專利名稱：假單胞菌活性蛋白及其生產(chǎn)方法
假單胞菌是廣泛存在于自然的一種見的低毒致病菌，常稱為條件致病菌(Opportunisticor conditioned pathogen)，對(duì)本菌的易感者與其機(jī)體免疫功能低下有密切關(guān)系，如免疫缺損、惡性腫瘤聯(lián)合化療患者，應(yīng)用免疫抑制劑、組織移植、大手術(shù)、泌尿系感染、大面積燒傷等均可合并本菌感染，常導(dǎo)致敗血癥和死亡。近幾年來(lái)假單胞菌發(fā)病率有所增加，由于本菌具有天然耐藥性，相當(dāng)部分菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，對(duì)抗生素耐藥，因此對(duì)已感染者或可能受感染的假單胞菌易感者，應(yīng)用特異性免疫預(yù)防和治療代替化學(xué)療法或作為抗生素治療的輔助藥物當(dāng)今受到極大重視，特別用細(xì)菌提取物作特異性自動(dòng)免疫以預(yù)防感染是行之有效的最好方法。
假單胞菌是慢性肺心病肺部感染病情加重和死亡原因之一，由其引起的院內(nèi)感染并有逐年上升趨勢(shì)，死亡率高達(dá)50％。在抗生素高速發(fā)展的年代，假單胞菌的發(fā)病率和死亡率仍有增無(wú)減，說(shuō)明臨床對(duì)本病的治療仍有一定困難。呼吸系統(tǒng)綠膿假單胞菌發(fā)病率占30～50％，其他假單胞菌占40～70％，且對(duì)抗生素有高度的適應(yīng)性和耐藥是本病感染延續(xù)時(shí)間長(zhǎng)和難治的主要原因。有關(guān)假單胞菌治療藥物研究，目前可用于治療的藥物包括生物提取、化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)改造的抗生素近300多種，這些藥物均有一定療效，但藥理作用可受多種因素影響，使藥物的抗菌作用發(fā)揮受到限制。
本發(fā)明的目的在于提供一種抗假單胞菌的特異性防治藥物，而能徹底解決對(duì)肺心病假單胞菌預(yù)防和治療之假單胞菌活性蛋白及其生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的組成成分及各成分的比例(重量比)為微粒蛋白40％、內(nèi)毒素蛋白20％、粘液蛋白20％、類毒素20％。其生產(chǎn)方法為分別取用11種不同假單胞菌第三代20小時(shí)液體培養(yǎng)物，12000轉(zhuǎn)/分4℃連續(xù)離心，取沉淀，用0.1M Tris·Hcl，pH7.2，1mM EDTA選三遍，再用上述液體溶解沉淀物，在冰浴中加入新鮮配制的溶菌酶(溶菌酶活力＞25000)，輕輕搖勻，在零度下作用20～30分鐘，將此菌懸液置-30℃，反復(fù)凍融三次，使菌體完全裂解，用膠體磨懸磨二次，每次10分鐘，4℃離心，3000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，棄沉淀(菌體殘?jiān)?，取上清，加入5％硫酸鋁鉀，放4℃過(guò)夜，次日取出，4℃離心，5000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，取沉淀，懸于pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)中常溫透析24小時(shí)，取透析物——微粒蛋白。
用上述第三代培養(yǎng)物經(jīng)離心后的上清液，用蔡司氏漏斗除菌過(guò)濾，取濾液加入5％硫氰酸鉀，邊加邊攪，室溫靜置2小時(shí)，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃過(guò)夜，次日取出，4℃離心，12000轉(zhuǎn)/分，取沉淀，加0.03N-NaOH的95％乙醇溶解沉淀物，35℃靜置16小時(shí)(把內(nèi)毒素中的脂肪酸去掉，并使內(nèi)毒素脫毒)，轉(zhuǎn)置于PBS pH6.8中，4℃低溫透析24小時(shí)(樣品與透析液比例為1∶50)，連續(xù)換水三次，置4℃冰箱備用——內(nèi)毒素蛋白(OEP)。
取假單胞菌第三代24小時(shí)液體培養(yǎng)物，15000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄沉淀取上清，用0.3μm的醋酸纖維膜過(guò)濾，收集濾液，放冷庫(kù)冷凍至1～2℃，加入硫氰酸鉀(先配成溶液)，邊加邊攪，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃冰庫(kù)過(guò)夜，12000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄上清，取沉淀，加入預(yù)冷95％乙醇，充分溶解沉淀物，4℃離心3000轉(zhuǎn)/分，棄沉淀取上清，用0.1N NaOH調(diào)至pH5.5，4℃離心，3000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，棄上清；取沉淀，置PBS pH6.8，4℃透析24小時(shí)(樣品與PBS比例為1∶100)——粘液蛋白。
取假單胞菌第三代24小時(shí)液體培養(yǎng)物，15000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄沉淀取上清，用蔡氏漏斗加濾紙板除菌過(guò)濾，收集濾液，加5％硫氰酸鉀，邊加邊攪，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃冰庫(kù)過(guò)夜，取出，12000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，加入預(yù)冷的95％乙醇，充分溶解沉淀物，用0.1N NaOH調(diào)至pH7.8，4℃離心，5000轉(zhuǎn)/分30分鐘，棄上清，取沉淀，置于含有4％福爾馬林和0.3M L-賴氨酸的0.1M Tris·HCl緩沖液(pH8.0)中透析，于37℃透析4天脫毒，再于pH8.0，0.1M Tris·HCl緩沖液中，4℃透析24小時(shí)(換液三次)，以除去福爾馬林，取透析物——外毒素的類毒素。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
分別取取11種不同假單胞菌第三代20小時(shí)液體培養(yǎng)物20升，12000轉(zhuǎn)/分4℃連續(xù)離心，取沉淀，用0.1M Tris·Hcl，pH7.2，1mM EDTA選三遍，再用上述液體1000ml溶解沉淀物，在冰浴中加入新鮮配制的溶菌酶800～1000mg(溶菌酶活力＞25000)，輕輕搖勻，在零度下作用20～30分鐘，將此菌懸液置-30℃，反復(fù)凍融三次，使菌體完全裂解，用膠體磨懸磨二次，每次10分鐘，4℃離心，3000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，棄沉淀(菌體殘?jiān)?，取上清，加入5％硫酸鋁鉀100ml，放4℃過(guò)夜，次日取出，4℃離心，5000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，取沉淀，懸于pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)中常溫透析24小時(shí)，取透析物——微粒蛋白，得微粒蛋白1200mg。
用上述第三代培養(yǎng)物經(jīng)離心后的上清液，用蔡司氏漏斗除菌過(guò)濾，取濾液加入5％硫氰酸鉀2000ml，邊加邊攪，室溫靜置2小時(shí)，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃過(guò)夜，次日取出，4℃離心，12000轉(zhuǎn)/分，取沉淀，加0.03N-NaOH的95％乙醇600ml溶解沉淀物，35℃靜置16小時(shí)(把內(nèi)毒素中的脂肪酸去掉，并使內(nèi)毒素脫毒)，轉(zhuǎn)置于PBS pH6.8中，4℃低溫透析24小時(shí)(樣品與透析液比例為1∶50)，連續(xù)換水三次，置4℃冰箱備用——內(nèi)毒素蛋白(OEP)，得內(nèi)毒素蛋白760mg。
取假單胞菌第三代24小時(shí)液體培養(yǎng)物20升，15000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄沉淀取上清，用0.3um的醋酸纖維膜過(guò)濾，收集濾液，放冷庫(kù)冷凍至1～2℃，加入硫氰酸鉀(先配成溶液)，邊加邊攪，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃冰庫(kù)過(guò)夜，12000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄上清，取沉淀，加入預(yù)冷95％乙醇1000ml，充分溶解沉淀物，4℃離心3000轉(zhuǎn)/分，棄沉淀取上清，用0.1N NaOH調(diào)至pH5.5，4℃離心，3000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，棄上清，取沉淀，置PBS pH6.8，4℃透析24小時(shí)(樣品與PBS比例為1∶100)——粘液蛋白，得粘液蛋白1030mg。
取假單胞菌第三代24小時(shí)液體培養(yǎng)物20升，15000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄沉淀取上清，用蔡氏漏斗加濾紙板除菌過(guò)濾，收集濾液，加5％硫氰酸鉀1850ml，邊加邊攪，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃冰庫(kù)過(guò)夜，取出，12000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，加入預(yù)冷的95％乙醇1000ml，充分溶解沉淀物，用0.1N NaOH調(diào)至pH7.8，4℃離心，5000轉(zhuǎn)/分30分鐘，棄上清，取沉淀，置于含有4％福爾馬林和0.3M L-賴氨酸的0.1MTris·HCl緩沖液(pH8.0)中透析，于37℃透析4天脫毒，再于pH8.0，0.1M Tris·HCl緩沖液中，4℃透析24小時(shí)(換液三次)，以除去福爾馬林，取透析物——外毒素的類毒素，得外毒素的類毒素812mg。
該方法制得的假單胞菌活性蛋白組合比例微粒蛋白0.4gm，內(nèi)毒素蛋白0.2gm，粘液蛋白0.2gm，類毒素0.2gm。合并后用PBS 1000ml(pH6.8)稀釋成1mg/ml或2mg/ml供皮下或肌肉注射。
本發(fā)明不限于上述一個(gè)實(shí)施例。
應(yīng)用本品防治肺心病肺部和各種假單胞菌感染，自動(dòng)免疫效果非常理想，顯示出高效和特異性，活性蛋白穩(wěn)定性好，反復(fù)服用無(wú)耐藥性，使用安全，無(wú)副作用。
權(quán)利要求
1.一種假單胞菌活性蛋白，其特征為它的組成成分及各成分的比例(重量比)為微粒蛋白40％、內(nèi)毒素蛋白20％、粘液蛋白20％、類毒素20％。
2.一種假單胞菌活性蛋白之生產(chǎn)方法，其特征為A.分別取用11種不同假單胞菌第三代20小時(shí)液體物，12000轉(zhuǎn)/分4℃連續(xù)離心，取沉淀，用0.1M Tris·Hcl，pH7.2，1mM EDTA選三遍，再用上述液體溶解沉淀物，在冰浴中加入新鮮配制的溶菌酶(溶菌酶活力＞25000)，輕輕搖勻，在零度下作用20～30分鐘，將此菌懸液置-30℃，反復(fù)凍融三次，使菌體完全裂解，用膠體磨懸磨二次，每次10分鐘，4℃離心，3000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，棄沉淀(菌體殘?jiān)?，取上清，加入5％硫酸鋁鉀，放4℃過(guò)夜，次日取出，4℃離心，5000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，取沉淀，懸于pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)中常溫透析24小時(shí)，取透析物——微粒蛋白；B.用上述第三代培養(yǎng)物經(jīng)離心后的上清液，用蔡司氏漏斗除菌過(guò)濾，取濾液加入5％硫氰酸鉀，邊加邊攪，室溫靜置2小時(shí)，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃過(guò)夜，次日取出，4℃離心，12000轉(zhuǎn)/分，取沉淀，加0.03N-NaOH的95％乙醇溶解沉淀物，35℃靜置16小時(shí)(把內(nèi)毒素中的脂肪酸去掉，并使內(nèi)毒素脫毒)，轉(zhuǎn)置于PBS pH6.8中，4℃低溫透析24小時(shí)(樣品與透析液比例為1∶50)，連續(xù)換水三次，置4℃冰箱備用——內(nèi)毒素蛋白(OEP)；C.取假單胞菌第三代24小時(shí)液體培養(yǎng)物，15000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄沉淀取上清，用0.3um的醋酸纖維膜過(guò)濾，收集濾液，放冷庫(kù)冷凍至1～2℃，加入硫氰酸鉀(先配成溶液)，邊加邊攪，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃冰庫(kù)過(guò)夜，12000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄上清，取沉淀，加入預(yù)冷95％乙醇，充分溶解沉淀物，4℃離心3000轉(zhuǎn)/分，棄沉淀取上清，用0.1N NaOH調(diào)至pH5.5，4℃離心，3000轉(zhuǎn)/分，30分鐘，棄上清，取沉淀，置PBS pH6.8，4℃透析24小時(shí)(樣品與PBS比例為1∶100)——粘液蛋白；D.取假單胞菌第三代24小時(shí)液體培養(yǎng)物，15000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，棄沉淀取上清，用蔡氏漏斗加濾紙板除菌過(guò)濾，收集濾液，加5％硫氰酸鉀，邊加邊攪，用1N鹽酸調(diào)至pH3.0，放4℃冰庫(kù)過(guò)夜，取出，12000轉(zhuǎn)/分，4℃連續(xù)離心，加入預(yù)冷的95％乙醇，充分溶解沉淀物，用0.1N NaOH調(diào)至pH7.8，4℃離心，5000轉(zhuǎn)/分30分鐘，棄上清，取沉淀，置于含有4％福爾馬林和0.3M L-賴氨酸的0.1M Tris·HCl緩沖液(pH8.0)中透析，于37℃透析4天脫毒，再于pH8.0，0.1M Tris·HCl緩沖液中，4℃透析24小時(shí)(換液三次)，以除去福爾馬林，取透析物——外毒素的類毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種假單胞菌活性蛋白及其生產(chǎn)方法。它由微粒蛋白、內(nèi)毒素蛋白、粘液蛋白、類霉素所組成,采用綠膿假單胞菌1、2、3、4、5、6、11、血清型標(biāo)準(zhǔn)菌種和嗜麥芽假單胞菌、惡臭假單胞菌、斯氏假單胞菌、產(chǎn)鹼假單胞菌凍干標(biāo)準(zhǔn)菌株,共11個(gè)價(jià)假單胞菌,分離提取微粒蛋白、外毒素的類毒素和內(nèi)毒素蛋白(OEP)),用這些具有良好免疫活性組分(抗原成分)合成——假單胞菌活性蛋白。本產(chǎn)品預(yù)防和治療慢性肺心病肺部感染和各種假單胞菌感染,顯示出高效和特異性,無(wú)耐藥性,使用安全,無(wú)副作用。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1184674SQ9511986
公開日1998年6月17日 申請(qǐng)日期1995年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月7日
發(fā)明者余國(guó)華 申請(qǐng)人:余國(guó)華