專利名稱：抗腫瘤疫苗、其制備方法以及抗腫瘤免疫療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該組發(fā)明涉及醫(yī)療技術(shù)，尤其涉及腫瘤患者的免疫治療，本發(fā)明也可應(yīng)用 于肺瘤疾病的治療和預(yù)防該病復(fù)發(fā)的藥物中。
背景技術(shù)：
對(duì)于肺瘤疾病的治療，由于手術(shù)、化學(xué)療法和》支射線療法在實(shí)施中受到限 制，迫切需要治療腫瘤患者的新方法的開發(fā)。特別是，人們相信，由于免疫治 療的原則是增強(qiáng)人體自身的、防御性的抗腫瘤免疫能力，因而免疫療法的發(fā)展 前景良好。
免疫治療的有效方法之一是疫苗接種。疫苗接種的效果好壞，取決于由腫 瘤抗原引起的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，這些腫瘤抗原可存在于疫苗的組分中，也可存在 于疫苗制備的不同階段(例如，基于抗個(gè)體抗體，樹突狀細(xì)胞等而制備的疫苗)。 因此，肺瘤抗原的分離是開發(fā)抗胂瘤疫苗的必要先決條件。
現(xiàn)已知有^f艮多不同制備抗腫瘤疫苗的方法。
一些疫苗是利用腫瘤細(xì)胞(TC)的特異性抗原制備——即肽類、熱休克 蛋白、多糖和其他物質(zhì)。特別公知的方法是通過合成的方法制備腫瘤肽類抗原。 由9個(gè)氨基酸合成的肽類疫苗，在髓細(xì)胞性白血病患者的臨床試驗(yàn)中效果良好 (Williams R.， "Harnessing the Immune System: The Promise and Potential of Cancer Vaccines", Oncolog.， 2005, v. 50, W 4)。其4也的肽類治療效果不一。例如， gplOO蛋白組成的肽類在初期效果良好，但不能引起足夠的免疫應(yīng)答來對(duì)抗患 者的月中瘤發(fā)展(Yu Z., Restifo N.R， "Cancer Vaccines: Progress Reveals New Complexities", J. Clin. Invest., 2002, v. 110, 289-294 )。
使用肺瘤糖類物質(zhì)作為激活免疫反應(yīng)抗原的方法是眾所周知的。但是，類 似的抗原療效僅表現(xiàn)在對(duì)單一的腫瘤細(xì)胞時(shí)以及早期的轉(zhuǎn)移階段。(Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens", Scand. J. Immunol., 2005， v. 61,391-397)。
應(yīng)注意的是，基于確定抗原的疫苗具有其本質(zhì)缺點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞不僅具有多 種抗原，而且其突變率較高且在機(jī)體中具有不斷地細(xì)胞選擇作用機(jī)制，這導(dǎo)致 新抗原和經(jīng)過修飾的已有的腫瘤抗原的出現(xiàn)。由此使用自體疫苗(基于病人自 身腫瘤細(xì)胞的疫苗)的優(yōu)點(diǎn)更為突出，這些自體疫苗覆蓋引起免疫反應(yīng)的整個(gè) 抗原譜，包括個(gè)體的和疾病狀態(tài)下的特異性抗原，這些抗原具有特定的病人在 腫瘤發(fā)展過程中的所有特征。
使用外來體(exosome)制備腫瘤抗原的方法是公知的。外來體是直徑不 足幾納米的嚢泡，可由多種細(xì)胞分泌，包括腫瘤細(xì)胞(如，論文Wolfers J. et al., "Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming", Nat. Med., 2001, v. 7, 297-303 )、 T-'淋巴細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞 (Raposo G. et al., "B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles", J. Exp. Med" 1996, v. 183, 1161-1172 ),以及樹突狀細(xì)胞(Zitvogel L. et al., "Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes", Nature Med., 1998， v. 4, 594-600 )。
這種方法的缺點(diǎn)是具有表面蛋白的外來體濃縮水平低，而這些表面蛋白是 實(shí)質(zhì)上免疫治療中的抗原。眾所周知，外來體主要包含胞漿蛋白和內(nèi)涵體間隔 擔(dān)保(見論文Thery C. et al" "Exosomes: composition, biogenesis and flmction" Reviews Immunology, 2002, v. 2, 569-579 )。該方法的第二個(gè)公知缺點(diǎn)是，收集 外來體所需時(shí)間較長(zhǎng)，這使得生長(zhǎng)培養(yǎng)基中必須有腫瘤細(xì)胞，并且必須從生長(zhǎng)
培養(yǎng)基成分中純化抗原。
另一種公知的制備抗腫瘤疫苗的方法，是向機(jī)體引入編碼抗原的DNA, 而不是引入抗原本身?？乖f呈細(xì)胞吸取DNA,形成肺瘤抗原，并且主要與 組織相容性復(fù)合體(hystocompatibility complex)結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞表面，以激 活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。由此，采用基于病毒載體的疫苗，在動(dòng)物模型上得 到4交好的效果(見i侖文Yu Z., Restifo N.R, "Cancer Vaccines: Progress Reveals New Complexities", J. Clin. Invest, 2002, v. 110, 289-294 )。
這種方法的缺點(diǎn)是病毒載體自身會(huì)引發(fā)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，這會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi) 的抗腫瘤疫苗缺乏明顯的療效。
另一種制備抗腫瘤疫苗的公知方法是，事先用整個(gè)肺瘤細(xì)胞作為抗原，從病人自身的腫瘤細(xì)胞或者其他病人的腫瘤細(xì)胞制備自體疫苗或同種異體疫苗。 細(xì)胞預(yù)先用電離輻射滅活。這種疫苗的優(yōu)勢(shì)在于不需要鑒別和分離具體的抗 原。由此與作為佐劑的卡介苗疫苗混合后的細(xì)胞，可用于治療結(jié)腸直腸癌、黑
色素瘤以及腎癌(見Armstrong A.C., Eaton D.， Ewing J.C., "Cellular Immunotherapy for Cancer", Brit. Med. J" 2001, v. 3323， 1289-1293 )。
這種方法的缺點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞必須滅活，以及由于吞噬作用和抗原呈遞細(xì)胞 的作用而導(dǎo)致的位于整個(gè)腫瘤細(xì)胞表面的抗原的低適應(yīng)性。
美國(guó)專利US 6039941 (分類號(hào)C12N 15/09, A61K 31/00，公開于于2000 年3月21日)公開了利用基因工程的方法處理編碼具有免疫活性的表面蛋白的 基因，以從腫瘤細(xì)胞中制得高致免疫性抗腫瘤疫苗的方法。
這種方法的缺點(diǎn)是，第一，必須對(duì)腫瘤細(xì)胞滅活；第二，腫瘤細(xì)胞表面抗 原很難適合吞噬作用和抗原呈遞細(xì)胞的作用。
國(guó)際申請(qǐng)WO 02053176 (分類號(hào)A61K 39/00; C12N 5/06; A61K 39/00; C12N5/06,公開于2002年7月11日)公開了一種基于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物 制備抗腫瘤疫苗的方法。這些疫苗的優(yōu)勢(shì)在于，不需經(jīng)電離輻射滅活，以及不 同于完整的腫瘤細(xì)胞，裂解的的細(xì)胞抗原更適合吞噬作用和抗原呈遞細(xì)胞的作 用，由此產(chǎn)生更明顯的免疫反應(yīng)。
這種方法的缺點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的主要部分是細(xì)胞內(nèi)蛋白，并且由這 種蛋白引起的免疫應(yīng)答沒有抗腫瘤的活性，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)蛋白很難進(jìn) 入免疫體系。
最接近本專利的是美國(guó)專利5993829(分類號(hào)A61P 35/00, C07K 14/47，公 開于1999年11月30日)中描述的制備抗腫瘤疫苗的方法。美國(guó)專利US 6338853 (分類號(hào)A61P 35/00， C07K 14/47， 7>開于2002年1月15日)，美國(guó) 專利5030621(公開于1991年7月9日)以及美國(guó)專利US 5635188(公開與1997 年6月3日)中也描述了類似的方法，包括肺瘤細(xì)胞培養(yǎng)以及其表面抗原的分 離。
另一種公知方法是預(yù)先在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)肺瘤細(xì)胞，并從生長(zhǎng)培 養(yǎng)基中分離表面細(xì)胞抗原，在此培養(yǎng)程中腫瘤細(xì)胞消失。經(jīng)純化收集抗原可用 作抗胂瘤疫苗的抗原。這種疫苗的優(yōu)勢(shì)在于，細(xì)胞表面腫瘤抗原含量高，這種 胂瘤抗原(并非隱藏在細(xì)胞內(nèi))容易被免疫系統(tǒng)作用。這種方法的缺點(diǎn)是-由于不受外部影響、自發(fā)地反應(yīng)，以及缺少培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的抗原，因而抗原產(chǎn)量低；-所得物質(zhì)中目的產(chǎn)物(抗原)含量低，且雜質(zhì)多。這是由于抗原收集之前，腫瘤細(xì)胞要在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育若干小時(shí)(如美國(guó)專利6338853所述，在 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)三個(gè)小時(shí))，這意味著要在含有40多種物質(zhì)(氨基酸、鹽、 緩沖劑、維生素、葡萄糖等)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中收集抗原，同時(shí)培養(yǎng)基中還含有 代謝產(chǎn)物以及在培養(yǎng)進(jìn)程中由腫瘤細(xì)胞分泌的其他物質(zhì)；-要分析抗原混合物的成分，必須事先純化從生長(zhǎng)培養(yǎng)基和細(xì)胞代謝產(chǎn)物 中得到的產(chǎn)物。-要分離得到足以滿足疫苗接種所需劑量的抗原，必須延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 時(shí)間以使其增殖，這會(huì)導(dǎo)致抗原混合物組成發(fā)生改變并使疫苗功效降低；-根據(jù)該方法，要得到疫苗接種所需的抗原數(shù)量，必須通過腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)， 也就是說，利用該方法不可能從離體(無培養(yǎng))細(xì)胞中提取抗原；-鑒于腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)和表面腫瘤抗原必須經(jīng)過純化，上述疫苗價(jià) 格昂貴。其他公知的抗腫瘤疫苗，其基本組成是不同抗原的混合物或者抗原與不同 免疫刺激物質(zhì)的混合物。國(guó)際申請(qǐng)WO 2004012685 (分類號(hào)A61K 39/00,公開于2004年2月12 日)所公開的抗腫瘤疫苗是基于表面腫瘤抗原的，這些抗原在細(xì)胞培養(yǎng)過程中 會(huì)"消失"。這種疫苗的制備，可能加快在不同因素影響下，通過生長(zhǎng)培養(yǎng)基的 細(xì)胞分泌抗原的速度，在受到一定程度上提高疫苗效果的不同影響下，疫苗制 備中，加速了通過生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞分泌抗原的進(jìn)程。但是這種疫苗也具有 與其他通過無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞所得到的疫苗相同的固有缺點(diǎn)。這里描述的最相近的專利申請(qǐng)是基于表面腫瘤抗原的疫苗，由美國(guó)專利 US 5993829 (分類號(hào)A61P 35/00, C07K 14/47,公開于1999年11月30日) 所披露。美國(guó)專利US 6338853 (分類號(hào)A61P 35/00, C07K 14/47，公開于2002 年1月15日)，美國(guó)專利US 5030621 (公開于1991年7月9日),美國(guó)專利US 5635188 (公開于1997年6月3日)中對(duì)相似的疫苗也有描述。正如前面所提到 的，這個(gè)公開疫苗的缺點(diǎn)是其高昂的價(jià)格，這主要是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的培養(yǎng)期和 純化步驟。還有很多已知的不同的抗腫瘤治療方法。
公知的利用單價(jià)疫苗進(jìn)行抗胂瘤免疫治療，包括向機(jī)體中導(dǎo)入確定的腫瘤 抗原。例如，這種疫苗屬于基于合成肽、熱休克蛋白、多糖及其他物質(zhì)的疫苗。
這些方法特別7/Hf于專利WO 2005083074 (分類號(hào)A61K 31/7088; A61P 35/00; C07K 7/06,7>開于2005年9月9日)和俄羅斯專利RU 2271831 (A61K 39/385; A61K 39/39; A61K 51/00,公開于2006年3月20日)。
這些方法的缺點(diǎn)是引入的抗腫瘤免疫的特異性較差，這是因?yàn)槟承┛乖瓕?duì) 具體患者的腫瘤不具有特異性，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)這些抗原是各類腫瘤的共同抗原。
公知的抗肺瘤療法，包括向機(jī)體注射全部的滅活腫瘤細(xì)胞，和經(jīng)過強(qiáng)化免 疫原性的全部的肺瘤細(xì)胞(例如，US Patent 6039941，分類號(hào)C12N 15/09, A61K31/00, />開于2000年3月21日)。
這種免疫療法的缺點(diǎn)是誘導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)特異性低，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表面抗 原幾乎不適合吞噬作用和接下的抗原呈遞細(xì)胞的過程。此方法的也需要預(yù)先在 體外進(jìn)行細(xì)胞增殖，以獲得疫苗接種所必須劑量的抗原，這也會(huì)引起抗原組成 的改變以及免疫治療效果的降低。
國(guó)際申請(qǐng)WO 02053176 (分類號(hào)A61K 39/00; C12N 5/06; A61K 39/00; C12N 5/06，公開于2002年7月11日)公開了實(shí)施抗肺瘤免疫治療的方法， 包括將腫瘤細(xì)胞溶胞產(chǎn)物導(dǎo)入機(jī)體的步驟。
這種免疫接種方法的缺點(diǎn)誘導(dǎo)的抗肺瘤免疫特異性低。這種方法中，疫苗 中除了含有免疫應(yīng)答所需的表面腫瘤抗原外，還含有作為溶胞產(chǎn)物主要成分的 細(xì)胞內(nèi)蛋白。因此，針對(duì)大量壓載蛋白(ballastproteins)的免疫反應(yīng)由此產(chǎn)生， 使得免疫應(yīng)答的腫瘤特異性變"模糊"。該方法也需要預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞體外增殖， 以獲得疫苗接種所需的足夠的抗原劑量，這也會(huì)引起腫瘤細(xì)胞抗原組成的改 變，繼而降低抗肺瘤治療的效果。
基于特定腫瘤抗原的組合以及不同抗原與各種免疫興奮劑的組合的方法， 是公知的。
同本發(fā)明最相近的抗腫瘤治療的方法，為美國(guó)專利US 5993829 (分類號(hào) A61P 35/00, C07K 14/47,公開于1999年11月30曰)所披露的。相近的方法也 在專利US 6338853 (分類號(hào)A61P 35/00， C07K 14/47，公開于2002年1月15 日),US 5030621 (公開于1991年7月9日)，美國(guó)專利US 5635188 (公開于1997年6月3日)以及WO 2004012685(分類號(hào)A61K 39/00,公開與2004年2月12 日)中有所描述。該方法包括將從抗原混合物中得到的疫苗注入機(jī)體內(nèi)，這些
抗原是腫瘤細(xì)胞表面蛋白的片段，在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中的被細(xì)胞自然 地除去。
這種方法的缺點(diǎn)之一是所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的低特異性。該方法首先要長(zhǎng)時(shí) 間地培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，這引起其抗原組成的改變并降低疫苗效果。另一個(gè)缺點(diǎn)是 該方法成本相對(duì)較高，這是由于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，以及必須從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的 組分中分離純化抗原而導(dǎo)致。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所達(dá)到的技術(shù)效果為由于強(qiáng)化了抗肺瘤免疫應(yīng)答而提高了肺瘤疾 病的治療效果。
本發(fā)明的技術(shù)效果是通過使用基于表面腫瘤抗原的抗腫瘤疫苗而實(shí)現(xiàn)的。 根據(jù)本發(fā)明，疫苗包含表面腫瘤抗原的混合物，所述抗原是通過收集活的肺瘤 細(xì)胞表面蛋白的肽類而得到，所述肽類是通過向原代培養(yǎng)的活的肺瘤細(xì)胞周期 性加入不使細(xì)胞死亡的蛋白酶進(jìn)行處理而得到的。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，所述抗腫瘤疫苗中使用的蛋白酶可為胰蛋白酶。
前述技術(shù)效果，也可通過本發(fā)明所提供的制備抗肺瘤疫苗的方法而實(shí)現(xiàn)， 所述制備方法包括培養(yǎng)肺瘤細(xì)胞和分離表面肺瘤抗原。根據(jù)本發(fā)明，將預(yù)先從 生長(zhǎng)培養(yǎng)基上洗脫的活的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，用蛋白酶對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行不 使細(xì)胞死亡的處理，收集釋放的表面腫瘤抗原。接著，經(jīng)過一段時(shí)間，用蛋白 酶對(duì)原代培養(yǎng)的活的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)處理，該段時(shí)間的間隔足以使得表面肺 瘤抗原的活性被細(xì)胞恢復(fù)。積聚(富集，收集；accumulate)表面胂瘤抗原直 至達(dá)到滿足疫苗接種的劑量，控制得到的表面腫瘤抗原的組分。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
本發(fā)明的技術(shù)效果也可通過抗腫瘤免疫療法的實(shí)施而獲得，包括將疫苗注 射到患者體內(nèi)的步驟，該疫苗由表面腫瘤抗原的混合物制成，這些抗原為肽類， 該肽類來源于腫瘤細(xì)胞表面蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，使用表面腫瘤抗原，其抗原為收集的活的胂瘤細(xì)胞表面蛋白的肽類，是通過向原代培養(yǎng)的活的腫瘤細(xì)胞中周期性地加入不使細(xì)胞死亡的蛋 白酶進(jìn)行處理而得到的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所用蛋白酶為胰蛋白酶。
為了獲得更強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答，所述表面腫瘤抗原可以為患者自身的表 面肺瘤抗原。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述表面腫瘤抗原可以為其他患者的表面腫 瘤抗原。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可以加入佐劑作為疫苗組成之一。


以下通過具體實(shí)施方式
和附圖來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
圖1為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明制備抗肺瘤疫苗的大體工藝總流程圖； 圖2A為根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方式，從原代培養(yǎng)肺瘤細(xì)胞得到的表面抗 原的質(zhì)譜圖2B為源自同樣的培養(yǎng)細(xì)胞，在表面抗原完全修復(fù)和經(jīng)過蛋白酶重復(fù)處
理后，得到的表面抗原的質(zhì)譜圖2C為源自同樣的培養(yǎng)細(xì)胞，在經(jīng)過蛋白酶處理、部分修復(fù)后，所得到
的表面抗原的質(zhì)譜圖3為根據(jù)本發(fā)明所述方法獲得的表面抗原片段質(zhì)譜圖3A,圖3B為抗原的碳水化合物中的CID片段圖譜；
圖3C,圖3D為具有b/y離子的抗原肽段序列的CID片段圖譜；
圖4為接種肽混合物后的H22腫瘤細(xì)胞荷瘤小鼠的生命曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一是利用人肝癌細(xì)胞H22的荷瘤小鼠制備抗腫瘤疫苗的方法。利 用了培養(yǎng)的H22細(xì)胞來制備疫苗。
1.將生長(zhǎng)培養(yǎng)基從培養(yǎng)有H22細(xì)胞的細(xì)胞瓶中移出，用不少于生長(zhǎng)培養(yǎng) 基一半體積的無菌生理溶液沖洗單層細(xì)胞。沖洗至少三次，以徹底清除培養(yǎng)基
中的雜質(zhì)。
接下來至關(guān)重要的一步，是用不致細(xì)胞死亡的濃度的蛋白酶處理細(xì)胞，一般使用胰蛋白酶(酶活力~ 3000U/mg )。
2. 將0.0001 %的胰蛋白酶溶液加入到單層細(xì)胞中，每25 cn^的細(xì)胞瓶面積 力口入lml溶液。
3. 細(xì)胞瓶在37。C環(huán)境下進(jìn)行孵育，在孵育到第5至第7分鐘之間時(shí)，收 集含有從細(xì)胞表面裂解出的抗原的胰蛋白酶溶液。
4. 將新制備的含有血清(通常含10%)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，繼 續(xù)培養(yǎng)。
5. 為了得到所需數(shù)量的抗原，隔24小時(shí)重復(fù)步驟2-4。
6. 采用質(zhì)譜分析以評(píng)估抗原的有效性。
7. 將積聚的抗原用于制備疫苗。
質(zhì)譜分析的操作步驟如下。140ul的抗原溶液與140ul的乙醇和720ul的丁 醇混合，再加入15ul的CL4B瓊脂糖凝膠?；旌衔锓跤?5分鐘并緩慢攪拌。 孵育后，用相同的乙醇-丁醇溶液沖洗瓊脂糖凝膠2遍，并在50%乙醇溶液中 孵育30分鐘。收集乙醇溶液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置(rotor-evaporating device)中 晾干。所得到的干燥物質(zhì)復(fù)溶于10ul水中，并采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析。 將待分析的2ul溶液，以1:1的比例同含有50%的乙腈和0.5%的三氟乙酸的 2,5-二羥基苯曱酸的飽和溶液混合，至于質(zhì)譜儀靶上。在樣品板上制備好的樣 品液滴在空氣中干燥，多肽的質(zhì)譜分析在質(zhì)量范圍600-4000道爾頓(Da)進(jìn)行。
已知大多數(shù)的腫瘤抗原都位于細(xì)胞表面，這些抗原在疫苗開發(fā)上有一定益 處(如綜述 Bocchia M. et al., "Antitumor vaccination: where we stand", Hematologica, 2000, v. 85, 1172-1206 )。用在不致細(xì)胞死亡條件下用胰蛋白酶處 理原代培養(yǎng)的細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致蛋白片段從細(xì)胞表面裂解(見Lokhov P.G., Archakov A丄,"Proteomic footprinting: a method for cells profiling by direct mass spectrometry", HUPO theses, 5-th Annual World Congress, 2006， abstract No 1201)。因此，根據(jù)本發(fā)明，胰蛋白酶以及其他蛋白酶的作用會(huì)使肺瘤表面蛋 白片段釋放到溶液中。在胰蛋白酶作用下釋放的表面肺瘤抗原(表面蛋白片段) 主要為可用于免疫治療的抗原，可用于腫瘤患者的免疫接種。
有必要指出，應(yīng)在細(xì)胞脫離細(xì)胞瓶壁之前收集含有細(xì)胞上分離出的肽類的 胰蛋白酶溶液，這樣會(huì)避免細(xì)胞轉(zhuǎn)移到樣品中，不必進(jìn)行額外的純化步驟。實(shí)驗(yàn)上根據(jù)每種腫瘤細(xì)胞以及所用蛋白酶的活性程度而確定用蛋白酶處
理細(xì)胞的條件，這些條件可以極不相同，蛋白酶濃度可以從0.0001%到0.05%， 處理時(shí)間可以從30秒到IO分鐘。使用不同活性的胰蛋白酶時(shí)，其濃度可以適 當(dāng)調(diào)整以提高或者降低酶活性。
細(xì)胞經(jīng)過非致死濃度的蛋白酶處理后不會(huì)死亡，由此可以用胰蛋白酶重復(fù) 處理原代培養(yǎng)的細(xì)胞。為了使得表面腫瘤抗原的劑量足以達(dá)到用接種疫苗的要 求，可以用胰蛋白酶對(duì)所培養(yǎng)的活性細(xì)胞進(jìn)行多次重復(fù)處理，兩次處理之間應(yīng) 至少間隔24小時(shí)。用胰蛋白酶處理細(xì)胞的間隔期間，細(xì)胞孵育的實(shí)驗(yàn)方案要 根據(jù)特定的細(xì)胞來確定(即培養(yǎng)于37。C的C02培養(yǎng)箱中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有 血清和必須的添力卩物)。
積聚的表面腫瘤抗原按照特定疫苗的制備技術(shù)處理，即，這些抗原可以經(jīng) 純化、濃縮、組成分析，也可進(jìn)行修飾或與佐劑混合以增強(qiáng)免疫原性。 在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，蛋白酶的處理可與細(xì)胞傳代培養(yǎng)相結(jié)合。 胰蛋白酶溶液由無菌生理溶液或任何合適的鹽溶液配制。 除了胰蛋白酶，也可采用其他蛋白酶，例如胰凝乳蛋白酶(chemotrypsin)等。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，當(dāng)使用細(xì)胞懸液的時(shí)候，需在積聚抗原以前， 使用離心或其他合適的方法收集細(xì)胞。
本發(fā)明實(shí)施例一中所述的抗原組成分析，采用分析糖基化的肽類的質(zhì)譜儀 器來進(jìn)行(M. Tajiri et al., "Differential analysis of site-specific glycans on plasma and cellular fibronectins: application of a hydrophilic affinity method for glycopeptide enrichment", Glycobiology, 2005, v. 15, 1332-1340 )。部分原因是由
苗抗原的有益部分(如Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens", Scand. J, Immunol" 2005, v. 61, 391-397 )。
糖基化抗原的脫鹽和濃縮可通過任何適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行，特別是高效液相色 譜法(HPLC)。
在其他實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞可從生物源液體中分離，如血液、尿液、體 液(liquor )、淋巴液、腹水以及胸膜液。抗肺瘤疫苗的制備方法適用于各種類型的細(xì)胞培養(yǎng)，包括貼壁培養(yǎng)、懸浮 培養(yǎng)、與母體組織或其他培養(yǎng)基培養(yǎng)、各種形式的細(xì)胞共培養(yǎng)、器官培養(yǎng)以及 細(xì)胞集合體(顆粒、球體)，也同樣包括新分離的腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織片段。
進(jìn)一步的，實(shí)施例二描述了本發(fā)明采用人結(jié)腸癌細(xì)胞貼壁原代培養(yǎng)，制備 而成的抗肺瘤疫苗和疫苗的制備方法。
1. 通過腫瘤切除手術(shù)取得的結(jié)腸腫瘤組織片段，移入含RPMI1640培養(yǎng) 基和抗生素的無菌管中，送入實(shí)驗(yàn)室。
2. 在無菌條件下將腫瘤組織轉(zhuǎn)移至有蓋培養(yǎng)皿中，去除壞死的部分、血 塊、殘留的脂肪以及結(jié)締組織。
3. 將組織小心地用剪刀剪成小片。
4. 用10ml的曱硅烷磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮組織碎片，強(qiáng)力吹打，使 腫瘤組織石爭(zhēng)片解離成細(xì)胞團(tuán)塊。
5. 靜置使剩余較大的組織碎片沉到試管底部。
6. 用吸管小心收集懸浮于液體中的細(xì)胞團(tuán)塊，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中。
7. 試管以400g的重力加速度離心5分鐘，丟棄上清。將含有細(xì)胞團(tuán)塊的 沉淀重新懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基內(nèi)含有胰島素(20)ag/ml)，轉(zhuǎn) 鐵蛋白(10iag/ml)，皮質(zhì)醇(50nM),表皮生長(zhǎng)因子(l ng/ml),乙醇胺(IO pM)， 磷酸乙醇胺(10nM),三硪曱腺原氨酸(triiodthyronine ) (100 pM)，牛血清蛋白 (2mg/ml),谷氨酰胺(2mM),丙酮酸鈉(sodium piruvate ) (0.5 mM),胎牛血 清(5%)。然后轉(zhuǎn)移至25 cm2的細(xì)胞瓶中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
8. 在37°C和5% C02的條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
9. 為了從基質(zhì)細(xì)胞中分離腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞瓶緊壓在震動(dòng)攪拌器上數(shù)秒 鐘。由于腫瘤細(xì)胞附著力較弱，因而分離并進(jìn)入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
10. 用吸管收集含有漂浮細(xì)胞的培養(yǎng)基，然后將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的細(xì)胞瓶 中，在37。C和5% C02條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
11. 腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合時(shí)，從細(xì)胞瓶中移除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用0.9%的 NaCl或曱硅烷磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞三次，所用沖洗溶液的體積不少于生長(zhǎng) 培養(yǎng)基體積的一半。沖洗后生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的血清應(yīng)除去。
12. 將0.0001%的胰蛋白酶溶液(酶活性~ 3000U/mg )加入到細(xì)胞中，加 入量為每25cm2細(xì)胞并瓦的面積lml溶液。13、 37。C醉育細(xì)胞瓶。在孵育到第5至第7分鐘時(shí)，收集含有從細(xì)胞上裂
解的表面抗原的溶液。收集的過程中，腫瘤細(xì)胞仍緊貼細(xì)胞瓶壁。如果一部分
細(xì)胞由于胰蛋白酶的作用脫離了細(xì)胞并瓦壁而漂浮于液體中，需對(duì)溶液以400g 的重力加速度離心5分鐘，取無細(xì)胞的上清備用。
14、 為滅活培養(yǎng)細(xì)胞瓶中剩余的胰蛋白酶，應(yīng)加入新制備的含有胎牛血清 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并繼續(xù)在37。C以及5% C02的條件下孵育細(xì)胞。
15、 由步驟13獲得的溶液在真空濃縮器中，于45。C條件下進(jìn)行濃縮。濃 縮前應(yīng)用適當(dāng)方法對(duì)溶液脫鹽，如反相色譜法、凝膠過濾法等。為了除去剩余 的胰蛋白酶,應(yīng)預(yù)先用可濾過分子量低于4kDa肽段的過濾器對(duì)溶液進(jìn)行過濾。
16、 經(jīng)過24小時(shí)，重復(fù)步驟11-15步驟，以使抗原達(dá)到所需的量。這些 抗原對(duì)疫苗接種的有效性通過質(zhì)譜儀來評(píng)定。
用蛋白酶處理細(xì)胞的次數(shù)以及數(shù)次處理間隔時(shí)間的長(zhǎng)短，是通過分析所積 聚的抗原混合物的組成來決定的。如果抗原組成開始改變，數(shù)次用蛋白酶處理 細(xì)胞之間的間隔增長(zhǎng)，不能得到由新分離出的腫瘤細(xì)胞得到的最初的抗原組 成，那么這些細(xì)胞便不能用于疫苗制備。
所積聚到抗原混合物的組成，是通過質(zhì)譜測(cè)定來控制的，正如本發(fā)明實(shí)施 例一種所描述的。
任何合適的方法都可用于從腫瘤組織中分離細(xì)胞。用蛋白酶分離腫瘤組 織，意在分離腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜分析時(shí)，必須在肺瘤細(xì)胞原代培 養(yǎng)24小時(shí)之后進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明得到的表面腫瘤抗原對(duì)腫瘤細(xì)胞供體有特異性。但是細(xì)胞培養(yǎng) 明顯改變了原代培養(yǎng)的表型，這是因?yàn)槿斯ぶ亟ㄅc腫瘤細(xì)胞在供體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán) 境體相類似的體外培養(yǎng)條件造成的。所以積聚的抗原需要進(jìn)行嚴(yán)格控制。下面 進(jìn)一步說明根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例二進(jìn)行抗原質(zhì)量鑒定的方法。
根據(jù)在對(duì)抗原混合物重復(fù)進(jìn)行質(zhì)譜分析后得到的數(shù)據(jù)，不少于95%質(zhì)量比 的糖基化肽類得到復(fù)制，可以作為兩個(gè)待比較的抗原組合物的標(biāo)準(zhǔn)品。如果積 聚的用于疫苗接種的抗原，其比例不少于一般新分離的腫瘤細(xì)胞中糖基化肽類 質(zhì)量的90%,則認(rèn)為此抗原是可以用于治療的。
從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可得知，直腸肺瘤細(xì)胞只有使用第 一和第二代傳代細(xì)胞在培養(yǎng)3-4天的情況下，才可用于制備適合免疫接種的抗原。不能否認(rèn)，在生長(zhǎng)培 養(yǎng)基中加入一些成分，可以保持細(xì)胞表型，增加細(xì)胞傳代次數(shù)，利于疫苗抗原 的積聚。
當(dāng)不能從腫瘤組織中制備得到足夠數(shù)量的細(xì)胞時(shí)，則必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng) 以增殖，直至達(dá)到所需數(shù)量，同時(shí)必須在細(xì)胞培養(yǎng)期間控制表面抗原的變異。 根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)過程中控制抗原組成，不需另外的細(xì)胞增殖。例如，細(xì)胞 培養(yǎng)期間，每周一次或兩次的用不會(huì)使細(xì)胞致死的蛋白酶進(jìn)行處理，以及進(jìn)行
質(zhì)譜分析。
肺瘤和疫苗抗原的鑒定，保證了由疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)的特異性。
對(duì)比原肺瘤抗原和根據(jù)本發(fā)明所提供的抗原之間的質(zhì)i普，可以進(jìn)行鑒定。圖 2A所示為原腫瘤細(xì)胞表面抗原的質(zhì)譜圖。圖2B所示為利用本發(fā)明所提供的 方法制備的適用于疫苗接種的抗原質(zhì)譜圖(圖2A和圖2B的質(zhì)譜具相似性)。 圖2C所示也是根據(jù)本發(fā)明所得到的不適用于疫苗接種的抗原的質(zhì)譜圖(圖2A 和圖2C所示明顯不同)。箭頭指向的面積分別對(duì)應(yīng)消失的抗原(圖2B)和新 出現(xiàn)的抗原(圖2C)。因此，通過控制肽類的組成，可以積聚到疫苗接種所需 足夠數(shù)量的抗原，從而誘導(dǎo)特異性抗肺瘤免疫反應(yīng)。
為了確定來自腫瘤細(xì)胞表面蛋白的抗原的真正起源(雖然這對(duì)發(fā)明的實(shí)現(xiàn) 是非必要的)，給出了抗原片段的質(zhì)譜圖，如圖3所示的圖例。
為此，在加入胰蛋白酶孵育細(xì)胞的過程獲得的樣品，先用自動(dòng)吸管的頭取 反相ZipTipd8(Millipore Corp.， USA),按照說明書的方法進(jìn)行脫鹽。按照前述 方法將其置于質(zhì)鐠儀的樣品板上。質(zhì)譜是通過離子片段的狀態(tài)進(jìn)行記錄的。蛋 白的鑒定是通過搜索系統(tǒng)Mascot (MatrixScience, USA)進(jìn)行，該系統(tǒng)建立于蛋 白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫NCBI (USA)的人類分類單元，使用離子質(zhì)譜 'b，和'y，(序 列標(biāo)記法)和/或使用已確立的氨基酸序列。(新生法& "ovo method)
圖3A和圖3B顯示了分離的質(zhì)量在1640-1480Da之間的糖基化肽類的碳 水化合物部分，裂解片>^分子量為162Da、 203Da和291Da,這分別與己糖(甘 露糖，葡萄糖或者半乳糖)、乙酰葡萄糖胺和唾液酸相對(duì)應(yīng)。利用肽類片段， 可以確定其氨基S吏序列，并可利用其免疫球蛋白重鏈(含大部分CD抗原，組 織相容性復(fù)合體，T-細(xì)胞受體和細(xì)胞粘附分子)上的可變區(qū)和恒定區(qū)、低密度 脂蛋白受體、白細(xì)胞介素IR-2受體、G蛋白偶聯(lián)受體、主要組織相容性復(fù)合體I和II來確定抗原混合物中的肽類。圖3C所示為一個(gè)分離片段，其中利用
b-y離子指示出分子量為857.4Da的雙電荷肽類，確定的氨基酸序列與G蛋白 結(jié)合受體的片段相對(duì)應(yīng)
lie Cys Cys Ala Cys Cys Leu Cys Arg Asn Asn Cys Cys Val Phe Arg 15 10 15
圖3D所示為另一個(gè)分離片段，由b-y離子示出具有分子量為573.3Da的 單電荷肽類，確定的氨基S吏序列與主要組織相容性復(fù)合體II相對(duì)應(yīng) Ala Val Leu Asn Arg
1 5 因此，根據(jù)本發(fā)明獲得的抗原的特征如下
1) 它們是有水溶性物質(zhì)組成，主要為糖基化的肝水解蛋白(當(dāng)用胰蛋白 酶作為蛋白酶時(shí)，它們的序列通常以賴氨酸或精氨酸結(jié)尾)，其分子量為 1.2-4kDa,
2) 它們來源相同——都是肺瘤細(xì)胞質(zhì)膜外蛋白的胞外片段，
3) 它們都是在不使得細(xì)胞死亡的濃度條件下用蛋白酶處理活的細(xì)胞而得 到的。
根據(jù)本發(fā)明得到的腫瘤抗原混合物，其實(shí)際應(yīng)用是由確定的氨基酸序列與 細(xì)胞表面呈現(xiàn)的與蛋白片段混合存在的修飾的(糖基化)肽類來決定。眾所周 知，腫瘤疾病的發(fā)生，是免疫系統(tǒng)無法破壞機(jī)體中形成的腫瘤細(xì)胞的結(jié)果。經(jīng) 過積聚純化的抗原，與能增強(qiáng)免疫反應(yīng)的佐劑相混合，然后注入人體或動(dòng)物體 內(nèi)。由于生物體細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的存在，在機(jī)體消滅注射入體內(nèi)的肽類的 同時(shí)，體內(nèi)已有的或新出現(xiàn)的肺瘤細(xì)胞也會(huì)被破壞，從而決定了抗肺瘤疫苗接 種的治療和預(yù)防效果。為了發(fā)揮免疫反應(yīng)的最大作用，可重復(fù)注射抗原。
為了確定根據(jù)本發(fā)明所得抗腫瘤疫苗的活性，用20只年齡和體重相同的 BALB/c系雄性小鼠做模型試驗(yàn)(10只作為對(duì)照，10只作為實(shí)驗(yàn)組)。
根據(jù)實(shí)施例一得到的腫瘤抗原，來自于培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞H22。將收集的抗 原采用葡聚糖凝膠G-10進(jìn)行凝膠過濾脫鹽，然后并用真空濃縮器SpeedVac 進(jìn)行濃縮。
先將抗原與完全弗氏佐劑以1:1 (體積比)的比例混合，然后取150ug進(jìn) 行皮下注射。使用不完全弗氏佐劑在三周內(nèi)進(jìn)行反復(fù)免疫(每周注射一次)。對(duì)照組動(dòng)物同時(shí)注射混有生理溶液的弗氏完全佐劑。在第四次免疫接種后，用 皮下注射的方法將1百萬個(gè)肝細(xì)胞瘤H22接種到小鼠體內(nèi)。記錄三個(gè)月內(nèi)對(duì)
照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的存活率。繪制存活曲線(圖4)確定根據(jù)本發(fā)明所得抗原
的抗腫瘤活性。
需要注意的是，該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不能認(rèn)為本發(fā)明僅能在動(dòng)物中成功應(yīng) 用，因?yàn)閯?dòng)物和人的抗腫瘤免疫的機(jī)制是一樣的。抗原的使用方法和其在每公 斤體重的使用劑量，保證了其在人類免疫療法中的作用，但是針對(duì)每一個(gè)病人， 其治療方案可以根據(jù)病情的嚴(yán)重性，疾病所處的階段，腫瘤細(xì)胞的突變性，機(jī) 體針對(duì)抗原而產(chǎn)生顯著性免疫應(yīng)答的能力等，進(jìn)行個(gè)體化定制。
進(jìn)一步地，以下提供抗肺瘤疫苗和及其抗腫瘤療法，該腫瘤疫苗是基于表 面肺瘤抗原，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例二而制備，用于進(jìn)行人的抗腫瘤治療。
疫苗包含lmg腫瘤抗原混合物，該抗原是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例二制備的， 溶于0.5ml的曱硅烷磷酸鹽緩沖溶液中，并與lml的佐劑山小星蒜堿 (Montanide) ISA-51 ( Syntex廠利用含有角鯊烯、Plu匿icL121、吐溫-80的 油水乳劑制備而成的佐劑)混合。
給患者皮下注射一個(gè)劑量的疫苗，每周一次，持續(xù)三周以及每月一次，持 續(xù)五個(gè)月。
用注射腫瘤抗原的免疫強(qiáng)度來評(píng)估疫苗的效果。在注射后2-3，注射抗原 引起的過敏性反應(yīng)通過注射局部紅斑的尺寸來衡量。以首次注射后出現(xiàn)的紅斑 尺寸作為基數(shù)。重復(fù)疫苗接種引起明顯的過壽文反應(yīng)，表示免疫反應(yīng)的發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，進(jìn)行抗腫瘤免疫療法也可采用靜脈或肌肉注 射疫苗，也可注射不含佐劑的疫苗。
由于腫瘤抗原混合物的使用，通過本發(fā)明所提供方法可確保免疫反應(yīng)的發(fā) 生。疫苗中存在的許多抗原，保證能對(duì)每一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這些細(xì)胞自 身沒有具有相同氨基酸序列的表面蛋白。
因此，本發(fā)明與現(xiàn)有的使用單價(jià)疫苗的方法相比，其抗腫瘤免疫療法的效 果增強(qiáng)很多倍。
本發(fā)明提供的由腫瘤細(xì)胞表面抗原組成的富含腫瘤特異性抗原的疫苗，其 應(yīng)用為抗腫瘤免疫療法的實(shí)施提供了可能。
產(chǎn)生這種療效，主要是由于用不使細(xì)胞死亡濃度的蛋白酶對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行處理。釆用不使細(xì)胞死亡濃度的蛋白酶，僅能使胂瘤細(xì)胞的表面抗原分離，而 不會(huì)使細(xì)胞死亡。而細(xì)胞死亡會(huì)伴隨著細(xì)胞膜的損壞，從而使得疫苗中出現(xiàn)細(xì) 胞質(zhì)內(nèi)容物，特別出現(xiàn)大量的非疫苗成分的胞內(nèi)蛋白。這會(huì)降低已有疫苗中腫 瘤特異性抗原部分含量減少，擾亂免疫應(yīng)答，從而降低免疫應(yīng)答的特異性，即 肺瘤抗原的特異性。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明制備的富含腫瘤抗原的疫苗，可提高抗腫瘤免疫療 法的效果。
此外，免疫療法的效果提高，是因?yàn)槭褂昧朔e聚自培養(yǎng)的原代腫瘤細(xì)胞的 抗原。這種制備抗腫瘤疫苗的方法，其收集抗原的步驟可以在每次蛋白酶處理 之后，這樣每次收集的抗原組成實(shí)際上是一樣的，如此增加了用于疫苗接種的 從原代細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的疫苗的數(shù)量。使用僅對(duì)特定腫瘤具有抗原特異性的疫 苗是安全的，因?yàn)槭占乖慕M分是可控的。
本發(fā)明不會(huì)導(dǎo)致疫苗中出現(xiàn)對(duì)特定腫瘤具有非特異性的抗原。這種非特異 性抗原可能出現(xiàn)在現(xiàn)有的用增殖細(xì)胞制備的疫苗中，這是因?yàn)轶w外繁殖過程中 的原代培養(yǎng)改變了其抗原組成。因此，從增殖細(xì)胞中收集得到的抗原混合物， 其組成與通過分離(而非培養(yǎng))的肺瘤細(xì)胞而得到的抗原的組成明顯不同。
根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗，可以是自體疫苗(從患者自身細(xì)胞獲得)或者異 體疫苗(從其他患者細(xì)胞獲得)。
在兩種情況下，本發(fā)明所提供的免疫療法都是有效的，因?yàn)椴煌颊叩碾?瘤細(xì)胞，其表面的肽類具有相同的氨基酸序列。
此外，根據(jù)本發(fā)明制備的自體疫苗更有效，因?yàn)檫@時(shí)疫苗含有特定病人在 肝瘤發(fā)展過程中所個(gè)別擁有的、符合特定疾病階段的抗原特性。 工業(yè)應(yīng)用
本發(fā)明基于細(xì)胞表面抗原制備腫瘤抗原，并在此基礎(chǔ)上治療腫瘤疾病，主 要利用疫苗接種的方法。
權(quán)利要求
1、一種基于表面腫瘤抗原的抗腫瘤疫苗，其特征在于，所述疫苗包含表面腫瘤抗原的混合物，所述抗原是通過收集活的腫瘤細(xì)胞表面蛋白的肽類而得到的，所述肽類是通過向原代培養(yǎng)的活的腫瘤細(xì)胞周期性加入不使細(xì)胞死亡的蛋白酶進(jìn)行處理而得到的。
2、 如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤疫苗，其特征在于，所述疫苗是在所述蛋 白酶為胰蛋白酶的條件下得到的。
3、 一種抗肺瘤疫苗的制備方法，包括培養(yǎng)肺瘤細(xì)胞和分離表面腫瘤抗原， 其特征在于將預(yù)先從生長(zhǎng)培養(yǎng)基上洗脫的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用蛋白酶對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn) 行不使細(xì)胞死亡的處理；收集釋放的表面腫瘤抗原；經(jīng)過一段時(shí)間后，重復(fù)肺瘤細(xì)胞培養(yǎng)，所述時(shí)間的間隔足以使得表面抗原 被所述腫瘤細(xì)胞恢復(fù)；積聚表面腫瘤抗原直至達(dá)到滿足疫苗接種的劑量； 控制積聚的表面肺瘤抗原的組分。
4、 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其中所述蛋白酶為胰蛋白酶。
5、 一種抗胂瘤免疫療法，包括將疫苗注入到患者體內(nèi)的步驟，所述疫苗 由一種表面腫瘤抗原的混合物制得，所述表面腫瘤抗原為肽類，所述肽類來源 于腫瘤細(xì)胞表面蛋白，其特征在于，所述表面腫瘤抗原混合物的應(yīng)用，所述抗 原為收集的活的腫瘤細(xì)胞表面蛋白的肽類，是通過向原代培養(yǎng)的活的腫瘤細(xì)胞 中周期性地加入不使細(xì)胞死亡的蛋白酶進(jìn)行處理而得到的。
6、 如權(quán)利要求5所述的療法，其中所述蛋白酶為胰蛋白酶。
7、 如權(quán)利要求5所述的療法，其中所述表面腫瘤抗原來自自體腫瘤細(xì)胞。
8、 如權(quán)利要求5所述的療法，其中所述表面腫瘤抗原來自同種異體腫瘤 細(xì)胞。
9、 如權(quán)利要求5所述的療法，其中抗腫瘤的所述疫苗含有佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)療技術(shù)，尤其涉及腫瘤患者的免疫治療。抗腫瘤疫苗以表面腫瘤抗原為基礎(chǔ)，包含表面腫瘤抗原混合物。包括培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞和分離表面腫瘤抗原。將預(yù)先從生長(zhǎng)培養(yǎng)基上洗脫的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，用蛋白酶對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行不使細(xì)胞死亡的處理，收集釋放的表面抗原。在一段時(shí)間間隔后，用蛋白酶重復(fù)處理原代培養(yǎng)的活體腫瘤細(xì)胞，該時(shí)間間隔足以使得細(xì)胞表面腫瘤抗原得到恢復(fù)。積聚表面腫瘤抗原，直至達(dá)到足夠的疫苗劑量，控制表面腫瘤抗原的組成。蛋白酶可以采用胰蛋白酶。本發(fā)明所提供抗腫瘤治療的方法，包括向患者體內(nèi)注入抗腫瘤疫苗。本發(fā)明所達(dá)到的技術(shù)效果包括通過強(qiáng)化抗腫瘤免疫反應(yīng)來提高腫瘤疾病的的治療效果。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101636174SQ200780052044
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者彼得·詹里耶維奇·盧克霍夫 申請(qǐng)人:彼得·詹里耶維奇·盧克霍夫