專利名稱：新的腫瘤抑制基因,hic－1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明用來自國家癌癥研究所基金號(hào)R01-CA43318的政府資助進(jìn)行。政府在本發(fā)明中擁有一些權(quán)利。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域一般來說，本發(fā)明涉及正常和腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)，特別地涉及一種新的腫瘤抑制基因，HIC-1，和其基因產(chǎn)物。
2.相關(guān)領(lǐng)域描述重組DNA技術(shù)的進(jìn)展導(dǎo)致了正常細(xì)胞基因的發(fā)現(xiàn)，比如控制生長、發(fā)育和分化的原癌基因和腫瘤抑制基因。在某些情況下，這些基因調(diào)節(jié)改變而引起正常細(xì)胞表現(xiàn)為腫瘤生長行為。迄今為止，已知有40多種原癌基因和腫瘤抑制基因，根據(jù)其功能特性可分為不同的種類。這些基因包括，(1)生長因子和生長因子受體，(2)如在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信使，和(3)影響基因表達(dá)和DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)蛋白(如，轉(zhuǎn)錄因子)。
在人類癌癥中染色體17p常有改變，通常等位缺失與位于17p 13.1的p53基因突變相一致(Vogelstein，B，等，細(xì)胞，70523，1992)。這個(gè)基因是人類腫瘤中改變最頻繁的腫瘤抑制基因之一?？墒窃谝恍┠[瘤類型中，17p等位缺失高頻率地發(fā)生于遠(yuǎn)離p53的區(qū)域并且不存在p53突變。例如，60％的乳腺癌缺失17p等位基因時(shí)，僅30％的這些腫瘤含p53突變(Chen L-C，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，883847，1991；Takita，K.等，癌癥研究，523914，1992；Deng，G.等，癌癥研究，54499，1994；Cornelis，R.S.等，癌癥研究，544200，1994)。此外，在乳腺癌的一項(xiàng)研究中，17p13.3等位基因的獨(dú)立缺失與伴隨著p53 mRNA水平的增加。
典型的人癌細(xì)胞含體細(xì)胞內(nèi)改變了的基因組，其特征是關(guān)鍵基因的突變、擴(kuò)增或缺失。此外，來自人癌細(xì)胞的DNA模板常表現(xiàn)為DNA甲基化的體細(xì)胞變化(E.R.Fearon，等，細(xì)胞，61759，1990；P.A.Jones，等，癌癥研究，46461，1986；R.Holliday，科學(xué)，238163，1987；A.DeBustros，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，855693，1988)P.A.Jones，等，癌癥研究進(jìn)展，541，1990；S.B.Baylin，等，癌細(xì)胞，3383，1991；M.Makos，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，891929，1992；N.Ohtani-Fujita，等，癌基因，81063，1993)。不過，尚未確立在人類腫瘤發(fā)生中異常DNA甲基化的精確作用。DNA甲基酶從通用的甲基供體S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移甲基基團(tuán)到DNA特定位點(diǎn)上。幾種生物學(xué)功能歸因于DNA中的甲基化堿基。已確立的最明顯的生物學(xué)功能是保護(hù)DNA免于同種限制酶的消化。迄今為止，限制性修飾現(xiàn)象僅在細(xì)菌中觀察到。不過，哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有一種不同的甲基酶，專一地甲基化DNA上鳥嘌呤5′鄰位的胞嘧啶殘基(CpG)。幾種跡象表明這種甲基化在基因活性、細(xì)胞分化、腫瘤形成、X-染色體生活、基因組印記和其它主要的生物學(xué)過程中起作用(Razin，A.H.和Riggs，R.D.eds.DNA甲基化的生物化學(xué)和生物學(xué)意義，Springer-Verlag，紐約，1984)。
CpG豐富的區(qū)域，或“CpG島”最近已在17p13.3位確認(rèn)，它在人類癌癥的多種普通類型中異常地過度甲基化(Makos，M.，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，891929，1992；Makos，M.等，癌癥研究，532715，1993；Makos，M.等，癌癥研究，532719，1993)。這種過度甲基化在腦、結(jié)腸和腎癌中與17p缺失和p53突變的時(shí)機(jī)和出現(xiàn)率恰好吻合。與普通非甲基化啟動(dòng)子區(qū)CpG島的過度甲基化相關(guān)的沉默基因轉(zhuǎn)錄，已作為一種腫瘤抑制基因失活的編碼區(qū)突變的替代機(jī)制。(Baylin，S.B.等，癌細(xì)胞，3383，1991；Jones，P.A.和Buckley，J.D.，癌癥研究進(jìn)展，541-23，1 990)。該變化現(xiàn)在已與VHL表達(dá)缺失相關(guān)，它是一種在3p上的腎癌腫瘤抑制基因(J.G.Herman，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，919700-9704，1994)，在6q上的雌激素受體基因(Ottaviano，Y.L.等，癌癥研究，542552，1994)和在11p上的H19基因的表達(dá)缺失相關(guān)(Steenman，M.J.C.等，自然遺傳學(xué)，7433，1994)。
對幾種人類腫瘤類型來說，第二個(gè)腫瘤抑制基因可能位于染色體17p13.1上的p53基因的遠(yuǎn)端，和p53基因相互作用。需要確認(rèn)腫瘤抑制基因，以便發(fā)展合適的方法學(xué)，以便在細(xì)胞中觀察到異常表達(dá)時(shí)增加或降低其表達(dá)。通過在多種普通人腫瘤類型中17p13.3 CpG島異常地過度甲基化的特征，本發(fā)明提供了這樣的一個(gè)基因。HIC-1(在癌癥中過度甲基化)是一種新穎的鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因，在正常組織中廣泛表達(dá)，但在過度甲基化的腫瘤細(xì)胞(如，乳腺、肺、結(jié)腸、成纖維細(xì)胞)中低表達(dá)。p53結(jié)合位點(diǎn)位于HIC-15′側(cè)翼區(qū)。野生型p53基因在只含一個(gè)突變的p53等位基因的結(jié)腸癌細(xì)胞中的過度表達(dá)，導(dǎo)致20倍的HIC-1表達(dá)活化。
本發(fā)明表明許多人癌顯示出相對于其起源組織的HIC-1表達(dá)降低?，F(xiàn)有技術(shù)在提供細(xì)胞增殖失調(diào)如癌癥存在相關(guān)的有意義標(biāo)志的局限和失敗，引起能用于上述失調(diào)過程的診斷、預(yù)后和治療的標(biāo)志的需求。本發(fā)明滿足了上述的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明基于一種新的腫瘤抑制基因，HIC-1(在癌中過度甲基化)，的創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)，它在多種普通人類腫瘤類型中異常過度甲基化。本發(fā)明提供一種HIC-1多肽和編碼多肽的多核苷酸序列及結(jié)合多肽的抗體。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種診斷方法，檢測在受試者組織中和HIC-1有關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)，它包括用一種檢測HIC-1的試劑與含HIC-1的靶細(xì)胞組分接觸。上述細(xì)胞組分包括核酸和蛋白。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療和HIC-1有關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)的方法，包括給失調(diào)的受試者服用調(diào)節(jié)HIC-1表達(dá)的治療有效量的藥物。例如，由于典型的和失調(diào)有關(guān)的HIC-1涉及HIC-1多核苷酸序列的過度甲基化，含不能甲基化的核苷酸類似物可用于治療受試者。
此外，本發(fā)明提供一種基因治療方法，包括將一種包含與啟動(dòng)子可操作地連接的編碼HIC-1的核苷酸序列的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主受試者細(xì)胞內(nèi)。
附圖簡述

圖1圖示粘粒C-13A的一個(gè)11.0kb區(qū)域圖，粘粒C-13A包含前已表明在多種腫瘤類型中具有過度甲基化的染色體17p13.3區(qū)的50kb人DNA插入片段(Makos，M.，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，891929，1992；Makos，M，等，癌癥研究，532715，1993；Makos，M.等，癌癥研究，532719，1993)。顯示了YNZ 22探針的位置，EcoRI(E)限制性位點(diǎn)和一系列制備橫跨該區(qū)的粘粒亞克隆的定位。
圖1B是發(fā)現(xiàn)其被包括在圖1A顯示的區(qū)域中的HIC-1基因的圖解和圖2B顯示其氨基酸序列的圖解。表示的是可能的p53結(jié)合位點(diǎn)；TATAA＝從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)40bp上游的TATA盒序列；5′UTR＝第一個(gè)不翻譯的外顯子；ATG＝多半為5′翻譯起點(diǎn)；ZIN(鋅指N-端)＝包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子Zin結(jié)構(gòu)域亞族的高度保守區(qū)(圖2A)的478bp外顯子；具陰影線的長方形表示HIC-1的2015bp最后外顯子，每一個(gè)陰影棒表示成簇位于基因3′區(qū)的5個(gè)鋅指(圖2B)之一；TAG＝HIC-1基因中翻譯終止位點(diǎn)；AATAAA＝離翻譯終止位點(diǎn)835bp發(fā)現(xiàn)的多腺苷化信號(hào)位點(diǎn)。
圖1C和SEQ ID NO1和2表示核苷酸和推導(dǎo)的HIC-1氨基酸序列。
圖2A和SEQ ID NO3顯示HIC-1氨基酸序列。HIC-1氨基酸序列和Zin結(jié)構(gòu)域鋅指家族其它成員的保守N-端區(qū)比較。在圓括號(hào)中，數(shù)字表示相對于每一基因的翻譯起始位點(diǎn)的保守區(qū)位置。最黑的陰影表示9個(gè)蛋白中至少5個(gè)相同的氨基酸位置，較淺的陰影表示在家族成員之間保守性氨基酸差異的位置。D＝果蠅；M＝鼠；H＝人。在底部氨基酸的括號(hào)代表在其它家族成員該位置未找到的在HIC-1中的一個(gè)區(qū)域。
圖2B顯示HIC-1基因整個(gè)編碼區(qū)。顯示了HIC-1兩個(gè)編碼外顯子的推導(dǎo)的氨基酸序列，由概括在本文中的序列分析和表達(dá)策略確定。在3′半個(gè)蛋白中的5個(gè)鋅指由陰影盒顯示。
圖3顯示HIC-1基因表達(dá)的RNA分析。S＝脾；The＝胸腺；P＝前列腺；Te＝睪丸；O＝卵巢；SI＝小腸；B＝外周血細(xì)胞。4.4kb標(biāo)記以上的帶和核糖體RNA共雜交。約1.1kb帶仍然未被確認(rèn)，但可能是一種替代性的剪接產(chǎn)物，因?yàn)橛脕碜訦IC-1的鋅指或3′非翻譯區(qū)的探針沒有檢出該帶。
圖4A顯示在各種正常和腫瘤人組織中HIC-1基因表達(dá)的RNAse保護(hù)分析。在全部試驗(yàn)組中，頂部星號(hào)標(biāo)記為未消化的360bp HIC-1基因RNA探針的位置，該探針衍生自粘粒亞克隆600中含鋅指的區(qū)域(圖1A)。被保護(hù)的HIC-1片段(300bp)標(biāo)記為HIC-1。圖4A用10μg總RNA比較下列細(xì)胞的表達(dá)，來自2個(gè)建成的正常人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)系(WI-38和IMR-90)與纖維肉瘤細(xì)胞HT1080培養(yǎng)系(成纖維-C)相比，來自3個(gè)不同的正常結(jié)腸樣品(結(jié)腸-N)與結(jié)腸癌細(xì)胞系，CaCO2(結(jié)腸-C)相比，以及來自正常肺樣品(肺-N)與人小細(xì)胞肺癌建成系，NCI-H209(肺-C)相比。
圖4B顯示對來自6種不同建成的乳腺癌培養(yǎng)系(1道MDA231；2道HS58T；3道MDA468；4道T47D；5道MCF7；6道MDA453)的10μg RNA的RNAse保護(hù)分析，其中每道普遍有HIC-1 CpG島NotI位點(diǎn)的甲基化。
圖4C顯示來自正常胎兒腦(B)與一組非培養(yǎng)腦瘤(1種退行性星形細(xì)胞瘤(AA)和8種更晚期的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(1-8道)相比較的10μg RNA的RNAse保護(hù)分析。
圖5顯示含β-半乳糖苷酶基因或野生型p53基因的腺病毒載體感染 進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480系后，如圖A詳示的RNAse保護(hù)分析。(非感染、正常對照人成纖維細(xì)胞(F)，未感染SW480細(xì)胞(U)，用β-半乳糖苷酶基因感染的SW480細(xì)胞(GAL)，和用p53基因感染的SW480細(xì)胞(p53))。非消化的HIC-1 GAPDH探針的位置以及HIC-1和GAPDH轉(zhuǎn)錄本的位置的標(biāo)志恰如圖4中一致準(zhǔn)確。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種新的腫瘤抑制基因，HIC-1(在癌癥中過度甲基化)。HIC-1位于染色體17p13.3上，近離位于17p13.1的p53腫瘤抑制基因，其中的CpG島在許多不同的腫瘤類型中異常甲基化。該異常甲基化的CpG島完全包括HIC-1基因的編碼區(qū)。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種基本上純的HIC-1多肽，其基本上由圖2B和SEQ ID NO3所示的氨基酸序列組成。HIC-1多肽的特征是具有與高度保守的N-端基序不同的氨基酸同源性，N-端基序稱作Zin(鋅指N-端)結(jié)構(gòu)域，它存在于鋅指轉(zhuǎn)錄因子集合的每一個(gè)成員中。此外，也含有5個(gè)那些相同蛋白3′區(qū)特征的Kruppel型Cys2-His2鋅指。
在此所用的術(shù)語“基本上純”指HIC-1多肽，它基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化技術(shù)純化HIC-1。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。HIC-1多肽的純度也能用氨基端氨基酸序列分析測定。
本發(fā)明包括一種功能性多肽，HIC-1，和其功能性片段。在此所用的術(shù)語“功能性多肽”指的是一種多肽，它具有的生物學(xué)功能或活性通過規(guī)定的功能分析確認(rèn)，與細(xì)胞中特異的生物學(xué)、形態(tài)學(xué)或表型的改變相關(guān)。HIC-1多肽的功能性片段包括保留HIC-1活性如腫瘤抑制活性的HIC-1片段。含HIC-1生物學(xué)活性的較小肽包括在本發(fā)明中。例如，生物學(xué)功能可從一個(gè)抗體分子可以結(jié)合的小至一個(gè)表位的多肽片段變化到能參與細(xì)胞內(nèi)表型變化的特征性誘導(dǎo)或程序化的大的多肽。“功能性多核苷酸”表示一種編碼在此所述的功能性多肽的多核苷酸。
HIC-1原始氨基酸序列的微小修飾，可能產(chǎn)生與在此所述的HIC-1多肽相比基本上等價(jià)活性的蛋白。這些修飾可考慮用定點(diǎn)突變產(chǎn)生法或自發(fā)產(chǎn)生。只要存在HIC-1腫瘤抑制活性，這些修飾產(chǎn)生的全部多肽包括在本發(fā)明之中。此外，一或多個(gè)氨基酸的缺失也能引起得到的分子結(jié)構(gòu)修飾而不顯著地改變其活性。這能導(dǎo)致具有更廣用途的較小活性分子的發(fā)展。例如，有可能移去HIC-1活性不需要的氨基或羧基末端氨基酸。
本發(fā)明的HIC-1多肽也包括多肽序列的保守性變化。在此所用的術(shù)語“保守性變化”表示一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)生物學(xué)上相似的殘基取代，保守自變化的實(shí)例包括一個(gè)疏水性殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一個(gè)疏水性殘基，或一個(gè)極性殘基取代另一個(gè)極性殘基，如精氨酸取代賴氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。術(shù)語“保守性變化”也包括在一個(gè)非取代親本氨基酸的部位使用一個(gè)取代的氨基酸，條件是抗取代的多肽的抗體也和非取代多肽起免疫反應(yīng)。
本發(fā)明也提供一種分離的多核苷酸序列，其基本由編碼具有SEQ IDNO3氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列組成。本發(fā)明的多核苷酸序列也包括5′和3′非翻譯序列，例如包括調(diào)節(jié)序列。在此所用的術(shù)語“分離的”包括多核苷酸，其基本上不含天然和其相關(guān)的其它核酸、蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本發(fā)明的多核苷酸序列包括編碼HIC-1的DNA、cDNA和RNA序列。不言而喻的是只要它們編碼具HIC-1活性的多肽，所有編碼HIC-1的全部或部分的多核苷酸也包括在本發(fā)明中。上述多核苷酸包括自然存在的、合成的和有目的操作的多核苷酸。例如，HIC-1多肽可進(jìn)行定點(diǎn)突變。HIC-1的多核苷酸序列也包括反義序列。本發(fā)明的多核苷酸包括作為遺傳密碼子簡并結(jié)果的序列。有20種天然氨基酸，其中大多數(shù)由多于1個(gè)密碼子所指定。因此，只要由核苷酸序列編碼的HIC-1多肽的氨基酸序列功能上沒有改變，所有簡并的核苷酸序列包括在發(fā)明中。此外，本發(fā)明也包括一種多核苷酸，其基本由編碼具有SEQID NO3氨基酸序列和至少有一個(gè)表位產(chǎn)生HIC-1多肽有免疫反應(yīng)性抗體的多肽的多核苷酸序列。
編碼HIC-1的多核苷酸包括在圖1C(SEQ ID NO1和2)的核苷酸序列和該序列互補(bǔ)的核酸序列。互補(bǔ)性序列可包括一種反義核苷酸。當(dāng)序列是RNA時(shí)，圖1C(SEQ ID NO1和2)的脫氧核糖核苷酸A、G、C和T分別由核糖核苷酸A、G、C和U代替。本發(fā)明中也包括的是至少長15個(gè)堿基的上述核酸序列，的片段它足夠允許片段在生理?xiàng)l件和中度嚴(yán)格條件下選擇性地與編碼圖2B(SEQ ID NO3)蛋白的DNA雜交。
在此特別公開的是HIC-1的DNA序列，在圖1A和1B(也見圖1C和SEQ ID NO2)圖解說明。轉(zhuǎn)錄外顯子包括5個(gè)鋅指，從最后一個(gè)鋅指到終止位點(diǎn)延伸了359bp。在明顯的3′非翻譯區(qū)(UTR)的239bp，在通過終止位點(diǎn)后轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行。也有自終止位點(diǎn)835bp位的多腺苷化信號(hào)，AATAAA。此外，在Zin結(jié)構(gòu)域后和鋅指外顯子前，有一個(gè)共有的剪接供體和由內(nèi)含子區(qū)分離的受體位點(diǎn)。HIC-1完整的編碼區(qū)由其中在NotI N3和N7位點(diǎn)之間的富含CpG的3.0kb區(qū)的2個(gè)外顯子所包括。
本發(fā)明的DNA序列能用幾種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離DNA。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源性核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫的抗體篩選以檢出共同具有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段。
本發(fā)明優(yōu)選的HIC-1多肽來源于哺乳動(dòng)物，并且最優(yōu)選的是來自人類。假如能得到合適的探針，依靠核酸雜交的篩選步驟有可能從任何生物中分離任何基因序列。與編碼所研究的蛋白的部分序列對應(yīng)的寡核苷酸探針，能化學(xué)合成。這需要氨基酸序列短的寡肽段必須已知。編碼蛋白的DNA序列能從遺傳密碼子推導(dǎo)出來，可是必須考慮密碼子的簡并性。當(dāng)序列有簡并時(shí)，可能進(jìn)行混合添加反應(yīng)。這包括變性的雙鏈DNA的異源性混合物。為上述篩選，優(yōu)選雜交在單鏈DNA或變性的雙鏈DNA上進(jìn)行。在來源于存在有關(guān)感興趣的多肽的極低量mRNA序列的cDNA克隆檢測時(shí)，雜交特別有用。換句話說，用直接避免非特異結(jié)合的嚴(yán)格雜交條件，例如，靶DNA與單鏈探針在完全互補(bǔ)的混合液中雜交時(shí)，有可能使特異的cDNA克隆放射自顯影顯示(Wallace，等，核酸研究，9879，1981)。
編碼HIC-1的特異DNA序列產(chǎn)生也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以提供感興趣多肽的必需密碼子；和3)從真核供體細(xì)胞分離的mRNA反轉(zhuǎn)錄體外合成雙鏈DNA序列。在后者的情況下，最終形成的互補(bǔ)mRNA的雙鏈DNA，一般稱作cDNA。
三種上面提到的用于重組步驟產(chǎn)生特異DNA序列中的方法中，基因組DNA分離體的分離最不常用。當(dāng)由于存在內(nèi)含子，希望得到哺乳動(dòng)物多肽的微生物表達(dá)時(shí)，這是特別真實(shí)的情形。
當(dāng)需要的多肽產(chǎn)物的氨基酸殘基整個(gè)序列已知時(shí)，DNA序列的合成是經(jīng)常選用的方法。當(dāng)不知道所需多肽的氨基酸殘基的整個(gè)序列時(shí)，DNA序列的直接合成是不可能的，選用的方法是cDNA序列的合成。分離感興趣的cDNA序列的標(biāo)準(zhǔn)方法是產(chǎn)生自大量存在于基因表達(dá)高水平的供體細(xì)胞中的mRNA的反轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)粒或噬菌體攜帶的cDNA文庫。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)時(shí)，即使稀少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。在已知多肽氨基酸序列的主要部分的這些情況下，復(fù)制假定存在于靶cDNA中的序列產(chǎn)生標(biāo)志的單鏈或雙鏈DNA或RNA探針序列可用在DNA/DNA雜交方法中，該雜交方法在cDNA變性成單鏈形式的克隆拷貝上進(jìn)行(Jay，等，核酸研究，112325，1983)。
可用HIC-1特異抗體對cNDA文庫，如λgt11進(jìn)行篩選。這樣的抗體可以是多克隆或單克隆來源的，用于檢測顯示HIC-1 cDNA存在的表達(dá)產(chǎn)物。
編碼HIC-1的DNA序列能通過將DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的宿主細(xì)胞中而體外表達(dá)?！八拗骷?xì)胞”是在其中載體能繁殖，其DNA能表達(dá)的細(xì)胞。該術(shù)語也包括任何受試者宿主細(xì)胞的后代。不言而喻的是所有后代可能與親本細(xì)胞不相同，因?yàn)榭赡艽嬖趶?fù)制過程中產(chǎn)生的突變。不過，當(dāng)用術(shù)語“宿主細(xì)胞”時(shí)上述后代包括其中。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法意味著外源DNA繼續(xù)在宿主中維持，這在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
在本發(fā)明中。HIC-1多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”涉及本領(lǐng)域熟知的質(zhì)粒、病毒或其它運(yùn)載體，通過HIC-1遺傳序列的插入或摻入操作。上述表達(dá)載體含啟動(dòng)子序列，其有利于宿主插入的遺傳序列有效轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體通常含復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、和允許作轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型選擇的特殊基因。在本發(fā)明中適用的載體包括但不局限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，等，基因，56125，1987)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee和Nathans，生物化學(xué)雜志，2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。DNA片段能存在于操縱性連接調(diào)節(jié)元件的載體中，例如啟動(dòng)子(如，T7，金屬硫蛋白T，或多角體蛋白啟動(dòng)子)。
編碼HIC-1的多核苷酸序列能在原核或真核生物中表達(dá)。包括的宿主是微生物、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物。具有真核或病毒序列的DNA序列在原核生物中表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。能在宿主中表達(dá)和復(fù)制的病毒和質(zhì)粒DNA載體的生物學(xué)功能在本領(lǐng)域中眾所周知。上述載體用于摻入本發(fā)明的DNA序列。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含HIC-1編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳技術(shù)。如見曼尼阿蒂斯，等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，所述的技術(shù)。
多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用于表達(dá)HIC-1編碼序列。這些包括但不局限于以下系統(tǒng)；微生物如用含HIC-1編碼序列的重組細(xì)菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用含HIC-1編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用含HIC-1編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒、TMV)感染的植物細(xì)胞系統(tǒng)或含HIC-1編碼序列的重粒質(zhì)粒表達(dá)載體(如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；用含HIC-1編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；或用含HIC-1編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如，反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，或工程化穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。由于HIC-1未證實(shí)含有糖類，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)和提供翻譯或翻譯后修飾的那些系統(tǒng)二者都可使用；如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母和植物表達(dá)系統(tǒng)。
依據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，許多合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件的任一個(gè)，包括組成性和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄終止子等，可用在表達(dá)載體中(見如，Bitter等，酶學(xué)方法153516-544，1987)。例如當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子如細(xì)菌噬菌體γ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜交啟動(dòng)子)等。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可用來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組(如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子，或來自哺乳動(dòng)物病毒(如反轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列；腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5k啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子。通過重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動(dòng)子。也可用于提供作插入的HIC-1編碼序列的轉(zhuǎn)錄。此外，內(nèi)源的HIC-1啟動(dòng)子也可用于提供HIC-1的轉(zhuǎn)錄裝置。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)打算作表達(dá)的用途，優(yōu)先選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)計(jì)劃產(chǎn)生大量的HIC-1時(shí)，合乎需要的是指導(dǎo)容易純化的融合蛋白產(chǎn)物高水平表達(dá)的載體。優(yōu)選的是那些工程化含裂解位點(diǎn)有助于恢復(fù)的載體。上述載體包括但不局限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther，等，EMBO J.21791，1983)，在pUR278載體中HIC-1編碼序列可連接到載體的lacZ編碼區(qū)框中，以產(chǎn)生雜種-lacZ蛋白；pIN載體(Inouyt&Inouye，核酸研究，133101-3109，1985；Van Heeke&Shuster，生物化學(xué)雜志2645503-5509 1989)；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等。
在酵母中，可用許多含組成性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的載體。綜述見，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，第2卷，1988，Ed，Ausubel，等，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience；Ch.13；Grant等，1987，酵母的表達(dá)和分泌載體，發(fā)表在酶學(xué)方法，Eds，Wu&Grossman，31987，Acad，Press.N.Y.，Vol153，pp.516-544；Glover，1986，DNA克隆，Vol.II，IRL Press，Wash.D.C.Ch.3；和Bitter，1987，異源基因在酵母中表達(dá)，酶學(xué)方法，編輯，Berger&Kimmel，Acad.Press.N.Y.Vol.152，pp.673-684；及酵母屬的分子生物學(xué)，1982，Eds.Strathern，等，冷泉港出版社，VolsI和II?？捎媒M成性酵母啟動(dòng)子如ADH或LEU2或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子如GAL(酵母克隆，Ch.3，R.RothsteinDNA克隆，第11卷，實(shí)用方法，Ed.DM Glover，1986，IRL Press，Wash.，D.C.)?？晒┻x擇的有，可用載體促進(jìn)外源DNA序列整合到酵母染色體中。
在用植物表達(dá)載體的下，HIC-1編碼序列的表達(dá)可由許多啟動(dòng)子的任一個(gè)驅(qū)動(dòng)。例如，可用病毒啟動(dòng)子如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動(dòng)子(Brisson等，自然310511-514，1984)，或針對TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子(Takamatsu等，EMBO J.6307-311，1987)；可供選擇的有，可使用植物啟動(dòng)子如RUBISCO的小亞單位(Coruzzi等，EMBO J.31671-1680，1984；Broglie等，科學(xué)224838-843，1984)；或熱休克啟動(dòng)子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley，等，分子細(xì)胞生物學(xué)6559-565，1986)。這些構(gòu)建體能用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化，顯微注射，電穿孔等方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中。這些技術(shù)的綜述見，例如，Weissbach&Weissbach，1988，植物分子生物學(xué)方法，Academic Press，NY VIII節(jié)，pp421-463；和Grierson&Corey，1988，植物分子生物學(xué)，2d Ed.Blackie，倫敦，Ch.7-9。
能用于表達(dá)的選擇性表達(dá)系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在這樣的一個(gè)系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)用作載體表達(dá)外源基因。該病毒生長在草地夜蛾的細(xì)胞中。HIC-1編碼序列可克隆到病毒非必需區(qū)(如多角體蛋白基因)中，置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)控制之下。HIC-1編碼序列的成功插入會(huì)導(dǎo)致多角體蛋白基因的失活，產(chǎn)生非閉合重組病毒(即，病毒缺乏由多角體蛋白基因編碼的蛋白外殼)。然后這些重組病毒用于感染插入基因在其中表達(dá)的草地夜蛾細(xì)胞(例如，見Smith，等，1983，病毒學(xué)雜志，46584U.S.Simth專利號(hào)4,215,051)。
真核生物系統(tǒng)，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)允許表達(dá)的哺乳動(dòng)物蛋白發(fā)生適當(dāng)?shù)姆g后修飾。擁有初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的適當(dāng)加工、糖基化、磷酸化和有利于基因產(chǎn)物分泌的細(xì)胞內(nèi)機(jī)構(gòu)的真核細(xì)胞，可用作宿主細(xì)胞表達(dá)HIC-1。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是優(yōu)選的。上述宿主細(xì)胞系可包括但不局限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、-293和WI38。
用于重組病毒或病毒元件以指導(dǎo)表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)可工程化處理。例如，當(dāng)使用腺病毒表達(dá)載體時(shí)，HIC-1編碼序列可連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/-翻譯控制復(fù)合體，例如，晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列上。然后這種嵌合基因通過體內(nèi)或體外重組插入到腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)(如E1或E3區(qū))插入會(huì)產(chǎn)生有活性的重組病毒，能在感染宿主中表達(dá)蛋白(如見Logan&Shenk，美國國家科學(xué)院院報(bào)，813655-3659，1984)?？晒┻x擇的是使用痘苗病毒7.5k啟動(dòng)子(如見Mackett，等，1982，美國國家科學(xué)院院報(bào)，797415-7419；Mackett，等，病毒學(xué)雜志，49857-864，1984；Panicali等，美國國家科學(xué)院院報(bào)794927-493 1，1982)。特別有趣的是依賴能作染色體外因子復(fù)制的牛乳頭瘤病毒的載體(Sarver，等，分子細(xì)胞生物學(xué)1486 1981)。這種DNA進(jìn)行小鼠細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)，每細(xì)胞質(zhì)粒復(fù)制了約100～200拷貝。插入的cDNA轉(zhuǎn)錄不需要質(zhì)粒整合到宿主染色體上，因而產(chǎn)生高水平表達(dá)。這些載體通過包括在質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記，如neo基因，能用于穩(wěn)定表達(dá)?？晒┻x擇的是，反轉(zhuǎn)錄病毒基因組能被修飾用作載體，能在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入和指導(dǎo)HIC-1基因的表達(dá)(Cone&Mulligan，美國國家科學(xué)院院報(bào).816349-6353，1984)。高水平表達(dá)也可用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子獲得，包括但不局限于金屬硫蛋白IIA啟動(dòng)子和熱休克啟動(dòng)子。
為重組蛋白的長期高產(chǎn)量的生產(chǎn)，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。不用含病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞能用由合適的表達(dá)控制元件(如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷化位點(diǎn)等)和可選擇的標(biāo)記控制的HIC-1 cDNA轉(zhuǎn)化。在重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記授與對選擇的抗性，允許細(xì)胞穩(wěn)定地整合質(zhì)粒到其染色體上，生長形成依次被克隆的轉(zhuǎn)化灶，擴(kuò)大成細(xì)胞系。例如，接外源DNA導(dǎo)入后，工程細(xì)胞可允許在加富培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)換到選擇性培養(yǎng)基中。可用許多選擇系統(tǒng)，包括但不局限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，等，細(xì)胞，11223，1977)，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖苷轉(zhuǎn)移酶(Szybalska&Saybalski，美國國家科學(xué)院院報(bào)，482026，1962)，和分別能用于tk-、hgprt或ap-rt細(xì)胞細(xì)胞的腺嘌呤磷酸核糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy，等，細(xì)胞，22817，1980)。另外，抗代謝物抗性能用作如下基因的選擇基礎(chǔ)，dhfr基因賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler，等，Natl.Acad.Sci.USA，773567，1980；O’Hare，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，781527，1981)；gpt基因?qū)γ狗铀嵊锌剐?Mulligan&Berg，美國國家科學(xué)院院報(bào)，782072，1981)；neo基因?qū)Π被擒誈-418有抗性(Colberre-Garapin，等，分子生物學(xué)雜志，1501，1981)；和hygro基因賦予對潮霉素的抗性(Santerre，等，基因，30147，1984)。最近，描述了另外的選擇性基因，即允許細(xì)胞用吲哚代替色氨酸的trp B；允許細(xì)胞用histinol代替組氨酸的HisD(Hartman&Mulligan，美國國家科學(xué)院院報(bào)，858047，1988)；賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑，2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸，DFMO(McConlogue L.，1987，分子生物學(xué)現(xiàn)代通訊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，ed)抗性的ODC(鳥氨酸脫羧酶)。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主是原核生物，如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞從指數(shù)生長期后收獲細(xì)胞，接著自CaCl2法處理制備，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是能用MgCl2或RbCl。如果需要，轉(zhuǎn)化也能形成宿主細(xì)胞原生質(zhì)體后進(jìn)行。
當(dāng)宿主是真核生物，可用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法，磷酸鈣共沉淀，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝質(zhì)粒插入或病毒載體。真核細(xì)胞也能用編碼本發(fā)明的HIC-1的DNA序列，和編碼選擇性表型如單純皰疹胸苷激酶基因的第二個(gè)外來的DNA分子共轉(zhuǎn)化。另-個(gè)方法是使用真核生物病毒載體，如猴病毒40(SV40)或牛乳頭瘤病毒，瞬時(shí)感染或轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，表達(dá)蛋白(見實(shí)例，真核生物病毒載體，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Gluzman編，1982)。
由本發(fā)明提供的微生物或宿主細(xì)胞表達(dá)多肽或其片段的分離和純化，可用常用方法進(jìn)行，包括制備性層析法和涉及單克隆抗體或多克隆抗體的親和及免疫學(xué)分離法。
本發(fā)明包括和HIC-1多肽(SEQ ID NO3)起免疫反應(yīng)的抗體或其免疫反應(yīng)的片段。提供了基本上由所收集的有不同表位特征的單克隆抗體組成的抗體和不同的單克隆抗體制品。單克隆抗體通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從含該蛋白片段的抗原制得(Kohler，等，自然，256495，1975)。在本發(fā)明中所用的術(shù)語抗體的意思包括完整分子和其片段，如能結(jié)合HIC-1上表位決定簇的Fab和F(ab′)2。
本發(fā)明也提供檢測在一受試者中和HIC-1有關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)的方法，包括用一種反應(yīng)或結(jié)合HIC-1的試劑，接觸懷疑有與HIC-1相關(guān)失調(diào)的靶細(xì)胞組分并檢測HIC-1。靶細(xì)胞組分可能是核酸，如DNA或RNA，或可能是蛋白。當(dāng)組分是核酸時(shí)，典型的試劑是核酸探針或PCR引物。當(dāng)細(xì)胞組分是蛋白時(shí)，典型的試劑是抗體探針。靶細(xì)胞組分可直接原位檢測，或和探針接觸前從其它細(xì)胞組分用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的普通方法分離(見例如，Maniatis，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，1989；分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，1994，Ed.Ausubel.等，Greene Publ.Assoc&Wiley Intercience)。檢測方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA和RNA印跡分析，RNaes保護(hù)，免疫分析和其它檢測法。
探針能檢測性標(biāo)記，如用同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員會(huì)知道結(jié)合到探針上的其它合適標(biāo)志，或能用日常實(shí)驗(yàn)確定上述標(biāo)志。
由于本發(fā)明顯示HIC-1轉(zhuǎn)錄水平降低常是HIC-1基因過度甲基化的結(jié)果，直接測定是否HIC-1基因過度甲基化常是合乎需要的。尤其是位于基因5′調(diào)節(jié)區(qū)稱為“CpG島”的富含胞嘧啶區(qū)，一般情況下非甲基化。術(shù)語“過度甲基化”包括在HIC-1基因序列中一般情況下非甲基化的胞嘧啶的任何甲基化，甲基化能通過HIC-1多核苷酸(基因)的限制性核酸內(nèi)切酶處理和例如DNA印跡分析檢測。因而在本發(fā)明的一個(gè)方法中，當(dāng)檢測的細(xì)胞組分是DNA時(shí)，優(yōu)選的限制性核酸內(nèi)切酶分析是檢測HIC-1基因的過度甲基化。能用的任一種限制性核酸內(nèi)切酶，是其識(shí)別位點(diǎn)部分包括CG，當(dāng)C被甲基化時(shí)其活性被抑制的種類。上述核酸內(nèi)切酶的實(shí)例是甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶如BssHII，MspI，NotI或HpaII單獨(dú)或結(jié)合使用。其它甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶會(huì)被本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知。此外，PCR能用于檢測HIC-1基因的甲基化狀態(tài)。基于HIC-1序列中任何編碼序列區(qū)的寡核苷酸引物能用于PCR擴(kuò)增DNA。
作為本發(fā)明的目的，特異針對HIC-1的抗體或核酸探針可用于檢測在生物學(xué)液體或組織中存在HIC-1多肽(用抗體)或多核苷酸(用核酸探針)。基于在HIC-1序列中任何編碼序列區(qū)的寡核苷酸引物能用于擴(kuò)增DNA，如用PCR法?？捎糜谌魏魏蓹z測量的HIC-1多核苷酸或HIC-1多肽抗原的樣本。核苷酸也能用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的原位RNA法分析。本發(fā)明優(yōu)選的樣品是心臟組織、腎、腦、結(jié)腸、乳腺、泌尿生殖組織、子宮、造血組織、前列腺、胸腺、肺、睪丸和卵巢。優(yōu)選的受試者是人。
通過本發(fā)明的方法能檢測的各種失調(diào)包括星形細(xì)胞瘤、退行性星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
本發(fā)明方法中所用的單克隆抗體適用于如在免疫測定中，用于液相或結(jié)合到固相載體上。此外，在這些免疫測定中的單克隆抗體能以各種方法檢測性地標(biāo)記。能用本發(fā)明單克隆抗體的免疫測定法類型的實(shí)例是以直接或間接形式的競爭性和非競爭性免疫測定法。上述免疫測定法的實(shí)例是放射免疫測定法(RIA)和三明治(免疫測量的)測定法。用本發(fā)明的單克隆抗體檢測抗原能用以正向、反向或同時(shí)模式進(jìn)行的免疫測定法操作，包括對生理學(xué)樣品的免疫組化測定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不用過多的實(shí)驗(yàn)，會(huì)知道或能容易地辨別其它免疫測定形式。
術(shù)語“免疫測量測定法”或“三明治免疫測定法”包括同時(shí)三明治、正向三明治和反向三明治免疫測定法。這些術(shù)語本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全明白。技術(shù)人員也會(huì)意識(shí)到根據(jù)本發(fā)明，在其它變化方法和目前已知的或?qū)戆l(fā)展的測定方式中，抗體是有用的。這些趨向包括在本發(fā)明的范圍之中。
單克隆抗體能結(jié)合到許多不同的載體上，用于檢測HIC-1的存在。熟知的載體實(shí)例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、支鏈淀粉、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁性材料。載體的性質(zhì)針對本發(fā)明的目的是可溶或不可溶的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道其它合適的載體結(jié)合單克隆抗體，或能用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定上述方法。
在進(jìn)行測定時(shí)，可能合乎需要的是在溫育介質(zhì)中包括某些“阻斷劑”(通常加標(biāo)記過的可溶性抗體)。加“阻斷劑”以確認(rèn)非特異的蛋白、蛋白酶或?qū)Υ嬖谟趯?shí)驗(yàn)樣品中抗HIC-1免疫球蛋白的抗異嗜性免疫球蛋白不會(huì)交聯(lián)，或不毀壞在固相支持物上的抗體或同位素標(biāo)記的指示抗體，而產(chǎn)生假陽性或假陰性的結(jié)果。因而“阻斷劑”的選擇基本上可加到本發(fā)明所述的測定特異性中。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多在測定中所用的那些同類或亞類(同種型)的無關(guān)(即非特異)抗體(如，IgG1、IgG2a、TgM、等)能用作“阻斷劑”?！白钄鄤钡臐舛?一般1-100μg/μl)是重要的，以便維持合適的敏感性，而通過相互在樣本中發(fā)生的互相反應(yīng)蛋白抑制任何非所需的干擾。
在用單克隆抗體體內(nèi)檢測抗原時(shí)，給出的可檢測的標(biāo)記單克隆抗體是診斷有效劑量。術(shù)語“診斷有效的”意指用檢測標(biāo)記單克隆抗體的量為足夠量，能檢出單克隆抗體特異的具有HIC-1抗原的位點(diǎn)。所用的可檢測的標(biāo)記單克隆抗體的濃度應(yīng)該是足夠的，結(jié)果與背景相比較，對有HIC-1的那些細(xì)胞的結(jié)合是可檢測的。此外，為了給出最好的靶物對背景的信號(hào)比，可檢測的標(biāo)記單克隆抗體從循環(huán)系統(tǒng)快速清除是合乎需要的。
作為一個(gè)原則，體內(nèi)診斷用的可檢測性標(biāo)記單克隆抗體的劑量是將根據(jù)諸如年齡、性別、和個(gè)體疾病程度的因素而變化。單克隆抗體的劑量可從約0.001mg/m2～約500mg/m2變化，優(yōu)選的是0.1mg/m2～約200mg/m2，最優(yōu)選的約0.1mg/m2～約10mg/m2。例如，上述劑量可根據(jù)是否進(jìn)行了多次注射，是否帶腫瘤和本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它因素而變化。
為體內(nèi)診斷成像，可用的檢測儀器類型是選擇特定的放射性同位素的主要因素。所選的放射性同位素必須具有對儀器特定類型可檢測的衰變類型。選擇體內(nèi)診斷的放射性同位素還有另一個(gè)重要因素是放射性同位素的半衰期，其足夠長在靶物最大吸收的時(shí)間點(diǎn)上仍可檢測，其足夠短以使關(guān)系到宿主的損害性輻射降低到最低程度。理想的用于體內(nèi)成像的放射性同位素缺乏粒子發(fā)射，但產(chǎn)生大量的在140-250keV范圍的質(zhì)子，可方便地通過普通的γ照像機(jī)檢測。
作體內(nèi)診斷，放射性同位素通過用中間介導(dǎo)性的官能基直接或間接地結(jié)合到免疫球蛋白上。常用的結(jié)合以金屬離子存在的使放射性同位素到免疫球蛋白上的中間介導(dǎo)功能性基團(tuán)是雙功能螯合劑如三亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)及相似分子。能結(jié)合到本發(fā)明單克隆抗體上的金屬離子的典型實(shí)例是“111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr和201Tl。
本發(fā)明方法中用的單克隆抗體也能標(biāo)記順磁同位素，目的作磁共振成像(MRI)或電子自旋共振(ESR)的體內(nèi)診斷。一般來說，能用任何顯現(xiàn)診斷影像的常規(guī)方法。通常發(fā)射γ和正電子的放射性同位素用于照相機(jī)影像和作MRI的順磁同位素。特別用于上述技術(shù)的元素包括157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、和56Fe。
本發(fā)明也提供一種治療和HIC-1有關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)的受試者的方法，包括給失調(diào)的受試者服用治療有效量的調(diào)節(jié)HIC-1表達(dá)的藥物。例如，在腦、乳腺和腎癌細(xì)胞中，HIC-1核苷酸序列與在正常細(xì)胞中表達(dá)相比是低表達(dá)的、因而有可能針對該序列設(shè)計(jì)合適的治療或診斷技術(shù)。這樣，哪里細(xì)胞增殖失調(diào)與惡性相關(guān)的HIC-1表達(dá)有聯(lián)系，哪里就能用在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)節(jié)HIC-1表達(dá)的核酸序列。例如在細(xì)胞增殖失調(diào)和異常細(xì)胞表型和HIC-1低表達(dá)相關(guān)的情況下，編碼HIC-1的核酸序列(有義)能給失調(diào)的受試者服用。
術(shù)語“細(xì)胞增殖失調(diào)”表示惡性和非惡性細(xì)胞群體，常顯得在形態(tài)學(xué)和遺傳類型上與周圍組織不同。例如，上述失調(diào)可能和缺乏HIC-1的表達(dá)有關(guān)。大體來說，任何病因?qū)W上與HIC-1表達(dá)有聯(lián)系的失調(diào)可考慮容易受本發(fā)明調(diào)節(jié)HIC-1表達(dá)的藥劑治療。
術(shù)語“調(diào)節(jié)”設(shè)想當(dāng)HIC-1低表達(dá)時(shí)抑制HIC-1多核苷酸的甲基化。當(dāng)細(xì)胞增殖失調(diào)和HIC-1表達(dá)相關(guān)時(shí)，如5-氮雜胞苷的甲基化抑制試劑可導(dǎo)入到細(xì)胞中?？晒┻x擇的是，當(dāng)細(xì)胞增殖失調(diào)和HIC-1多肽的低表達(dá)相關(guān)時(shí)，編碼HIC-1多肽的有義多核苷酸序列(DNA編碼鏈)，或和HIC-1多核苷酸操縱性連接的HIC-15′調(diào)節(jié)核苷酸序列(即，啟動(dòng)子)可導(dǎo)入到細(xì)胞中。本領(lǐng)域已知的脫甲基酶也能用于移去甲基化。
本發(fā)明也提供治療由HIC-1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖失調(diào)的基因治療。通過導(dǎo)入合適的含HIC-1結(jié)構(gòu)基因(有義)的HIC-1多核苷酸到具增殖失調(diào)的受試者細(xì)胞中，上述療法會(huì)獲得其療效。用如嵌合病毒的重組表達(dá)載體或膠體分散系統(tǒng)，能獲得有義HIC-1多核苷酸構(gòu)建體的傳送。
用于本發(fā)明方法中的多核苷酸序列可能是天然的非甲基化的序列，或供選擇的在序列中被不能甲基化類似物取代的序列。優(yōu)選的類似物是胞苷不能甲基化類似物如5-氮雜胞苷。其它類似物會(huì)被本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解?？晒┻x擇的是，上述不能甲基化的類似物能作治療藥物，單獨(dú)或同時(shí)與HIC-1的有義結(jié)構(gòu)基因或操縱性地與HIC-1結(jié)構(gòu)基因連接的HIC-1有義啟動(dòng)子，給受試者服用。
在另一實(shí)施方案中，HIC-1結(jié)構(gòu)基因操縱性地與一組織特異性的異源性啟動(dòng)子相連，用于基因治療。例如，HIC-1基因能連接到前列腺特異抗原(PSA)-前列腺特異啟動(dòng)子上，使HIC-1在前列腺組織中表達(dá)。其它組織特異的啟動(dòng)子會(huì)被本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解?？晒┻x擇的是，另一個(gè)腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子能連接到HIC-1結(jié)構(gòu)基因上，用于基因治療。
在此談的用于基因治療的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘苗或更優(yōu)選的是RNA病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選的反轉(zhuǎn)錄載體是鼠或鳥類反轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。單個(gè)外來基因能插入反轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括但不局限于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳頭瘤病毒和勞斯肉瘤病毒(RSV)。最優(yōu)選的是使用非人的靈長類反轉(zhuǎn)錄載體，如長臂猿白血病病毒(GaLV)，因而提供比如鼠載體更寬的宿主范圍。
許多附加的反轉(zhuǎn)錄載體能摻入許多基因。所有這些載體能轉(zhuǎn)移或摻入一個(gè)選擇標(biāo)記基因，結(jié)果轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞能被識(shí)別和產(chǎn)生。通過插入如編碼糖、糖脂或蛋白的多核苷酸，反轉(zhuǎn)錄病毒載體能制成具靶物特異性。優(yōu)選的靶向用靶向反轉(zhuǎn)錄病毒載體的抗體完成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不用過多的實(shí)驗(yàn)會(huì)知道或容易確認(rèn)能插入反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的特異多核苷酸序列，以允許含HIC-1有義或反義多核苷酸的反轉(zhuǎn)錄病毒載體靶物特異性傳送。
由于重組反轉(zhuǎn)錄病毒有缺陷，為產(chǎn)生感染性的載體粒子它們需要幫助。例如在LTR中調(diào)節(jié)序列控制下，通過用含編碼全部反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒的輔助細(xì)胞系，能提供這種幫助。這些質(zhì)粒缺失能使包裝機(jī)制為衣殼化識(shí)別RNA轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列。有包裝信號(hào)缺失的輔助細(xì)胞系包括但不局限于如Ψ2、PA317和PA12。這些細(xì)胞系產(chǎn)生空病毒粒子，因?yàn)闆]有包裝基因組。如果反轉(zhuǎn)錄病毒載體被導(dǎo)入包裝信號(hào)是完整的上述細(xì)胞中，但結(jié)構(gòu)基因被感興趣的其它基因取代，載體能被包裝，產(chǎn)生載體病毒粒子。
另一個(gè)作HIC-1多核苷酸靶向傳送系統(tǒng)是膠體分散系統(tǒng)。膠體分散系統(tǒng)包括大分子復(fù)合物、毫微型囊、微球、珠和包括水油乳劑、微膠粒、混合微膠粒和脂質(zhì)體的基于脂質(zhì)的系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選的膠質(zhì)系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是體外和體內(nèi)有用的作傳送載體的人工膜泡。已表明體積范圍從0.2-0.4μm的大單室泡(LUV)能包囊大量百分率的含較大大分子的水相緩沖液。RNA、DNA和完整病毒粒子能包囊在內(nèi)部水之中，傳送到處生物學(xué)活性態(tài)的細(xì)胞上(Fraley等，生物化學(xué)科學(xué)動(dòng)態(tài)677，1981)。除了哺乳動(dòng)物細(xì)胞，脂質(zhì)體被用于在植物、酵母和細(xì)菌細(xì)胞中多核苷酸的傳送。為使脂質(zhì)體成為有效的基因轉(zhuǎn)移載體，應(yīng)具備如下特征(1)感興趣的基因高效率地包囊而不損害它們的生物學(xué)活性；(2)與非靶細(xì)胞比較，優(yōu)先和基本上結(jié)合到靶細(xì)胞上；(3)高效率地傳送載體水相內(nèi)含物到靶細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中；(4)遺傳信息準(zhǔn)確有效的表達(dá)(Mannino，等，生物技術(shù)，6682，1988)。
脂質(zhì)體的組成通常是磷脂組合，尤其是高相轉(zhuǎn)變溫度脂質(zhì)體，一般和類固醇特別是膽固醇結(jié)合。也可用其它磷脂或其它脂類。脂質(zhì)體的物理特性依賴于pH、離子強(qiáng)度和二價(jià)陽離子的存在。
用于脂質(zhì)體生產(chǎn)的脂類實(shí)例包括磷脂?；衔?，如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂類、腦苷脂類和神經(jīng)節(jié)苷脂。特別有用的是雙乙酰磷脂酰甘油，其脂部分含14-18碳原子，尤其含16-18的碳原子，脂部分是飽和的。用作說明的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。
脂質(zhì)體的靶向依據(jù)解剖和機(jī)制因素分類。解剖學(xué)分類依據(jù)選擇性水平，如器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性。機(jī)制靶向依據(jù)是被動(dòng)還是主動(dòng)予以區(qū)別。被動(dòng)靶向應(yīng)用脂質(zhì)體的自然屬性，分配到器官內(nèi)含竇狀隙毛細(xì)血管的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞上。另一方面，主動(dòng)靶向涉及脂質(zhì)體的改變，使脂質(zhì)體與特異配基如單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白偶聯(lián)，或改變脂質(zhì)體的組成或體積，以獲得靶向到器官和細(xì)胞類型而不是天然存在的定位點(diǎn)。
靶向的傳送系統(tǒng)表面可用種種方法修飾。在脂質(zhì)體靶向傳送系統(tǒng)的情況中，脂基團(tuán)能摻入到脂質(zhì)體脂雙層中，以穩(wěn)定靶向配基穩(wěn)定地與脂質(zhì)體雙層相連。各種連接基團(tuán)能用于把脂鏈連接到靶向配基上。
一般來說，結(jié)合到靶向傳送系統(tǒng)表面的化合物，可能是允許靶向的傳送系統(tǒng)尋找和“尋的”(“home in”)所需細(xì)胞的配基和受體。配基可以是感興趣的任何化合物，能結(jié)合到如受體的另一種化合物上。
一般來說，結(jié)合到特異效應(yīng)分子上的表面膜蛋白稱為受體。在本發(fā)明中，抗體是優(yōu)先的受體。抗體能用于靶向脂質(zhì)體到特異的細(xì)胞表面配基上。例如特異地在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)稱為腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的某些抗原，可以開發(fā)以直接靶向含HIC-1抗體的脂質(zhì)體到惡性腫瘤中。由于HIC-1基因產(chǎn)物不能辨別其作用的細(xì)胞類型，靶向的傳送系統(tǒng)提供了對隨機(jī)注射非特異脂質(zhì)體的顯著改善。優(yōu)選的靶組織是人腦、結(jié)腸、乳腺、肺和腎起源的組織。許多方法能用于多克隆或單克隆抗體共價(jià)連接到脂質(zhì)體雙層中?？贵w靶向的脂質(zhì)體可包括單克隆或多克隆膠體或其片段如Fab或F(ab′)2，只要它們有效地結(jié)合到靶細(xì)胞的抗原表位上。脂質(zhì)體也可靶向到表達(dá)激素或其它血清因子受體的細(xì)胞上。
為用于上面提到的診斷研究和治療應(yīng)用，本發(fā)明也提供了試劑盒。上述的試劑盒包括劃分為幾部分的一個(gè)承載裝置，以緊密地放一或多個(gè)容器如小瓶、管等，容器具的每一個(gè)包括用于本方法的不同組分之一。
例如，容器之一可包括是或能檢測性標(biāo)記的探針。上述探針可分別特異地針對靶蛋白或靶核酸的抗體或核苷酸，其中靶物指示本發(fā)明的HIC-1存在，或與其有關(guān)。試劑盒用于核酸雜交檢測靶核酸的地方，試劑盒也可有含用于擴(kuò)增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或一個(gè)包括報(bào)告工具的容器，如生物素結(jié)合蛋白，如結(jié)合到報(bào)告分子上的親和素或鏈霉親和素，報(bào)告分子有如酶、florescent或放射性核苷酸標(biāo)記物。
通過檢測異常核苷酸的甲基化，尤其是檢測在頻繁等位缺失區(qū)域的CpG島過度甲基化，本發(fā)明也提供一種辨認(rèn)腫瘤抑制基因的方法。本發(fā)明顯示正常非甲基化CpG島的異常甲基化能作“突變”功能，以在腫瘤發(fā)展過程中沉默(silence)腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄。17p.13.3過度甲基化的發(fā)生似乎與在腦、結(jié)腸和腎癌發(fā)展中，這些等位基因缺失的時(shí)間和發(fā)生率相關(guān)。本發(fā)明已表明該CpG島包含被異常甲基化沉默的腫瘤抑制HIC-1基因。換句話說，上述CpG島的辨認(rèn)構(gòu)成分離新腫瘤抑制HIC-1基因的一個(gè)重要策略。因此，經(jīng)常出現(xiàn)腫瘤相關(guān)的等位基因缺失大致定為候選腫瘤抑制區(qū)的染色體區(qū)中，找到該異常能有利于反應(yīng)基因的定位。用于檢測異常核酸甲基化的普通方法在本領(lǐng)域中已眾所周知，為了實(shí)施本發(fā)明本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能相應(yīng)地應(yīng)用那些方法之一。
下列實(shí)施例意圖是說明，而不是限制本發(fā)明。雖然這些實(shí)施例是典型的可應(yīng)用的實(shí)例，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法也可選擇使用。
實(shí)施例HIC-1表達(dá)在正常成年組織中是普遍的。可是，在培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞和表現(xiàn)出與CpG島過度甲基化相關(guān)的原發(fā)癌中，HIC-1表達(dá)降低或或缺乏。例如，在具有CpG島過度甲基化的腫瘤包括肺、結(jié)腸、乳腺和腦腫瘤中，HIC-1表達(dá)缺乏。該表達(dá)類型與HIC-1的腫瘤抑制基因功能一致。
實(shí)施例1材料和方法1.粘粒DNA的亞克隆通過在瓊脂糖凝膠上分離多種限制性片段和連接這些片段到pBluescript質(zhì)粒中(Stratagene)，制備粘粒C13A DNA的亞克隆(圖1A)。
2.DNA測序首先質(zhì)粒DNA在有75μg/ml氨芐青霉素的2×YT肉湯中在存在107-108pfu/ml的VCSM13(Stratagene)(輔助噬菌體)下生長2小時(shí)，分離單鏈DNA。分離后，DNA用GIBCO BRL循環(huán)測序試劑盒測序。大體來說，22個(gè)堿基對引物末端標(biāo)記γ-32p，循環(huán)條件是95℃1個(gè)循環(huán)，接著是95℃10秒和65℃10秒的20個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在10％丙烯酰胺/8M尿素凝膠上分析。
3.DNA和RNA雜交分離DNA和polyA+RNA的方法，走瓊脂糖凝膠的條件，探針的α32p標(biāo)記，膜雜交和漂洗條件前已所述(Baylin S.B.等，癌細(xì)胞，3383-390，1991；Jones，P.A.，等，癌癥研究，541-23，1990；Herman，J.G.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，印刷中，1994；Ottaviano，Y.L.等，癌癥研究，542552-2555，1994；Issa，J-P.，等，自然遺傳學(xué)，印刷中；Steenman，M.J.C.，等，自然遺傳學(xué)，7433-439，1994；和Gish，W.等，自然遺傳學(xué)，3266-272，1993)。放射自顯影照片在-70℃曝光不同時(shí)間，或者在磷影像機(jī)盒中接著曝光，用磷影像機(jī)(phosphoimager)Image Quant程序(分子動(dòng)力學(xué))分析。用T3或T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄圖1 A所示在不同粘粒亞克隆中的DNA插入片段，完成用于某些RNA雜交的單鏈、α-32P標(biāo)記的RNA探針的制備。
4.RNAse保護(hù)分析從各種粘粒亞克隆(圖1A)中制備α-32p標(biāo)記的RNA探針，與RNA樣本液相雜交和RNAse的雜交后消化，均用Ambion MAXIscript和RPAII試劑盒按廠家的說明操作。大體來說，8×104cpm探針與10μg總RNA在45℃雜交12-15h。RNAse消化的產(chǎn)物在6％丙烯酰胺/8M尿素凝膠中分析。雜交探針的長度由質(zhì)粒插入DNA的不同限制切口的位置決定。為估計(jì)RNA上樣量，由HincII限制酶消化制備250bp的GAPDH探針，該探針在全部反應(yīng)液中與RNA共雜交。
5.外顯子陷阱法(trapping)外顯子陷阱法用GIBCO BRL外顯子陷阱系統(tǒng)，按每個(gè)廠家的方案在亞克隆26(圖1A)上進(jìn)行。
6.細(xì)胞培養(yǎng)和組織樣本正常人成纖維細(xì)胞系WI-38和IMR-90及結(jié)腸癌細(xì)胞系，CaCO2從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC，Rockville，MD)。人小細(xì)胞肺癌NCI-H209系前已描述(Carney，D.N.，等，癌癥研究新近結(jié)果，99157-166，1985)。所有建成的乳腺癌細(xì)胞系如圖5詳示，用于最近的研究中(Herman，J.G.，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)919700-9704，1994)，由Nancy Davidson博士惠贈(zèng)。組成正常供體成纖維細(xì)胞系GM229和纖維肉瘤細(xì)胞HT1080系的腫瘤進(jìn)展細(xì)胞融合系統(tǒng)，加上其融合產(chǎn)物，SFTH300和SFTH300 TR1，是來自B.Weismann博士的禮物。所有新鮮的，非培養(yǎng)的正常和腫瘤人組織樣品按前述方法獲得(Herman，J.G.等，同前；Ottaviano，Y.L.，等，同前；Issa，J-P，同前；Steeman，M.J.C.，等，同前；和Gish，W.，等，同前)
實(shí)施例2新腫瘤抑制基因的鑒定為表示包圍異常甲基化的CpG島區(qū)域的特性，從前已顯示在腫瘤中含敏感NotI位點(diǎn)過度甲基化的甲基化簇的17p粘粒C-13A(Ladbetter，D.H.，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，865136，1989；El-Deiry，W.S.，等，自然遺傳學(xué)，145-49，1992；Kern，S.E.，等，科學(xué)，2521708，1991；Funk，W.D.，等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，122866，1992)，制備一系列亞克隆(圖1A)。用這些作探針進(jìn)行“游動(dòng)印跡”“Zoo blots”，找到三個(gè)區(qū)域(圖1A質(zhì)粒CI，CII和400)，在嚴(yán)格條件下，這些區(qū)域能與牛和鼠DNA中限制性片段雜交。由于這些探針與人DNA和cDNA文庫的高非特異雜交，可能由于該區(qū)的高GC含量，傳統(tǒng)的部位克隆方法受到妨礙。因此，大多數(shù)11kb區(qū)(圖1A)被測序，通過Grail計(jì)算機(jī)程序(Gish，W.，等，D.J.，自然遺傳學(xué)，3266，1993)分析。
圖1是顯示粘粒C-13A的11.0kb區(qū)域的圖解，粘粒C-13A含有前已表明在多種腫瘤類型中具有過度甲基化的染色體經(jīng)17p13.3區(qū)的50kb人DNA插入片段(Makos，M.，等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，891929，1992；Makos，M.，等，癌癥研究，532715，1993；Makos，M.，等，癌癥研究，532719，1993)。顯示YN22探針的位置，EcoRI(E)限制性位點(diǎn)和一系列制備跨越該區(qū)的粘粒亞克隆的定位。
圖1B是發(fā)現(xiàn)HIC-1基因包括在圖1A所顯示的區(qū)域中的HIC-1基因的圖解，而其氨基酸序列如圖2B所示。表示的是可能的p53結(jié)合位點(diǎn)；TATAA＝從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)40bp上游的TATA盒序列；5′UTR＝第一個(gè)不翻譯的外顯子；ATG＝多半為5′翻譯起點(diǎn)；ZIN(鋅指N-端)＝包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子Zin結(jié)構(gòu)域亞家族的高度保守區(qū)(圖2A)的478bp外顯子；具陰影線的長方形表示HIC-1的2015bp最后一個(gè)外顯子，每一個(gè)陰影條表示成簇位于基因3′區(qū)的5個(gè)鋅指(圖2B)之一；TAG＝HIC-1基因中翻譯終止位點(diǎn)；AATAAA＝從翻譯終止位點(diǎn)835bp找到的多腺苷化信號(hào)位點(diǎn)。圖1C顯示HIC-1的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列。
二個(gè)獨(dú)立極好的可能編碼區(qū)顯示在N3-N7NotI限制性位點(diǎn)之間(圖1A)。沖擊波程序(Al+Schul，S.F.，等，分子生物學(xué)雜志，215403，1990)分析顯示針對高度保守的稱為Zin(鋅指N端)結(jié)構(gòu)域的N端基序，在獨(dú)立區(qū)之一中有明顯有氨基酸同源性(圖1B和2A)，該基序存在于最近定義為鋅指轉(zhuǎn)錄因子的子集合的每一成員中Harrison和Travers，EMBO J9207，1990；di Bello，等，遺傳學(xué)，129385，1991；Numoto等，核苷酸研究213767，1993；Chardin，等，核酸研究191431，1991)。除了Zin結(jié)構(gòu)域，這些相同蛋白3′區(qū)特征性的5個(gè)Kruppel型Cys2-His2鋅指(Ruppert，J.M.，等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，83104-3113，1988)也被辨認(rèn)(圖1B和2B)。該新基因命名為HIC-1(在癌癥中過度甲基化)。
實(shí)施例3HIC-1的特征RNAse保護(hù)策略，外顯子陷阱法和研究和RNA印跡分析的結(jié)合用于HIC-1表達(dá)特征的描述，確定該基因的基因組結(jié)構(gòu)(圖1B和1C；SEQID NO1和2)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)確定在位于第一個(gè)非翻譯外顯子之前的TATA盒序列(圖1B)的40bp下游之中。假定性的ATG位點(diǎn)和Zin結(jié)構(gòu)域位于476bp的第二個(gè)外顯子中，與8種其它Zin結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)相比處相似的位置(圖2A)。5個(gè)鋅指(圖1B和2B)位于2015bp最后外顯子中、含有從多腺苷化信號(hào)，AATAAA，835bp上游的翻譯終止位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)與其它Zin結(jié)構(gòu)域蛋白相似的HIC-1基因(圖1C和2B)，被介于NotI位點(diǎn)N3和N7之間位于富CpG3.0kb區(qū)中的三個(gè)外顯子所包括(圖1)。
圖2A和SEQ ID NO2顯示HIC-1的氨基酸序列。HIC-1氨基酸序列與Zin結(jié)構(gòu)域鋅指家族其它成員的保守N端區(qū)比較。在圓括號(hào)中，數(shù)字表示相對于每一基因的翻譯起始位點(diǎn)的保守區(qū)位置。最黑的陰影表示9個(gè)蛋白中至少5個(gè)相同的氨基酸位置，較淺的陰影表示在家族成員之間保守性氨基酸差異的位置。D＝果蠅；M＝鼠；H＝人。在底部氨基酸的括號(hào)代表在其它家族成員該位置未找到的在HIC-1中的一個(gè)區(qū)域。
圖2B和SEQ ID NO3顯示HIC-1基因的整個(gè)編碼區(qū)。顯示了HIC-1的二個(gè)編碼外顯子的推導(dǎo)氨基酸序列，由概括在本文中的序列分析和表達(dá)策略確定。在3′半個(gè)蛋白中的5個(gè)鋅指由陰影盒顯示。
實(shí)施例4HIC-1基因表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn)HIC-1是普遍性表達(dá)的基因。通過來自多種正常組織的polyA+RNA的RNA分析，從HIC-1 Zin結(jié)構(gòu)域、鋅指區(qū)和包括多腺苷化位點(diǎn)的3′非翻譯區(qū)的探測，都識(shí)別相同的占優(yōu)勢的3.0kb轉(zhuǎn)錄本。圖3顯示HIC-1基因表達(dá)的RNA分析。S＝脾；The＝胸腺；P＝前列腺；Te＝睪丸；O＝卵巢；SI＝小腸；B＝外周血細(xì)胞。4.4kb標(biāo)記以上的帶和核糖體RNA共雜交。約1.1kb帶仍然未被確認(rèn)，但可能是一種替代性的剪接產(chǎn)物，因?yàn)橛脕碜訦IC-1的鋅指或3′非翻譯區(qū)的探針沒有檢出該帶。
圖4A顯示在各種正常和腫瘤的人組織中HIC-1基因表達(dá)的RNAse保護(hù)分析。在全部試驗(yàn)組中，頂部星號(hào)標(biāo)記未消化的360bp HIC-1基因RNA探針的位置，該探針衍生自粘粒亞克隆600中含鋅指的區(qū)域(圖1A)。被保護(hù)的HIC-1片段(300bp)標(biāo)記為HIC-1。圖4A用10μg總RNA比較下列細(xì)胞的表達(dá)，來自2個(gè)建成的正常人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)系(WI-38和IMR-90)與纖維肉瘤細(xì)胞HT1080培養(yǎng)系(Fibro-C)相比，來自3個(gè)不同的正常結(jié)腸樣品(結(jié)腸-N)與結(jié)腸癌細(xì)胞系CaCO2(結(jié)腸-C)相比，來自正常肺樣品(肺-N)與人小細(xì)胞肺癌建成系，NCI-H209(肺-C)相比。
圖4B顯示來自6種不同建成的乳腺癌培養(yǎng)系(1道MDA231；2道HS58T；3道MDA 468；4道T47D；5道MCF7；6道MDA453)的10μg RNA的RNAse保護(hù)分析，其中每道普遍有HIC-1 CpG島NotI位點(diǎn)的甲基化。圖4C顯示來自正常胎兒腦(B)與一組非培養(yǎng)腦瘤(1種退行性星形細(xì)胞瘤(AA)和8種更晚期的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(1-8道)的10μg RNA的RNAse保護(hù)分析。
在所有檢驗(yàn)的成年組織中，發(fā)現(xiàn)3.0kb轉(zhuǎn)錄本特別高水平的組織是肺、結(jié)腸、前列腺、胸腺、睪丸和卵巢(圖3)。用Zin結(jié)構(gòu)域探針，1.1kb的轉(zhuǎn)錄本也可在存在替代性剪接產(chǎn)物的一些組織中檢出(圖3)。用來自質(zhì)粒600的探針(圖1A)的RNase保護(hù)分析(RPAZ kit-Ambion)證實(shí)了HIC-1的普遍表達(dá)，保護(hù)在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(圖4A)和非培養(yǎng)的結(jié)腸粘膜(圖4A)、肺(圖4A)、和腦(圖4C)中預(yù)期大小的轉(zhuǎn)錄本。
通過RNAse保護(hù)分析，發(fā)現(xiàn)HIC-1表達(dá)在具有異常的HIC-1 CpG島甲基化的腫瘤細(xì)胞中缺乏或降低，在結(jié)腸、肺和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)癌細(xì)胞系中，前面均已顯示在NotI位點(diǎn)3-7完全甲基化，很少或沒有表達(dá)(圖4A)被檢測到。相同的發(fā)現(xiàn)在6種培養(yǎng)的乳腺癌中是真實(shí)的(圖4B)，所有細(xì)胞顯示NotI位點(diǎn)3-7的過度甲基化。
此外，在原發(fā)結(jié)腸腫瘤中，與相應(yīng)的正常結(jié)腸比較，HIC-1表達(dá)在一種非培養(yǎng)人結(jié)腸息肉和3種原發(fā)結(jié)腸腫瘤中降低了2～17倍。最后，在原發(fā)非培養(yǎng)腦瘤中發(fā)現(xiàn)的HIC-1表達(dá)缺乏是在顯示CpG島過度甲基化的腫瘤中。與正常腦相比較，一例顯示HIC-1 CpG島完全甲基化型的退行性星形細(xì)胞瘤不表達(dá)該基因(圖4C)。在4例可得到的DNA和RNA的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，2例弱表達(dá)HIC-1(圖4C，1道)或根本不表達(dá)(圖4C，4道)，有明顯的過度甲基化等位基因，而有非甲基化等位基因的2例表達(dá)基因的量水平與附近正常腦相等(圖4C，2和3道)。
對4例另外的得到其RNA的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤也進(jìn)行了研究。1例弱表達(dá)HIC-1(圖4C，5道)，1例沒有表達(dá)(圖4C，6道)及二例腫瘤表達(dá)了該基因(圖4C，7-8道)。
另外，通過如下DNA分析，HIC-1過度甲基化在幾種原發(fā)腫瘤和培養(yǎng)細(xì)胞系中進(jìn)行了分析。來自對照和24小時(shí)感染細(xì)胞用EcoRI(12U/μg DNA)加NotI(20U/μg)消化的DNA的DNA分析，正確按以前研究的詳細(xì)方法(Makos等，同前，1992，1993)用α-32P標(biāo)記的YNZ22(圖1A)探測。膜在磷影像機(jī)上(Molecular Dynamic)成像。表1顯示的結(jié)果表示在包括腦、結(jié)腸、腎、造血組織和前列腺癌和腫瘤的不同起源的多種腫瘤和細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)HIC-1處過度甲基化狀態(tài)。腫瘤和細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)HIC-1處過度甲基化狀態(tài)。
表1HIC-1在腫瘤和細(xì)胞系中過度甲基化原發(fā)腫瘤 培養(yǎng)細(xì)胞系腦瘤#甲基 ％ #甲基 ％低級(jí)星形細(xì)胞瘤 77100退形性星形細(xì)胞瘤5480多形成膠質(zhì) 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤8675 22100
#甲基 ％ #甲基％成神經(jīng)管細(xì)胞瘤 54 80結(jié)腸癌息肉 66 100癌 87 90癌6 7 85肺癌癌 50 0 癌1612 75腎癌早期 84 50晚期 32 67晚期 2116 80白血病淋巴瘤31 33淋巴瘤8 5 60CML/未成熟 87 87AML13 1080AML10 8 80乳腺癌癌 24 1562癌6 6 100前列腺癌癌 17 17100 癌5 4 80子宮內(nèi)膜癌癌 64 67成神經(jīng)細(xì)胞瘤早/晚期 12 2 16癌44100(甲基化量低)實(shí)施例5p53和HIC-1表達(dá)的相互作用與存在于17p13.3位的抑制基因可能和p53相互作用的假說相一致，本發(fā)明確認(rèn)在HIC-1基因中5′TATA盒的4kb位有一可能的p53結(jié)合位點(diǎn)(圖1B)。因此，HIC-1基因的p53反應(yīng)用結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480)測試，在該細(xì)胞系中p53反應(yīng)基因，WAF-1，前已表明被野生型p53的表達(dá)所誘導(dǎo)(EL-Deiry，等，細(xì)胞，75817-825，1993)。該細(xì)胞系含一條17p染色體、一個(gè)突變的p53等位基因和完全甲基化的HIC-1 CpG島。此外，細(xì)胞系SW480被外原表達(dá)的野生型p53基因嚴(yán)重地生長抑制(Baker，S.J.等，科學(xué)，249912-915，1990)。
圖5顯示含β-半乳糖苷酶基因或野生型p53基因轉(zhuǎn)染進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480系后，如圖4詳示的RNAse保護(hù)分析。(未感染的正常對照人成纖維細(xì)胞(F)，未感染的SW480細(xì)胞(U)，用β-半乳糖苷酶基因感染的SW480細(xì)胞(GAL)和用p53基因感染的SW480細(xì)胞(p53))。非消化的HIC-1和GAPDH探針的位置及HIC-1和GAPDH轉(zhuǎn)錄本的位置如圖4準(zhǔn)確地標(biāo)出。
在該細(xì)胞系中HIC-1僅低水平表達(dá)(圖5A-U)。當(dāng)野生型p53基因外源性地在SW480細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，與對照細(xì)胞相比(U和GAL)，HIC-1的表達(dá)水平上調(diào)20倍(圖5-p53)。這些結(jié)果表明腫瘤抑制基因p53直接或間接地活化HIC-1的表達(dá)。我們正在工作以證實(shí)該型作用。
實(shí)施例概述HIC-1在正常和腫瘤細(xì)胞中起重要作用。迄今為止至少4個(gè)其它基因被確認(rèn)為p53可能的下游靶物，包括WAF1(EL-Oeiry，W.S.等，同前)，MDM2(Chen C.Y.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，912684-2688，1994)，GADD45(Kastan，M.B.等，細(xì)胞，71587-597，1992)和BAX(Miyashita T.等，癌基因，91799-1805，1994)。參考Zin結(jié)構(gòu)域家族其它成員的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)、HIC-1可能起轉(zhuǎn)錄因子的作用。二個(gè)果蠅成員tram-track和廣泛復(fù)合體(broad complex)，是幫助調(diào)節(jié)體節(jié)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄抑制子(Harrion和Travers，EMBO J.9207，1990；di Bello，等，遺傳學(xué)，129385，1991)。第三個(gè)果蠅蛋白GAGA似乎通過有力地阻斷妨礙啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活化的核小體結(jié)構(gòu)的形成(Tsukiyama，T，等，自然，367525-532，1994)。鼠Zin結(jié)構(gòu)域基因MZF5具有對c-myc和胸苷激酶啟動(dòng)子的體外轉(zhuǎn)錄抑制活性(Numoto，等，核酸研究，213767，1993)。最后，4個(gè)其它的人zin結(jié)構(gòu)域蛋白的二個(gè)被發(fā)現(xiàn)為在人腫瘤中轉(zhuǎn)移的組分(Chardin等，核酸研究，191431，1991；Hromas，等，生物化學(xué)雜志，26614183，1991；Chen，等，EMBO J.121161，1993)。其次，有必要確定p53和HIC-1啟動(dòng)子之間的精確相互作用。
總之，本發(fā)明確認(rèn)了在17p13.3位的一個(gè)新基因HIC-1，對HIC-1而言，表達(dá)類型、結(jié)構(gòu)基序、染色體定位和p53反應(yīng)性顯示其在腫瘤發(fā)生中有重要的功能。涉及HIC-1的精確p53通路的確認(rèn)將闡明該基因在正常和腫瘤細(xì)胞中的作用。最后，結(jié)果提示在腫瘤DNA中，和等位缺失區(qū)有關(guān)的過度甲基化CpG島的確認(rèn)能有利于候選的腫瘤抑制基因的定位和克隆，以及對特別的治療方案有抗性的復(fù)發(fā)異常生長或細(xì)胞作標(biāo)志作用。
前述內(nèi)容意指解釋而不是限制本發(fā)明的范圍。確實(shí)，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員根據(jù)在此介紹的方法，不用過多的實(shí)驗(yàn)就能容易地預(yù)想和產(chǎn)生更多的實(shí)施方案。
序列表(1)一般信息(i) 申請者約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院(ii)發(fā)明題目新的腫瘤抑制基因，HIC-1(iii)序列數(shù)3(iv)通訊地址(A)地址Fish&Richardson，P.C.
(B)街道4225 Executive Square，Suite1400(C)城市La Jolla(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵區(qū)92037(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)朠CT/US95/(B)提交日期15-11-1995(C)分類號(hào)(viii)委托人/代理人信息(A)姓名Haile，Ph.D.，Lisa A.
(B)登記號(hào)38，347(C)參考/備案號(hào)07265/039W01(ix)電訊信息(A)電話(619)678-5070(B)電傳(619)678-5099(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度4616堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ii)分子類型DNA(基因組的)(vii)直接來源(B)克隆HIC-1多核苷酸(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)定位1...4616(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCGGCCCGC CGGGACCGCA GGTAACGGGC CGCGGGGCCC CGCGGGCCAG GAGGGGAACG 60GGGTCGGGCG GGCGAGCAGC GGGCAGGGGA GCTCAGGGCT CGGCTCCGGG CTCTGCCGCC 120GGATTTGGGG GCCGCGAGGA AGAGCTGCGA GCCGAGGGCC TGGGGCCGGC GCACTCCTCC 180CGCCCTGTCT GCAGTTGGAA AACTTTTCCC CAAGTTTGGG GCGGCGGAGT TCCGGGGGAG 240AAGGGGCCGG GGGAGCCGCG GAGGGAGGCG CCGGGCCCGC GCGTGTAGGG CCCAGGCCGA 300GGCCGGGACG CGGGTGGGGC GCAGGCCCGG GTCAGGGCCG CAGCCGGCTG TGCGCCGTGC 360CCGCCCGGGG CGCTGCCCCC TCCCTCCCCT GGGAGCTGCG TGGCTCCCCC CTCCCCCCCA 420CCTGCTTCCT GCCTCAGCCT CCTGCCCCGA TATAACGCCC TCCCCGCGCC GGGCCCGGCC 480TTCGCGCTCT GCCCGCCACG GCAGCCGCTG CCTCCGCTCC CCGCGCGGCC GCCGCCCGGG 540CCCCGACCGA GGGTTGACAG CCCCCGGCCA GGGCGGCGCC AGGGCGGGCA CCGCGCTCCC 600CTCCTCCGTA TCACTTCCCC CAACTGGGGC AACTTCTCCC GAGGCGGGAG GCGCTGGTTC 660CTCGGCTCCC TTTCTCCCTA CTTGGGTAAA GTTCTCCGCC CTGAATGACT TTTCCTGAAG 720CGGACATTTT ACTTAAATCG GGTAACTGTC TCCAAAAGGG TCACTGCGCC TGAACAGTTT 780TCTTCTCGGA AGCCCCAGCA CCCAGCCAGG TGCCCTGGGG CGTGCAGGCC GCCCTGGCCT 840CCCCTCCACC GGCGGCCGCT CACCTCCTGC TCCTTCTCCT GGTCCGGGCG GGCCGGCCTG 900GGCTCCCACT CCAGAGGGCA GCTGGTCCTT CGCCGGTGCC CAGGCCGCAG GGCTGATGCC 960CCCGCTCAGC TGAGGGAAGG GGAAGTGGAG GGGAGAAGTG CCGGGCTGGG GCCAGGCGGC 1020CAGGGCGCCG CACGGCTCTC ACCCGGCCGG TGTGTGTCCC CGCAGGAGAG TGTGCTGGGC 1080AGACGATGCT GGACACGATG GAGGCGCCCG GCCACTCCAG GCAGCTGCTG CTGCAGCTCA 1140ACAACCAGCG CACCAAGGGC TTCTTGTGCG ACGTGATCAT CGTGGTGCAG AACGCCCTCT 1200TCCGCGCGCA CAAGAACGTG CTGGCGGCCA GCAGCGCCTA CCTCAAGTCC CTGGTGGTGC 1260ATGACAACCT GCTCAACCTG GACCATGACA TGGTGAGCCC GGCCGTGTTC CGCCTGGTGC 1320TGGACTTCAT CTACACCGGC CGCCTGGCTG ACGGCGCAGA GGCGGCTGCG GCCGCGGCCG 1380TGGCCCCGGG GGCTGAGCCG AGCCTGGGCG CCGTGCTGGC CGCCGCCAGC TACCTGCAGA 1440TCCCCGACCT CGTGGCGCTG TGCAAGAAAC GCCTCAAGCG CCACGGCAAG TACTGCCACC 1500TGCGGGGCGG CGGCGGCGGC GGCGGCGGCT ACGCGCCCTA TGGTCGGCCG GGCCGGGGCC 1560TGCGGGCCGC CACGCCGTCA TCCAGGCCTG CTACCCGTCC CCAGTCGGGC CTCCGCCGCC 1620GCCTGCCGCG GAGCCGCCCT CGGGCCCAGA GGCCGCGGTC AACACGCACT GCGCCGAGCT 1680GTACGCGTCG GGACCCGGCC CGGCCGCCGC ACTCTGTGCC TCGGAGCGCC GCTGCTCCCC 1740TCTTTGTGGC CTGGACCTGT CCAAGAAGAG CCCGCCGGGC TCCGCGGCGC CAGAGCGGCC 1800GCTGGCTGAG CGCGAGCTGC CCCCGCGCCC GGACAGCCCT CCCAGCGCCG GCCCCGCCGC 1860CTACAAGGAG CCGCCTCTCG CCCTGCCGTC GCTGCCGCCG CTGCCCTTCC AGAAGCTGGA 1920GGAGGCCGCA CCGCCTTCCG ACCCATTTCG CGGCGGCAGC GGCAGCCCGG GACCCGAGCC 1980CCCCGGCCGC CCCAACGGGC CTAGTCTCCT CTATCGCTGG ATGAAGCACG AGCCGGGCCT 2040GGGTAGCTAT GGCGACGAGC TGGGCCGGGA GCGCGGCTCC CCCAGCGAGC GCTGCGAAGA 2100GCGTGGTGGG GACGCGGCCG TCTCGCCCGG GGGGCCCCCG CTCGGCCTGG CGCCGCCGCC 2160GCGCTACCCT GGCAGCCTGG ACGGGCCCGG CGCGGGCGGC GACGGCGACG ACTACAAGAG 2220CAGCAGCGAG GAGACCGGTA GCAGCGAGGA CCCCAGCACC GCCTGGCGGC CACCTCGAGG 2280GCTACCCATG CCCGCACCTG GCCTATGGCG AGCCCGAGAG CTTCGGTGAC AACCTGTACG 2340TGTGCATTCC GTGCGGCAAG GGCTTCCCCA GCTCTGAGCA GCTGAACGCG CACGTGGAGG 2400CTCACGTGGA GGAGGAGGAA GCGCTGTACG GCAGGGCCGA GGCGGCCGAA GTGGCCGCTG 2460GGGCCGCCGG CCTAGGGCCC CCTTTTGGAG GCGGCGGGGA CAAGGTCGCC GGGGCTCCGG 2520GTGGCCTGGG AGAGCTGCTG CGGCCCTACC GCTGCGGCTC GTGCGACAAG AGCTACAAGG2580ACCCGGCCAC GCTGCGGCAG CACGAGAAGA CGCACTGGCT GACCCGGCCC TACCCATGCA2640CCATCTGCGG GAAGAAGTTC ACGCAGCGTG GGACCATGAC GCGCCACATG CGCAGCCACC2700TGGGCCTCAA GCCCTTCGCG TGCGACGCGT GCGGCATGCG GTTCACGCGC CAGTACCGCC2760TCACCCGGAC GCACATGCGC ATCCACCCTC GCGGCGAGAA GCCCTACGAG TGCCAGGTGT2820GCGGCGGCAA GTTCGCACAG CAACGCAACC TCATCAGCCA CATGAAGATG CACGCCGTGG2880GGGGCGCGGC GGCGCGGCCG GGGCGCTGGC GGGCTTGGGG GGGCTCCCCG GCGTCCCCGG2940CCCCGACGGC AAGGGCAAGC TCGACTTCCC CGAGGGCGTC TTTGCTGTGG CTCGCTCACG3000GCCGAGCAGC TGAGCCTGAA GCAGCAGGAC AAGGCGGCCG CGACCGAGCT GCTGGCGCAG3060ACCACGCACT TCCTGCACGA CCCCAAGGTG GCGCTGGAGA GCCTCTACCC GCTGGCCAAG3120TTCACGGCCG AGCTGGGCCT CAGCCCCGAC AAGGCGGCCG AGGTGCTGAG CCAGGGCGCT3180CACCTGGCGG CCGGGCCCGA CGGCGGACCA TCGACCGTTT CTCTCCCACC TAGAGCGCCC3240CTCGCCAGCC CGCTCTGTCG CTGCTGCGCG GCCCTGGCCC GCACCCCAGG GAGCGGCGGG3300GGCGGCGCGC AGGGCCCACT GTGCCCGGGA CAACCGCAGC GTCGCCACAG TGGCGGCTCC3360ACCTCTCGGC GGCCTCACCT GGCCTCACTG CTTCGTGCCT TAGCTCGGGG GTCGGGGGAG3420AACCCCGGGA CGGGGTGGGA TGGGGTAAGG GAAATTTATA TTTTTGATAT CAGCTTTGAC3480CAAAGGAGAC CCCAGGCCCC TCCCGCCTCT TCCTGTGGTT CGTCGGCCCC CTCCCCCGGC3540TCCGCGCTGC TCTTAGAGGG GGAGGGGTGT CACTGTCGGG GCACTCCTAG CCCTACCTCC3600GGCCCTTGCG ACCACACCCA TTCTCACTGT GAATCTCCCC GCTGGGTCGG AGCGTCGGGC3660AGAGTTGGGG AGTGGGGAGG GGACTGAGCC GGCCGGAGGC CCCCGCACCC CCGCTCCCAC3720CCACCCCGGG ACTGATAATG TGAAGTTCCT CATTTTGCAC AAGTGGCACT AGCCCAGGGC3780CAACCCTTCC TTCCTCAGTC ACCAAGGGCG GGGAGTTCTG GAGTCGGAAG GCGAAGAGCC3840TACCACCAGG TCTCCCACTC CCGCGGTGCC CTCCCTTCCC TTCCCTGCGG CCCCGGACCA3900TATTTATTGC ATGCGCCCCG GCGGCCCCCC ATCCCGAGCC CAGGCTGGGC TGGGCTGGAA3960CGCGGTCTCT TTAGCTCCCT CCTCTTCGTT TGTATATTTC CTACCTTGTA CACAGCTCTT4020CCAGAGCCGC TTCCATTTTC TATACTCGAA CCAAACAGCA ATAAAGCAGT AACCAAGGAC4080CCCGACCCCG CTGCTCTCTT CTGCCCCTGC ACAAGGACCT GGATGCTGCG CCCGCTGGGT4140GGAGGAGCCA GAAAGGGCCA CCCTCACACA GGTGCAGAGG CTTGGACCTG CCTCCCTCCC4200CAGTCCCAGA AACAGATCAG CAAGAGGTCA GGTATGTTTC ATAACTAAAA ATTTATTAAG4260GAAACAAAAC CAGTGCTGCA AACGGGACAG AAAGGAGAGC TGGGTCTCCC TCCCGACCAC4320CCAGTCATCG GCCTTCCAGC TGGGGAGAGA ATCTTAAAGG AGAGGCCGGG GACCCTGTAC4380TCCAAAGAGC CCAGTCTTCT GAGACTCTAG GGGACTCCTA CCCCCAAACT ACTGGCCTTG4440GCTCCCCTAC ACGGTACCCC ATCGCTTCTG GCATAGTCCT GGGCCTCAGG GAGGGCAGAG4500CTGCGCACCC ATCCTCCAGG CAGGCTGTGC AGTCAGGCCA TGGGCTCTGG GGTATCCCCC4560ACTGGTCCCA TTAAGATTTG CCCCTGGCTC CACCGAAAAC CCCGTCTTCC CCTAAG4616(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度4112堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(vii)直接來源(B)克隆HIC-1編碼多核苷酸(ix)特點(diǎn)(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)定位1086…2726(xi)序列描述SEQ ID NO2CCCGGCCCGC CGGGACCGCA GGTAACGGGC CGCGGGGCCC CGCGGGCCAG GAGGGGAACG 60GGGTCGGGCG GGCGAGCAGC GGGCAGGGGA GCTCAGGGCT CGGCTCCGGG CTCTGCCGCC 120GGATTTGGGG GCCGCGAGGA AGAGCTGCGA GCCGAGGGCC TGGGGCCGGC GCACTCCTCC 180CGCCCTGTCT GCAGTTGGAA AACTTTTCCC CAAGTTTGGG GCGGCGGAGT TCCGGGGGAG 240AAGGGGCCGG GGGAGCCGCG GAGGGAGGCG CCGGGCCCGC GCGTGTAGGG CCCAGGCCGA 300GGCCGGGACG CGGGTGGGGC GCAGGCCCGG GTCAGGGCCG CAGCCGGCTG TGCGCCGTGC 360CCGCCCGGGG CGCTGCCCCC TCCCTCCCCT GGGAGCTGCG TGGCTCCCCC CTCCCCCCCA 420CCTGCTTCCT GCCTCAGCCT CCTGCCCCGA TATAACGCCC TCCCCGCGCC GGGCCCGGCC 480TTCGCGCTCT GCCCGCCACG GCAGCCGCTG CCTCCGCTCC CCGCGCGGCC GCCGCCCGGG 540CCCCGACCGA GGGTTGACAG CCCCCGGCCA GGGCGGCGCC AGGGCGGGCA CCGCGCTCCC 600CTCCTCCGTA TCACTTCCCC CAACTGGGGC AACTTCTCCC GAGGCGGGAG GCGCTGGTTC 660CTCGGCTCCC TTTCTCCCTA CTTGGGTAAA GTTCTCCGCC CTGAATGACT TTTCCTGAAG 720CGGACATTTT ACTTAAATCG GGTAACTGTC TCCAAAAGGG TCACTGCGCC TGAACAGTTT 780TCTTCTCGGA AGCCCCAGCA CCCAGCCAGG TGCCCTGGGG CGTGCAGGCC GCCCTGGCCT 840CCCCTCCACC GGCGGCCGCT CACCTCCTGC TCCTTCTCCT GGTCCGGGCG GGCCGGCCTG 900GGCTCCCACT CCAGAGGGCA GCTGGTCCTT CGCCGGTGCC CAGGCCGCAG GGCTGATGCC 960CCCGCTCAGC TGAGGGAAGG GGAAGTGGAG GGGAGAAGTG CCGGGCTGGG GCCAGGCGGC 1020CAGGGCGCCG CACGGCTCTC ACCCGGCCGG TGTGTGTCCC CGCAGGAGAG TGTGCTGGGC 1080AGACG ATG CTG GAC ACG ATG GAG GCG CCC GGC CAC TCC AGG CAG CTG 1127Met Leu Asp Thr Met Glu Ala Pro Gly His Ser Arg Gln Leu1 5 10CTG CTG CAG CTC AAC AAC CAG CGC ACC AAG GGC TTC TTG TGC GAC GTG1175Leu Leu Gln Leu Asn Asn Gln Arg Thr Lys Gly Phe Leu Cys Asp Val15 20 25 30ATC ATC GTG GTG CAG AAC GCC CTC TTC CGC GCG CAC AAG AAC GTG CTG1223Ile Ile Val Val Gln Asn Ala Leu Phe Arg Ala His Lys Asn Val Leu35 40 45GCG GCC AGC AGC GCC TAC CTC AAG TCC CTG GTG GTG CAT GAC AAC CTG1271Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Leu Lys Ser Leu Val Val His Asp Asn Leu50 55 60CTC AAC CTG GAC CAT GAC ATG GTG AGC CCG GCC GTG TTC CGC CTG GTG1319Leu Asn Leu Asp His Asp Met Val Ser Pro Ala Val Phe Arg Leu Val65 70 75CTG GAC TTC ATC TAC ACC GGC CGC CTG GCT GAC GGC GCA GAG GCG GCT 1367Leu Asp Phe Ile Tyr Thr Gly Arg Leu Ala Asp Gly Ala Glu Ala Ala80 85 90GCG GCC GCG GCC GTG GCC CCG GGG GCT GAG CCG AGC CTG GGC GCC GTG 1415Ala Ala Ala Ala Val Ala Pro Gly Ala Glu Pro Ser Leu Gly Ala Val95 100 105 110CTG GCC GCC GCC AGC TAC CTG CAG ATC CCC GAC CTC GTG GCG CTG TGC 1463Leu Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Gln Ila Pro Asp Leu Val Ala Leu Cys115 120 125AAG AAA CGC CTC AAG CGC CAC GGC AAG TAC TGC CAC CTG CGG GGC GGC 1511Lys Lys Arg Leu Lys Arg His Gly Lys Tyr Cys His Leu Arg Gly Gly130 135 140GGC GGC GGC GGC GGC GGC TAC GCG CCC TAT GCT ATG GCG ACG AGC TGG 1559Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Pro Tyr Ala Met Ala Thr Ser Trp145 150 155GCC GGG AGC GCG GCT CCC CCA GCG AGC GCT GCG AAG AGC GTG GTG GGG 1607Ala Gly Ser Ala Ala Pro Pro Ala Ser Ala Ala Lys Ser Val Val Gly160 165 170ACG CGG CCG TCT CGC CCG GGG GGC CCC CGC TCG GCC TGG CGC CGC CGC 1655Thr Arg Pro Ser Arg Pro Gly Gly Pro Arg Ser Ala Trp Arg Arg Arg175 180 185 190CGC GCT ACC CTG GCA GCC TGG ACG GGC CCG GCG CGG GCG GCG ACG GCG 1703Arg Ala Thr Leu Ala Ala Trp Thr Gly Pro Ala Arg Ala Ala Thr Ala195 200 205ACG ACT ACA AGA GCA GCA GCG AGG AGA CCG GTA GCA GCG AGG ACC CCA 1751Thr Thr Thr Arg Ala Ala Ala Arg Arg Pro Val Ala Ala Arg Thr Pro210 215 220GCA CCG CCT GGC GGC CAC CTC GAG GGC TAC CCA TGC CCG CAC CTG GCC 1799Ala Pro Pro Gly Gly His Leu Glu Gly Tyr Pro Cys Pro His Leu Ala225 230 235TAT GGC GAG CCC GAG AGC TTC GGT GAC AAC CTG TAC GTG TGC ATT CCG 1847Tyr Gly Glu Pro Glu Ser Phe Gly Asp Asn Leu Tyr Val Cys Ile Pro240 245 250TGC GGC AAG GGC TTC CCC AGC TCT GAG CAG CTG AAC GCG CAC GTG GAG 1895Cys Gly Lys Gly Phe Pro Ser Ser Glu Gln Leu Asn Ala His Val Glu255 260 265 270GCT CAC GTG GAG GAG GAG GAA GCG CTG TAC GGC AGG GCC GAG GCG GCC 1943Ala His Val Glu Glu Glu Glu Ala Leu Tyr Gly Arg Ala Glu Ala Ala275 280 285GAA GTG GCC GCT GGG GCC GCC GGC CTA GGG CCC CCT TTT GGA GGC GGC 1991Glu Val Ala Ala Gly Ala Ala Gly Leu Gly Pro Pro Phe Gly Gly Gly290 295 300GGG GAC AAG GTC GCC GGG GCT CCG GGT GGC CTG GGA GAG CTG CTG CGG 2039Gly Asp Lys Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Leu Gly Glu Leu Leu Arg305 310 315CCC TAC CGC TGC GGC TCG TGC GAC AAG AGC TAC AAG GAC CCG GCC ACG 2087Pro Tyr Arg Cys Gly Ser Cys Asp Lys Ser Tyr Lys Asp Pro Ala Thr320 325 330CTG CGG CAG CAC GAG AAG ACG CAC TGG CTG ACC CGG CCC TAC CCA TGC 2135Leu Arg Gln His Glu Lys Thr His Trp Leu Thr Arg Pro Tyr Pro Cys335 340 345 350ACC ATC TGC GGG AAG AAG TTC ACG CAG CGT GGG ACC ATG ACG CGC CAC 2183Thr Ile Cys Gly Lys Lys Phe Thr Gln Arg Gly Thr Met Thr Arg His355 360 365ATG CGC AGC CAC CTG GGC CTC AAG CCC TTC GCG TGC GAC GCG TGC GGC 2231Met Arg Ser His Leu Gly Leu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ala Cys Gly370 375 380ATG CGG TTC ACG CGC CAG TAC CGC CTC ACC CGG ACG CAC ATG CGC ATC 2279Met Arg Phe Thr Arg Gln Tyr Arg Leu Thr Arg Thr His Met Arg Ile385 390 395CAC CCT CGC GGC GAG AAG CCC TAC GAG TGC CAG GTG TGC GGC GGC AAG 2327His Pro Arg Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Gln Val Cys Gly Gly Lys400 405 410TTC GCA CAG CAA CGC AAC CTC ATC AGC CAC ATG AAG ATG CAC GCC GTG 2375Phe Ala Gln Gln Arg Asn Leu Ile Ser His Met Lys Met His Ala Val415 420 425 430GGG GGC GCG GCG GCG CGG CCG GGG CGC TGG CGG GCT TGG GGG GGC TCC 2423Gly Gly Ala Ala Ala Arg Pro Gly Arg Trp Arg Ala Trp Gly Gly Ser435 440 445CCG GCG TCC CCG GCC CCG ACG GCA AGG GCA AGC TCG ACT TCC CCG AGG 2471Pro Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Arg Ala Ser Ser Thr Ser Pro Arg450 455 460GCG TCT TTG CTG TGG CTC GCT CAC GGC CGA GCA GCT GAG CCT GAA GCA 2519Ala Ser Leu Leu Trp Leu Ala His Gly Arg Ala Ala Glu Pro Glu Ala465 470 475GCA GGA CAA GGC GGC CGC GAC CGA GCT GCT GGC GCA GAC CAC GCA CTT 2567Ala Gly Gln Gly Gly Arg Asp Arg Ala Ala Gly Ala Asp His Ala Leu480 485 490CCT GCA CGA CCC CAA GGT GGC GCT GGA GAG CCT CTA CCC GCT GGC CAA 2615Pro Ala Arg Pro Gln Gly Gly Ala Gly Glu Pro Leu Pro Ala Gly Gln495 500 505 510GTT CAC GGC CGA GCT GGG CCT CAG CCC CGA CAA GGC GGC CGA GGT GCT 2663Val His Gly Arg Ala Gly Pro Gln Pro Arg Gln Gly Gly Arg Gly Ala515 520 525GAG CCA GGG CGC TCA CCT GGC GGC CGG GCC CGA CGG CGG ACC ATC GAC 2711Glu Pro Gly Arg Ser Pro Gly Gly Arg Ala Arg Arg Arg Thr Ile Asp530 535 540CGT TTC TCT CCC ACC TAGAGCGCCC CTCGCCAGCC CGCTCTGTCG CTGCTGCGCG 2766Arg Phe Ser Pro Thr545GCCCTGGCCC GCACCCCAGG GAGCGGCGGG GGCGGCGCGC AGGGCCCACT GTGCCCGGGA 2826CAACCGCAGC GTCGCCACAG TGGCGGCTCC ACCTCTCGGC GGCCTCACCT GGCCTCACTG 2886CTTCGTGCCT TAGCTCGGGG GTCGGGGGAG AACCCCGGGA CGGGGTGGGA TGGGGTAAGG 2946GAAATTTATA TTTTTGATAT CAGCTTTGAC CAAAGGAGAC CCCAGGCCCC TCCCGCCTCT 3006TCCTGTGGTT CGTCGGCCCC CTCCCCCGGC TCCGCGCTGC TCTTAGAGGG GGAGGGGTGT 3066CACTGTCGGG GCACTCCTAG CCCTACCTCC GGCCCTTGCG ACCACACCCA TTCTCACTGT 3126GAATCTCCCC GCTGGGTCGG AGCGTCGGGC AGAGTTGGGG AGTGGGGAGG GGACTGAGCC 3186GGCCGGAGGC CCCCGCACCC CCGCTCCCAC CCACCCCGGG ACTGATAATG TGAAGTTCCT 3246CATTTTGCAC AAGTGGCACT AGCCCAGGGC CAACCCTTCC TTCCTCAGTC ACCAAGGGCG 3306GGGAGTTCTG GAGTCGGAAG GCGAAGAGCC TACCACCAGG TCTCCCACTC CCGCGGTGCC 3366CTCCCTTCCC TTCCCTGCGG CCCCGGACCA TATTTATTGC ATGCGCCCCG GCGGCCCCCC 3426ATCCCGAGCC CAGGCTGGGC TGGGCTGGAA CGCGGTCTCT TTAGCTCCCT CCTCTTCGTT 3486TGTATATTTC CTACCTTGTA CACAGCTCTT CCAGAGCCGC TTCCATTTTC TATACTCGAA 3546CCAAACAGCA ATAAAGCAGT AACCAAGGAC CCCGACCCCG CTGCTCTCTT CTGCCCCTGC 3606ACAAGGACCT GGATGCTGCG CCCGCTGGGT GGAGGAGCCA GAAAGGGCCA CCCTCACACA 3666GGTGCAGAGG CTTGGACCTG CCTCCCTCCC CAGTCCCAGA AACAGATCAG CAAGAGGTCA 3726GGTATGTTTC ATAACTAAAA ATTTATTAAG GAAACAAAAC CAGTGCTGCA AACGGGACAG 3786AAAGGAGAGC TGGGTCTCCC TCCCGACCAC CCAGTCATCG GCCTTCCAGC TGGGGAGAGA 3846ATCTTAAAGG AGAGGCCGGG GACCCTGTAC TCCAAAGAGC CCAGTCTTCT GAGACTCTAG 3906GGGACTCCTA CCCCCAAACT ACTGGCCTTG GCTCCCCTAC ACGGTACCCC ATCGCTTCTG 3966GCATAGTCCT GGGCCTCAGG GAGGGCAGAG CTGCGCACCC ATCCTCCAGG CAGGCTGTGC 4026AGTCAGGCCA TGGGCTCTGG GGTATCCCCC ACTGGTCCCA TTAAGATTTG CCCCTGGCTC 4086CACCGAAAAC CCCGTCTTCC CCTAAG 4112(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度547個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Leu Asp Thr Met Glu Ala Pro Gly His Ser Arg Gln Leu Leu Leu1 5 10 15Gln Leu Asn Asn Gln Arg Thr Lys Gly Phe Leu Cys Asp Val Ile Ile20 25 30Val Val Gln Asn Ala Leu Phe Arg Ala His Lys Asn Val Leu Ala Ala35 40 45Ser Ser Ala Tyr Leu Lys Sar Leu Val Val His Asp Asn Leu Leu Asn50 55 60Leu Asp His Asp Met Val Ser Pro Ala Val Phe Arg Leu Val Leu Asp65 70 75 80Phe Ile Tyr Thr Gly Arg Leu Ala Asp Gly Ala Glu Ala Ala Ala Ala85 90 95Ala Ala Val Ala Pro Gly Ala Glu Pro Ser Leu Gly Ala Val Leu Ala100 105 110Ala Ala Ser Tyr Leu Gln Ile Pro Asp Leu Val Ala Leu Cys Lys Lys115 120 125Arg Leu Lys Arg His Gly Lys Tyr Cys His Leu Arg Gly Gly Gly Gly130 135 140Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Pro Tyr Ala Met Ala Thr Ser Trp Ala Gly145 150 155 160Ser Ala Ala Pro Pro Ala Ser Ala Ala Lys Ser Val Val Gly Thr Arg165 170 175Pro Ser Arg Pro Gly Gly Pro Arg Ser Ala Trp Arg Arg Arg Arg Ala180 185 190Thr Leu Ala Ala Trp Thr Gly Pro Ala Arg Ala Ala Thr Ala Thr Thr195 200 205Thr Arg Ala Ala Ala Arg Arg Pro Val Ala Ala Arg Thr Pro Ala Pro210 215 220Pro Gly Gly His Leu Glu Gly Tyr Pro Cys Pro His Leu Ala Tyr Gly225 230 235 240Glu Pro Glu Ser Phe Gly Asp Asn Leu Tyr Val Cys Ile Pro Cys Gly245 250 255Lys Gly Phe Pro Ser Ser Glu Gln Leu Asn Ala His Val Glu Ala His260 265 270Val Glu Glu Glu Glu Ala Leu Tyr Gly Arg Ala Glu Ala Ala Glu Val275 280 285Ala Ala Gly Ala Ala Gly Leu Gly Pro Pro Phe Gly Gly Gly Gly Asp290 295 300Lys Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Leu Gly Glu Leu Leu Arg Pro Tyr305 310 315 320Arg Cys Gly Ser Cys Asp Lys Ser Tyr Lys Asp Pro Ala Thr Leu Arg325 330 335Gln His Glu Lys Thr His Trp Leu Thr Arg Pro Tyr Pro Cys Thr Ile340 345 350Cys Gly Lys Lys Phe Thr Gln Arg Gly Thr Met Thr Arg His Met Arg355 360 365Ser His Leu Gly Leu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ala Cys Gly Met Arg370 375 380Phe Thr Arg Gln Tyr Arg Leu Thr Arg Thr His Met Arg Ile His Pro385 390 395 400Arg Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Gln Val Cys Gly Gly Lys Phe Ala405 410 415Gln Gln Arg Asn Leu Ile Ser His Met Lys Met His Ala Val Gly Gly420 425 430Ala Ala Ala Arg Pro Gly Arg Trp Arg Ala Trp Gly Gly Ser Pro Ala435 440 445Ser Pro Ala Pro Thr Ala Arg Ala Ser Ser Thr Ser Pro Arg Ala Ser450 455 460Leu Leu Trp Leu Ala His Gly Arg Ala Ala Glu Pro Glu Ala Ala Gly465 470 475 480Gln Gly Gly Arg Asp Arg Ala Ala Gly Ala Asp His Ala Leu Pro Ala485 490 495Arg Pro Gln Gly Gly Ala Gly Glu Pro Leu Pro Ala Gly Gln Val His500 505 510Gly Arg Ala Gly Pro Gln Pro Arg Gln Gly Gly Arg Gly Ala Glu Pro515 520 525Gly Arg Ser Pro Gly Gly Arg Ala Arg Arg Arg Thr Ile Asp Arg Phe530 535 540Ser Pro Thr54權(quán)利要求
1.一種基本純的HIC-1(在癌癥中過度甲基化)的多肽，其基本上由SEQ D NO3的氨基酸序列組成。
2.一種分離的多核苷酸序列，基本上由編碼具有SEQ ID NO3氨基酸序列多肽的一種多核苷酸序列組成。
3.權(quán)利要求2的分離的多核苷酸序列，基本上由編碼具有SEQ IDNO3的氨基酸序列和具有至少一個(gè)表位使抗體對HIC-1多肽有免疫反應(yīng)的多肽的一種多核苷酸序列組成。
4. 權(quán)利要求2的多核苷酸，其中核苷酸序列選自a)SEQ D NO1，其中T也可能是U；b)互補(bǔ)于a)的核苷酸序列；c)a)或b)的至少長為15個(gè)堿基的片段，能選擇性地與編碼HIC-1的基因組DNA雜交。
5.一種含權(quán)利要求2的多核苷酸的重組表達(dá)載體。
6.一種含權(quán)利要求5的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.一種結(jié)合SEQ ID NO3的多肽和結(jié)合SEQ ID NO3的免疫反應(yīng)性片段的抗體。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中抗體是多克隆的。
9.權(quán)利要求7的抗體，其中抗體是單克隆的。
10.一種檢測在受試者中和HIC-1有關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)的方法，包括用和HIC-1反應(yīng)的試劑與含HIC-1的靶細(xì)胞組分接觸、檢測HIC-1。
11.權(quán)利要求10的方法，其中靶細(xì)胞組分是核酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中核酸是DNA。
13.權(quán)利要求11的方法，其中核酸是RNA。
14.權(quán)利要求11的方法，其中核酸是過度甲基化的。
15.權(quán)利要求10的方法，其中靶細(xì)胞組分是蛋白。
16.權(quán)利要求10的方法，其中試劑是一種探針。
17.權(quán)利要求16的方法，其中探針是核酸。
18.權(quán)利要求16的方法，其中探針是抗體。
19.權(quán)利要求18的方法，其中抗體是多克隆的。
20.權(quán)利要求18的方法，其中抗體是單克隆的。
21.權(quán)利要求16的方法，其中探針為可檢測性地標(biāo)記。
22.權(quán)利要求21的方法，其中標(biāo)記物選自放射性同位素、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光化合物、金屬螯合物或酶。
23.權(quán)利要求10的方法，其中試劑是一種限制性核酸內(nèi)切酶。
24.權(quán)利要求23的方法，其中限制性核酸內(nèi)切酶是甲基化敏感的。
25.權(quán)利要求24的方法，其中限制性核酸內(nèi)切酶選自MspI、HpaII、BssHII和NotI。
26.權(quán)利要求10的方法，其中細(xì)胞增殖失調(diào)有關(guān)的組織，選自腦、結(jié)腸、泌尿生殖器、肺、腎、造血組織、乳腺、胸腺、睪丸、卵巢和子宮。
27.權(quán)利要求26的方法，其中失調(diào)選自低級(jí)星形細(xì)胞瘤、退行性星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
28.一種治療和HIC-1有關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)的方法，包括給失調(diào)的受試者服用一種治療有效量的調(diào)節(jié)HIC-1表達(dá)的藥劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中藥劑是一種包括HIC-1有義多核苷酸序列的多核苷酸序列。
30.權(quán)利要求29的方法，其中進(jìn)一步包括的藥劑是編碼操縱性地與HIC-1多核苷酸序列連接的一種多核苷酸序列。
31.權(quán)利要求29的方法，其中多核苷酸序列在一表達(dá)載體中。
32.權(quán)利要求28的方法，其中與失調(diào)相關(guān)的組織選自腦、泌尿生殖器、結(jié)腸、腎、造血組織、乳腺、胸腺、睪丸、卵巢和子宮。
33.權(quán)利要求32的方法，其中失調(diào)選自低級(jí)星形細(xì)胞瘤、退行性星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
34.權(quán)利要求28的方法，其中HIC-1相關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)和HIC-1核苷酸序列的過度甲基化有關(guān)。
35.一種基因治療方法，包括向宿主受試者細(xì)胞中導(dǎo)入一種表達(dá)載體，其中表達(dá)載體包含與啟動(dòng)子可操作地連接的編碼HIC-1的核苷酸序列。
36.權(quán)利要求35的方法，其中表達(dá)載體被導(dǎo)入離體的受試者細(xì)胞中，然后重導(dǎo)入受試者中。
37.權(quán)利要求35的方法，其中表達(dá)載體是一種RNA病毒。
38.權(quán)利要求37的方法，其中RNA病毒是一種反轉(zhuǎn)錄病毒。
39.權(quán)利要求35的方法，其中受試者是人。
40.權(quán)利要求35的方法，其中失調(diào)與HIC-1多核苷酸的過度甲基化有關(guān)。
41.一種診斷試劑盒，用于檢測顯示有與HIC-1核酸甲基化相關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)的靶細(xì)胞組分，包括劃分為幾部分的載體裝置，可緊密地放一或多個(gè)容器，包括首要的含檢測甲基化的HIC-1核酸的探針的容器。
42.權(quán)利要求41的試劑盒，其中靶細(xì)胞組分是HIC-1多肽。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中探針是一種抗體。
44.權(quán)利要求41的試劑盒，其中靶細(xì)胞組分是核酸序列。
45.權(quán)利要求44的試劑盒，其中探針是一種多核苷酸雜交探針。
46.一種鑒定腫瘤抑制基因的方法，包括在核酸樣品中檢測異常的核酸甲基化和鑒定基因。
47.權(quán)利要求46的方法，，其中核酸至少包括1個(gè)CpG島核苷酸序列。
48.權(quán)利要求47的方法，其中CpG核苷酸序列是過度甲基化的。
全文摘要
提供編碼一種新的腫瘤抑制基因,HIC－1的多核苷酸和多肽序列。也包括一種檢測和HIC－1相關(guān)的細(xì)胞增殖失調(diào)的方法。HIC－1是一種標(biāo)志,能用于上述失調(diào)過程中的診斷、預(yù)后和治療方面。
文檔編號(hào)A61P15/00GK1171743SQ95197251
公開日1998年1月28日 申請日期1995年11月15日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月15日
發(fā)明者S·B·貝林, M·M·威爾斯 申請人:約翰斯·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院