專利名稱：來自曲霉屬融合產(chǎn)物中經(jīng)加工的重組乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及鐵結(jié)合糖蛋白和相關(guān)的多肽，即乳鐵蛋白。更具體地，本發(fā)明涉及曲霉屬，特別是泡盛曲霉，黑曲霉及米曲霉中各種乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷的重組產(chǎn)物。
公開內(nèi)容背景在共同未決的專利申請美國專利序列號08/145,681中，公開了人乳鐵蛋白的cDNA序列。另外，在相同的共同未決的專利申請美國專利序列號08/145,681中，人乳鐵蛋白的cDNA序列被用于在各種不同微生物，包括各種各樣的真菌如釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉和米曲霉中生產(chǎn)人乳鐵蛋白。現(xiàn)有技術(shù)的描述乳鐵蛋白(LF)是一種發(fā)現(xiàn)于牛奶和其它分泌物及體液的鐵結(jié)合糖蛋白。LF參予了哺乳動物中鐵結(jié)合及轉(zhuǎn)運。
LF最初在牛奶中發(fā)現(xiàn)，它在初乳中能夠以達(dá)7克/升的水平分泌出來。自從最初發(fā)現(xiàn)以來，LF已在人和其它哺乳動物的分泌液中檢測到。這些體液包括眼淚、唾液和粘膜分泌物以及在多形核白細(xì)胞的次生顆粒。
LF是一種具有二葉結(jié)構(gòu)的78千道爾頓(kDa)的糖蛋白，在C和N端半部分有高度同源性，這在氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)水平都是明顯的。這些葉的每一個能可逆地具有高度的親和性地結(jié)合一個三價鐵，和伴隨結(jié)合碳酸氫鹽。乳鐵蛋白的生物功能包括對微生物病原體制菌和殺菌作用，鐵的轉(zhuǎn)運，促進(jìn)細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和炎癥反應(yīng)，以及調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的生成。已發(fā)現(xiàn)去糖基化蛋白保留了天然LF的所有生物功能。
乳鐵蛋白的殺菌功能域具有廣譜抗微生物作用。Bellamy，W.M.等，J.App.Bact.73，472-479(1992)。盡管Bellamy等報道從牛奶分離的牛乳鐵蛋白提供胃蛋白酶消化能提供商業(yè)量的牛多肽，但用于兩個研究的材料的最大純度有95％。Bellamy等未提供大量生產(chǎn)合成的人或牛乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽的資料。Bellamy等也沒有討論提供生產(chǎn)由酶消化不能得到的多肽的方法。
絲狀真菌在胞外糖蛋白的工業(yè)生產(chǎn)中已被用作宿主。某些工業(yè)菌株能夠分泌克量的這些蛋白。另外，絲狀真菌能夠正確地完成真核蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾并且許多蛋白已獲美國食品與藥品管理局的批準(zhǔn)。而且，可以得到大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)和下游處理經(jīng)驗。然而，已有報道乳鐵蛋白對某些真菌有毒(Valenti，等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，33271-275(1986)；Epstein，等，Reviews of Infectious Diseases，696-106(1984)；Soukka，等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，90223-228(1992))，因而工作者未廣泛應(yīng)用真菌，特別地對乳鐵蛋白的生產(chǎn)。
在絲狀真菌，特別地曲霉屬中生產(chǎn)乳鐵蛋白首先由本發(fā)明者報道(Ward，等，Gene，122219-223(1992)；Ward，等，Biotechnology，10784-789(1992)；Conneely等，重組人乳鐵蛋白的生產(chǎn)，PCT/US 93/22348，國際申請?zhí)朠CT/US93/03614，有1992年4月24日的優(yōu)先權(quán)日并在93年11月出版；和Conneely等，美國序列號08/250,308，5/27/94提交，它是美國序列號07/873,304，04/24/92提交的延續(xù)申請，現(xiàn)放棄，所有這些在此以參考文獻(xiàn)收入)。然而，雖然這些過程是顯著的突破，但是它們在有效地生產(chǎn)商業(yè)性大量的乳鐵蛋白的能力上仍有限制。
目前，除了生產(chǎn)乳鐵蛋白多肽外，需要更有效和經(jīng)濟(jì)的方法生產(chǎn)人、?；蜇iLF。因而，也有發(fā)展一種有效和商業(yè)化的方法的需要，用于生產(chǎn)營養(yǎng)和治療應(yīng)用的人乳鐵蛋白和用于進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。通過用曲霉屬宿主細(xì)胞結(jié)合新的載體構(gòu)建以及特別是在曲霉屬宿主細(xì)胞中生產(chǎn)乳鐵蛋白的方法，提供乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷的生產(chǎn)，本標(biāo)題發(fā)明滿足了這一需要，使它們能夠生產(chǎn)商業(yè)量的重組乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷。
發(fā)明概述本標(biāo)題發(fā)明提供了用曲霉屬宿主細(xì)胞結(jié)合新的質(zhì)粒構(gòu)建生產(chǎn)乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷。更特別地，本標(biāo)題發(fā)明提供了能夠在曲霉屬宿主細(xì)胞中生產(chǎn)乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷的新載體構(gòu)建。更特別地，本標(biāo)題發(fā)明提供了適宜與曲霉屬，特別是泡盛曲霉、黑曲霉和米曲霉宿主細(xì)胞一起使用的新的質(zhì)粒構(gòu)建，使它們能生產(chǎn)大量的重組乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷。
本標(biāo)題發(fā)明也提供了新的表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建物，它使乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷能夠生產(chǎn)。質(zhì)粒載體構(gòu)建含有兩個重要的成分，它提供了如此高水平的要生產(chǎn)的乳鐵蛋白。除了啟動子、編碼所選蛋白的cDNA、信號序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和選擇性標(biāo)記外，質(zhì)粒載體構(gòu)建物還含有(a)其產(chǎn)物從曲霉屬細(xì)胞分泌的高表達(dá)內(nèi)源性基因的5′部分，和(b)連接序列，借此連接序列有一個它的內(nèi)源性蛋白酶。該新的質(zhì)粒載體構(gòu)建物的產(chǎn)物是融合蛋白，包括融合到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的高表達(dá)基因的部分(ha1f)。此后該融合蛋白被對Kex2肽酶剪切位點優(yōu)選專一的內(nèi)源性蛋白酶加工。例如，如果使用來自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶啟動子，載體也應(yīng)含有泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分。產(chǎn)生的乳鐵蛋白融合到葡糖淀粉酶基因的部分，然后被對Kex2肽酶切割位點專一的內(nèi)源性泡盛曲霉蛋白酶加工。另一個例子，如果使用來自黑曲霉的葡糖淀粉酶啟動子，載體也應(yīng)含有黑曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分。由載體構(gòu)建物(LF融合到葡糖淀粉酶基因的部分)產(chǎn)生的融合產(chǎn)物然后用對Kex2肽酶切割位點專一的黑曲霉內(nèi)源性蛋白酶加工，釋放出期望的乳鐵蛋白或LF多肽片斷。而且，如果使用米曲霉細(xì)胞，載體構(gòu)建應(yīng)含有來自α-淀粉酶基因的米曲霉啟動子和部分米曲霉α-淀粉酶基因。此載體可用于轉(zhuǎn)化米曲霉細(xì)胞，融合產(chǎn)物(LF融合到α-淀粉酶基因的部分)可通過對Kex2肽酶切割位點專一的內(nèi)源性米曲霉蛋白酶加工，產(chǎn)生所要的LF或LF多肽片斷。
因而，本標(biāo)題發(fā)明提供在任何曲霉菌株中生產(chǎn)商品量的LF或LF多肽片斷的新載體質(zhì)粒構(gòu)建。
本標(biāo)題發(fā)明的另一個實施方案包含下列可行地從5′連接到3′的成分，以形成表達(dá)質(zhì)粒載體(a)一個啟動子；(b)一個信號序列；(c)其產(chǎn)物從米曲霉細(xì)胞分泌的高表達(dá)內(nèi)源基因(即葡糖淀粉酶基因)的5′部分；(d)一個連接序列；以及(e)對應(yīng)于所期望的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列。
上面的(a)-(e)的DNA序列然后克隆到一起形成質(zhì)粒。得到的表達(dá)質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化曲霉屬細(xì)胞，它將表達(dá)融合到高表達(dá)的內(nèi)源基因如葡糖淀粉酶基因基因的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷(對應(yīng)于插入表達(dá)質(zhì)粒的乳鐵蛋白核苷酸序列)。LF或LF多肽片斷通過對Kex2肽酶裂解位點特異的內(nèi)源蛋白酶進(jìn)行加工。
所要求的發(fā)明的另一個實施方案為產(chǎn)生乳鐵蛋白的方法，它包括培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化曲霉屬真菌細(xì)胞，其中所說的質(zhì)粒包含編碼乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列，其中所說的轉(zhuǎn)化曲霉屬真菌細(xì)胞培養(yǎng)在合適的營養(yǎng)基質(zhì)中直到乳鐵蛋白作為一種融合產(chǎn)物形成并經(jīng)Kex2肽酶裂解位點特異的內(nèi)源蛋白酶加工，其中所說的加工的乳鐵蛋白被分泌到營養(yǎng)基質(zhì)中，并且其中所說的乳鐵蛋白從營養(yǎng)液中分離或回收。
本發(fā)明被進(jìn)一步規(guī)定，因為上面提到的質(zhì)粒載體還包含啟動子，信號序列，葡糖淀粉酶基因的5′部分，連結(jié)序列，轉(zhuǎn)錄終止序列和可選擇標(biāo)記基因。針對本發(fā)明的目的，“連結(jié)序列”和“蛋白水解酶識別序列”可被交互使用。
此表達(dá)載體被進(jìn)一步規(guī)定，其中啟動子選自乙醇脫氫酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和denA的基因，而且其中啟動子被進(jìn)一步限定來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因。
上述過程被進(jìn)一步規(guī)定，其中所說的啟動子來自葡糖淀粉酶基因，其中所說的啟動子來自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因，并且其中該信號序列來自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因。此過程被進(jìn)一步規(guī)定，其中上述信號序列還含有來自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶5′部分。
上述過程還可規(guī)定，其中所說的啟動子來自葡糖淀粉酶基因，其中所說的啟動子來自黑曲霉的葡糖淀粉酶基因，并且其中該信號序列來自黑曲霉的葡糖淀粉酶基因。此過程被進(jìn)一步規(guī)定，其中上述信號序列還含有來自黑曲霉的葡糖淀粉酶5′部分。
上述過程還可進(jìn)一步規(guī)定，其中所說的啟動子來自α-淀粉酶基因，其中所說的啟動子來自米曲霉的α-淀粉酶基因，并且其中對應(yīng)于信號序列的cDNA序列來自米曲霉的α-淀粉酶基因。此過程被進(jìn)一步規(guī)定，其中上述信號序列還含有來自米曲霉的α-淀粉酶5′部分。
上述過程被進(jìn)一步規(guī)定，其中連結(jié)序列為肽酶識別序列，本發(fā)明還進(jìn)一步規(guī)定其中連結(jié)序列編碼Kex2肽酶識別序列。針對本發(fā)明的目的Kex2肽酶識別序列和Kex2肽酶裂解位點是相同的。
上述過程被進(jìn)一步規(guī)定其中轉(zhuǎn)錄終止序列選自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脫氫酶和benA基因。本發(fā)明還進(jìn)一步規(guī)定，因為轉(zhuǎn)錄終止序列來自葡糖淀粉酶基因并且其中轉(zhuǎn)錄終止序列來自黑曲霉的葡糖淀粉酶基因。
上述過程被進(jìn)一步規(guī)定其中可選擇的標(biāo)記基因選自pyr4，pyrG，amdS，argB，trpC和福來霉素抗性基因。該過程被進(jìn)一步規(guī)定，因為可選擇標(biāo)記來自福來霉素抗性基因。
本發(fā)明還規(guī)定其中乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷為人，豬或牛乳鐵蛋白。本發(fā)明還規(guī)定其中任何乳鐵蛋白產(chǎn)物已被去糖基化。
本發(fā)明的另一個實施方案是基本上由編碼人乳鐵蛋白氨基酸的DNA和在細(xì)胞中表達(dá)該DNA的質(zhì)粒載體組成的質(zhì)粒，其中所說的質(zhì)粒用于在泡盛曲霉真菌細(xì)胞中表達(dá)人乳鐵蛋白的DNA。一種特別優(yōu)選的質(zhì)粒規(guī)定為具有ATCC登記號74290的特征并命名為Awa LF24-1的質(zhì)粒，其中Awa LF24-1是用含有編碼人乳鐵蛋白DNA的pPLF-19表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的泡盛曲霉，即美國系列號08/145,681的SEQ.I.D.Listing No.1，美國系列號08/145,681在此引入作為參考。本發(fā)明的另一個實施方案是含有上述質(zhì)粒的泡盛曲霉真菌細(xì)胞。
本發(fā)明的具體實施方案是包含培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化泡盛曲霉，黑曲霉和米曲霉的真菌細(xì)胞，其中所說的質(zhì)粒包含一種質(zhì)粒載體含有(a)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的一個啟動子；(b)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的一個信號序列；(c)高表達(dá)內(nèi)源基因的5′部分，如泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因；(d)編碼Kex2肽酶裂解部位的連接序列；(e)編碼人乳鐵蛋白氨基酸的DNA；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇標(biāo)記基因；其中所說的轉(zhuǎn)化泡盛曲霉，黑曲霉和米曲霉真菌細(xì)胞培養(yǎng)在合適的營養(yǎng)液中直到乳鐵蛋白作為融合產(chǎn)物形成，然后被對Kex2肽酶裂解位點專一的內(nèi)源蛋白酶加工，其中所說的乳鐵蛋白是編碼人LF氨基酸序列的cDNA的產(chǎn)物，其中乳鐵蛋白被分泌到營養(yǎng)液中并從中分離。針對本發(fā)明的目的，“Kex2肽酶裂解位點”和“Kex2肽酶識別序列”可交互使用。
本發(fā)明的另一個實施方案是從真菌培養(yǎng)液中分離乳鐵蛋白的方法，包括培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化曲霉屬真菌細(xì)胞，其中所說的質(zhì)粒載體包含啟動子，信號序列，葡糖淀粉酶基因的5′部分，連結(jié)序列，編碼人乳鐵蛋白氨基酸的DNA，轉(zhuǎn)錄終止序列和可選擇標(biāo)記基因，其中所說的轉(zhuǎn)化曲霉屬真菌細(xì)胞培養(yǎng)在合適的營養(yǎng)液中直到乳鐵蛋白作為融合產(chǎn)物形成，然后被內(nèi)源蛋白酶加工，其中乳鐵蛋白被分泌到營養(yǎng)液中并從中分離。
上述從真菌營養(yǎng)液中分離乳鐵蛋白的方法被進(jìn)一步規(guī)定其中質(zhì)粒載體含有來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子，泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列，葡糖淀粉酶基因的5′部分，編碼Kex2肽酶裂解位點的連結(jié)序列，黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列和福來霉素抗性可選擇標(biāo)記基因。
本發(fā)明的另一個實施方案是包含將下列成分從5′到3′連結(jié)的新的重組表達(dá)質(zhì)粒載體1)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的一個啟動子；2)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的一個信號序列；3)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因5′部分；4)編碼Kex2肽酶裂解部位的連接序列；5)編碼人乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷氨基酸的核苷酸序列；6)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和7)福來霉素抗性可選擇標(biāo)記基因；本發(fā)明還包含人，?；蜇i乳鐵蛋白cDNA的完全及部分序列，替代類似物或其等位變異的產(chǎn)生，它編碼與部分乳鐵蛋白具有同源性的生物活性多肽，特別是那些不能從天然乳鐵蛋白酶消化獲得的，用表達(dá)部分cDNA序列制造多肽的方法和通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)多肽產(chǎn)物。目的部分序列可通過限制酶裂解產(chǎn)生，如在圖13，14和15中表示的裂解位點。圖13到15分別顯示人，牛和豬LF cDNA序列的限制性酶切位點。該部分序列還可以合成，通過PCR擴(kuò)增，裂解、連結(jié)與合成的組合，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法來獲得。
豬(Lydon，J.P.，等，Biochem.biophysic.ACTA，113297-99(1992)；A1exander，L.J.，等，Animal Genetics，23251-256(1992))和牛(Mead，P.E.，等，Nucleic Acids Research，187167(1990)；Pierce，A.等，Eur.J.Biochem.，196177-184(1991))乳鐵蛋白的cDNA序列已被確定并在文獻(xiàn)中報道。含有牛和豬乳鐵蛋白的cDNA序列的參考文獻(xiàn)在此引入本專利申請作為參考。
來自乳鐵蛋白的多肽片斷已知為生物活性的并可以通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。人乳鐵蛋白片斷的N-端包括從完整hLF胃蛋白酶消化物分離的hLF殺菌結(jié)構(gòu)域。Bellamy，W.M.等，Biochem.Biophys.ACTA，1121130-136(1992)。合成的23和25氨基酸多肽已被合成并發(fā)現(xiàn)具有與胃蛋白酶消化得到的片斷相似的活性。合成細(xì)節(jié)，產(chǎn)率和合成肽的純度沒有報道。Bellamy等沒有提供不含有由于天然產(chǎn)物分離所至污染的?；蛉巳殍F蛋白多肽大規(guī)模生產(chǎn)的實際路線。這些多肽片斷可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)，并形成其優(yōu)選實施方案。
下列公開的氨基酸序列和相應(yīng)的cDNA序列在此插入作為參考(a)Powell，et al.，Nucleic Acids Research，18(13)4013(1990；mammary)；(b)Rey，et al.，Nucleic Acids Research，18(17)5288(1990；mammary)；(c)Rado，et al.，Blood，70(4)989-993(1987；neutrophil)；(d)Stowell，et al.，Biochem.J.，276349-355(1991)；(e)Panella，et al.，Cancer Research，513037-3043(1991；mammary)；and(f)Johnston，et al.，Blood，79(11)2998-3006(1992；leukemic).
這些序列的任何一個或其修飾形式可用于本發(fā)明的方法中，優(yōu)選序列為具有被本發(fā)明者報告給GenBank的多肽序列并具有登記號A31000，它們?nèi)吭诖艘胱鳛閰⒖肌?br> 附圖簡述因而獲得上面特點，優(yōu)點和本發(fā)明目的敘述的方式以及會變清楚的其它方面，并可被詳細(xì)了解，上面簡要概括的本發(fā)明更特別的描述可通過參考在附圖中說明的某些實施方案獲得。這些圖構(gòu)成本說明書的一部分。
然而要指出這些


本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，因此不被認(rèn)為限制其范圍。此發(fā)明可以承認(rèn)其它等同效能的等效實施方案。
圖1表示含有用于在泡盛曲霉中表達(dá)的hLF cDNA、命名為“pPLF-19”的質(zhì)粒載體的構(gòu)建。圖中使用的縮寫如下Apr氨芐青霉素抗性；hLF人乳鐵蛋白；GA葡糖淀粉酶基因；pGA來自葡糖淀粉酶基因的啟動子；GA 3′UTR葡糖淀粉酶基因3′非翻譯區(qū)；s.s.信號序列；phleo r福來霉素基因抗性。實施例4詳述此載體的構(gòu)建。
圖2為從含有pPLF-19的泡盛曲霉轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)基中純化的重組hLF(100ng)的SDS-PAGE。
圖3為從含有pPLF-19的泡盛曲霉轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)基中純化的糖基化(1μg)和去糖基化重組hLF(1μg)的Western印記雜交。
圖4描述泡盛曲霉中重組產(chǎn)生的hLF起始10個氨基酸N-末端測序的結(jié)果。
圖5描述標(biāo)準(zhǔn)和重組hLF鐵離子結(jié)合和飽和研究的結(jié)果。
圖6描述鐵離子結(jié)合于標(biāo)準(zhǔn)和重組hLF的pH穩(wěn)定性的比較結(jié)果。
圖7描述天然和重組hLF對大腸桿菌0111的抗菌作用。
圖8描述天然和重組hLF對弗氏志賀菌抗菌作用研究得到的結(jié)果。
圖9描述在殺滅時間研究中天然和重組hLF對福氏志賀菌抗菌作用的結(jié)果。
圖10-A和圖10-B概括通用的泡盛曲霉表達(dá)穿梭載體pPLF-26的設(shè)計，中間體和構(gòu)建。注意不是所有的限制性位點在這些圖中表示出來。
圖11表示含有用于克隆的單一Not1和EcoRI的通用穿梭載體pPLF-26的詳細(xì)說明。
圖12描述用各種限制性酶消化pPLF-26和pPLF-19以確認(rèn)單一Not1和EcoRI位點的存在和質(zhì)粒方向性的結(jié)果。
圖13表示人LF cDNA序列限制性酶切位點。
圖14表示牛LF cDNA序列限制性酶切位點。
圖15表示豬LF cDNA序列限制性酶切位點。
圖16A表示米曲霉中產(chǎn)生的重組hLF的Western免疫印記分析。
圖16B表示與圖16A一式二份樣品的銀染SDS-聚丙烯酰胺凝膠分析。
圖16C表示米曲霉中產(chǎn)生的重組hLF N-末端氨基酸序列。
發(fā)明詳述定義為了標(biāo)題申請的目的下列術(shù)語被定義以更好地了解本發(fā)明。
術(shù)語“轉(zhuǎn)鐵蛋白家族”指鐵結(jié)合蛋白家族，包括血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin)和乳鐵蛋白。這些蛋白都是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的。
術(shù)語“乳鐵蛋白”指轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一個成員，發(fā)現(xiàn)它在乳汁和其它分泌物中。乳鐵蛋白是一個78kb鐵結(jié)合蛋白。
此外術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”被用于限定乳鐵蛋白的功能片斷或包括影響如鐵結(jié)合，殺菌特性，受體結(jié)合和免疫刺激等特異功能分子元件的全部或部分的乳鐵蛋白多肽。
術(shù)語“多肽”指幾個氨基酸連結(jié)在一起形成一個小肽或多肽。
術(shù)語“替代類似物”或“等位變異”或者“等位突變體”均指決定乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽一個或多個氨基酸的一個或多個密碼子被由不同DNA序列決定相同氨基酸序列的其它密碼子替代的DNA序列。這里“替代類似物”或“等位突變體”指一種蛋白或多肽，意思是少量的通常5個或更少氨基酸替代在人或其它哺乳動物蛋白中已知發(fā)生的等位變異，在此保留了該蛋白的生物活性。已報道在幾個公開的hLF cDNAs序列中的氨基酸替代，它們最可能由于等位突變。見圖16，和此圖相關(guān)的討論。
術(shù)語“載體”指質(zhì)粒，粘粒，噬菌體或其它任何使乳鐵蛋白cDNA插入，增殖和表達(dá)的載體。
術(shù)語“宿主”指允許乳鐵蛋白表達(dá)的任何細(xì)胞。
術(shù)語“啟動子”指控制乳鐵蛋白cDNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA序列。
術(shù)語“多克隆盒”指含有多種酶的單一限制性酶切位點的DNA片斷，以插入各種cDNAs。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指允許細(xì)胞中異源DNA序列表達(dá)的插入。
術(shù)語“鐵離子結(jié)合量”指結(jié)合鐵的能力。完整功能的人乳鐵蛋白每分子LF可結(jié)合兩個鐵原子。
術(shù)語“生物活性或生物學(xué)上活性的”指乳鐵蛋白通過測量其結(jié)合鐵離子，殺滅微生物，阻止微生物的生長，起鐵轉(zhuǎn)運蛋白的作用，與特異受體結(jié)合，刺激免疫應(yīng)答或調(diào)節(jié)髓細(xì)胞生成的能力確定的功能學(xué)活性。
本發(fā)明中有用的啟動子可以是允許調(diào)節(jié)乳鐵蛋白cDNA轉(zhuǎn)錄的任何啟動子。優(yōu)選的，該啟動子選自乙醇脫氫酶，α-淀粉酶和葡糖淀粉酶基因。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的啟動子，但本發(fā)明優(yōu)選使用從泡盛曲霉中分離的葡糖淀粉酶啟動子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的信號序列以及這些信號序列的來源，但本發(fā)明者優(yōu)選使用泡盛曲霉葡糖淀粉酶信號序列加來自葡糖淀粉酶基因的5′部分。
在本方法中有用的信號序列可以任意含有翻譯起始密碼子和帶有部分高表達(dá)內(nèi)源基因編碼區(qū)的分泌信號。
本方法中有用的連結(jié)序列含有任何蛋白水解酶的識別序列，優(yōu)選Kex2肽酶識別序列。
本方法中有用的轉(zhuǎn)錄終止序列可以是任何穩(wěn)定化和校正乳鐵蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄終止的序列。該轉(zhuǎn)錄終止序列優(yōu)選來自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脫氫酶或benA基因。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的轉(zhuǎn)錄終止序列，但本發(fā)明者優(yōu)選使用來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的3′非翻譯區(qū)。
在本發(fā)明的方法中，有用的可選擇標(biāo)記基因可為任何使用乳鐵蛋白cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分離的基因。該可選擇標(biāo)記基因優(yōu)選自pyr4，pyrG，argB，trpC，amdS或福來霉素抗性基因。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的可選擇標(biāo)記，但本發(fā)明者優(yōu)選使用福來霉素抗性基因。
此外，在優(yōu)選實施方案中已描述乳鐵蛋白的重組產(chǎn)生。LF可在幾種來源生產(chǎn)細(xì)胞來源如曲霉屬，釀酒酵母，Kluyveromyces lactis，或Pichia pastorsis；昆蟲細(xì)胞如SF9；和哺乳動物細(xì)胞如Cos細(xì)胞。
本發(fā)明中有用的細(xì)胞，優(yōu)選真核細(xì)胞是任何允許整合載體的細(xì)胞，優(yōu)選包含乳鐵蛋白cDNA的質(zhì)粒并表達(dá)乳鐵蛋白cDNA。真核細(xì)胞優(yōu)選絲狀真菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞例如SF9在本發(fā)明的方法中是有用的。該細(xì)胞更優(yōu)選真菌曲霉屬細(xì)胞。本發(fā)明中有用的真核細(xì)胞最優(yōu)選曲霉屬菌株，如米曲霉，黑曲霉，構(gòu)巢曲霉和泡盛曲霉。
編碼hLF cDNA序列的確定和推導(dǎo)的氨基酸以被多種確認(rèn)方法證明。
它們是1.多重序列分析2.從用抗hLF抗體確切鑒定的cDNA轉(zhuǎn)錄和翻譯hLF蛋白。
編碼hLF的cDNA序列可用于準(zhǔn)備重組人乳鐵蛋白，因而可以得到用于治療和營養(yǎng)用途的蛋白來源。確認(rèn)的cDNA序列可用于合適的克隆載體以復(fù)制該cDNA序列。該cDNA也可以插入用于人乳鐵蛋白生產(chǎn)的載體系統(tǒng)。其它乳鐵蛋白DNA序列可替換人乳鐵蛋白cDNA序列以提供牛，豬，馬或其它乳鐵蛋白。部分cDNA序列還可用來得到所期望的來自乳鐵蛋白的多肽。本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可用于提供來自乳鐵蛋白的多肽，它們不能通過用酶消化天然產(chǎn)生乳鐵蛋白得到。本標(biāo)題發(fā)明還提供在曲霉屬細(xì)胞中產(chǎn)生乳鐵蛋白和乳鐵蛋白相關(guān)多肽的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明允許乳鐵蛋白的生產(chǎn)，它不含有乳過氧化物酶，溶菌酶或其它從牛奶或其它天然來源分離的乳鐵蛋白污染物的其它蛋白質(zhì)。本發(fā)明不限于人cDNA序列的任何具體用途或從合適的DNA序列產(chǎn)生其它種類乳鐵蛋白。
從重組技術(shù)得到的重組LF蛋白可用于多種用途。人類基因可被轉(zhuǎn)到哺乳動物系統(tǒng)，如奶牛和其它農(nóng)業(yè)上重要的動物并在乳汁中表達(dá)。乳鐵蛋白基因的插入以及在動物乳汁中的表達(dá)可以抵抗小豬中典型的鐵缺陷。帶有表達(dá)的乳鐵蛋白基因包含體能夠改善動物抵抗細(xì)菌和病毒感染疾病。人乳鐵蛋白的組織特異性表達(dá)，如在乳腺中，可以對用這種奶喂養(yǎng)的幼體給予表達(dá)基因的抗菌和抗病毒優(yōu)點，并可能提供用于治療的分泌蛋白生產(chǎn)方法。
用標(biāo)題發(fā)明重組方法產(chǎn)生的LF可用于各種產(chǎn)品，包括人或動物食物，作為治療添加劑以增強鐵的運輸和傳遞，其殺病毒和殺菌特性可作為添加劑用于眼藥水，接觸晶狀體和眼睛護(hù)理液，局部皮膚保護(hù)產(chǎn)品，滴耳液，漱口劑，口香糖和牙膏。重組LF可以提供安全的天然產(chǎn)生的產(chǎn)物，它們可局部應(yīng)用并且安全吸收?？咕殍F蛋白多肽在上述產(chǎn)品中作為預(yù)防藥以及作為治療的抗感染藥都是有用的。結(jié)合鐵的多肽對作為營養(yǎng)和治療用途的鐵或其它金屬離子載體，以及作為抑菌劑和殺菌劑都是有用的，特別是在上述類型的產(chǎn)品中。每種蛋白還可用作營養(yǎng)補充并可作為氨基酸和金屬的來源。
用于產(chǎn)生重組人乳鐵蛋白的質(zhì)粒表達(dá)載體不同成分在下面列出，并且不以任何形式作為本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的啟動子，但發(fā)明者優(yōu)選使用從泡盛曲霉中分離的葡糖淀粉酶啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的信號序列和這些信號序列的來源，但發(fā)明者喜歡用來自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶信號序列加葡糖淀粉酶基因的5′部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的連結(jié)序列，但發(fā)明者優(yōu)選使用編碼Kex2肽酶裂解位點的合成連結(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的轉(zhuǎn)錄終止序列，但發(fā)明者優(yōu)選使用黑曲霉葡糖淀粉酶基因的3′非翻譯區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多不同的可選擇標(biāo)記，但發(fā)明者優(yōu)選使用福來霉素抗性基因。
本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都知道并認(rèn)可各種不同的參數(shù)，它們可以改變還不影響通過權(quán)利要求發(fā)明產(chǎn)生的乳鐵蛋白的數(shù)量或質(zhì)量。下面列出可以改變但不影響產(chǎn)生乳鐵蛋白的數(shù)量和質(zhì)量的這些參數(shù)溫度；pH；所需營養(yǎng)；擴(kuò)大規(guī)?？紤]；使用裝置的類型；使用的氧氣/空氣比例；攪拌；相對于穩(wěn)定系統(tǒng)的攪拌系統(tǒng)的應(yīng)用；收獲時間等。
不同的的生長和產(chǎn)生條件可用于泡盛曲霉中重組人乳鐵蛋白的表達(dá)。為了解釋不同的條件而給出下列描述，這些不同的條件可用于hLF在泡盛曲霉中的表達(dá)，并不意味著以任何方式限制本發(fā)明。下面給出的是發(fā)酵生產(chǎn)過程以及用于回收產(chǎn)生的乳鐵蛋白過程的總的概括。本領(lǐng)域任何一位普通的技術(shù)人員知道該方法可以改變或稍加修改以增加目的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽的產(chǎn)量。
為了解釋本發(fā)明的不同實施方案給出下列實施例，它們并不意味以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1用于在泡盛曲霉中表達(dá)重組人乳鐵蛋白的表達(dá)載體pPLF-19的構(gòu)建本實施例說明用于在泡盛曲霉中表達(dá)重組人乳鐵蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建。
I.菌株，質(zhì)粒，酶和培養(yǎng)基A.細(xì)菌和真菌菌株泡盛曲霉菌株ATCC 22342被用作對人乳鐵蛋白異源表達(dá)的宿主菌株。大腸桿菌菌株DH5α用于人乳鐵蛋白表達(dá)載體，pPLF-19的構(gòu)建。
B.質(zhì)粒質(zhì)粒pUC19和pGEM4(Promega，Madison，WI)用于各種導(dǎo)致最終人乳鐵蛋白表達(dá)質(zhì)粒pPLF-19構(gòu)建的克隆步驟。
由質(zhì)粒pUT713(CAYLA，Toulouse-Cedex，F(xiàn)R)衍生含有偶聯(lián)到酵母細(xì)胞色素C1終止子上的福來霉素抗性基因(一種鏈異壁菌的福來霉素結(jié)合蛋白基因)的福來霉素抗性載體，pLO-3，。它在真菌中通過黑曲霉的β-微管蛋白啟動子表達(dá)。
C.酶限制酶從新英格蘭Biolabs(Beverly，MA)獲得。T4連接酶，T4激酶，以及大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片斷購自Bethesda研究實驗室(BRL，Gaithersburg，MD)。綠豆核酸酶從Stratagene(La Jolla，CA)獲得。Taq聚合酶從Promega公司(Madison，WI)獲得。質(zhì)粒構(gòu)建的DNA序列用序列酶版本2.0 T7 DNA聚合酶及試劑盒(美國生物化學(xué)，Cleveland，OH)完成。Novozym 234，一種原生質(zhì)球酶購自NovoBioLabs(Bagsvaerd，Denmark)。
D.普通培養(yǎng)基大腸桿菌菌株在L-肉湯(Difco，Detroit，MI)中培養(yǎng)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化體在含有1.5％瓊脂和125μg/ml氨芐青霉素的L-肉湯平板上培養(yǎng)。用于泡盛曲霉在溶液中培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基(CM)含有50ml20×Clutterbuck鹽(120g Na2NO3，10.4g KCl，10.4g MgSO4·H2O，30.4g KH2PO4)，2.0mlVogel微量元素(0.3M檸檬酸，0.2M ZnSO4，25mMFe(NH4)2(SO4)2·6H2O，10mM CuSO4，3mMSO42-，8mM硼酸，2mMNa2MoO4·2H2O)，5.0g胰化蛋白胨，5.0g酵母提取液，10g葡萄糖溶于一升蒸餾水中。對CM斜面加入1.5％瓊脂。PDA斜面含有39.0g/L溶于水的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Difco，Detroit，MI)，10.0g/L葡萄糖，10.0g/L瓊脂，0.1g/L MgSO4·H2O，0.12g/L KH2PO4，0.25g/LNH4H2PO4。
泡盛曲霉產(chǎn)生乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)于KT-4培養(yǎng)基150g/L麥芽糖，60g/L soyfine豆奶LF，79.8g/L C6H5O7Na3·H2O，15g/L(NH4)2SO4，1.0g/L NaH2PO4，2.05g/L MgSO4·H2O，1.0ml/L吐溫80，2.0ml/L消泡204；Dunn-Coleman等，1991，Bio/technology9976-981。
E.ATCC細(xì)胞保藏按照專利程序的關(guān)于微生物保藏國際認(rèn)可的布達(dá)佩斯協(xié)議條款，下列轉(zhuǎn)化菌株由申請人在1994年7月8日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD.20852)。“Awa LF 24-1”是用含有編碼人乳鐵蛋白cDNA的表達(dá)質(zhì)粒pPLF-19轉(zhuǎn)化的泡盛曲霉。其ATCC保藏號是74290。申請者還同意使這種保藏物為公眾可得，當(dāng)這一申請在美國得到專利批準(zhǔn)時，對于負(fù)責(zé)任的第三者不加限制，并遵守相關(guān)法律和法規(guī)，除了就堅持本申請產(chǎn)生的專利權(quán)利要求所描述的申請人的權(quán)利的第三者之外，不加限制。
II.方法A.人乳鐵蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建下列質(zhì)粒作為最終表達(dá)質(zhì)粒pPLF-19的前身構(gòu)建。pPLF-19構(gòu)建圖顯示于圖1。在此圖中使用的縮寫為Apr氨芐青霉素抗性；hlf人乳鐵蛋白；GA葡糖淀粉酶；pGA來自葡糖淀粉酶的啟動子；GA 3′UTR葡糖淀粉酶3′非翻譯區(qū)；s.s.信號序列；phleo r福來霉素抗性載體。
pPLF-1hlF cDNA從pGEM4hlFc中以2.3kb Sacl/HindIII片斷取出并亞克隆到載體pUC-19中。制備此亞克隆是為了從含有不所期望的NgoMI位點的pGEM4骨架中取出cDNA。
pPLF-2修飾hlF的5′末端以引入單一NgoMI位點，它可以用于無縫加入葡糖淀粉酶(GA)啟動子和信號序列。通過跨越成熟乳鐵蛋白編碼序列的5′末端到單一AccI位點的270bp片斷的PCR擴(kuò)增來進(jìn)行修飾。引物列于下面并分別示于SEQ.ID.No.1和2。
KpnI NgoMI5hLFFW 5′-G GGG TAC CGC GCC GGC CGT AGG AGA AGG AGT GGly Arg Arg Arg Arg Ser(成熟hLF N-端)AccI5hLFRV 5′-TTCGGTCCCGTAGACTTCCGCCGCT此270bp片斷用Promega的Taq聚合酶按下列條件擴(kuò)增1.25到5mM MgCl2；每種引物(5hlFFW和5hlFRV)0.5μM；10ng pGEM4hlFc作為模板。在Perkin Elmwr 9600熱循環(huán)儀上循環(huán)1@2分鐘，96℃；30@20秒，96℃/20秒，55℃/20秒72℃；1@5分鐘，72℃。
片斷從瓊脂糖分離，用酶鈍端化，磷酸化并亞克隆到用SmaI剪切的pUC19中給出pPUC270。擴(kuò)增產(chǎn)物的序列用M13通用正向和反向引物來證實。該片斷然后從pPUC270作為kpnIAccI取出并用于取代pPLF-1的kpn/AccI片斷。生成的質(zhì)粒指定為pPLF-2。
pPLF-6攜帶hLF最后的17bp和GA 3′非翻譯區(qū)(UTR)160bp的280bpEcoRI/PstI片斷從載體pAhLFG(+1)亞克隆進(jìn)EcoRI/PstI剪切的pUC19。
pPLF-7pPLF-2修飾的hLF基因作為EcoRI片斷亞克隆進(jìn)載體pPLF-6。正確取向的質(zhì)粒(pPLF-7)含有緊靠上游單一NgoMI位點和緊靠下游GA3′UTR的160bp的全長成熟hLF序列。GA啟動子和信號序列(見下面)將加入到此載體中。
GA啟動子和信號序列從由泡盛曲霉菌株ATCCC22342分離的基因組DNA通過PCR擴(kuò)增獲得。正向引物跨越GA信號序列的大約1.1kb上游的SacI位點。該引物序列根據(jù)ATCC 10864(GenBank登記號X56442)公布的序列設(shè)計并分別示于SEQ.ID.No.3和4中。15 GAFW5′-TATGCAGAGGAGCTCTCCCCTGACSacI反向引物插入一個NgoMI位點用于連接到hLF上。
NgoMIGARV5′-GAT TCC GCC GGC CAA CCC TGT GCA GAC GAG GC← Ala Leu Gly Thr Cys Val Leu ←正確大小的片斷(1.1kb)從ATCC 22342基因組DNA擴(kuò)增，采用下列條件2.5mM MgCl2；每個引物0.5μM(GAFW和GARV)以及100ng基因組DNA。循環(huán)參數(shù)設(shè)定在1@2分鐘，95℃；30@30秒，95℃/30秒，60℃/45秒，72℃；和1@5分鐘，72℃。
擴(kuò)增產(chǎn)物被鈍端化，磷酸化并亞克隆到用SmaI剪切的pUC-19中。DNA序列從擴(kuò)增片斷的3′端產(chǎn)生以檢查跨越GA信號序列區(qū)擴(kuò)增的保真性。帶有核實序列的克隆用作GA啟動子和s.s.片斷的儲備源。
pPLF-9PCR擴(kuò)增的GA啟動子和信號序列作為SacI/NgoMI片斷被連接到載體pPLF-7上給出載體pPLF-9。在一個方向由連接產(chǎn)生的序列實現(xiàn)了凈連接。
pPLF-18最終GA表達(dá)質(zhì)粒含有GA啟動子、信號序列以及編碼融合到hLF的葡糖淀粉酶原498aa的序列。在GA和hLF序列之間對終止于雙堿性KEX-2識別序列Lys-Arg的葡糖淀粉酶的六肽原改造。嵌合蛋白大概會被內(nèi)源性GA分泌通路更好地識別導(dǎo)致高分泌滴度的hLF。KEX-2連接臂應(yīng)允許從GA中準(zhǔn)確的加工hLF。
pPLF9首先用NgoMI剪切。采用Klenow片斷用dCTP添平末端。然后用綠豆核酸酶除去殘留5′突出端，給出平頭以準(zhǔn)備進(jìn)行符合讀框的蛋白融合。載體然后用NsiI切割以接受如下所述PCR擴(kuò)增的GA序列。
從菌株ATCC 22342PCR擴(kuò)增編碼期望的GA片斷的片斷，其中分別用顯示于SEQ.ID.No.5，6和7的下述引物組合。GA-15′-GAATTCAAGCTAGATGCT該正向引物跨越公布的ATCC 22343(NRRL 3112)GA上游序列(Nunberg等，Mol.Cell.Bio.1984，p2306-2315)的堿基1-18。此序列位于用于構(gòu)建的單一NstI位點的上游區(qū)大約50bp處。
Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Asn Val Ile Ser5′-AGC GTG ACC TCG ACC AGC AAG AAT GTG ATT TCCAAG CGCLys ArgKX2GA 3′-TCG CAC TGG AGC TGG TCG TTC TTA CAC TAA AGGTTC GCG-5′
此反向引物序列與插入的六肽原(下劃線者)編碼序列互補，緊接著編碼為492-498的GA原序列的互補序列。
2.0kb片斷用Taq聚合酶PCR擴(kuò)增。根據(jù)經(jīng)驗確定2.5mMMgCl2給出最好的擴(kuò)增。片斷經(jīng)酶用Klenow鈍端化以除掉潛在從擴(kuò)增剩余的不規(guī)則末端。該平頭片斷然后用NsiI剪切，并作為NsiI/平頭片斷亞克隆到處理的載體pPLF-18(見上面)給出質(zhì)粒pPLF-18。序列通過GA/KEX-2/hLF連接用雙脫氧測序來檢驗。
pPLF-19來自CAYLA載體pUT713(鏈異壁菌ble基因)并從黑曲霉微管蛋白啟動子(pPLO-3)表達(dá)的福來霉素抗性標(biāo)記作為2.3kb HindIII片斷被加入到pPLF-18中給出最終表達(dá)質(zhì)粒pPLF-19。
B. 盛曲霉菌株ATCC 22342的DNA轉(zhuǎn)化用Tilburn等，1983，Gene 26205-221修飾的方法對泡盛曲霉菌株ATCC 22342原生質(zhì)球化和轉(zhuǎn)化。30℃在完全培養(yǎng)基(CM)斜面上培養(yǎng)4到7天的泡盛曲霉ATCC 22342的Conidating培養(yǎng)物用2mlsNP40水(0.005％Nonidet-40)刮下，獲得芽孢懸浮液。1ml此芽孢懸浮液(約1×108芽孢)加入到50mlsCM中并在30℃，200rpm培養(yǎng)22小時。通過雙層干酪包布過濾收集菌絲，并加入到含有5mg/ml Novozym 234(Novo Biolabs，bagsvaerd，Denmark)的50mlsKCM緩沖液(Cantoral等，1987，Biotechnology 5494-497；KCM0.7M KCl，10mM MOPS，pH5.8)中，30℃，90rpm溫育過夜使原生質(zhì)球生成。
通過填有miracloth(Calbiochem；La jolla，GA)的漏斗過濾收獲原生質(zhì)球，并用干酪包布覆蓋裝入四個15ml圓錐性離心管，然后在臺式離心機(jī)上1800rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。粒狀沉淀小心地重懸于總體積15mls的KCM緩沖液中再離心。粒狀沉淀再在15mlsKCM緩沖液中洗滌，然后重懸在KCMC(KCM+50mM CaCl2)緩沖液中至最終密度5×107細(xì)胞/ml。
20μl TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中的5μgspPLF19加入到200μl原生質(zhì)球中，50μl PCM(Cantoral等；PCM40％PEG 8000，10mM MOPS，pH5.8，50mM CaCl2[CaCl2用前加入])小心地移入DNA-原生質(zhì)球混合液中并在冰上溫育30分鐘。
1ml新鮮準(zhǔn)備的PCM加入到轉(zhuǎn)化混合液中，該混合液移入到50mls冷至50℃并分成5塊培養(yǎng)板的再生瓊脂(CM+1.3M甘露糖醇，3％瓊脂)上。用等量的OL+120μg/ml福來霉素(OL1％胨，1％瓊脂；福來霉素[CAYLA；Toulouse，F(xiàn)R])覆蓋前，讓原生質(zhì)球在30℃再生3到5小時。推定的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到含125-150μg/ml福來霉素的PDA斜面上。
C.在泡盛曲霉中人乳鐵蛋白表達(dá)的發(fā)酵條件來自推定的產(chǎn)生HLF轉(zhuǎn)化體的芽孢從選擇性PDA斜面轉(zhuǎn)移到CM斜面上，并在30℃培養(yǎng)4天。用1.5ml NP40水刮此斜面收獲分生孢子，等份的1×108芽孢加入到250ml培養(yǎng)瓶中的30ml KT-4中。培養(yǎng)物在30℃200rpm發(fā)酵6天。在3000rpm離心1ml的發(fā)酵肉湯15分鐘，收集乳鐵蛋白樣品并測定保留的上清液。
D.人乳鐵蛋白測定通過修飾由Vilja等，1985，J.of Imm.Methods 7673-83發(fā)展的非競爭性親和素-生物素免疫測定，定量乳鐵蛋白。96孔微量滴定板(U型Microtest III；Baxter，Chicago，IL)用在涂層緩沖液(0.1M碳酸鈉/碳酸氫鈉，pH9.6)中的100μg/ml兔抗人乳鐵蛋白抗體(Sigma，St.Louis，MO.)涂層，并在4℃振蕩過夜。
第二天，除去涂層溶液，平板用洗滌緩沖液(1×PBS pH7.4，0.5％吐溫20)洗三次，之后用250μl稀釋緩沖液(1×PBS pH7.4，1％BSA[組分V，RIA級，美國Biochemicals，Cleveland，OH]，0.05％吐溫20)在室溫封閉至少1小時。棄去稀釋緩沖液，加入平板100μl稀釋的發(fā)酵樣品和已知的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)，然后在37℃溫育1小時。在加入到微量滴定板之前，從發(fā)酵樣品收集的上清液用稀釋緩沖液1∶1000稀釋。含有人乳鐵蛋白(Sigma，St.Louis，MO.)的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)在稀釋緩沖液中以1到1000ng/ml稀釋。
在37℃反應(yīng)后，樣品被棄去，平板用洗滌緩沖液洗三次。在稀釋緩沖液中從1mg/ml儲備液按1∶7500稀釋的100μl生物素化的抗HLF抗體(生物素-SR-兔抗HLF IgG，Jackson Immuno-Research Labs)加入到每一個孔中并在37℃溫育1小時。
棄去該溶液，在加入100μlABC試劑(Vectastain ABC試劑盒，Vector Labs，Burlingame，GA)前用洗滌緩沖液洗三次平板并在37℃溫育平板1小時。Vectastain試劑在混合兩種溶液前用稀釋緩沖液按A1∶200稀釋，試劑B1∶400稀釋，使用前讓它們在室溫預(yù)溫育1小時。
棄去該ABC溶液，用洗滌緩沖液洗平板5次。加入100μl OPD底物溶液(10ml底物緩沖液[25mM檸檬酸，50mM Na2HPO47H2O，pH5.0]，8mg鄰苯二胺[Bethesda Research Labs，Gaithersburg，MD]，100μl 30％H2O2[Sigma，St.Louis，MO])，平板在暗處室溫溫和攪動溫育20分鐘。至顏色出現(xiàn)后，加入100μl 2M H2SO4停止反應(yīng)。然后在490nm讀取平板，通過與已知標(biāo)準(zhǔn)比較，測定乳鐵蛋白的濃度。
實施例2hLF(pPLF-19)在泡盛曲霉中的表達(dá)和加工人乳鐵蛋白表達(dá)盒pPLF-19轉(zhuǎn)化進(jìn)入泡盛曲霉22342時，在培養(yǎng)基中分泌的乳鐵蛋白通過ELISA試驗及Western blot分析測定。一個轉(zhuǎn)化體，#19-254，產(chǎn)生大約250mg/ml的人乳鐵蛋白(hLF)。更優(yōu)選的轉(zhuǎn)化體，Awa LF 24-1(ATCC登記號74290；#19-24.1)產(chǎn)生大約500mg/ml的人乳鐵蛋白。改善產(chǎn)量的實驗以及菌株的研制正在進(jìn)行，以增加泡盛曲霉中重組體hLF的總產(chǎn)量。至今，本發(fā)明者在含有菌株Awa LF 24-1的泡盛曲霉轉(zhuǎn)化體中已經(jīng)獲得滴定度＞900mg/l的hLF。結(jié)果示于在下面比較的總產(chǎn)量表中。
由于pPLF-19表達(dá)產(chǎn)物是嵌合蛋白，由葡糖淀粉酶的498個氨基酸組成并且hLF的完全編碼區(qū)域被KEX-2斷裂切割位點分開，所以進(jìn)行SDS-PAGE，銀染色法，Western blot分析和N-末端測序以確定該蛋白是否正確地加工。
A.從泡盛曲霉轉(zhuǎn)化體純化的重組體人乳鐵蛋白銀染色SDS-聚丙烯酰胺凝膠分析重組體人乳鐵蛋白從泡盛曲霉轉(zhuǎn)化體的生長培養(yǎng)基中用CM-Sephadex C50(Stowell，K.M.等，Biochem.J.，276349-355)離子交換色譜純化。標(biāo)準(zhǔn)人乳奶LF(Std hLF)和純化的重組體hLF(Rec hLF)在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并銀染色。此分析結(jié)果示于圖2。重組hLF蛋白以已加工hLF(泳道2)的預(yù)期大小遷移，而且與標(biāo)準(zhǔn)hLF(泳道1)的大小相同。分子量標(biāo)記的位置在左邊指示。
B.從泡盛曲霉轉(zhuǎn)化體純化的糖基化和去糖基化重組體人乳鐵蛋白的Western BIot分析從泡盛曲霉轉(zhuǎn)化體生長培養(yǎng)基中純化的重組體人乳鐵蛋白，未用N-糖基化酶F處理和用N-糖基化酶F處理，都用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上并用對人乳鐵蛋白特異的IgG(Sigma)探測。此分析結(jié)果示于圖3。比較未處理的轉(zhuǎn)化體hLF和未處理的標(biāo)準(zhǔn)乳奶說明這兩個蛋白共遷移(圖3，分別為泳道3和1)。N-糖基化酶F水解葡基氨連接產(chǎn)生小分子量的糖自由肽。比較用N-糖基化酶F處理后重組體hLF和標(biāo)準(zhǔn)hLF說明，兩個蛋白同樣遷移示意兩個蛋白相似地N-連接到糖上(圖3，分別為泳道4和2)。
實施例3N-末端序列分析證實重組體人乳鐵蛋白在泡盛曲霉中是正確加工的為了證實在泡盛曲霉中產(chǎn)生的重組體hLF是正確加工的，測序重組產(chǎn)生hLF的N-末端部分。首先，重組hLF在泡盛曲霉中以黑曲霉葡糖淀粉酶基因(498AA)的催化區(qū)域的融合蛋白表達(dá)，它由編碼Kex-2蛋白裂解位點的合成接頭分開。其次，用CM-sephadex C50從生長培養(yǎng)基中純化出重組體hLF(在先由Stowell等描述，Biochem.j.，276；349-59(1991))。為測定重組體hLF在其N-末端是否正確地被加工，用自動Edman降解方法測序純化蛋白開始的10個N-末端氨基酸(5μg)。此分析的結(jié)果概括于圖4。重組體蛋白的序列與人乳奶乳鐵蛋白中相應(yīng)的氨基酸相同。所以，重組體hLF在泡盛曲霉的KEX-2蛋白酶剪切位點正確地被加工。
實施例4在泡盛曲霉中產(chǎn)生的人乳鐵蛋白的功能分析A.標(biāo)準(zhǔn)和重組體hLF的鐵結(jié)合及飽和乳鐵蛋白是一種具有每摩爾LF結(jié)合兩摩爾鐵能力的鐵構(gòu)建糖蛋白。為測定鐵被重組體乳鐵蛋白的結(jié)合是可飽和的，進(jìn)行了鐵結(jié)合測定。為了產(chǎn)生脫鐵-乳鐵蛋白，純化的Rec hLF和人乳奶用0.1M檸檬酸，pH2.0透析，隨后用水徹底透析。用5mM磷酸鈉把溶液的pH慢慢升至pH7.6。增加濃度(從過量0.5到4.0摩爾)的FeCl3∶59FeCl3∶NTA(400∶1∶8)加入到hLF(500μg)的1ml結(jié)合緩沖液(0.025M Tris，pH7.8；0.01M碳酸氫鈉；0.1M NaCl)中。樣品在室溫溫育30分鐘。過一先用15ml結(jié)合緩沖液平衡的NAP-10柱把鐵結(jié)合hLF從未結(jié)合的鐵和NTA中分出來。用液體閃爍計數(shù)定量鐵結(jié)合到LF上的量。該分析結(jié)果概括于圖5中。重組體和標(biāo)準(zhǔn)hLF以相似的方式結(jié)合鐵。鐵的這種結(jié)合是劑量依賴的。此外，鐵被標(biāo)準(zhǔn)和重組體hLF的結(jié)合在鐵與乳鐵蛋白2∶1摩爾比時可飽和。典型地，飽和水平達(dá)92.5％最大結(jié)合。這表示最初的7.5％鐵透析后仍結(jié)合到乳鐵蛋白上。為了本發(fā)明的目的，“標(biāo)準(zhǔn)hLF”或“天然hLF”是從人乳奶分離或從Sigma購買的人乳鐵蛋白。
B.結(jié)合到標(biāo)準(zhǔn)和重組體hLF鐵的pH穩(wěn)定性為了測定結(jié)合到標(biāo)準(zhǔn)和重組體hLF鐵的pH穩(wěn)定性，59Fe-飽和的標(biāo)準(zhǔn)和重組體hLF(500μg)用從pH7.0到pH2.0范圍的緩沖液在4℃透析48小時，除去為結(jié)合的鐵(Stowell等；biochem.J.，276；349-59(1991))。透析后，結(jié)合到hLF樣品上的鐵用液體閃爍計數(shù)定量。此分析結(jié)果示于圖6。鐵從標(biāo)準(zhǔn)和重組體hLF的pH依賴的釋放都相同。標(biāo)準(zhǔn)和重組體hLF在pH7-4的范圍保留大多數(shù)鐵，在pH2.0基本上無鐵。
C.天然和重組體hLF對大腸桿菌0111的抗微生物作用用體外微量滴定板分析(Nonnecker和Smith，J.Dairy Sci.，67；606-613(1984))測定天然(標(biāo)準(zhǔn))和重組體hLF對大腸桿菌0111的抗微生物活性。簡要地，對數(shù)期細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)接種(1×106CFU/ml)培養(yǎng)在基本細(xì)菌培養(yǎng)用胨培養(yǎng)基(100μl)中，存在或不存在濃度增加的Apo-Std或Apo-Rec hLF。該樣品在37℃/200 RPM培養(yǎng)4小時。等份取出，連續(xù)稀釋并在MacConkey瓊脂平板上鋪板過夜用于計數(shù)。該分析結(jié)果示于圖7。對大腸桿菌0111，天然和重組體hLF在所有測試濃度產(chǎn)生相似的劑量依賴的抗微生物作用。
D.天然和重組體hLF對弗氏志賀菌的抗微生物作用按實施例4(C)所述測定天然(標(biāo)準(zhǔn))和重組體hLF對弗氏志賀菌的抗微生物作用。該分析結(jié)果示于圖8。天然和重組體hLF在所有測試濃度產(chǎn)生相似劑量依賴的弗氏志賀菌抑制作用作用。
E.天然和重組體hLF對弗氏志賀菌的抗微生物作用(殺滅時間研究)進(jìn)行天然和重組體hLF抗微生物活性的時程。簡要地，對數(shù)期弗氏志賀菌細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)接種(1×106CFU/ml)培養(yǎng)在基本細(xì)菌培養(yǎng)用胨培養(yǎng)基(100μl)中，存在或不存在濃度增加的Apo-Std或Apo-Rec hLF。該樣品在37℃/200 RPM培養(yǎng)4小時。在各個時間段(0，1，4和20小時)等份取出，連續(xù)稀釋并在MacConkey瓊脂平板上鋪板過夜用于計數(shù)。該分析結(jié)果示于圖9。重組天然的和重組體hLF對弗氏志賀菌以時間依賴的方式產(chǎn)生相似的抗微生物作用，4小時后無可測的弗氏志賀菌CFUs存在。
實施例5允許任何cDNA框內(nèi)亞克隆的通用穿梭載體pPLF-26的構(gòu)建該實施例描述能夠表達(dá)曲霉屬顆粒中hLF的突變形式的人乳鐵蛋白穿梭載體的設(shè)計和構(gòu)建。為了促進(jìn)改變形式的乳鐵蛋白克隆進(jìn)載體，造成單一NotI和EcoRI位點。蛋白在葡糖淀粉酶啟動子和作為葡糖淀粉酶hLF嵌合體信號序列的方向表達(dá)，它在體內(nèi)通過KEX-2剪切位點的識別來加工。兩種載體也含有增加mRNA穩(wěn)定性的葡糖淀粉酶3′非翻譯區(qū)和福來霉素抗性基因用于曲霉屬中的選擇作用。
I.人乳鐵蛋白表達(dá)載體構(gòu)建A.pPLF-26的構(gòu)建為了造成能夠接受乳鐵蛋白突變形式的表達(dá)載體，改變幾個限制位點以容許單一克隆位點。代替進(jìn)入質(zhì)粒的乳鐵蛋白突變形式，設(shè)計在hLF基因的5′末端加入NOTI位點。選擇EcoRI位點作為在hLF基因3′末端的單一克隆位點；以及，其它存在的EcoRI位點需要刪除以使此位點單一。
除了單一克隆位點，pPLF-26含有泡盛曲霉葡糖淀粉酶(GA)啟動子、信號序列、以及通過KEX-2識別位點與hLF分隔開的葡糖淀粉酶蛋白的498個氨基酸。該載體還含有黑曲霉GA3′非翻譯區(qū)(UTR)，以及來自鏈異壁菌(CAYLAZ載體pUT713)被黑曲霉β-微管蛋白啟動子表達(dá)的福來霉素抗性基因。為了在大腸桿菌中選擇和復(fù)制，質(zhì)粒含有ColEI復(fù)制起點和氨芐青霉素抗性基因。hLF表達(dá)載體pPLF-26的構(gòu)建概括于圖10-A和圖10-B，構(gòu)建中期的描述如下。
pPLF18Sp.Alt含有啟動子，信號序列和通過KEX-2識別位點與hLF分隔開的葡糖淀粉酶的部分蛋白序列的質(zhì)粒pPLF-18被選作起始質(zhì)粒，用于期望位點修飾。pPLF-18用SphI消化分離兩個片斷；含有hLFd 3.3 kb片斷以正確的取向被亞克隆到體外誘變載體pALTER給出pPLF18Sp.Alt。
pR18.2出自pPLF-18的4.4kb Sph片斷重新連結(jié)得到pR18.2。
-pNot.9通過載體pPLF18Sp.Alt的體外誘變造成跨越KEX-2剪切位點和hLF起始位點的NotI限制位點。把“T”核苷酸改變?yōu)椤癈”核苷酸造成的NotI位點是符合讀框的，并未改變?nèi)魏伟被帷Ｏ铝?1堿基核苷酸(如SEQ.ID.No.8所示)被用于誘變，其中小寫字母指一個堿基改變寡聚HLF NotINotI5′AG CGC GGC Ccc AGG AGA AGG A 3′...... Lys ArgGlv Arc Arc ArcArc......
成熟的HLF誘變寡聚HLF NotI用于與氨芐青霉素修復(fù)寡核苷酸(Promega)偶聯(lián)退火成單鏈pPLF18Sp.AltDNA，然后用T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶補平。修復(fù)負(fù)菌株BMH71-18muts和JM109的轉(zhuǎn)化后，選擇的轉(zhuǎn)化體的50％包含在新的NotI位點，其中之一指定為pNot.9。
pΔE12質(zhì)粒pR18.2yong EcoRI消化，兩個片斷用凝膠電泳分離。兩個片斷都單獨用Klenow補平，并且較大的3.6kb片斷用牛小腸磷酸酶(CIP)在50℃作用1小時去磷酸化。酚抽提和乙醇沉淀后，兩個補平的片斷相互平端連接。轉(zhuǎn)化前，連接混合液用EcoRI消化以使任何仍含有EcoRI位點的載體線性化。16個克隆中的三個均具有線性化仍含有一個EcoR1位點的任何載體的EcoR1。其中之一指定為pΔE12。
pPLF-25pΔE12用SphI消化并用CIP去磷酸化。從pNot.9分離含有新的NotI位點的3.3kb SphI片斷并連接到pΔE12/Sph。帶有正確取向SphI片斷的克隆指定為pPLF-25，它含有兩個單一的EcoRI和NotI位點，并且hLF融合到被GA啟動子表達(dá)的葡糖淀粉酶序列。
pLO3ΔRI為了使pPLF-25對在曲霉屬中選擇有用，加入了福來霉素抗性盒。在質(zhì)粒pLO3中的盒含有兩個EcoRI位點，它們在該盒加入前必須除去。質(zhì)粒pLO3用EcoRI消化，分離兩個4.3和0.9kb片斷，并分別用Klenow補平。補平反應(yīng)后，4.3kb片斷用CIP處理，然后純化和沉淀。兩個補平的片斷相互連接過夜。細(xì)菌轉(zhuǎn)化后選擇的克隆顯示24個中的5個具有補平的兩個EcoRI位點并正確取向，給出pLO3ΔRI。
pPLF-26來自pLO3ΔRI，含有被B-微管蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄的福來霉素抗性基因的2.3kb HindIII片斷，連接到用HindIII消化和用CIP去磷酸化的pPLF-25上。16個克隆有9個在兩個取向有HindIII片斷。指定為“pPLF-26”的質(zhì)粒具有在如hLF基因的相同方向轉(zhuǎn)錄的福來霉素抗性基因。
圖11表示含有用于克隆的單一NotI和EcoRI位點的通用穿梭載體pPLF-26的詳細(xì)描述。在葡糖淀粉酶(GA)啟動子區(qū)域已存在的EcoRI位點通過補平除去。該載體也含有GA非翻譯區(qū)、Kex-2切割位點、以及用于在泡盛曲霉選擇的福來霉素抗性。注意所有已知限制位點示于該圖。
圖12表示用各種限制性酶消化pPLF-26和pPLF-19以證實單一NotI和EcoRI位點的存在、質(zhì)粒的取向的結(jié)果。1μg pPLF-26或pPLF-19DNA以20μl體積用指出的限制酶在37℃消化1小時。泳道1，1μgλ-HindIII標(biāo)準(zhǔn)。泳道2，用EcoRI消化的pPLF-26。泳道3，pPLF-19/EcoRI.。泳道4，pPLF-26/EcoRI和NotI。泳道5，pPLF-19/EcoRI和NotI。泳道6，pPLF-26/BamHI。泳道7，pPLF-19/BamHI。泳道8，pPLF-26/HindIII。泳道9，pPLF-19/HindIII。泳道10，pPLF-26/SphI。泳道11，pPLF-19/SphI。泳道12，pPLF-26/Xba(注意未完全消化)。泳道13，pPLF-19/Xba。
此通用載體能容易地適應(yīng)表達(dá)各種不同的期望蛋白。例如，公布的hLF的序列可以插入到此載體并從其表達(dá)和分離。
實施例6牛和豬乳鐵蛋白在泡盛曲霉中的表達(dá)在實施例5中構(gòu)建的通用泡盛曲霉表達(dá)載體能用來允許任何感興趣cDNA的符合讀框亞克隆。此載體pPLF-26與利用來在泡盛曲霉表達(dá)人乳鐵蛋白的pPLF-19相似。使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增它們的已知DNA序列，5′和3′寡核苷酸引物可以設(shè)計成分別含有Not1和EcoR1末端并用于獲得編碼成熟豬和牛乳鐵蛋白的全長cDNA序列。PCR片斷可以用Not1消化，用綠豆核酸酶(Stratagene)修復(fù)，所有用EcoRI消化的可以允許符合讀框的亞克隆到經(jīng)Not1酶切、修復(fù)、EcoR1消化的pPLF-26。該質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化到泡盛曲霉中以獲得前面描述的人乳鐵蛋白非DNA的表達(dá)和分泌。
實施例7人乳鐵蛋白在不同曲霉菌株中的表達(dá)比較研究本實施例比較了用不同載體構(gòu)建得到的不同曲霉菌株，特別是米曲霉和構(gòu)巢曲霉中hLF表達(dá)的不同水平。這些數(shù)據(jù)將與上面列出的泡盛曲霉中hLF表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
A.米曲霉中人乳鐵蛋白的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒pAhLFG設(shè)計含有編碼人乳鐵蛋白的完整cDNA序列并用于在米曲霉中的相同表達(dá)。設(shè)計、構(gòu)建和pAhLFG圖示的詳細(xì)情況見共同未決的專利申請，94年5月27日提交的US序列號08/250,308，它是92年4月24日提交現(xiàn)已放棄的申請序列號07/873,304的部分延續(xù)。共同未決的專利申請US序列號08/250,308的公開在此插入作為參考。
表達(dá)質(zhì)粒pAhLFG含有編碼α淀粉酶啟動子，分泌信號序列和成熟α淀粉酶首密碼子的米曲霉AMYII基因的5′-旁側(cè)序列。編碼成熟人乳鐵蛋白的cDNA亞克隆到這些序列的下游框內(nèi)，通過向培養(yǎng)基中加入淀粉來產(chǎn)生重組蛋白。黑曲霉葡糖淀粉酶3′非翻譯區(qū)提供轉(zhuǎn)錄終止子和聚腺苷酸化信號。該質(zhì)粒還含有粗糙鏈孢霉pyr4選擇性標(biāo)記和一個氨芐青霉素抗性基因。
Southern印記分析在轉(zhuǎn)化的米曲霉菌株中進(jìn)行，該數(shù)據(jù)先前存在于94年5月27日提交的共同未決的專利申請美國系列號08/250,308中，它是92年4月24日提交現(xiàn)已放棄的申請系列號07/873,304的部分延續(xù)。簡要地說，各轉(zhuǎn)化株的基因組DNA和對照A07與放射標(biāo)記的hLFcDNA探針(2.1kb)雜交。結(jié)果證明放射性標(biāo)記片斷(2.8kb)產(chǎn)生自表達(dá)質(zhì)粒的EcoR1酶切，它存在于所有轉(zhuǎn)化株(#1-9)中，但在對照未轉(zhuǎn)化的A07中不存在。
進(jìn)行Northern分析以確定在表達(dá)質(zhì)粒調(diào)控元件下乳鐵蛋白mRNA是否在米曲霉中正確和有效的轉(zhuǎn)錄。該數(shù)據(jù)先前存在于94年5月27日提交的共同未決的專利申請美國系列號08/250,308中，它是92年4月24日提交現(xiàn)已放棄的申請系列號07/873,304的部分延續(xù)。簡要地說，結(jié)果證明用32P標(biāo)記的人LF cDNA(2.0kb)探針可檢測人乳鐵蛋白mRNA。用人LF放射性標(biāo)記的cDNA探針雜交檢測轉(zhuǎn)化株中而不是對照的未轉(zhuǎn)化株中特異的對乳鐵蛋白mRNA(2.3kb)正確大小的放射性標(biāo)記帶。用點雜交進(jìn)行的mRNA水平等量顯示對照A07和被試轉(zhuǎn)化株(#1)之間內(nèi)源性α淀粉酶mRNA表達(dá)的可比水平。
為了檢測重組LF在米曲霉表達(dá)和分泌的水平，轉(zhuǎn)化株(#1)在3％淀粉存在下、30℃培養(yǎng)72小時。收集培養(yǎng)物，菌絲體在pH10洗滌以釋放與細(xì)胞壁松散結(jié)合的蛋白質(zhì)(Huge-Jensen等，Lipids，24781-785(1989))。結(jié)果見圖16。用直接抗人乳鐵蛋白的特異IgG進(jìn)行Western免疫印記分析檢測到在轉(zhuǎn)化株中對應(yīng)于乳鐵蛋白大小的78kd蛋白，它在對照A07中不存在。(圖16A，2、3泳道)。
圖16A泳道1含有乳奶hLF標(biāo)準(zhǔn)品(500ng)；泳道2和3分別含有來自誘導(dǎo)的對照A07和#1轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物樣品(40μg蛋白)；泳道4到6含有來自培養(yǎng)物的重組hLF經(jīng)CM-葡聚糖純化后收集的各20μl等體積洗脫組分(分別是#35，40和45)。雙銀染的SDS-PAGE凝膠分析還顯示轉(zhuǎn)化株中存在78kd蛋白，它在A07對照中不存在(圖16B，泳道2和3)。用抗hLF的特異性生物素化的IgG進(jìn)行ELISA分析(Vilja等，J.Immunol.Methods 7673-83(1985))表明重組hLF在5-25mg/l水平分泌，并代表來自誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中大約5％的總培養(yǎng)物蛋白。在整合的拷貝數(shù)和重組蛋白分泌的水平間無相關(guān)性。載體設(shè)計和生產(chǎn)水平見下表。
用CM-葡聚糖C5026通過離子交換層析從#1轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)物中純化重組乳鐵蛋白(Stowell等，Biochem.J.276349-355(1991))。人乳鐵蛋白用線性鹽梯度從柱上洗脫。用直接對hLF的特異性IgG通過Western免疫印記雜交在組分35到45中檢測到相應(yīng)于hLF大小的免疫反應(yīng)區(qū)帶(圖16A，泳道4到6)。用銀染SDS-PAGE的雙重樣品分析顯示該免疫反應(yīng)hLF對應(yīng)于這些組分中的主要蛋白區(qū)帶(圖16B，泳道4到6)。這些結(jié)果表明這種單離子交換層析步驟可達(dá)重組hLF約95％純化。圖16B對圖16A描述的雙重樣品的SDS聚丙烯酰胺凝膠分析的銀染。
為了確定hLF是否在其N-末端被正確加工，該重組蛋白用自動的Edman降解步驟從N-端對10個殘基進(jìn)行測序。除了在N-末端附加的丙氨酸殘基(圖16C)，它被導(dǎo)入我們的質(zhì)粒構(gòu)建以準(zhǔn)確模擬信號肽與成熟α-淀粉酶的連接，此材料的大部分與天然人乳LF相應(yīng)的氨基酸相同(Metz-Boutigue等，Eur J.Biochem.145659-676(1984))。小部分失去了N-末端Ala-Gly-Arg三肽或Ala-gly-Arg-Arg四肽。天然hLF先前的分析提示這種加工形式對hLF蛋白本身可能是固有的(Hutchens等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.882994-2998(1991))，或可能由于米曲霉信號肽酶N-末端加工能力的異質(zhì)性(Christensen等，Bio/Technology 61419-1422(1988)；Huge-Jensen等，Lipids 24781-783(1989))。
B.人乳鐵蛋白在構(gòu)巢曲霉中的表達(dá)設(shè)計和構(gòu)建用于hLF cDNA在構(gòu)巢曲霉中表達(dá)的質(zhì)粒。該載體的設(shè)計和構(gòu)建(包括所有中間載體)的細(xì)節(jié)先前在1993年10月28日提交，美國系列號08/145,681的共同未決專利申請中描述。
簡要地，構(gòu)巢曲霉表達(dá)質(zhì)粒pAL3hLFT，含有構(gòu)巢曲霉alcA基因5′旁側(cè)序列的300bp，含有控制基因表達(dá)所必須的所有調(diào)節(jié)元件，該載體包含來自構(gòu)巢曲霉的乙醇脫氫酶啟動子，天然hLF信號序列，編碼hLF的cDNA，構(gòu)巢曲霉的BenA3′非翻譯序列和粗糙鏈孢霉pyr4選擇性標(biāo)記。
轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉菌株進(jìn)行Southern印記分析，數(shù)據(jù)先前在1993年10月28日提交，美國系列號08/145,681的共同未決專利申請中描述，并在此插入作為參考。簡要地，進(jìn)行Southern印記分析以確認(rèn)轉(zhuǎn)化體含有帶有hLF cDNA的整合質(zhì)粒。在泳道1到10而非對照芽孢的DNA中檢測到預(yù)期大小(2.3kb)的hLF特異的放射性標(biāo)記區(qū)帶。這些結(jié)果證明hLF cDNA被整合的所有被試構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體的基因組中，每個細(xì)胞隨意的從一個拷貝到20個拷貝有所不同。質(zhì)粒整合的構(gòu)巢曲霉基因組的位置由于沒有對靶載體進(jìn)入特殊位點的同源序列是隨機(jī)的。
hLF在構(gòu)巢曲霉中產(chǎn)生的具體細(xì)節(jié)先前在1993年10月28日提交，美國系列號08/145,681的共同未決專利申請中描述。簡要地，分子孢子(1×106ml)與乙酸鈉為碳源，加入或不加入1.2％乙醇，在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)以誘導(dǎo)hLF cDNA的轉(zhuǎn)錄。用Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA)收集并分離培養(yǎng)物和菌絲體。菌絲體(200mg)冷凍干燥過夜。在特氟龍玻璃勻漿器中用磷酸緩沖液在苯甲基氟磺酸存在下通過勻漿準(zhǔn)備總細(xì)胞提取物。離心該勻漿，并回收含有可溶組分的上清液。通過冷凍干燥濃縮培養(yǎng)基并重懸于PDS中。用Bradford試劑根據(jù)制造者的說明(Biorad，Richmond，CA)測定蛋白濃度。含有40μg蛋白和可溶性提取物(50μg蛋白)的濃縮培養(yǎng)基樣品進(jìn)行SDS-PAGE。純化的乳鐵蛋白用作標(biāo)準(zhǔn)(hLF std)溶解蛋白用Western印記方法電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。該濾膜用含有2％干牛奶的Tris緩沖液封閉，然后再加入1μg/ml抗hLF的特異性多克隆IgG(Sigma，St.Louis，MO)的相同緩沖液中溫育。濾膜用TBS/0.05％NP-40洗滌，然后與125碘蛋白A保溫，該濾膜然后洗滌干燥并在-70℃對柯達(dá)XAR5膠片曝光過夜。該膠片然后進(jìn)行放射自顯影。放射自顯影證明hLF的產(chǎn)生。
進(jìn)行Western分析以確定hLF cDNA是否在構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體中，在alcA啟動子控制下是否表達(dá)。來自一個轉(zhuǎn)化體(No.5)的分子孢子(1×106ml)，含有整合hLF cDNAs的最高拷貝數(shù)。培養(yǎng)物收集洗滌后再接種到補充乙醇的基本培養(yǎng)基中，在收集培養(yǎng)物之前，再生長12或24小時，細(xì)胞提取物和培養(yǎng)基樣品通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上并用對hLF特異的多克隆IgG免疫印記。與天然hLF無區(qū)別的免疫反應(yīng)區(qū)帶在來自5號轉(zhuǎn)化體加入乙醇誘導(dǎo)僅12和24小時后在細(xì)胞和培養(yǎng)基中是明顯的。這些結(jié)果證明hLF在轉(zhuǎn)化的泡盛曲霉中，在alcA啟動子控制下表達(dá)。
Western分析揭示hLF在所有剩余的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中(未給出數(shù)據(jù))。一般地，在質(zhì)?？截悢?shù)和得到的表達(dá)水平之間存在相關(guān)性。在培養(yǎng)基中，僅用含有整合表達(dá)質(zhì)粒(1，5，7和10號)的多拷貝的轉(zhuǎn)化體來檢測hLF。
進(jìn)行5號轉(zhuǎn)化體的預(yù)發(fā)酵以測定產(chǎn)生hLF的大約數(shù)量。用直接對hLF的特異生物素化IgG進(jìn)行ELISA分析，說明產(chǎn)生的重組hLF的總水平是5mg/l，有大約30％(1.5-2.0μg/ml)的此原料分泌到培養(yǎng)基中。見下表載體設(shè)計和產(chǎn)量水平。
所以，該實施例表明本申請者通過修飾表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建的設(shè)計和改變所有的宿主細(xì)胞，已改善并增加了人乳鐵蛋白的表達(dá)。如在下表指明的，幾個不同的載體構(gòu)建已用于在至少四個不同的曲霉屬菌株中生產(chǎn)人乳鐵蛋白。產(chǎn)生的人乳鐵蛋白的量用每毫升hLF毫克數(shù)表示。
為了方便，每個載體成分以從左到右的方向出現(xiàn)于載體構(gòu)建中的順序列表。包括在表達(dá)質(zhì)粒載體的元件包括啟動子和啟動子源，信號序列和信號序列源，連接臂序列，編碼人乳鐵蛋白的DNA，轉(zhuǎn)錄終止序列，印記可選擇的標(biāo)記物。
>
實施例8用含有等位基因變異的公開DNA序列生產(chǎn)乳鐵蛋白可以使用編碼乳鐵蛋白的幾個已知DNA序列中的任一個，如在上面參考的發(fā)表文獻(xiàn)和專利申請中確定的，在此引入作為參考。另外，可以使用保持了乳鐵蛋白性質(zhì)的編碼乳鐵蛋白多肽片斷的DNA序列。普通的技術(shù)人員會明白和知道本發(fā)明的范圍，還包括不同的被公開和顯然來自人、豬或牛乳鐵蛋白的等位基因變異的產(chǎn)物。一些等位基因變異在文獻(xiàn)中已有報道，它們試圖作為可能通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的乳鐵蛋白類型而被包括。
實施例9發(fā)酵方案不同的生長和生產(chǎn)條件可以用于泡盛曲霉中重組人乳鐵蛋白的表達(dá)。下列描述存在目的是為了解釋各種條件，它能用于hLF在泡盛曲霉中的表達(dá)并不意味著是本發(fā)明任何形式的限制。下面提供的是發(fā)酵生產(chǎn)過程和用于回收生產(chǎn)的乳鐵蛋白的過程的一般概要。為了增加期望的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽的產(chǎn)量，普通的技術(shù)人員會明白方案可以改變或以稍加以修飾。
以下是通過使用發(fā)酵過程生產(chǎn)乳鐵蛋白的簡要概括。
I.發(fā)酵工藝A.培養(yǎng)基成分1)種子培養(yǎng)基Roquette Corn Steep Power 100g/L葡萄糖10g/LMgSO4-7H2O 1g/LNaH2PO4-2H2O 1g/L高壓滅菌前調(diào)pH到5.8并高壓滅菌15分鐘。
2)生產(chǎn)培養(yǎng)基(濃度指接種后)Amaizo Lodex-5部分水解的玉米淀粉 175g/LRoquette Corn Steep Power(SolulysAST) 60g/L檸檬酸三鈉80g/LMgSO4-7H2O 1g/LNaH2PO4-2H2O 1g/L硫酸銨15g/L消泡劑204 2ml/L高壓滅菌前調(diào)pH到5.8并高壓滅菌15分鐘。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當(dāng)部分水解的淀粉用于發(fā)酵工藝時，可以獲得增加的乳鐵蛋白產(chǎn)量。然而，未處理的玉米淀粉和葡萄糖配合產(chǎn)生了合理產(chǎn)量的乳鐵蛋白。通過常規(guī)實驗，可以使用較少量的淀粉產(chǎn)物或代替更貴的淀粉產(chǎn)物以優(yōu)化乳鐵蛋白的產(chǎn)量。
B.發(fā)酵工藝至今，發(fā)酵是以分批工藝進(jìn)行的。最大產(chǎn)物濃度在5-6天達(dá)到。
1)接種階段1a)2L錐形瓶中的450mls接種培養(yǎng)基b)用每毫升1×106芽孢的接種培養(yǎng)基接種c)在33℃，70％相對濕度，240rpm(50mm throw shaker)下接種24小時。
2)接種階段2a)20L接種培養(yǎng)物在具有兩個12cm六片rushton推動器的NBSMicros 30發(fā)酵罐中。
b)消毒30分鐘用2％階段1的種子接種。
500rpm攪拌空氣流速 0.75VVM
壓力 300mbarpH 未控制DO 未控制3)生產(chǎn)中試容器是具有3∶1縱橫比的B.Braun Biotech UD 100。兩個16cm六漿Rushton高速攪拌機(jī)用于攪拌。發(fā)酵在接種后80L進(jìn)行。
攪拌 450rpm能量輸入未加檢查溫度 33℃通氣 0.75VVM 此可變因素未加檢查壓力 300mbarpH 未控制DO 未控制此可變因素未加檢查消泡劑 不需要容器條件如上描述。容器裝有80L的培養(yǎng)基成分并brought to aVolume of 72L withdeionized water。消毒30分鐘。生長36-48小時時轉(zhuǎn)移8升(10％CV)階段2種子。目前正研究優(yōu)化的接種工藝。
到24小時可見乳鐵蛋白產(chǎn)物，在5-6天產(chǎn)物積累有最大值。
II.下游加工A.過濾發(fā)酵達(dá)30-40％非成球形態(tài)的收集細(xì)胞體積。假如使用過濾來澄清肉湯，則需要助濾劑。由于加工體積小，可以在3,000cm2支撐物上直接真空過濾。用聚丙烯墊作為底板。
最初使用硅藻土作為助濾劑。然而，直接煅燒或融化煅燒的硅藻土因為結(jié)合乳鐵蛋白而不能用作助濾劑。只有酸洗的硅藻土不結(jié)合乳鐵蛋白。酸洗硅藻土(DE)比未處理硅藻土購買價格貴40-50倍。另外的選擇是在生產(chǎn)現(xiàn)場酸洗DE。初步實驗測定，硅藻土可以用3N HCl攪成泥漿，混合45分鐘，然后用去離子水洗至pH4.0。乳鐵蛋白不與這樣處理的材料結(jié)合。處理的DE與總?cè)鉁?∶5W/V比例使用。在與肉湯混合前，DE與去離子水?dāng)嚦赡酀{。發(fā)現(xiàn)l∶l0的比例不利于過濾。
一種可供選擇的產(chǎn)物是纖維素纖維。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)Solkafloc 10IND(Protein Technologies International in Urbana，IL；1-800-258-0351)很奏效且不結(jié)合乳鐵蛋白。發(fā)明者用Solkafloc作為裝填物來幫助過濾。對100L的發(fā)酵肉湯，20kg的Solkafloc與100L去離子水?dāng)嚦蓾{狀物。肉湯混合到漿狀物中?；旌衔锟梢匀菀椎剡^濾。在此步獲得的澄清液使進(jìn)一步下游加工(超濾和柱層析)成為可能，而不需要附加過濾。對單一一批過濾，Solkafloc與肉湯和去離子水的比例正在優(yōu)化過程中。如果洗濾器濾渣，乳鐵蛋白的回收應(yīng)該幾乎是定量的。用連續(xù)的過濾處理裝置，以Solkafloc為助濾劑的方法要改變。
可以使用具有改善的流變學(xué)和過濾特性的已存在菌株或改進(jìn)菌株。例如，在攪拌箱發(fā)酵中成球的突變株在加工過程中可允許較厚的濾渣并且不需要助濾劑除非作為濾料層。
B.超濾澄清的肉湯用超濾方法濃縮。兩個具有30,000 MW膜的AmiconS10Y30(各0.93m2)螺旋柱體用于Amicon DC-30系統(tǒng)。該膜是一種低蛋白質(zhì)結(jié)合的纖維素材料。流動速度為1-1.8rpm，取決于處理的階段。一旦達(dá)到最小的操作處理體積，濃縮的溶液就連續(xù)用5倍體積的含有0.1M NaCl，1mM EDAT和25mM Tris pH7.5的緩沖液連續(xù)透析。該緩沖液然后冷至4℃，透析的溶液濃縮至可能的最小體積并回收。此過程的產(chǎn)率已接近100％。
最后的超濾(UF)濃縮物為5-8mg/ml總蛋白，乳鐵蛋白占總蛋白的10％。在開發(fā)新菌株時會優(yōu)化回收速率。對于一個80升發(fā)酵量，用此系統(tǒng)濃縮和透析約需2小時。
C.層析分離使用Pharmacia CM瓊脂糖快流速凝膠。此樹脂對澄清肉湯中乳鐵蛋白的結(jié)合容量約為20mg/ml。
將UF濃縮物上柱。加樣的柱開始用0.1M NaCl/25mM Tris pH7.5沖洗，然后用0.2M NaCl/25mM Tris pH7.5沖洗。除非該柱超載，乳鐵蛋白不會釋放出來。該乳鐵蛋白用0.5M NaCl/25mM Tris pH7.5洗脫。含有乳鐵蛋白的洗脫組分體積通常為樹脂長體積的2倍。
D.轉(zhuǎn)化為脫鐵蛋白混合含有乳鐵蛋白的0.5M NaCl組分。加入1M檸檬酸銨使終濃度為0.1M檸檬酸銨。pH用10N鹽酸緩慢調(diào)至2.0。該溶液轉(zhuǎn)至合適大小的使用3,000MW膜的超濾裝置，濃縮至合適的體積，然后連續(xù)用5倍體積的0.5M NaCl/0.1M檸檬酸銨pH2.0透析。完成鐵的釋放和透析后，pH調(diào)至中性以防止在下一步中的沉淀。如果存在殘留的鐵，它將在中性pH再與乳鐵蛋白結(jié)合。透析液變?yōu)?0mM碳酸氫銨(pH7.8)，溶液連續(xù)用5倍體積的緩沖液透析。該溶液然后濃縮至最小體積，回收并冷凍干燥。
該步驟現(xiàn)在已被優(yōu)化。特異因子被認(rèn)為依賴于使用的菌株。一些因子包括(1)pH限制，(2)裝置的預(yù)處理以消除鐵，和(3)緩沖液用Chelex樹脂預(yù)處理以除去痕量的鐵?？赡苡斜匾ㄟ^一種中間緩沖液，如0.2MNaCl 50mM碳酸氫銨以避免乳鐵蛋白沉淀以及殘留鐵的重新結(jié)合。
實施例10在米曲霉或黑曲霉細(xì)胞中乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為一種融合產(chǎn)物的產(chǎn)生A.米曲霉中乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的表達(dá)與前面描述相似的表達(dá)載體可被構(gòu)建用于乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為一種融合蛋白產(chǎn)物在米曲霉中的表達(dá)。米曲霉表達(dá)載體可含有下列從5′到3′可操作連結(jié)的成分(a)來自米曲霉α-淀粉酶基因啟動子的啟動子；
(b)米曲霉α-淀粉酶基因的信號序列；(c)米曲霉α-淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶裂解部位的連接序列，在那有一個對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；(f)福來霉素抗性可選擇標(biāo)記基因；其中所述載體能產(chǎn)生作為融合蛋白的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷，并與加工的蛋白表達(dá)相同。
該載體然后用來轉(zhuǎn)化米曲霉細(xì)胞；這種新質(zhì)粒載體構(gòu)建的產(chǎn)物是一種融合蛋白，包含部分融合到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的高表達(dá)米曲霉α-淀粉酶基因，對應(yīng)于上面(e)步驟的核苷酸序列。乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷融合產(chǎn)物然后可以被對Kex2肽酶位點特異的內(nèi)源性米曲霉蛋白酶加工。
B.黑曲霉中乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的表達(dá)與前面描述相似的表達(dá)載體可被構(gòu)建用于乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為一種融合蛋白產(chǎn)物在黑曲霉中的表達(dá)。黑曲霉表達(dá)載體可含有下列從5′到3′可操作連結(jié)的成分(a)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子；(b)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列；(c)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶裂解部位的連接序列，在那有一個對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；(f)福來霉素抗性可選擇標(biāo)記基因；其中所述載體能產(chǎn)生作為融合蛋白的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷，并與加工的蛋白表達(dá)相同。
該載體然后用來轉(zhuǎn)化黑曲霉細(xì)胞；這種新質(zhì)粒載體構(gòu)建的產(chǎn)物是一種融合蛋白，包含一半融合到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的高表達(dá)黑曲霉葡糖淀粉酶基因，對應(yīng)于上面(e)步驟的核苷酸序列。乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷融合產(chǎn)物然后可以被對Kex2肽酶位點特異的內(nèi)源性黑曲霉蛋白酶加工。
總之，可見本發(fā)明和這里公開的實施方案很好地適合完成目標(biāo)，并得到本申請的最終闡述。在方法和設(shè)備中會做某些改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍。意識到改變是可能的，并進(jìn)一步認(rèn)為負(fù)責(zé)任何提交的權(quán)利要求的每個元素或步驟將被理解為指以基本相同或等效的方法完成基本相同的結(jié)果的所有等效的元素或步驟。試圖以任何使其原理可被應(yīng)用的形式廣泛地覆蓋本發(fā)明。因此本發(fā)明很好的適合完成目標(biāo)并獲得提及的結(jié)果和優(yōu)點以及其中固有的其它方面。
序列列表(1)總說明(i)申請人Conneely，Orla M.，等。
(ii)發(fā)明題目來自曲霉屬融合產(chǎn)物中經(jīng)加工的重組乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷的表達(dá)(iii)序列數(shù)8(iv)通信地址(A)收信人Pennie & Edmonds(B)街道1155 Avenue of the Americas(C)城市紐約(E)國家美國(F)郵政編碼10036-2711(v)計算機(jī)可讀方式(A)介質(zhì)類型磁帶(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.25版(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)枌⒅付?B)提交日期在此同時給出(C)分類(viii)律師/代理人資料(A)姓名Albert P.Halluin(B)登記號25,227(C)查詢/案號8206-101(ix)電信(A)電話415/854-3660(B)傳真415/854-3694(C)電報66141 PENNIE(2)SEQ ID NO1的說明(i)序列特征(A)長度32個堿基對
(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO1GGGGTACCGC GCCGGCCGTA GGAGAAGGAG TG 32(2)SEQ ID NO2的說明(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO2TTCGGTCCCG TAGACTTCCG CCGCT 25(2)SEQ ID NO3說明(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO3TATGCAGAGG AGCTCTCCCC TGAC 24(2)SEQ ID NO4說明(i)序列特征
(A)長度32堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO4GATTCCGCCG GCCAACCCTG TGCAGACGAG GC 32(2)SEQ ID NO5說明(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO5GAATTCAAGC TAGATGCT 19(2)SEQ ID NO6說明(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO6AGCGTGACCT CGACCAGCAA GAATGTGATT TCCAAGCGC39(2)SEQ ID NO7說明(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO7TCGCACTGGA GCTGGTCGTT CTTACACTAA AGGTTCGCG39(2)SEQ ID NO8說明(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO8AGCGCGGCCG CAGGAGA AGG A 2權(quán)利要求
1.新的重組表達(dá)載體質(zhì)粒，其中包括下列可行地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)啟動子；(b)信號序列；(c)其產(chǎn)物從曲霉屬細(xì)胞分泌的高表達(dá)內(nèi)源性基因的5′部分；(d)連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白水解酶；(e)編碼乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；其中所述載體能夠產(chǎn)生作為融合蛋白的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷，并表達(dá)與加工后蛋白相同的產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的載體，其中啟動子選自乙醇脫氫酶，α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，和benA基因。
3.權(quán)利要求2的載體，其中啟動子來自葡糖淀粉酶基因。
4.權(quán)利要求3的載體，其中葡糖淀粉酶基因來自泡盛曲霉或黑曲霉。
5.權(quán)利要求2的載體，其中啟動子來自α-淀粉酶基因。
6.權(quán)利要求5的載體，其中α-淀粉酶基因來自米曲霉。
7.權(quán)利要求1的載體，其中信號序列選自葡糖淀粉酶和α-淀粉酶基因。
8.權(quán)利要求7的載體，其中信號序列選自泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因。
9.權(quán)利要求7的載體，其中信號序列選自米曲霉α-淀粉酶基因。
10.權(quán)利要求1的載體，其中高表達(dá)內(nèi)源性基因選自α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因。
11.權(quán)利要求10的載體，其中高表達(dá)內(nèi)源性基因是米曲霉α-淀粉酶基因。
12.權(quán)利要求10的載體，其中高表達(dá)內(nèi)源性基因是泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因。
13.權(quán)利要求1的載體，其中連結(jié)序列是肽酶裂解位點。
14.權(quán)利要求13的載體，其中連結(jié)序列編碼Kex2肽酶裂解位點。
15.權(quán)利要求1的載體，進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄終止序列和可選擇標(biāo)記。
16.權(quán)利要求15的載體，其中轉(zhuǎn)錄終止序列選自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脫氫酶和benA基因。
17.權(quán)利要求16的載體，其中轉(zhuǎn)錄終止序列來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因。
18.權(quán)利要求15的載體，其中可選擇標(biāo)記基因選自pyr4，pyrG，amdS，argB，trpC，和福來霉素抗性基因。
19.權(quán)利要求18的載體，其中可選擇的標(biāo)記選自福來霉素抗性基因。
20.權(quán)利要求1的載體，其中乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷從人，?；蜇i得到。
21.當(dāng)權(quán)利要求1的載體用于轉(zhuǎn)化曲霉屬真菌細(xì)胞時產(chǎn)生的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷。
22.新的重組表達(dá)質(zhì)粒載體，其中包括下列可行地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子；(b)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列；(c)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因；其中所述載體能夠產(chǎn)生作為融合蛋白的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷，并表達(dá)與加工后蛋白相同的產(chǎn)物。
23.當(dāng)權(quán)利要求22的載體用于轉(zhuǎn)化泡盛曲霉真菌細(xì)胞時產(chǎn)生和加工的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷。
24.新的重組表達(dá)質(zhì)粒載體，其中包括下列可行地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子；(b)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列；(c)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因；其中所述載體能夠產(chǎn)生作為融合蛋白的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷，并在將所述載體轉(zhuǎn)化入黑曲霉細(xì)胞后表達(dá)與加工后蛋白相同的產(chǎn)物。
25.新的重組表達(dá)質(zhì)粒載體，其中包括下列可行地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)來自米曲霉α-淀粉酶基因的啟動子；(b)來自米曲霉α-淀粉酶基因的信號序列；(c)米曲霉α-淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因；其中所述載體能夠產(chǎn)生作為融合蛋白的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷，并表達(dá)與加工后蛋白相同的產(chǎn)物。
26.當(dāng)權(quán)利要求25的載體用于轉(zhuǎn)化米曲霉真菌細(xì)胞時產(chǎn)生和加工的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷。
27.產(chǎn)生乳鐵蛋白的方法，其中包括培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的曲霉屬真菌細(xì)胞，此處所述質(zhì)粒包括下列可行地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)啟動子；(b)信號序列；(c)其產(chǎn)物從曲霉屬細(xì)胞分泌的高表達(dá)內(nèi)源性基因的5′部分；(d)連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；其中所述轉(zhuǎn)化的曲霉屬真菌細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為融合產(chǎn)物產(chǎn)生并隨后通過一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶加工，其中所述加工的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中并從中分離。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述質(zhì)粒進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄終止序列和可選擇的標(biāo)記基因。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述啟動子選自乙醇脫氫酶，α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，和benA基因。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述啟動子來自葡糖淀粉酶基因。
31.權(quán)利要求30的方法，其中葡糖淀粉酶基因來自泡盛曲霉或黑曲霉。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述啟動子來自α-淀粉酶基因。
33.權(quán)利要求32的方法，其中α-淀粉酶基因來自米曲霉。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述信號序列選自葡糖淀粉酶和α-淀粉酶基因。
35.權(quán)利要求34的方法，其中信號序列來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因。
36.權(quán)利要求34的方法，其中信號序列來自米曲霉α-淀粉酶基因。
37.權(quán)利要求27的方法，其中高表達(dá)內(nèi)源性基因選自α-淀粉酶和葡糖淀粉酶基因。
38.權(quán)利要求37的方法，其中高表達(dá)內(nèi)源性基因為米曲霉α-淀粉酶基因。
39.權(quán)利要求37的方法，其中高表達(dá)內(nèi)源性基因為泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因。
40.權(quán)利要求27的方法，其中連結(jié)序列為肽酶剪切位點。
41.權(quán)利要求40的方法，其中連結(jié)序列編碼Kex2肽酶剪切位點。
42.權(quán)利要求28的方法，其中轉(zhuǎn)錄終止序列選自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脫氫酶和benA基因。
43.權(quán)利要求42的方法，其中轉(zhuǎn)錄終止序列來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因。
44.權(quán)利要求28的方法，其中可選擇的標(biāo)記基因選自pyr4，pyrG，amdS，argB，trpC，和福來霉素抗性基因。
45.權(quán)利要求44的方法，其中可選擇標(biāo)記來自福來霉素抗性基因。
46.通過權(quán)利要求27的方法產(chǎn)生的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷。
47.權(quán)利要求46的乳鐵蛋白，其中乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷為人，豬或牛乳鐵蛋白。
48.權(quán)利要求47的乳鐵蛋白，其中乳鐵蛋白已去糖基化。
49.權(quán)利要求47的乳鐵蛋白，其中人乳鐵蛋白產(chǎn)物已去糖基化。
50.權(quán)利要求27的方法，其中曲霉屬真菌細(xì)胞表達(dá)乳鐵蛋白。
51.含有下列可操作地從5′到3′連結(jié)的組成部分的表達(dá)質(zhì)粒載體(a)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子；(b)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列；(c)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼人乳鐵蛋白或人乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因；其中所述載體被用于在曲霉屬真菌細(xì)胞中表達(dá)人乳鐵蛋白或人乳鐵蛋白多肽片斷。
52.權(quán)利要求51的質(zhì)粒，進(jìn)一步定義為具有ATCC保藏號74290并命名為Awa LF 24-1。
53.含有權(quán)利要求51質(zhì)粒的泡盛曲霉真菌細(xì)胞。
54.產(chǎn)生乳鐵蛋白的方法，其中包括培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的泡盛曲霉真菌細(xì)胞，此處所述質(zhì)粒包括下列可操作地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子；(b)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列；(c)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼人乳鐵蛋白或人乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因；其中所述轉(zhuǎn)化的泡盛曲霉真菌細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為融合產(chǎn)物產(chǎn)生并隨后通過一種對該連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶加工，其中所述加工的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中并從中分離。
55.產(chǎn)生乳鐵蛋白的方法，其中包括培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的米曲霉真菌細(xì)胞，此處所述質(zhì)粒包括下列可操作地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)來自米曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子；(b)來自米曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列；(c)米曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼人乳鐵蛋白或人乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因；其中所述轉(zhuǎn)化的米曲霉真菌細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為融合產(chǎn)物產(chǎn)生并隨后通過一種對該連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶加工，其中所述加工的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中并從中分離。
56.通過產(chǎn)生乳鐵蛋白的方法生產(chǎn)的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷，它包括培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的泡盛曲霉真菌細(xì)胞，此處所述質(zhì)粒包括下列可操作地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子；(b)來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列；(c)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列，靠近那有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因；其中所述轉(zhuǎn)化的泡盛曲霉真菌細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為融合產(chǎn)物產(chǎn)生并隨后通過一種對該連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶加工，其中加工的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中并從中分離。
57.從真菌營養(yǎng)培養(yǎng)基分離乳鐵蛋白多肽片斷的方法，它包括培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化泡盛曲霉真菌細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒載體包含來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子，來自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列，泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分，編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶，編碼乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列，來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列，和福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因，其中所述轉(zhuǎn)化的泡盛曲霉真菌細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為融合產(chǎn)物產(chǎn)生并隨后通過一種對該連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶加工，其中加工的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中并從中分離。
58.產(chǎn)生乳鐵蛋白的方法，它包括培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的黑曲霉真菌細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒包括下列可操作地從5′到3′連結(jié)的組成部分(a)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子；(b)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的信號序列；(c)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)編碼Kex2肽酶剪切位點的連結(jié)序列，借此有一種對所述連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶；(e)編碼人乳鐵蛋白或人乳鐵蛋白多肽片斷的核苷酸序列；(f)來自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列；和(g)福來霉素抗性可選擇的標(biāo)記基因；其中所述轉(zhuǎn)化的黑曲霉真菌細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷作為融合產(chǎn)物產(chǎn)生并隨后通過一種對該連結(jié)序列特異的內(nèi)源性蛋白酶加工，其中加工的乳鐵蛋白或乳鐵蛋白多肽片斷分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中并從中分離。
全文摘要
本標(biāo)題發(fā)明提供用曲霉屬宿主細(xì)胞與新的質(zhì)粒構(gòu)建生產(chǎn)乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽。更確切地,本標(biāo)題發(fā)明提供能在曲霉屬宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生乳鐵蛋白和乳鐵蛋白片斷的載體構(gòu)建。更特別地,本標(biāo)題發(fā)明提供對曲霉屬,特別是泡盛曲霉,黑曲霉和米曲霉宿主細(xì)胞適用的質(zhì)粒構(gòu)建物,這使它們產(chǎn)生大量的重組乳鐵蛋白和乳鐵蛋白多肽片斷。
文檔編號A61K38/00GK1171815SQ95197115
公開日1998年1月28日 申請日期1995年11月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月2日
發(fā)明者O·M·康尼利, D·R·黑登, B·W·奧梅利 申請人:貝勒醫(yī)學(xué)院