專利名稱：土貝母苷甲制備治療白血病的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及土貝母苷甲在機體中抗癌的新用途。
眾所周知，白血病是一種死亡率很高的血液疾病，臨床上尚無很有效的治療手段和藥物，一般采用輸血的辦法來延長患者的生命。目前在臨床上用于治療白血病的化療藥物主要有強的松、長春新堿、6-巰嘌呤、環(huán)胞苷、柔紅霉素、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥等，這些藥物的主要副作用是抑制骨髓，療效也不理想。骨髓移植療法雖有較好的療效，但價格昂貴，技術(shù)條件要求較高，且不易找到合適的供體，使得這種療法難以得到推廣使用。
本發(fā)明的目的在于克服上述藥物在治療白血病用途中的缺點，為用土貝母苷甲制備的藥物提供一種新用途。
為達到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案是有效成份用土貝母苷甲制備治療白血病的藥物用途。
土貝母苷甲是從中藥土貝母中提取出來的一種有效成份，它的分子式為C63H98O29、分子量為1318，分子結(jié)構(gòu)式見下頁。
土貝母苷甲的提取工藝已在《中國藥理學(xué)報》1994年15卷103～106頁公開。
有效成份用土貝母苷甲制備治療白血病的藥物以常規(guī)藥用制劑的形式來使用；所述的常規(guī)藥用制劑含作為活性成分的土貝母苷甲，該活性成份在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于胃腸內(nèi)和胃腸外給藥的有機或無機的固體或液體賦形劑混合。該藥用制劑可以是固體形式如片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊劑或液體形式如針劑、懸浮劑、糖漿劑、乳劑等。 (土貝母苷甲分子結(jié)構(gòu)式)上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤濕劑和其它常用的添加劑，如乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸鎂、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、鹽酸普魯卡因、鹽酸利多卡因、抗壞血酸等。
上述制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。
本發(fā)明所述有效成份土貝母苷甲作為治療白血病藥物的用途，所制成各種劑型的口服藥物，成人口服，藥物中土貝母苷甲的含量應(yīng)為每天30～120mg，10～30天為一個療程，用藥3～5個療程。所制成各種劑型的注射用藥物，成人肌肉注射，藥物中土貝母苷甲的含量為10～40mg，10～30天為一個療程，用藥3～5個療程；靜脈點滴，成人用量，藥物中土貝母苷甲的含量為10～40mg，10～30天為一個療程，用藥3～5個療程。兒童酌情減量。
本發(fā)明中的有效成份土貝苷甲經(jīng)藥效、毒理、作用機理和藥代動力學(xué)試驗，證明它具有殺傷白血病細胞和誘導(dǎo)白血病細胞分化作用，治療量對動物骨髓無明顯抑制作用，毒副作用很低。若用于臨床試驗，預(yù)期將會有較好的治療效果。
例舉下列實驗內(nèi)容及其試驗結(jié)果，證明用土貝母苷甲制備的藥物治療白血病的有效性。
一、藥效試驗1.土貝母苷甲對人早幼粒白血病細胞(HL-60細胞)生長抑制試驗試驗藥物土貝母苷甲。
試驗方法將HL-60細胞接種于直徑為35mm的塑料小碟內(nèi)，用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbeco′s Modified Eagle′s minimum es.sential medium)培養(yǎng)基，置于37℃、濕度飽和、95％空氣、5％二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)。用不同濃度的土貝母苷甲水溶液加入培養(yǎng)基內(nèi)觀察其對HL-60細胞生長的抑制效果，并用加入相同體積無菌蒸餾水的培養(yǎng)物作對照試驗。加入土貝母苷甲后1～3天內(nèi)，每天用臺盼蘭排斥法計活細胞數(shù)。
試驗結(jié)果如

圖1所示，土貝母苷甲對HL-60細胞有明顯的抑制效果。
2.土貝母苷甲對HL-60細胞的誘導(dǎo)分化作用試驗試驗藥物土貝母苷甲。
試驗方法在HL-60細胞中加入2.4μmol/L的土貝母苷甲，按1所述的條件培養(yǎng)5天，觀察其形態(tài)變化，并對HL-60細胞進行氮藍四唑(NBT)還原試驗、酵母多糖吞噬試驗、以及非特異性酯酶染色試驗。對照組分為陰性對照和陽性對照。在HL-60細胞中加入1mmol/L維甲酸按實驗組的方法進行試驗，即為陽性對照。
試驗結(jié)果與土貝母苷甲共同培養(yǎng)5天的HL-60細胞中有62％的細胞被誘導(dǎo)分化，分化后的細胞形態(tài)類似于正常晚幼粒細胞，NBT陽性率為57％，酵母多糖的吞噬率為44％，非特異性酯酶染色陰性，而陰性對照組被誘導(dǎo)分化的細胞不超過6％。試驗結(jié)果見表1。
二、毒理試驗1.急性毒性試驗選用ICR小鼠用肌肉注射和灌胃給藥法進行試驗。
試驗結(jié)果肌肉注射的LD50為40.28mg/kg，灌胃給藥的LD50為315.gmg/kg。
2.亞急性毒性試驗選取12只健康狗，分為對照和土貝母苷甲不同劑量實驗組，即劑量分別為1.6mg/kg、0.8mg/kg、0.4mg/kg的三組狗。
實驗組每周給藥5次，共用藥20次，對照組同時注射同體積的生理鹽水。
給藥前、給藥結(jié)束時和停藥一個月后稱狗的體重，每周測定血清蛋白、血象、紅細胞脆性、肝腎功能。末次給藥后24小時各組分別處死1只狗進行大體解剖，并取各種組織進行病理組織學(xué)檢查。其余狗停藥后繼續(xù)觀察，每月做一次上述化驗檢查，為期二個月。最后處死所有的狗進行病理組織學(xué)檢查，即檢查其心、肝、脾、胃、胰腺、甲狀腺、胸腺、腎上腺、淋巴結(jié)、睪丸(卵巢)、前列腺、膀胱、腎、腦和骨髓等。
試驗結(jié)果劑量為0.4mg/kg和0.8mg/kg的兩組狗，在整個試驗過程中，未出現(xiàn)不良反應(yīng)。劑量為1.6mg/kg的一組狗，在用藥期間出現(xiàn)流涎、食量減少、體重明顯減輕，停藥后體重逐漸恢復(fù)并有所增加。劑量為0.8mg/kg和1.6mg/kg的兩組狗，用藥后谷丙轉(zhuǎn)氨酶有所上升，但上升的幅度不大，停藥后逐漸恢復(fù)，對肝腎功能無明顯影響。
3.致畸試驗試驗分劑量為0.15mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg、的土貝母苷甲實驗組和對照組。每組選用30只受精雌性ICR小鼠，在器官形成期，即受孕后6～15天給藥，每天肌肉注射土貝母苷甲一次，對照組注射相同體積的生理鹽水，孕后18天，每組各解剖10只孕鼠，其余孕鼠任其自然產(chǎn)仔(第一代)。為了觀察土貝母苷甲對小鼠第二代胎鼠生長發(fā)育的影響，將對照組和土貝母苷甲2.5mg/kg組在出生后8周齡第一代鼠進行同組內(nèi)不同窩間的交配，將各組查到的受精陽性的雌鼠分籠飼養(yǎng)，每組10只孕鼠。土貝母苷甲組在孕后6～15天每天肌肉注射一次土貝母苷甲(2.5mg/kg)，對照組注射同體積的生理鹽水，孕后第18天解剖孕鼠。
試驗結(jié)果劑量為0.5mg/kg和1.25mg/kg的兩組小鼠，其活胚胎的數(shù)量、體重、身長、發(fā)育與對照組比較未發(fā)現(xiàn)差異。當(dāng)劑量為2.5mg/kg時，其活胚胎的體重、身長及出生后25天仔鼠的體重有一定的影響，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。
4.土貝母苷甲對正常培養(yǎng)細胞的毒性作用采用比色法測試了土貝母苷甲對培養(yǎng)的T-淋巴母細胞樣細胞株(MT-2細胞)的毒性作用，試驗情況如下表
結(jié)果表明，土貝母苷甲的濃度低于40μg/ml時，其細胞毒性很低。
5.防癌試驗采用經(jīng)典的誘發(fā)小鼠二階段皮膚乳頭狀瘤的實驗?zāi)Ｐ停枚谆讲⑤旒ぐ?2-0-十四酰佛波-13-乙酸酯(以下簡稱TPA)促癌。實驗組每鼠每次用1mg的土貝母苷甲水溶液涂抹背部皮膚，并將含0.2mg/ml土貝母苷甲的飲水供小鼠自由飲用，對照組用二甲基苯并蒽激癌、TPA促癌，進行18周試驗。
試驗結(jié)果背部皮膚涂抹土貝母苷甲可完全抑制實驗組小鼠皮膚上出現(xiàn)腫瘤，而對照組的帶瘤率為80％，平均腫瘤數(shù)1033(見圖2)。飲水中加入土貝母苷甲可減少皮膚腫瘤的發(fā)生(見圖3)。此外，土貝母苷甲的應(yīng)用并不妨礙小鼠體重增加。
上述各項毒性試驗表明，土貝母苷甲的毒副作用低。
三、土貝母苷甲治療白血病的作用機理試驗1.土貝母苷甲對腫瘤細胞脫氧核糖核酸(DNA)合成的影響用3H-胸苷法測定土貝母苷甲對人胰癌和胃癌細胞DNA合成的影響。將胰癌或胃癌細胞培養(yǎng)24小時，加入土貝母苷甲或其溶媒作對照試驗。胰癌或胃癌細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48或72小時，然后以3H-胸苷標記1小時，并測定其摻入酸不溶性物質(zhì)的放射活性。試驗結(jié)果表明土貝母苷甲抑制3H-胸苷摻入DNA組分(參見表2)。提示，這些腫瘤細胞DNA的正常合成和成熟受到了抑制。試驗結(jié)果還表明，在不同細胞DNA合成的抑制發(fā)生在不同時相。
2.3H摻入培養(yǎng)細胞C3H10T 1/2克隆8磷脂試驗將C3H10T 1/2克隆8磷脂細胞置于含10％胎牛血清的Eagle′sminimum essential medium、37℃、濕度飽和、95％空氣、5％二氧化碳的孵箱中單層培養(yǎng)。細胞經(jīng)胰酶處理剝離后轉(zhuǎn)移到35mm直徑的Petri塑料盤內(nèi)，使其密度為2×105細胞/ml。培養(yǎng)48小時后，土貝母苷甲以二甲基亞砜溶液的形式加入，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml。對照組加入同量的二甲亞砜在相同條件下培養(yǎng)。細胞經(jīng)1小時培養(yǎng)后，試驗組和對照組同時加入TPA(5×10-8mol/L)和3H-膽鹼(4μCi/碟)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。
與3H-膽鹼一起培養(yǎng)過的細胞經(jīng)胰酶處理后收集，并以磷酸鹽緩沖液涮洗后懸浮在150μl的磷酸鹽緩沖液中，細胞中的脂質(zhì)以改進的Bligh和Dyer法提取。即將細胞凍融1次后，加入300μl的氯仿/甲醇(1/2、V/V)，其中甲醇中含2％乙酸。細胞懸液用冰浴型超聲波發(fā)生器處理，再加入100μl氯仿，并振蕩混勻，混合液經(jīng)離心機離心后分為氯仿相和液相，用液體閃爍儀測定氯仿相的放射性，蛋白質(zhì)含量用改進的Lowry氏法測定。
試驗結(jié)果如圖4所示，土貝母苷甲具有抑制TPA增強3H摻入細胞磷脂的作用。當(dāng)土貝母苷甲的濃度低于5μg/ml時仍可測出這一效果，而且表現(xiàn)出明顯的量效依賴關(guān)系。
3.土貝母苷甲與TPA競爭HL-60細胞內(nèi)的受體試驗HL-60細胞用含有10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。
試驗方法取1ml細胞懸液(1×105細胞/ml)接種到直徑為35mm的塑料培養(yǎng)皿中，離心收集細胞，再用含有137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4和1.3mM KH2PO4的磷酸鹽緩沖液洗滌。被懸浮在含50mM Tris-HCl緩沖液中的細胞(1×107細胞/ml)用勻漿器處理，收集上清液，得細胞提取物，低溫貯存?zhèn)溆?。在細胞提取物解凍后加入Tris-HCl緩沖液調(diào)整蛋白濃度至200μg蛋白/ml，再加入不同濃度的土貝母苷甲、3H標記的TPA，放入孵箱，39℃孵育20分鐘，抽濾器迅速過濾后，用丙酮沖洗濾膜，濾膜放入閃爍瓶，加入液體閃爍液，液體閃爍計數(shù)儀測定放射性。
試驗結(jié)果如圖5所示，土貝母苷甲能競爭性抑制3H-TPA與HL-60細胞提取物的結(jié)合。
4.細胞毒作用(1)參見圖1，土貝母苷甲對白血病細胞有直接殺傷作用。
(2)細胞凋謝性死亡形態(tài)學(xué)試驗電鏡觀察經(jīng)土貝母苷甲處理過的腫瘤細胞產(chǎn)生細胞萎縮，染色質(zhì)凝聚成塊、邊移甚至裂解為凋零體。
DNA的有控降解電泳圖譜表明，經(jīng)土貝母苷甲處理的腫瘤細胞DNA出現(xiàn)典型凋零梯型圖譜。
四、土貝母苷甲的藥代動力學(xué)試驗1.土貝母苷甲的吸收試驗取小鼠14只，每鼠以土貝母苷甲100mg/kg灌胃給藥，給藥后不同時間各處死2只小鼠，取出全部胃腸道及內(nèi)容物，制成勻漿。用同法作空白對照，給藥后即處死小鼠，測定殘存于消化道及內(nèi)容物中的藥物含量。
試驗結(jié)果即藥后即刻處死者胃腸中土貝母苷甲的回收率為100％，給藥后0.5、1、2、4、8、12小時的回收率分別為91.8％、82.0％、60.7％、41.0％、18.0％和0。
2.組織分布試驗取20只小鼠和4只大鼠，每鼠肌肉注射土貝母苷甲60mg/kg，1小時后處死，取心、肝、脾、肺、腎和腦組織1g，加生理鹽水3ml研成勻漿，按實驗者建立的甲醇提取—薄層分離—比色測定法測定在各組織內(nèi)土貝母苷甲的含量。
試驗結(jié)果土貝母苷甲在肝和脾內(nèi)含量最高，在血、肺和心內(nèi)含量次之，在腎和腦內(nèi)含量最低。
3.土貝母苷甲與血漿蛋白與組織蛋白的結(jié)合試驗采用平衡透析法測定土貝母苷甲與血漿、肝、腎組織蛋白的結(jié)合率。
試驗結(jié)果土貝母苷甲與血漿、肝、腎組織蛋白的結(jié)合率分別為17％、28％、20％。
4.排泄試驗取10只小鼠，每鼠肌肉注射60mg/kg土貝母苷甲，收集24小時尿液，取膽汁，測定在排泄物中土貝母苷甲的含量。
試驗結(jié)果在膽汁和尿液中無土貝母苷甲，推測土貝母苷甲可能以代謝產(chǎn)物的形式從尿液或膽汁排出。
圖1是土貝母苷甲對HL-60細胞生長的抑制作用圖。圖中橫坐標為培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標為活細胞數(shù)，單位為活細胞數(shù)/碟○-○為對照培養(yǎng)，●--●為土貝母苷甲用量1.9μmol/L，×-×為土貝母苷甲用量3.8μmol/L，△-△為土貝母苷甲用量7.6μmol/L，■-■為土貝母苷甲用量15.2μmol/L。
圖2是局部應(yīng)用土貝母苷甲對小鼠皮膚促癌過程的抑制作用圖。圖中橫坐標為促癌周數(shù)，縱坐標A為帶瘤鼠數(shù)(％)，縱坐標B為腫瘤個數(shù)/鼠?！?●為對照組，○-○為實驗組。
圖3是小鼠口服土貝母苷甲對皮膚促癌的抑制作用圖。圖中橫坐標為促癌周數(shù)，縱坐標A為帶瘤鼠數(shù)(％)，縱坐標B為腫瘤個數(shù)/鼠?！?●為對照組，○-○為實驗組。
圖4是土貝母苷甲對TPA增強3H摻入培養(yǎng)細胞磷脂的抑制效應(yīng)圖。圖中橫坐標為土貝母苷甲的濃度(μg/ml)，縱坐標為抑制率(％)。
圖5是土貝母苷甲與TPA競爭HL-60細胞內(nèi)受體圖。圖中橫坐標為土貝母苷甲的濃度(μM)，縱坐標為3H-TPA特異性結(jié)合(dpm)，圖中左邊一條曲線為未標記的TPA對3H-TPA結(jié)合的抑制作用曲線，右邊一條曲線為土貝母苷甲對3H-TPA結(jié)合的抑制作用曲線。
發(fā)明人給出了用土貝母苷甲制備治療白血病藥物的藥用制劑的實施例。
實施例1藥用制劑制備成片劑，以生產(chǎn)10000片土貝母苷甲片為例所用的原料和輔料的配比為土貝母苷甲100g乳糖 400g玉米淀粉 500g實施例2藥用制劑制備成注射液，以生產(chǎn)1000ml土貝苷甲注射液為例所用的原料和輔料的配比為土貝母苷甲 5g葡萄糖 40g鹽酸利多卡因 3g注射用水 加至1000ml
表1土貝母苷甲對HL-60細胞的誘導(dǎo)分化作用a培養(yǎng) 晚幼粒細胞或中性氮藍四唑 酵母多糖天數(shù) 粒細胞(％)b還原(％)b吞噬(％)b對照3 4.25±0.405.25±0.602.50±0.285 4.50±0.385.50±0.503.25±0.30維甲酸 3 67.23±8.91 64.88±6.60 62.46±6.34(1mmol/L) 5 64.26±5.68 51.26±4.68 60.54±5.68土貝母苷甲3 31.50±3.34c25.12±2.48c30.50土4.09c(2.4μmol/L) 5 62.34土5.87c56.78±7.23c43.64±3.98ca.三份平行試驗的平均結(jié)果。
b.均值±標準誤。
c.P＜0.01(與相應(yīng)的對照組比較)。
表2土貝母苷甲對人胰癌和胃癌細胞DNA合成的影響*細胞條件DNA合成3H-胸苷摻入培養(yǎng)期(日)12 3胰癌對照3.56±0.273.63±0.33 5.88±0.85(100) (100) (100)土貝母苷甲 3.44±0.523.56±0.33 3.45±0.34(3μg/ml) (96.7) (98.0) (58.7，P＜0.0002)胃癌對照8.78±0.5510.05±0.65 7.50±0.21(100)(100) (100)土貝母苷甲6.12±0.56 6.40±0.85 5.47±0.85(10μg/ml) (69.7，P＜0.0001) (63.7，P＜0.0002)(72.9，P＜0.0018)*表中給出的值代表三份平行試驗的平均值。括弧中的值是以對照作為100％的百分率。
權(quán)利要求
有效成份用土貝母苷甲制備治療白血病的藥物用途。
全文摘要
有效成分用土貝母苷甲制備治療白血病的藥物用途，土貝母苷甲是從中藥土貝母中提取出來的一種有效成分，該有效成分與有機或無機的固體或液體賦形劑混合，制備成固體形式如片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊劑或液體形式如針劑、懸浮劑、糖漿劑、乳劑等，土貝母苷甲經(jīng)藥效、毒理、藥理、藥代動力學(xué)試驗，證明它具有殺傷白血病細胞和誘導(dǎo)白血病細胞分化作用，對動物骨髓無明顯抑制作用，毒副作用低等優(yōu)點，可用于動物和臨床試驗。
文檔編號A61K31/70GK1146895SQ9511375
公開日1997年4月9日 申請日期1995年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月29日
發(fā)明者馬潤娣, 于立堅 申請人:陜西省中醫(yī)藥研究院