫瘤的生長(zhǎng)離不開(kāi)肺瘤血管化。積聚和純化的內(nèi)皮細(xì)胞表面抗 原(優(yōu)選激活的)與能增強(qiáng)免疫反應(yīng)的佐劑相混合一并注入人體或動(dòng)物體內(nèi)。 由于細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的作用，使得注入體內(nèi)的抗原失活，因而肺瘤血管中 已有的或新出現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)被交叉破壞，這決定了免疫接種的治療和預(yù)防效 果。為了發(fā)揮免疫反應(yīng)的最大作用，可重復(fù)注射表面抗原。
以下為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述方法的實(shí)施例一，采用人肝癌細(xì)胞H22接種于小 鼠，基于自體激活的內(nèi)皮細(xì)胞制備腫瘤疫苗。
依據(jù)Belloni等的方法，從BALB/c小鼠肝臟血管中獲得自體內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn) 行培養(yǎng)。(Microvasc. Res., 1992, vol. 43， 20-45)在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中以1 : 3的 比例加入來(lái)自H22細(xì)胞的條件培養(yǎng)基來(lái)激活內(nèi)皮細(xì)胞。在激活的第5-7天后，根據(jù)以下方案，利用內(nèi)皮細(xì)胞制備表面抗原。
1. 從裝有培養(yǎng)激活的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞瓶中移除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用無(wú)菌生理 溶液(體積為生長(zhǎng)培養(yǎng)基體積的一半)沖洗單層細(xì)胞不少于三次。沖洗的目的 是去除殘留的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
接下來(lái)至關(guān)重要的一步是用上述細(xì)胞所必需濃度的蛋白酶處理細(xì)胞，其
中，蛋白酶選擇胰蛋白酶(活性~ 3000U/mg )。
2. 將0.0001%的胰蛋白酶溶液加入到單層細(xì)胞中，加入量為每25cm2細(xì)胞 并瓦的表面lml溶液。
3.37。C下孵育細(xì)胞瓶，在孵育到5-7分鐘時(shí)，移出含有已分離的表面抗原 的胰蛋白酶溶液。
4. 加入新制備的含有血清(通常10%)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，再接著進(jìn)行培養(yǎng)。
5. 為了使積聚的表面抗原達(dá)到疫苗接種的劑量，經(jīng)過(guò)24小時(shí)，重復(fù)步驟 1-4,通過(guò)檢查培養(yǎng)激活的內(nèi)皮細(xì)胞的適配性，來(lái)控制疫苗質(zhì)量，以得到腫瘤 血管特異性抗原。
用胰蛋白酶處理細(xì)胞的條件可以極不相同，例如處理時(shí)間可以從幾分鐘到 數(shù)十分鐘，胰蛋白酶的濃度可以從0.00001%到0.5%，這些條件分別針對(duì)各內(nèi) 皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。如果胰蛋白酶的活性不同于說(shuō)明書(shū)中提供的活性，可以根 據(jù)其活性來(lái)推算其正確的濃度比例。
在用胰蛋白酶處理以前，應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速?zèng)_洗，例如用生理溶液，以去 除殘留的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。經(jīng)胰蛋白酶處理后，釋放出的抗原為表面蛋白片段，可 以用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ占@些蛋白片段，如用移液器傾析。
在細(xì)胞培養(yǎng)期間，與任何培養(yǎng)細(xì)胞一樣，內(nèi)皮細(xì)胞的抗原組成會(huì)發(fā)生變化， 這會(huì)使得細(xì)胞培養(yǎng)的抗原與患者腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原之間產(chǎn)生差異。 為了避免制備出不適合的疫苗，抗原積聚中內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的適當(dāng)性，按照歐亞 專利No.009326"測(cè)試細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量的方法"所述進(jìn)行評(píng)定。
眾所周知，用不會(huì)使細(xì)胞死亡的一定濃度的蛋白酶處理細(xì)胞，會(huì)引起細(xì)胞 表面抗原的分離(見(jiàn)歐亞專利No.009325"腫瘤疫苗、制備腫瘤疫苗的方法以
9及抗腫瘤免疫治療法")。因此根據(jù)本發(fā)明，胰蛋白酶以及其他蛋白酶使得內(nèi)皮 細(xì)胞表面抗原釋放到溶液中。在胰蛋白酶的作用下釋》文的內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原 (表面蛋白片段)，大部分適用于免疫接種，用于腫瘤患者的免疫接種。
注意，最好在細(xì)胞脫離細(xì)胞瓶表面之前收集含有細(xì)胞表面蛋白分離出的抗 原的胰蛋白酶溶液，這樣會(huì)避免細(xì)胞出現(xiàn)在抗原溶液中，從而避免了不必要的 純化步驟。
必需的蛋白酶在合適的濃度下處理細(xì)胞后不會(huì)使其死亡，由此可用胰蛋白 酶重復(fù)處理原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，從而積聚得到疫苗接種所需劑量的抗原。
在用胰蛋白酶處理細(xì)胞的間隔期間，根據(jù)方案培養(yǎng)細(xì)胞(如在37。C的C02 培養(yǎng)箱中，用含有血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，以保持添加物的激活狀態(tài))。
根據(jù)疫苗的制備技術(shù)處理積聚的表面抗原，即可經(jīng)過(guò)純化、濃縮、組成分 析，也可經(jīng)修飾或者與佐劑混合以增強(qiáng)免疫原性。
在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，用胰蛋白酶處理細(xì)胞的步驟可與細(xì)胞的接種步 驟(用胰蛋白酶處理細(xì)胞，細(xì)胞釆集和分離)相結(jié)合。
胰蛋白酶溶液可用無(wú)菌生理溶液制備，也可用任何適當(dāng)?shù)柠}溶液或緩沖液 制備。
在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，可采用其他蛋白酶來(lái)代替胰蛋白酶，如胰凝乳 蛋白酶(chemotrypsin)、蛋白酶K等。
本發(fā)明所述制備腫瘤疫苗的方法可用于各種類型的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是 基于基質(zhì)(matrix)或基于底物(substrate)培養(yǎng)；也可用于不同組合的共培 養(yǎng)以及新分離的內(nèi)皮細(xì)胞。
下面進(jìn)一 步地在實(shí)施例二中描述采用人結(jié)腸癌血管中分離出的激活的內(nèi) 皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，來(lái)制備肺瘤疫苗的方法。
1、 在外科切除肺瘤手術(shù)期間取一塊結(jié)腸肺瘤組織，將其放入內(nèi)有含抗生 素的RPMI 1640培養(yǎng)基的無(wú)菌管中，送至實(shí)-驗(yàn)室。
2、 在無(wú)菌條件下將肺瘤組織轉(zhuǎn)移至有蓋培養(yǎng)皿(Petri dish)中，用器械 去除壞死部分、血塊、殘留脂肪以及結(jié)締組織。3、 將腫瘤組織用剪刀剪成小片。
4、 將腫瘤組織的碎片在37。C下置于0.2。/。的膠原酶溶液中，所用溶液體積 足以覆蓋腫瘤片段。
5、 移去膠原酶溶液，用PBS溶液輕輕沖洗肺瘤組織碎片。
6、 加入3ml的RPMI 1640培養(yǎng)基，用移液管強(qiáng)力吹打，使得肺瘤組織碎 片分解成小的細(xì)胞團(tuán)塊。
7、 較大的團(tuán)塊沉于底部，余下的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中，并在室 溫下以170g離心。
8 、用RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮。
9、 在室溫條件下，lml的細(xì)胞懸浮液在Percoll梯度下以670g離心20分鐘。
10、 收集Percoll梯度密度在1.033-1.047范圍內(nèi)(與內(nèi)皮細(xì)胞相符)的細(xì) 胞碎片，加入10ml的RPMI 1640,重新懸浮混合物，然后以170g離心5分鐘
后收集細(xì)胞。
11、 將內(nèi)皮細(xì)胞重新懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(RPMI 1640,肝磷脂，內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子，腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液，10%的胎牛血清)中，并在培養(yǎng)細(xì)胞并瓦中培養(yǎng)。
12、 從瓶中移除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基一半體積的生理溶液或者PBS溶 液沖洗細(xì)胞三次。沖洗后應(yīng)將來(lái)自生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的血清清除。
13、 將0.0001%的胰蛋白酶溶液(酶活性~ 3000U/mg )加入到細(xì)胞中， 加入量為每25cm2細(xì)胞瓶的面積lml溶液。
14、 37。C孵育細(xì)胞瓶。在孵育到5至7分鐘時(shí)，收集含有所釋放的表面抗 原的溶液。從細(xì)胞瓶中移除溶液期間，內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)緊貼瓶底。如果一部分細(xì)胞 由于胰蛋白酶的作用脫離了細(xì)胞瓶壁而漂浮于液體中，則需對(duì)溶液以400g離 心5分鐘，取無(wú)細(xì)胞的上清備用。
15、 為滅活具有內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞瓶中剩余的胰蛋白酶的活性，應(yīng)加入 新的含有小牛血清的培養(yǎng)基，并繼續(xù)在37。C以及5% C02的條件下孵育。
16、 由步驟14獲得的溶液在45。C條件下進(jìn)行利用真空濃縮機(jī)進(jìn)行濃縮。 濃縮前應(yīng)用適當(dāng)方法對(duì)溶液脫鹽，如反相色譜法、凝膠過(guò)濾法等。
ii17、為了得到所需數(shù)量的抗原，經(jīng)過(guò)幾小時(shí)到幾天的時(shí)間間隔，重復(fù)步驟 12-16。在這期間，制備疫苗的質(zhì)量通過(guò)評(píng)定內(nèi)皮細(xì)胞與患者肺瘤血管抗原特 異性的適配性來(lái)控制。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述內(nèi)皮細(xì)胞，與同該內(nèi)皮細(xì)胞分離出的相同 腫瘤來(lái)源的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述內(nèi)皮細(xì)胞，與其他患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞 共培養(yǎng)，或者與特定的肺瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述內(nèi)皮細(xì)胞，與用以分離該內(nèi)皮細(xì)胞的肺 瘤片段共培養(yǎng)，或與其他病人的腫瘤片段共培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述激活的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)自其他病人(同種異 體內(nèi)皮細(xì)胞)。
根據(jù)本發(fā)明得到的培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原， 一定對(duì)供體肺瘤內(nèi)皮細(xì)胞有特 異性。但是細(xì)胞培養(yǎng)改變了細(xì)胞表型，這是因?yàn)轶w外不可能創(chuàng)造與腫瘤細(xì)胞在 患者身體內(nèi)相同的生長(zhǎng)條件。因此，應(yīng)以強(qiáng)制手段控制用以疫苗接種的積聚抗 原的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的適配性，并根據(jù)上述歐洲專利"檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量的方法" 中所述方法進(jìn)行。
為了確定根據(jù)本發(fā)明而得疫苗的抗肺瘤活性，利用小鼠進(jìn)行模型試驗(yàn)，選 擇三組年齡和體重相同的BALB/c小鼠(每組6只雄性)。
根據(jù)實(shí)施例一，采用自體的激活和非激活的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，得到抗原。將 分離的抗原用葡聚糖凝膠(Sephadex) G-10進(jìn)行凝膠過(guò)濾脫鹽，繼而用真空 濃縮器濃縮。
給小鼠皮下注射1百萬(wàn)肝癌細(xì)胞H22。注射后第七天，預(yù)先將抗原與完全 弗氏佐劑以1 : 1 (體積比)的比例混合，取150嗎給小鼠以皮下注射的方式 進(jìn)行疫苗接種。隨后每周一次用完全弗氏佐劑進(jìn)行免疫接種，持續(xù)4周。第一 實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物用本發(fā)明實(shí)施例一制備的疫苗進(jìn)行接種，也就是用自體的激活的 內(nèi)皮細(xì)胞。第二實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物用本發(fā)明實(shí)施例一制備的疫苗接種，但是所用為 自體的非激活內(nèi)皮細(xì)胞。對(duì)照組注射相同量的混合有完全弗氏佐劑的PBS。
在接種胂瘤后三個(gè)月，分別觀察對(duì)照組和試驗(yàn)組的生長(zhǎng)狀況。測(cè)量結(jié)果(見(jiàn)圖2)顯示，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤縮小并消失，這證明含有內(nèi)皮細(xì)胞表面抗
原的疫苗有顯著的抗腫瘤效果，基于激活的內(nèi)皮細(xì)胞的表面抗原加工而成的疫 苗顯示出更明顯的效果。
為了證實(shí)疫苗的抗血管機(jī)制，通過(guò)對(duì)死亡的腫瘤血管壁的組織切片和免疫
酶法，來(lái)檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組的腫瘤血管生成指數(shù)(每1000個(gè)胂瘤細(xì)胞的血 管數(shù)量)。
在接種后的第30天，分離新鮮腫瘤組織碎片，用含10%曱醛的PBS (pH7.0-7.2)溶液固定，用石蠟包埋。制備成4pm厚的切片用于免疫組化^見(jiàn) 察。為顯示血管，切片用標(biāo)準(zhǔn)的抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶試劑，用鼠 抗人CD31抗體染色。用乙醇去除石蠟。使用3%的過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧 化物酶的活性。用含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS來(lái)阻止抗體的非特異性 結(jié)合。隨后將切片與CD31的一抗、生物素標(biāo)記的小鼠IgG抗體和抗生物素蛋 白鏈霉素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物共同孵育。切片用新制備的二氨基聯(lián)苯胺 染色，用蘇木素復(fù)染(poststain)。每步之后，用PBS沖洗切片。根據(jù)上述方 法對(duì)陰性對(duì)照組切片染色時(shí)，其中 一抗用小鼠IgG替代。
圖3示出了第一試^r組(A)、第二試-險(xiǎn)組(B)和對(duì)照組(C)中的腫瘤 組織切片，這些試驗(yàn)組相對(duì)應(yīng)的血管生成指數(shù)(AI)分別為16、 32和80。這 一事實(shí)證實(shí)，用內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原進(jìn)行疫苗接種，具有抑制血管化作用的效果， 需要注意的是激活的內(nèi)皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制效果。
需要強(qiáng)調(diào)的是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不受到所使用的動(dòng)物的限制，由于免疫反 應(yīng)的機(jī)理在人和動(dòng)物都是相同的。
抗原的使用方法和其每公斤體重的使用劑量，保證了其在人類免疫療法中 的作用，但是針對(duì)每一個(gè)病人，免疫治療方案(劑量，重復(fù)注射的次數(shù)和佐劑 的使用)可以根據(jù)每個(gè)特殊病人進(jìn)行個(gè)性化，綜合考慮疾病的發(fā)展、腫瘤疾病 的階段、腫瘤的血管化程度、機(jī)體對(duì)伴行于化學(xué)療法的明顯的抗原免疫反應(yīng)的 能力等。
以下說(shuō)明如何得到基于內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原的腫瘤疫苗，該疫苗是根據(jù)本發(fā) 明的實(shí)施例二而制備的，用于人的抗腫瘤疫苗接種。
13疫苗包含lmg抗原混合物(根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例二而制備)溶于0.5ml的 PBS中，并與1ml的佐劑山小星蒜堿(Montanide) ISA-51 ( Syntex廠基于水 油乳濁液和角豊烯、PlunoricL121、吐溫-80而制成的佐劑)相混合。
給患者皮下注射一個(gè)劑量的疫苗，每周一次，持續(xù)三周以及每月一次，持 續(xù)五個(gè)月。
免疫接種的效果通過(guò)對(duì)注射的表面抗原的免疫的強(qiáng)度來(lái)評(píng)估。在注射2-3 天后，針對(duì)注射抗原的過(guò)敏性反應(yīng)通過(guò)注射局部紅斑的尺寸來(lái)衡量。以首次注 射后局部出現(xiàn)的紅斑尺寸作為基數(shù)。經(jīng)過(guò)重復(fù)疫苗接種，過(guò)敏反應(yīng)明顯強(qiáng)化， 證明免疫反應(yīng)的發(fā)展。
可以采用靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射疫苗，也可注射不含佐劑的疫苗。
使用根據(jù)本發(fā)明提供的方法制備的疫苗后，免疫反應(yīng)的發(fā)生是由于疫苗中 含有內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。疫苗中存在的許多抗原，即表面蛋白片段，可對(duì)所有 的、表面蛋白上有與之相同的氨基Sl/f列的細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，用患者自身的激活的內(nèi)皮細(xì)胞和用其他患者的內(nèi)皮細(xì)胞制備 的腫瘤疫苗，均可具有效果。
上述兩種情況都可達(dá)到治療效果，這是因?yàn)閬?lái)自不同患者的腫瘤血管的內(nèi) 皮細(xì)胞表面上，具有相同的氨基酸序列。而且，使用根據(jù)所述方法制備的自體 疫苗時(shí)，效果更為明顯，這是因?yàn)橐呙绾械目乖瓕?duì)特定患者的肺瘤血管內(nèi)皮 細(xì)胞具特定性。
使用來(lái)自正常組織的靜息的和通過(guò)各種方法激活的內(nèi)皮細(xì)胞，均可達(dá)到治 療效果。這是由于所有內(nèi)皮細(xì)胞均具有的相同的表面抗原，也是由于通過(guò)各種 方法激活的內(nèi)皮細(xì)胞的抗體組分變化具有部分相同的特性。
應(yīng)當(dāng)注意，根據(jù)本發(fā)明所述方法制得的疫苗，使用時(shí)與單價(jià)疫苗相比，治 療效果可提高許多倍。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法制備的疫苗，在使用中可以克服機(jī)體對(duì)腫瘤血管內(nèi) 皮細(xì)胞的免疫耐受性，這是由于疫苗富含對(duì)肺瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性的抗 原。
這種情況是因?yàn)橛玫鞍酌笇?duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，蛋白酶處理細(xì)胞的這些細(xì)胞蛋白酶濃度是活性的(非致死的)?；钚缘牡鞍酌笣舛鹊氖褂?，能僅使內(nèi)皮細(xì)胞 表面抗原分離，而不會(huì)使細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡會(huì)伴隨質(zhì)膜損壞，從而導(dǎo)致疫苗 被細(xì)胞質(zhì)成分污染，特別是被大量胞內(nèi)蛋白污染，這些蛋白對(duì)疫苗接種來(lái)說(shuō)是 無(wú)益的。這會(huì)減少已知的疫苗中的特異性肺瘤血管抗原的量，引發(fā)非靶向性免 疫反應(yīng)，從而降低表面抗原的特異性。
由于使用富含表面抗原的疫苗，本發(fā)明所提供的疫苗可提高抗腫瘤治療的 效果。
此外，免疫療法效果的提高，也可通過(guò)積聚^目同內(nèi)皮細(xì)胞活的抗原制備 而成的表面抗原來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種制備腫瘤疫苗的方法，可以通過(guò)每次使用蛋白酶 處理，獲得實(shí)際上成分不變的抗原，并且積聚抗原使得其量滿足免疫接種所需。 可以通過(guò)控制疫苗質(zhì)量，來(lái)保證僅對(duì)特定腫瘤血管有特異性的抗原混合入疫苗。
因此，本發(fā)明提供了獲得內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原的方法，利用此抗原可以對(duì)腫 瘤疾病進(jìn)行免疫接種治療。
1權(quán)利要求
1、一種腫瘤疫苗的制備方法，包括用蛋白酶在不使細(xì)胞死亡的溫和條件下處理活的內(nèi)皮細(xì)胞；收集釋放的細(xì)胞表面抗原；用蛋白酶重復(fù)處理所述活的內(nèi)皮細(xì)胞，間隔的時(shí)間足以使得表面抗原被所述內(nèi)皮細(xì)胞恢復(fù)；積聚釋放的抗原，直至達(dá)到所需的抗原數(shù)量；控制疫苗質(zhì)量。
2、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞為激活的內(nèi)皮細(xì)胞。
3、 如權(quán)利要1或2所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞為從腫瘤組織血管中新分離出來(lái)的內(nèi)皮細(xì)胞。
4、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)使其增殖。
5、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
6、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，激活的所述內(nèi)皮細(xì)胞是從腫瘤血管中分離的，并在保持所述內(nèi)皮細(xì)胞激活狀態(tài)的條件下培養(yǎng)。
7、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 6中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，培養(yǎng)過(guò)程中所述內(nèi)皮細(xì)胞的激活狀態(tài)是通過(guò)與肺瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)而維持的。
8、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 6中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，培養(yǎng)過(guò)程中所述內(nèi)皮細(xì)胞的激活狀態(tài)是通過(guò)與腫瘤組織片段共同培養(yǎng)而維持的。
9、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，激活的所述內(nèi)皮細(xì)胞為取自病人自身腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞。
10、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，激活的所述內(nèi)皮細(xì)胞為取自其他病人肺瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞。
11、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)是通過(guò)體外與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)而激活的。
12、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 11中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞是被患者自身的腫瘤細(xì)胞激活的。
13、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 11中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞是^L其他患者的腫瘤細(xì)胞激活的。
14、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 11中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞是被肺瘤細(xì)胞系激活的。
15、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)是通過(guò)體外在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入激活物質(zhì)而激活的。
16、 如斥又利要求l、 2、 4、 15中^f壬意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞被至少 一種激活因子激活。
17、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 16中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞是一皮血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子激活的。
18、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)是通過(guò)體外加入來(lái)自腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)液而激活的。
19、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述表面抗原中加入佐劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用內(nèi)皮細(xì)胞制備腫瘤疫苗的方法，該方法包括在不使細(xì)胞死亡的溫和條件下，用蛋白酶處理活的內(nèi)皮細(xì)胞；收集分離出的表面抗原；再次用蛋白酶重復(fù)處理活的內(nèi)皮細(xì)胞，間隔的時(shí)間長(zhǎng)度足以使得內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原恢復(fù)；收集釋放出的抗原，直至達(dá)到所需數(shù)量；控制疫苗質(zhì)量。本發(fā)明的技術(shù)效果在于，由于克服了對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)體免疫耐受性，從而破壞了腫瘤血管，提高了腫瘤疾病的治療效果。也就是說(shuō)克服免疫耐受性就是針對(duì)激活的內(nèi)皮細(xì)胞，從而使得免疫系統(tǒng)的破壞作用主要針對(duì)腫瘤血管。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101663042SQ200780052639
公開(kāi)日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日
發(fā)明者彼得·詹里耶維奇·盧克霍夫 申請(qǐng)人:彼得·詹里耶維奇·盧克霍夫