專利名稱：制備緩釋制劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含滲透在生物可降解的基質中的水溶性多肽的緩釋制劑。
蛋白質，亦稱多肽，已知在體內具有各種藥理作用。由于基因工程和細胞工程技術的發(fā)展，已經用生物如大腸桿菌、酵母、動物細胞和倉鼠大量地生產一些供藥用的蛋白質。這樣的蛋白質藥物包括干擾素(α，β，γ)、白介素2、紅細胞生成素和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。然而，由于這些蛋白質通常具有短的生物半壽期，所以它們必須被頻繁地服用，這樣對病人造成了很大的身體注射負擔。為了解決該問題，人們已進行過各種嘗試來發(fā)展緩釋制劑。由于由細胞素所代表的蛋白質必須特別小心地服用，同時監(jiān)測其治療效果，所以需要發(fā)展一種具有大約1-2周的釋放持續(xù)期的可注射的緩釋制劑，特別是微囊緩釋制劑。然而，通常人們都知道，當暴露于熱、有機溶劑、強剪切力等條件下時，蛋白質便變性，喪失其生物活性。例如，當在60℃加熱20分鐘時，蛋白質的水溶液便迅速失去其生物活性，即使在50℃的較低溫度下加熱約1小時，也可以降低蛋白質的生物活性。同樣，人們也知道，在有機溶劑如乙醇或二氯甲烷存在下，蛋白質的生物活性也會降低。
WO93/06872公開了一種制備包含可使成骨蛋白質在延長的時間內釋放的生物可降解的聚合物的多孔顆粒的藥物制劑的技術;該多孔顆粒是成骨蛋白質和自體固有血液的聚集體。在該技術中，活性成分成骨蛋白質恰在給藥前吸附到所述顆粒上，再加入自體固有血液形成聚集體，以控制釋放。緩釋持續(xù)大約數周。由于該方法涉及使用自體固有血液，所以該方法不可普遍采用。
在JournalofControlledRelease，Vol.23，p157(1993)中，A.Supersaxo等人描述了一種技術，其中用生物可降解的聚合物制備多孔微球，之后，用大分子滲透，允許大分子滲透其中以將大分子摻入微球中，而不使大分子與有機溶劑接觸。具體講，由于使用的聚乳酸是疏水性的，所以先用50%乙醇(有機溶劑)潤濕微球。然后用水置換乙醇，再用大分子溶液置換。
日本專利未審查公報No.32559/1993(EP-A473268)公開了一種制備藥物組合物的方法，該方法是將藥物組合物組分和生物活性物質溶解在有機溶劑中或將其均勻地分散在有機溶劑或水性介質中，然后干燥所述溶液或分散液。
雖然人們已進行過各種嘗試來制備上述可維持蛋白質等的生物活性的緩釋制劑，但就藥物滲透入基質的效率、最初藥物爆裂的抑制、恒定的長期藥物釋放等性質而言尚未獲得令人滿意的緩釋制劑。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種制備緩制劑的方法，該方法包括在水性溶液中使水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中。
(2)上述(1)的方法，其中生物可降解的基質是通過將生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金屬鹽混合制備的，(3)上述(2)的方法，其中脂族羧酸是脂族單羧酸，(4)上述(2)的方法，其中水溶液金屬鹽是多價金屬鹽，(5)上述(1)的方法，包括在水溶性多肽已水性滲透到生物可降解的基質中后干燥所述生物可降解的基質的步驟，(6)上述(5)的方法，其中干燥步驟是冷凍干燥，(7)上述(1)的方法，其中水溶性多肽是細胞素，
(8)上述(7)的方法，其中細胞素是干擾素，(9)上述(1)的方法，其中生物可降解的基質呈細顆粒形式，(10)上述(1)的方法，其中生物可降解的基質是由生物可降解的聚合制備的，(11)上述(10)的方法，其中生物可降解的聚合物是脂族聚酯，(12)上述(11)的方法，其中脂族聚酯是由α-羥基羧酸衍生的共聚物，(13)上述(12)的方法，其中共聚物是乳酸-乙醇酸共聚物，(14)一種緩釋制劑，它是通過使水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中產生的，(15)一種緩釋制劑，它是通過將生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金屬鹽混合，然后使水溶性多肽滲透到所得生物可降解的基質中產生的，以及(16)上述(14)的緩釋制劑，其中制劑是供注射用的。
本發(fā)明中所用的水溶性多肽的分子量優(yōu)選為大約200-50，000，更優(yōu)選的是大約5，000-40，000。
任何水溶性的多肽都可以使用，只要該多肽起激素作用并被內分泌到血流中。這樣的水溶性多肽包括細胞素、造血因子、生長因子和酶。
細胞素的實例包括淋巴激活素和單激活素。淋巴激活素的實例包括干擾素(α，β，γ)和白介素(IL-2～IL-12)。單激活素的實例包括白介素(IL-1)和腫瘤壞死因子。
造血因子包括紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、血小板生成素、血小板生長刺激因子和巨核細胞增強劑。
生長因子的實例包括堿性或酸性成纖維細胞生長因子(FGF)或其家庭成員(如FGF-9)(MolecularandCellularBiology，Vol.13，NO.7，p.4251(1993))、神經細胞生長因子(NGF)或其家族成員、胰島素樣生長因子(如IGF-1，IGF-2)以及骨生長因子(BMF)或其家族成員。
酶的實例包括過氧化物歧化酶(SOD)和組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)。
除了上述物質外，可用作本發(fā)明的水溶性多肽的還有生長激素、胰島素、促尿鈉排泄肽、促胃液素、催乳激素、促腎上腺皮質激素(ACTH)、甲狀腺刺激激素(TSH)、促黃體激素(LH)、卵泡刺激激素(FSH)、人絨膜促性腺激素(HCG)、胃動素、血管舒張素、與胰腺再生有關的Reg蛋白質(日本專利審查公報No.132388/1989，FEBSLetters，Vol.272，p.85(1990))等。
所述的水溶性多肽可以是天然衍生的或通過基因重組產生的。
本發(fā)明的水溶性多肽不局限于上述水溶性多肽。具體講，水溶性多肽可以有糖鏈，也可以沒有糖鏈，可以具有多個不同結構的糖鏈。水溶性多肽也可以是上述水溶性多肽的突變體、衍生物(激動性的或拮抗性的)或片段。
水溶性多肽優(yōu)選是細胞素。細胞素的例子有淋巴激活素和單激活素。淋巴激活素的實例包括干擾素(α，β，γ)和白介素(IL-2～IL12)。單激活素的實例包括白介素(IL-1)和腫瘤壞死因子。
水溶性多肽更優(yōu)選地是淋巴激活素。淋巴激活素的實例包括干擾素(α，β，γ)和白介素(IL-2～IL-12)。
水溶性多肽最優(yōu)選的是干擾素(α，β，γ)。
在本發(fā)明中，生物可降解的基質優(yōu)選為細顆粒形式。生物可降解的基質可以具有任何粒度，只要它能通過供正常皮下或肌內注射用的普通注射針頭就行，具體講，它為大約0.1-300μm，優(yōu)選約1-150μm，最優(yōu)選約2-100μm。
生物可降解的基質通過本身已知的方法從例如生物可降解的聚合物產生。生物可降解的基質最好通過將生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金屬鹽相混合而制備?？捎糜诖四康姆椒òㄏ率龅乃懈稍锓?、相分離方法和噴霧干燥法及其改進方法。
(ⅰ)水中干燥法(w/o/w法)將水或含水溶性組分的水溶液用作內水相。水溶性組分的例子有無機鹽(如氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉)、糖類(如甘露糖醇、葡萄糖、菊粉)、有機鹽(如碳酸鈉、碳酸鎂、乙酸銨)和氨基酸(如甘氨酸、精氨酸、組氨酸)。水溶性組分在水溶液中的濃度為，例如大約0.1-10%(w/v)、優(yōu)選大約0.5-5%(w/v)。具體講，例如，當水溶性組分是氯化鈉時，優(yōu)選使用0.9%(w/v)的生理鹽水。代替上述水溶性組分，可以將碳酸鈣等分散在內水相中。優(yōu)選地，將含有脂族羧酸的水溶性金屬鹽的水溶液用作內水相。金屬鹽在水溶液中的濃度通常為大約10-90%(w/v)，優(yōu)選大約20-80%(w/v)，這取決于所述金屬鹽的溶解性。
將上述的水或含有水溶性組分的水溶液乳化或分散在由α-羥基羧酸合成的生物可降解的聚合物或共聚物的有機溶劑溶液中，制得w/o乳液，雖然生物可降解的聚合物在有機溶劑溶液中的濃度隨著生物可降解的聚合物的分子量和有機溶劑的種類而改變，但它選自大約0.01-90%(w/w)范圍，優(yōu)選大約0.1-80%(w/w)，更優(yōu)選是大約1-70%(w/w)。
水或含水溶性組分的水溶液與生物可降解的聚合物的有機溶劑溶液的比例通常為1∶1000-1∶1(v/v)，優(yōu)選1∶100-1∶5(v/v)，更優(yōu)選是1∶50-1∶5(v/v)，該乳化通過用葉輪機型機械攪拌器、均化器等的已知分散方法來完成。
將如此制得的w/o乳液加到另一個水相(外水相)中形成w/o/w乳液，接著蒸發(fā)油相中的溶劑，得到生物可降解的基質。油相溶劑通過用例如葉輪機型機械攪拌器攪拌來蒸發(fā)。水相體積通常為油相體積的大約1-10，000倍，優(yōu)選大約2-5，000倍，更優(yōu)選大約5-2，000倍。
可以向外水相中加入乳化劑，乳化劑可以是任何乳化劑，只要它能形成穩(wěn)定的o/w乳液就行。這樣的乳化劑的實例包括陰離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠和透明質酸。它們可被單獨使用或結合使用。所用的乳化劑的濃度通常適當地選自大約0.001-20%(w/w)，優(yōu)選大約0.01-10%(w/w)，更優(yōu)選地大約0.05-5%(w/w)。代替水溶性組分，當將碳酸鈣分散在內水相中時，通過向外水相中加入稀鹽酸溶解所述碳酸鈣。
可以向外水相中補以脂族羧酸的水溶性金屬鹽。所用金屬鹽可以與內水相中所用的脂族羧酸的金屬鹽相同或不同。在該種情況下，優(yōu)選加入脂族羧酸金屬鹽使其在外水相中的濃度為大約0.01-20%(w/w)，更優(yōu)選是大約0.1-10%(w/w)。通過改變脂族羧酸金屬鹽在外水相中的濃度，也可以控制脂族羧酸的金屬鹽從生物可降解的基質中被洗出。
通過離心或過濾，收集如此得到的生物可降解的基質，然后用蒸餾水分數個循環(huán)反復洗滌，以除去粘附在所述基質表面的乳化劑等，再將基質分散在蒸餾水等中，然后冷凍干燥。
所得生物可降解的基質的表面不是光滑的，具有各種大小的孔，一些孔到達了生物可降解的基質的內部。通過例如壓縮汞注射法或BET法可以測定生物可降解的基質中這些孔的體積比率(孔隙度)?？紫抖入S著內水相組分、內水相濃度、內水相溶液和生物可降解的聚合物的有機溶劑溶液的比率、外水相體積和油相體積的比率、外水相溫度以及其它因素而變化;在生物可降解的基質內看到了不同的孔結構。
脂族羧酸的水溶性金屬鹽在生物可降解的基質中的含量按金屬計優(yōu)選為大約0.01-10%(w/w)，更優(yōu)選大約為0.05-7%(w/w)，最優(yōu)選大約為0.1-5%(w/w)。通過原子吸收法和其它方法測定脂族羧酸的水溶性金屬鹽在生物可降解的基質中按金屬計的含量。
(ⅱ)水中干燥法(o/w方法)在本發(fā)明中，也可以不使用內水相來制備生物可降解的基質。在該方法中，先制備生物可降解的聚合物在有機溶劑中的溶液。在該操作中，生物可降解的聚合物在有機溶劑溶液中的濃度隨生物可降解的聚合物的分子量、有機溶劑的種類和其它因素而改變，通常選自大約0.01-90%(w/w)范圍，優(yōu)選約0.1-80%(w/w)，更優(yōu)選約1-70%(w/w)。
可以將碳酸鈣加到并分散在生物可降解的聚合物的有機溶劑溶液中。在該操作中，設定加入的碳酸鈣的量使得碳酸鈣和生物可降解的聚合物的重量比為大約5∶1-1∶100，優(yōu)選大約2∶1-1∶10。
優(yōu)選地，將脂族羧酸的水溶性金屬鹽加到并分散到生物可降解的聚合物的有機溶劑溶液中。加入脂族羧酸金屬鹽的量應使得脂族羧酸金屬鹽與生物可降解的聚合物的重量比為大約5∶1-1∶100，優(yōu)選大約2∶1-1∶50，更優(yōu)選地大約1∶1-1∶10。
接著，用葉輪機型機械攪拌器或類似裝置攪拌，將如此制得的有機溶劑溶液加到水相中形成o/w乳液，接著蒸發(fā)油相中的溶劑，得到生物可降解的基質。水相的體積通常選自油相體積的大約1-10，000倍，優(yōu)選大約2-5，000倍，更優(yōu)選大約5-2，000倍。
可以向外水相中加入乳化劑，乳化劑可以是任何乳化劑，只要它能形成穩(wěn)定的o/w乳液就行。這樣的乳化劑的實例包括陰離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠和透明質酸。它們可被單獨使用或結合使用。所用的乳化劑的濃度通常適當地選自大約0.001-20%(w/w)，優(yōu)選大約0.01-10%(w/w)，更優(yōu)選地大約0.05-5%(w/w)。當將碳酸鈣加入并分散在生物可降解的聚合物的有機溶劑溶液中時，向外水相中加入稀鹽酸。
可以向外水相中補以脂族羧酸的水溶性金屬鹽。所用金屬鹽可以與加到并分散在生物可降解的聚合物的有機溶劑溶液中的脂族羧酸的金屬鹽相同或不同。在該種情況下，優(yōu)選加入脂族羧酸金屬鹽使其在外水相中的濃度為大約0.01-20%(w/w)，更優(yōu)選是大約0.1-10%(w/w)。通過改變脂族羧酸金屬鹽在外水相中的濃度，可以控制脂族羧酸的金屬鹽從生物可降解的基質中被洗出。
另外，也可以按上述方式通過將生物可降解的聚合物的有機溶劑溶液加到含脂族羧酸的水溶性金屬鹽的外水相中形成o/w乳液來產生生物可降解的基質。
通過離心或過濾，收集如此得到的生物可降解的基質，然后用蒸餾水分數個循環(huán)反復洗滌，以除去粘附在所述基質表面的乳化劑等，再將基質分散在蒸餾水等中，然后冷凍干燥。
脂族羧酸的水溶性金屬鹽在生物可降解的基質中的含量按金屬計優(yōu)選為大約0.01-10%(w/w)，更優(yōu)選大約為0.05-7%(w/w)，最優(yōu)選大約為0.1-5%(w/w)。
(ⅲ)相分離法(凝聚法)在通過相分離法產生生物可降解的基質時，在攪拌期間將凝聚劑一點一點地加到上述的生物可降解的聚合物的w/o乳液或有機溶劑溶液中，以使生物可降解的聚合物分離并固化，加入凝聚劑的量按體積計為生物可降解的聚合物的w/o乳液或有機溶劑溶液的大約0.01-1，000倍，優(yōu)選大約0.05-500倍，更優(yōu)選大約0.1-200倍。
任何凝聚劑都是可接受的，它可以是一種聚合物、礦物油或植物油化合物，只要它在生物可降解的聚合物所用的溶劑中混溶并且不溶解所述聚合物就行。凝聚劑的實例包括硅油、芝麻油、豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亞麻子油、礦物油、正已烷和正庚烷。這些物質可單獨使用，也可結合使用。
過濾收集這樣得到的生物可降解的基質，然后，用庚烷等反復洗滌以除去凝聚劑。然后以在水性干燥法中的同樣方式洗滌該生物可降解的基質，最后冷凍干燥。
通過已知方法可以除去溶劑，所述方法包括在用葉片式攪拌器、磁力攪拌器或類似裝置攪拌下于常壓或逐漸減壓下蒸發(fā)溶劑的方法和用旋轉蒸發(fā)器或類似裝置調節(jié)真空度的同時蒸發(fā)溶劑的方法。
脂族羧酸的水溶性金屬鹽在生物可降解的基質中的含量按金屬計優(yōu)選大約為0.01-10%(w/w)，更優(yōu)選為大約0.05-7%(w/w)，最優(yōu)選為大約0.1-5%。
在通過水中干燥法或凝聚法的生產中，可以加入防絮凝劑以防顆粒發(fā)生絮凝作用。防絮凝劑的例子有水溶性多糖類如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、淀粉(如玉米淀粉)、透明質酸或其堿金屬鹽、蛋白質類如甘氨酸、血纖維蛋白和膠原以及無機鹽如氯化鈉和磷酸氫鈉。
(ⅳ)噴霧干燥法通過噴霧干燥法生產生物可降解的基質時，將(a)包含水或包含含有水溶性組分和生物可降解的聚合物的水溶液的w/o乳液或者(b)生物可降解的聚合物的有機溶劑溶液，通過噴嘴噴到噴霧干燥器的干燥室中使有機溶劑以細小的滴狀形式在很短的時間內揮發(fā)，得到細小的生物可降解的膠囊。所述的噴嘴的例子有雙液噴嘴(double-fluidnozzle)、壓力噴嘴和旋轉盤噴嘴。需要時，為了防止生物可降解的基質發(fā)生絮凝作用，在對(a)包含水或包含含有水溶性組分和生物可降解的聚合物的水溶液的w/o乳液或(b)生物可降解的有機溶劑溶液噴霧的同時，可以通過另一個噴嘴有效地對上述防絮凝劑的水溶液進行噴霧。生物可降解的基質優(yōu)選用包含含有脂族羧酸的水溶性金屬鹽和生物可降解的聚合物的水溶液的w/o乳液或者含有脂族羧酸水溶性金屬鹽的生物可降解的聚合物懸浮液的有機溶液產生。需要時，可以在升高的溫度和減壓下除去所得生物可降解的基質中的水和有機溶劑。
保留在用于本發(fā)明的生物可降解的基質中的有機溶劑的量通常少于大約1，000ppm，優(yōu)選少于大約500ppm，更優(yōu)選少于大約250ppm，最好少于100ppm。
用作本發(fā)明的生物可降解的基質的原料優(yōu)選是生物可降解的聚合物。生物可降解的聚合物的實例包括不溶或微溶于水的高分子聚合物如脂族聚酯(如由一種或多種α-羥基羧酸如乙醇酸、乳酸、羥基丁酸、纈氨酸和亮氨酸、羥基二羧酸如蘋果酸、羥基三羧酸如檸檬酸以及其它酸產生的聚合物、共聚物或其混合物)、聚-α-氰基丙烯酸酯和聚氨基酸(如聚-γ-芐基-L-谷氨酸)，以及它們的混合物。在這里，聚合類型可以是無規(guī)聚合、嵌段聚合或接枝聚合。
生物可降解的聚合物優(yōu)選是脂族聚酯(如由一種或多種α-羥基羧酸如乙醇酸、乳酸和羥基丁酸、羥基二羧酸如蘋果酸、羥基三羧酸如檸檬酸以及其它酸產生的聚合物、共聚物或其混合物)。
上述脂族聚酯中，從可靠的生物降解能力和生物相容性觀點來看，優(yōu)選的是由一種或多種α-羥基羧酸(如乙醇酸、乳酸和羥基丁酸)合成的聚合物或共聚物。更優(yōu)選地，脂族聚酯是由一種或多種α-羥基羧酸(如乙醇酸、乳酸、羥基丁酸)合成的共聚物。最好，脂族聚酯是由兩種或多種α-羥基羧酸(如乙醇酸、乳酸、羥基丁酸)產生的共聚物(如乙醇酸-乳酸共聚物)。
本發(fā)明的生物可降解的聚合物優(yōu)選是這樣一類聚合物，當通過已知方法制備并形成可用普通注射針頭注射的生物可降解的基質時，它允許水滲透并在沒有乙醇和其它有機溶劑存在下通過溶脹使生物可降解的基質增大。
雖然上述α-羥基羧酸可以具有D-、L-或D，L-構型，但優(yōu)選D-/L-構型的比率(mol%)落在大約75/25-25/75的范圍內。更優(yōu)選地，羥基羧酸中D-/L-構型比率(mol%)落在大約60/40-30/70范圍內。
上述α-羥基羧酸共聚物的實例包括乙醇酸與另一種α-羥基酸的共聚物，所述的另一種α-羥基酸優(yōu)選是乳酸、2-羥基丁酸、纈氨酸或亮氨酸。
α-羥基羧酸共聚物優(yōu)選是乳酸-乙醇酸共聚物或2-羥基丁酸-乙醇酸共聚物。
更優(yōu)選地，α-羥基羧酸共聚物是乳酸-乙醇酸共聚物。
關于乳酸-乙醇酸共聚物，優(yōu)選的含量比率(乳酸/乙醇酸)是大約100/0-40/60，更優(yōu)選地是大約90/10-45/55，最好是大約60/40-45/55。上述乙醇酸-乳酸的重均分子量優(yōu)選為大約3，000-12，000，更優(yōu)選是大約4，000-10，000。水溶性多肽滲透到用所述共聚物產生的生物可降解的基質中的滲透率以及給藥后生物可降解的基質的體內排除率受含量比率和重均分子量共同影響。當給藥(如皮下給藥)后的體內排除期是大約2周時，并且如果水滲透到生物可降解的膠囊中沒有問題的話，那么，舉例來說，含量比率(乳酸/乙醇酸)可以是大約50/50，而重均分子量應為大約4，000-9，000，優(yōu)選大約5，000-9，000。
在本發(fā)明中，可以將具有不同組成和重均分子量的兩種乳酸-乙醇酸共聚物以任意比例的混合物形式使用。
這樣的混合物包括具有大約75/25的含量比率(乳酸/乙醇酸，mol%)和大約6，000的重均分子量的乳酸-乙醇酸共聚物與具有大約50/50的含量比率(乳酸/乙醇酸，mol%)和大約4，000的重均分子量的另一種乳酸-乙醇酸共聚物的混合物。重量混合比優(yōu)選為大約25/75-75/25。
乳酸-乙醇酸共聚物的分散度(重均分子量/數均分子量)優(yōu)選為大約1.2-4.0。更優(yōu)選地，所述共聚物的分散度是大約1.5-3.5。本發(fā)明的乳酸-乙醇酸共聚物可以通過已知方法如日本專利未審查公報No.28521/1986中所述的方法產生。優(yōu)選地，所述共聚物通過無催化劑的脫水聚合縮合產生。
關于2-羥基丁酸-乙醇酸共聚物，優(yōu)選地，乙醇酸占大約10-75mol%，而余量為2-羥基丁酸。更優(yōu)選地，乙醇酸占大約20-75mol%，最好占大約30-70mol%。2-羥基丁酸-乙醇酸共聚物的重均分子量為大約2，000-20，000，優(yōu)選大約3，000-10，000，更優(yōu)選為大約4，000-8，000。所述乙醇酸共聚物的分散度(重均分子量/數均分子量)優(yōu)選為大約1.2-4.0，更優(yōu)選為大約1.5-3.5。該乙醇酸共聚物可以通過已知方法如日本專利未審查公報No.28521/1986中所述的方法(基于在沒有催化劑存在下或在有機固體酸催化劑存在下的脫水聚合縮合的方法)產生。優(yōu)選地，所述共聚物通過無催化劑的脫水聚合縮合方法產生。
上述乙醇酸共聚物可以以與聚乳酸的混合物形式使用。雖然聚乳酸可以具有D-構型、L-構型或其混合物，但優(yōu)選的是，D-/L-構型的比率(mol%)落在大約75/25-20/80的范圍內。更優(yōu)選的是一種D-/L-構型的比率(mol%)落在大約60/40-25/75范圍內的聚乳酸。最好是一種D-/L-構型的比率(mol%)落在大約55/45-25/75范圍內的聚乳酸。所述的聚乳酸優(yōu)選具有大約1，500-10，000的重均分子量，更優(yōu)選地，所述分子量落在大約2，000-8，000范圍內，最好在大約3，000-6，000范圍內。所述聚乳酸的分散度優(yōu)選為大約1.2-4.0，更優(yōu)選為大約1.5-3.5。
已知有兩種產生聚乳酸的方法丙交酯(一種乳酸二聚體)的開環(huán)聚合和乳酸的脫水聚合縮合。為了得到用于本發(fā)明的分子量較低的聚乳酸，優(yōu)選方法是乳酸的直接脫水聚合縮合。該方法例如描述在日本專利未審查公報No.28521/1986中。
當將乙醇酸共聚物與聚乳酸混合使用時，它們的混合比為大約10/90-90/10(重量%)，優(yōu)選為大約20/80-80/20，更優(yōu)選為大約30/70-70/30。
在本發(fā)明中，由無催化劑的脫水聚合縮合產生的生物可降解的聚合物通常具有末端羧基。
具有末端羧基的生物可降解的聚合物是這樣一種聚合物，其中用GPC測定法測定的數均分子量與用端基測定法測定的數均分子量幾乎一致。
為了對末端羧基進行定量，將大約1-3g的生物可降解的聚合物溶解在丙酮(25ml)和甲醇(5ml)的混合溶劑中，在室溫攪拌下用酚酞作為指示劑用0.05N氫氧化鉀的醇溶液快速滴定，測定末端羧基含量;由下述公式計算數均分子量端基測定法測定的數均分子量＝20，000A/B其中，A為生物可降解的聚合物的重量(g)，B為達到滴定終點時所加的0.05N氫氧化鉀醇溶液的量(ml)。
下文中，該值被稱為由端基測定法測定的數均分子量。
例如，在聚合物具有末端羧基并且是通過無催化劑的脫水聚合縮合法由一種或多種α-羥基酸產生的情況下，由GPC測定法測定的數均分子量與由端基測定法測定的數均分子量幾乎彼此一致。另一方面，在聚合物沒有末端羧基并且是用催化劑通過開環(huán)聚合法由環(huán)狀二聚體合成的情況下，由端基測定法測定的數均分子量明顯高于由GPC測定法測定的數均分子量。這種差別使得可以清楚地區(qū)分具有末端羧基的聚合物和沒有末端羧基的聚合物。
由端基測定法測定的數均分子量是一個絕對值，而由GPC測定法測定的數均分子量是一個相對值，它隨著各種分析條件(如流動相的種類、柱的類型、參比物質、選擇板的寬度、選擇的基線等)而變化，所以難以用一個絕對數字表示由GPC測定法測定的數均分子量。然而，由GPC測定法測定的數均分子量與由端基測定的數均分子量幾乎彼此一致的事實意味著由端基測定法測定的數均分子量落在由GPC測定法測定的數均分子量的大約0.5-2倍、優(yōu)選大約0.8-1.5倍的范圍內。同樣，由端基測定法測定的數均分子量顯著高于由GPC測定法測定的數均分子量的事實意味著由端基測定法測定的數均分子量超過由GPC測定法測定的數均分子量的大約2倍。
在本發(fā)明中，優(yōu)選由GPC測定法測定的數均分子量與由端基測定法測定的數均分子量幾乎彼此一致的聚合物。
在本說明書中，重均分子量和數均分子量是用重均分子量分別為120，000、52，000、22，000、9，200、5，050、2，950、1，050、580和162的9種聚苯乙烯作為參比物通過凝膠滲透色譜(GPC)得到的基于聚苯乙烯的那些值。測量使用的是GPC柱KF804L×2(由ShowaDenko生產)和RI檢測器L-3300(由Hitachi，Ltd.生產)，用氯仿作為流動相。
分散度通過下式計算重均分子量/數均分子量。
脂族羧酸的水溶性金屬鹽可以是任何一種，沒有限制，只要它在水中可溶并且不對活體產生不利影響就行。
脂族羧酸的水溶性金屬鹽優(yōu)選是這樣一種脂族羧酸的金屬鹽，它在常溫(大約20℃)下的水溶解度超過大約200mg/ml。
關于脂族羧酸的水溶性金屬鹽，其中的脂族羧酸優(yōu)選具有2-9個碳原子。脂族羧酸包括脂族單羧酸、脂族二羧酸和脂族三羧酸。這些羧酸可以是飽和或不飽和的。
脂族單羧酸的實例包括具有2-9個碳原子的飽和脂族單羧酸(如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、已酸、庚酸、辛酸、壬酸、caprynicacid)和具有2-9個碳原子的不飽和脂族單羧酸(如丙烯酸、丙炔酸、甲基丙烯酸、巴豆酸、異巴豆酸)。
脂族二羧酸的實例包括具有2-9個碳原子的飽和脂族二羧酸(如丙二酸、丁二酸、戊二酸、已二酸、庚二酸)和具有2-9個碳原子的不飽和脂族二羧酸(如馬來酸、富馬酸、檸康酸、中康酸)。
脂族三羧酸的實例包括具有2-9個碳原子的飽和脂族三羧酸(如丙三羧酸、1，2，3-丁三羧酸)。
這些脂族羧酸可以具有1或2個羥基。這樣的脂族羧酸包括乙醇酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸、蘋果酸、酒石酸和檸檬酸)。
脂族羧酸優(yōu)選是脂族單羧酸，更優(yōu)選的是具有2-9個碳原子的飽和脂族單羧酸，進一步優(yōu)選的是具有2至3個碳原子的飽和脂族單羧酸。特別優(yōu)選的脂族羧酸的實例包括乙酸。
在脂族羧酸的水溶性金屬鹽中，所述金屬鹽的實例有一價金屬鹽如堿金屬(如鈉、鉀)鹽和銅(Ⅰ)以及多價金屬鹽如堿土金屬(如鈣、鎂)的鹽、鋅(Ⅱ)鹽、鐵(Ⅱ、Ⅲ)鹽、銅(Ⅱ)鹽、錫(Ⅱ、Ⅳ)鹽和鋁(Ⅱ、Ⅲ)鹽。
金屬鹽優(yōu)選是多價金屬鹽，更優(yōu)選的是鈣鹽或鋅鹽。
脂族羧酸的水溶性金屬鹽的實例包括乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸鈣、乙酸鋅、丙酸鈉、丙酸鈣、乙醇酸鈉、乙醇酸鋅、乳酸鈉、乳酸鈣、乳酸鋅、酒石酸鈉、酒石酸鋅和檸檬酸鈉。更優(yōu)選的脂族羧酸的水溶性金屬鹽包括乙酸鈣和乙酸鋅。
芳族羧酸的水溶性金屬鹽可以以與脂族羧酸的水溶性金屬鹽的同樣方式使用。芳族羧酸的水溶性金屬鹽的實例包括苯甲酸鈉、苯甲酸鋅、水楊酸鈉和水楊酸鋅。
用于上述方法的油相中所用的溶劑優(yōu)選為可溶解所述生物可降解基質的、沸點不高于120℃的有機溶劑。這樣的溶劑包括囟代烴類(如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳)、醇類(如乙醇、甲醇)和乙腈。它們可被單獨使用或結合使用。有機溶劑優(yōu)選為二氯甲烷或乙腈。
本發(fā)明的緩釋劑制劑可以通過在水溶液中使水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中來制備。本發(fā)明的緩釋制劑(如微膠囊)可以通過例如下述步驟制備。這樣制得的緩釋制劑下文也稱之為微膠囊。
1)制備水溶性多肽的水溶液。
2)使生物可降解的基質與上述1)的水溶液接觸，使后者滲透到生物可降解的基質中。
3)必要時，將未滲透到生物可降解的基質中的水溶性多肽與生物可降解的基質分離(洗滌)。
4)對緩釋制劑(如微膠囊)進行干燥，其中所述緩釋制劑是通過使水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中產生的。
可以向上述水溶性多肽的水溶液中加入可體內注射的鹽如無機鹽(如氯化鈉、磷酸-氫鈉)、有機鹽(如乙酸銨)和氨基酸(如甘氨酸、精氨酸、組氨酸)以增大水溶性多肽的溶解度或維持水溶性多肽的生物活性。
可以將這些鹽結合使用以獲得接近藥物最佳pH的pH值。雖然通常是將所述水溶液調到中性或弱酸性pH值，但它也可以被調成堿性pH值。調節(jié)這些鹽的濃度以使水溶性多肽的水溶液的滲透壓力為生理鹽水的大約1/50-5倍，優(yōu)選為大約1/25-3倍?？梢约尤氡砻婊钚詣┤鏣ween80。表面活性劑以大約0.0001-0.2%(w/v)濃度使用，優(yōu)選濃度為大約0.001-0.1%(w/v)。
可以向水溶性多肽的水溶液中加入血清白蛋白。加入血清白蛋白可以增加水溶性多肽的溶解度并能使水溶性多肽保持有生物活性?？蓪⒀灏椎鞍最A先與水溶性多肽混合。加入的血清白蛋白優(yōu)選是人的血清白蛋白，它可以從人體血液中分離和純化得到，也可以通過基因工程技術產生。水溶性多肽和血清白蛋白的混合比(按重量計)為例如大約1∶1，000-100∶1，優(yōu)選大約1∶100-10∶1。
雖然水溶性多肽在水溶液中的濃度不受限制，但優(yōu)選地，所述濃度在低于水溶性多肽的溶解度時應盡可能地高，以使每單位重量的生物可降解的基質滲透有最大可能量的水溶性多肽。所述溶解度隨鹽濃度、溫度和添加劑存在與否而變化。一般人們都知道，緩釋制劑的水溶性多肽的釋放模式隨水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中的濃度而變化;水溶性多肽的濃度也是從這一觀點出發(fā)選擇的。水溶性多肽的濃度通常為大約100μg/ml-500mg/ml，優(yōu)選為大約1-300mg/ml，更優(yōu)選的是大約1-100mg/ml。
在生物可降解的基質是通過將生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金屬鹽混合來產生的情況下，當使水溶性多肽的水溶性滲透到生物可降解的基質中時，雖然水溶性多肽的水溶液的pH值隨生物可降解的基質中所含的脂族羧酸的水溶性金屬鹽的種類、水溶性多肽的等電點和其它因素而改變，但它優(yōu)選為大約3-9，更優(yōu)選的是大約3-8。可以用酸如無機酸(如鹽酸)或有機酸(如乙酸)或堿如堿金屬氫氧化物(如氫氧化鈉)適當地調節(jié)pH值。按照酸或堿的電離程度和強度以及所希望的pH值，適當地選擇用于此目的的酸或堿的量。優(yōu)選的脂族羧酸的水溶性金屬鹽包括乙酸鈉、乙酸鋅和乙酸鈣，這是因為它們能在接近于中性pH值時使水溶性多肽的水溶液滲透生物可降解的基質。
水溶性多肽在水溶液中向生物可降解的基質的滲透通過例如將水溶性多肽的水溶液與生物可降解的基質混合來完成。
混合水溶性多肽的水溶液和生物可降解的基質的次序是任選的，只要能保持水溶性多肽的生物活性就行。例如，可以將生物可降解的基質浸沒在水溶性多肽的水溶液中，也可以將水溶性多肽的水溶液加到生物可降解的基質中。
設定水溶性多肽的水溶液和生物可降解的基質的混合比，使得水溶性多肽的水溶液的用量過量，以便用水溶性多肽的水溶液徹底滲透生物可降解的基質。換句話說，制備混合物以使全部生物可降解的基質浸沒在水溶性多肽的水溶液中。
盡管水溶性多肽水溶液和生物可降解基質的重量比例因生物可降解基質的孔隙率變化大而不能明確確定，但該比例優(yōu)選為約1∶10至20∶1，更優(yōu)選為約1∶5至10∶1。不過，通常在必需范圍內采用盡可能少量的水溶性多肽水溶液，以最大限度地減少貴重的水溶性多肽的損失，并且避免重復使用未滲入生物可降解基質的水溶性多肽。水溶性多肽的水溶液和生物可降解基質一般用容器進行混合，優(yōu)選用對水溶性多肽的吸附性極低的容器，如用硅化玻璃。同樣可優(yōu)選經過表面處理后對水溶性多肽的生物活性沒有影響的合金(不銹鋼和鈦合金)。
作為舉例，將生物可降解的基質加入水溶性多肽的水溶液中并放置即可實現混合操作，放置期間可不進行攪拌或進行輕微攪拌，但攪拌強度以不喪失水溶性多肽的生物活性為限。這種混合操作可在一定真空下進行，其中真空度以水溶性多肽的水溶液不過分鼓泡為宜。該混合操作在不會影響水溶性多肽的生物活性或不會使構成生物可降解基質的生物可降解聚合物分解的溫度下進行，一般溫度為室溫，優(yōu)選在低溫處進行。具體地講，混合溫度為約1-30℃，優(yōu)選約4-25℃。混合時間可從幾分鐘至數十小時，優(yōu)選幾小時至數十小時，這取決于生物可降解基質的含量、生物可降解聚合物的組成、分子量、溫度和其它因素。具體地講，可在約4℃下混合約10-100小時或在約25℃下混合約5-50小時。在水溶性多肽不喪失生物活性并且生物可降解聚合物不過分水解的條件下，混合時間可任意選定。在應用生物可降解聚合物與脂族羧酸的水溶性金屬鹽混合所得生物可降解基質的情況下，該混合時間可縮短。具體地講，可于約4℃下混合約0.5-24小時，或于約25℃下混合約0.5-5小時。
混合操作后必要時可進行洗滌。這種洗滌操作去除未滲入生物可降解基質的水溶性多肽?？刹捎酶鞣N洗滌方法，包括不會破壞生物可降解基質的方法和滲入生物可降解基質的水溶性多肽不會從生物可降解基質中滲漏出來并且可保持其生物活性的方法。例如，在混合操作結束后就加洗滌液，然后進行離心或過濾操作以使微膠囊與洗滌液分開，再重復這一過程。該操作所用洗滌液可為蒸餾水或含鹽(如磷酸氫鈉、氯化鈉)或糖(如甘露糖醇)的水溶液。該洗滌液優(yōu)選含甘露糖醇的水溶液。
然后將所得微膠囊干燥。干燥方法包括凍干法和真空干燥法，優(yōu)選凍干法。可加入防絮凝劑以防在干燥操作期間出現顆粒絮凝。防絮凝劑的例子可舉出水溶性多糖如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖和淀粉(如玉米淀粉)、粘多糖如透明質酸、蛋白質如甘氨酸、血纖維蛋白和膠原蛋白、無機酸鹽如氯化鈉和磷酸氫鈉以及磷脂如卵磷脂。
在干燥操作過程中，在水溶性多肽的生物活性不受影響和微膠囊不被破壞的條件下，干燥溫度就可任意選定。優(yōu)選的是，加熱溫度超過所用可生物降解聚合物的玻璃轉化溫度，但不會使微膠囊粒相互粘結。玻璃轉化溫度定義為用差示掃描量熱儀(DSC)以約10或20℃/分鐘的速度加熱而達到的中間玻璃轉化溫度(Tmg)。優(yōu)選的是，加熱溫度比玻璃轉化溫度高約2-10℃，尤其是約25-50℃，優(yōu)選約30-45℃。加熱時間為數小時，優(yōu)選為微膠囊達到給定溫度后的約24小時內。這取決于加熱溫度、被處理微膠囊量和其它因素。只要能保證微膠囊均勻受熱，就可不加限制地采用任何加熱方法。這類加熱方法包括在恒溫室中加熱和微波爐加熱。這種干燥操作可抑制微膠囊施用于溫血動物后出現過早釋放。
在本發(fā)明中，水溶性多肽的生物活性在微膠囊制備過程中幾乎不受影響，因為在水溶性多肽滲入可生物降解基質時沒有采用有機溶劑，也沒有進行過度加熱。這里提到的有機溶劑的例子可舉出囟代烴、醇、乙腈和冰醋酸。
應用脂族羧酸的水溶性金屬鹽可使水溶性多肽有效地滲入可生物降解的基質。在用于注射時，本發(fā)明緩釋制劑可在長時間如約1星期至1個月內達到幾乎恒定的緩釋效果。
在本發(fā)明緩釋制劑為微膠囊時，其中的水溶性多肽含量的確定方法例子是采用色譜法如HPLC或免疫測定法如用酶免疫測定法分離出微膠囊中所含的水溶性多肽并將其定量，或測定分離出來的水溶性多肽的生物活性。微膠囊中水溶性多肽與生物可降解的聚合物之含量比例一般為約0.1-30%(w/w)，優(yōu)選為約1-20%(w/w)。
本發(fā)明緩釋制劑可以如此之微膠囊形式給藥，也可以各種非口服劑型(如肌內、皮下或內臟注射液或導服制劑、鼻內、直腸或子宮內經粘膜給藥制劑)或口服劑型(如膠囊(如硬膠囊和軟膠囊)或固體制劑如粒劑和粉劑或液體制劑如懸濁液)給藥。
在本發(fā)明中，緩釋制劑優(yōu)選用于注射。在該緩釋制劑為微膠囊時，可將其制成注射制劑，其制備方法例如將該微膠囊與分散劑(如表面活性劑如Tween80和HCO-60、多糖如羧甲基纖維素、藻酸鈉和透明質酸鈉，以及硫酸魚精蛋白)，防腐劑(如羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯)、等滲劑(如氯化鈉、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖)、局部麻醉劑(如木卡因鹽酸鹽、氯丁醇)等一起懸浮在水中而得到水懸濁液，或將其分散在植物油如芝麻油或玉米油或中等鏈長脂肪酸甘油三酯(如Miglyol812，HülsAktiengesellschaft)中并加入或不加磷脂如卵磷脂而得到油懸濁液。
在緩釋制劑為微膠囊時，如果將其用作可注射懸濁液，則只要能滿足分散度和穿過針頭的要求，就可將其粒徑選為例如約0.1-300μm。優(yōu)選的是，粒徑范圍為約1-150μm，更優(yōu)選約2-100μm。
上述微膠囊可制成無菌制劑，其中可采用使整個生產過程無菌的方法，用伽馬射線作為滅菌射線的方法和加抗菌劑的方法，但并不僅限于這些方法。
本發(fā)明緩釋制劑毒性低，可安全地用于哺乳動物(如人、牛、豬、狗、貓、小鼠、大鼠、兔)。
本發(fā)明緩釋制劑的適應征根據所用水溶性多肽而變化。例如，本發(fā)明緩釋制劑中水溶性多肽為α-干擾素時可有效地用于治療或預防病毒性肝炎(如丙型肝炎、HBe抗原呈陽性的慢性活動性乙型肝炎)、癌癥(如腎癌和多發(fā)性骨髓瘤)，水溶性多肽為紅細胞生成素時可有效地用于治療貧血(如腎透析過程中的貧血)，水溶性多肽為G-CSF時可有效地用于治療中性白細胞減少(如在抗癌劑治療期間)和傳染性疾病，水溶性多肽為IL-2時可有效地用于治療癌癥(如血管內皮瘤)，水溶性多肽為FGF時可有效地用于治療消化道潰瘍，水溶性多肽為FGF-9時可有效地用于治療血小板減少，水溶性多肽為NGF時可有效地用于治療老年性癡呆和神經病，水溶性多肽為TPA時可有效地用于治療血栓形成等，水溶性多肽為胰島素時可有效地用于治療糖尿病，水溶性多肽為腫瘤壞死因子時可有效地用于治療癌癥。
根據水溶性多肽的類型和含量、水溶性多肽釋放時間、待治療疾病、接受治療的動物和其它因素，可選取不同的緩釋制劑劑量，使水溶性多肽顯示出其藥理作用。在制劑預定釋放時間為1星期時，每個成人每次服用的水溶性多肽劑量可適當選為約0.0001-10mg/kg體重，更優(yōu)選為約0.0005-1mg/kg體重。
每個成人每次服用的緩釋制劑量可適當地選為約0.0005-50mg/kg體重，更優(yōu)選為約0.0025-10mg/kg體重。給藥次數可根據水溶性多肽種類、含量和劑型、水溶性多肽釋放時間、待治療疾病、接受治療的動物和其它因素而適當地選定，例如每星期一次或每兩星期一次。
盡管本發(fā)明制劑可在常溫或低溫處貯存，但優(yōu)選將其貯存在低溫處。這里所說的常溫和低溫處由PharmacopoeiaofJapan定義，具體地講常溫為15-25℃，而低溫處為15℃以下。
以下實施例和比較例詳述本發(fā)明，但不應理解為是對本發(fā)明的限制。除另有說明外，以%單位計的數值為重量/體積(w/v)比例。
實施例1將2.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，400，GPC數均分子量2，900，端基測定法測定的數均分子量2，200，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷中。加入1ml注射用生理鹽水作為內水相后，用均化器(Polytron)將混合物攪拌約30秒。將該溶液倒入500ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)的水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以4，000rpm速度攪拌而得到w/o/w乳液，之后再于室溫下將該乳液攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化，最后用離心機(05PR-22，Hitachi，Ltd.)以2，000rpm轉速離心收集固體。所得沉淀再分散于蒸餾水中并進行離心分離。在將收集得到的乳酸-乙醇酸共聚物基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末。
在聚乙烯試管中稱量的1.08×109IU(國際單位)α-干擾素(含約25mg人血清白蛋白)溶于200μl蒸餾水中。向該溶液中加入200mg上述生物可降解的基質。在進行密封后，該混合物在冰箱中于4-8℃放置約4天。這一操作之后，加入5ml蒸餾水，然后輕微攪拌約1分鐘并后續(xù)以約2，000rpm的速度離心分離5分鐘，此后廢棄上層清液。這一系列操作重復3次以進行洗滌。向所得微膠囊中加入44mg D-甘露糖醇和2ml蒸餾水，然后輕微攪拌而得到分散體，最后在40℃下真空干燥6小時。
實施例2按同于實施例1的方法得到粉狀乳酸-乙醇酸共聚物基質。
將在聚乙烯試管中稱量的1.08×109IUα-干擾素(含約25mg人血清白蛋白)溶于200μl蒸餾水中。向該溶液中加入200mg上述生物可降解的基質。在進行密封后，混合物在冰箱中于4-8℃放置約30小時。該操作之后加入5ml蒸餾水，然后輕微攪拌約1分鐘并后續(xù)以約1，000rpm的速度離心分離5分鐘，此后廢棄上層清液。這一系列操作重復3次以進行洗滌。向所得微膠囊中加入1ml透明質酸鈉(分子量1，800，000)的0.1%水溶液，然后輕微攪拌而得到分散體，最后再將其凍干16小時。
實施例3將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，900，GPC數均分子量2，600，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入4g碳酸鈣后，用旋渦混合器將溶液攪拌約30秒鐘而得到s/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。再加入10ml1N鹽酸以中和過量的碳酸鈣。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
在玻璃試管中稱量4mg(8×108IU)凍干α-干擾素并將其溶于2ml 10mM鹽酸溶液中。向該溶液中加入50mg上述生物可降解的基質，然后于4℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生產)旋轉混合約1天。這樣操作后，加入4ml蒸餾水，之后輕微攪拌約1分鐘并后續(xù)在約1，000rpm轉速下離心分離5分鐘，此后將上層清液廢棄。這一系列操作重復2次以進行洗滌。所得分散體凍干而得微膠囊(約48mg)。
為了測定所得微膠囊中的α-干擾素含量，用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫試驗封閉劑)對微膠囊進行萃取，然后進行EIA(酶免疫分析)。微膠囊中α-干擾素含量為5，700，000IU/mg微膠囊。
實施例4將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，100，GPC數均分子量2，570，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙酸鋅(二水合物)后，將溶液搖蕩2小時并后續(xù)用均化器(Polytron)攪拌約30秒鐘而得到s/o乳液。將該乳液倒入800mg已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
在玻璃試管中稱量6mg(約1.2×109IU)凍干α-干擾素并將其溶于3ml 0.5mM鹽酸溶液中。向該溶液中加入300mg上述生物可降解的基質，然后于4℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生產)旋轉混合約1天。這樣操作后，加入10ml 5%甘露糖醇水溶液，之后輕微攪拌約1分鐘并后續(xù)在約2，000rpm轉速下離心分離5分鐘，此后仍將上層清液廢棄。這一系列操作重復3次以進行洗滌。向所得微膠囊中加入30mg D-甘露糖醇和0.5ml蒸餾水，然后輕微攪拌而得到懸浮液，再凍干而得到微膠囊(約310mg)。
為了測定所得微膠囊中的α-干擾素含量，用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫試驗封閉劑)對微膠囊進行萃取，然后進行酶免疫分析(用干擾素抗體進行的夾層技術，以下簡稱EIA)。微膠囊中α-干擾素含量為2，300，000IU/mg微膠囊。
實施例5將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，900，GPC數均分子量2，600，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入1ml含800mg乙酸鋅(二水合物)的水溶液后，用均化器(Polytron)將溶液攪拌約30秒鐘而得到w/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到w/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
在玻璃試管中稱量6mg(約1.2×109IU)凍干α-干擾素并將其溶于3ml 0.5mM鹽酸溶液中。向該溶液中加入300mg上述生物可降解的基質，然后于10℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生產)旋轉混合約1天。這樣操作后，加入10ml 5%甘露糖醇水溶液，之后輕微攪拌約1小時并后續(xù)在約1，000rpm轉速下離心分離5分鐘，此后將上層清液廢棄。這一系列操作重復2次以進行洗滌。將所得微膠囊凍干。
為了測定所得微膠囊中的α-干擾素含量，可用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫試驗封閉劑)對微膠囊進行萃取，然后進行EIA。微膠囊中α-干擾素含量為780，000IU/mg微膠囊。
實施例6將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，900，GPC數均分子量2，600，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙酸鈣(一水合物)后，用均化器(Polytron)將溶液攪拌約30秒鐘而得到s/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
在玻璃試管中稱量4mg(8×108IU)凍干α-干擾素并將其溶于2ml 1mM鹽酸溶液中。向該溶液中加入50mg上述生物可降解的基質，然后于4℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生產)旋轉混合約1天。這樣操作后，加入4ml蒸餾水，之后輕微攪拌約1分鐘并后續(xù)在約1，000rpm轉速下離心分離5分鐘，此后將上層清液廢棄。這一系列操作重復2次以進行洗滌。所得分散體凍干而得微膠囊(約48mg)。
為了測定所得微膠囊中的α-干擾素含量，可用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫試驗封閉劑)對微膠囊進行萃取，然后進行EIA。微膠囊中α-干擾素含量為9，400，000IU/mg微膠囊。
實施例7將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，100，GPC數均分子量2，570，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙醇鋅(二水合物)后，將溶液搖蕩2小時并后續(xù)用均化器(Polytron)攪拌約30秒鐘而得到s/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
在玻璃試管中稱量50mg生物可降解基質。在加入已預先用鹽酸或氫氧化鈉調為適當pH(約為2，4，5和8這樣4個pH值)的2mg/mlα-干擾素溶液(約4.0×108IU)后，混合物于4℃旋轉混合24小時，以使α-干擾素滲入生物可降解基質。在約1，000rpm下進行離心分離并去除上層清液后，剩余物用4ml蒸餾水洗滌2次，然后加0.5ml蒸餾水并凍干。
實施例8將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，900，GPC數均分子量2，600，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙酸鈣(一水合物)后，用均化器(Polytron)將溶液攪拌約30秒鐘而得到s/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約4.0g)。
然后，按同于實施例7的方法，在不同pH值下讓α-干擾素滲入可生物降解基質中并隨后凍干。
實施例9將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，100，GPC數均分子量2，570，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.2g乙酸鈉(三水合物)后，將溶液搖蕩2小時并后續(xù)用均化器(Polytron)攪拌約30秒鐘而得到s/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
然后，按同于實施例7的方法，在不同pH值下讓α-干擾素滲入生物可降解基質中并隨后凍干。
實施例10將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，100，GPC數均分子量2，570，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙酸鋅(二水合物)后，將溶液搖蕩2小時并后續(xù)用均化器(Polytron)攪拌約30秒鐘而得到s/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
用玻璃試管取出2ml含白介素2(20μg)的水溶液。加入300mg上述生物可降解的基質后，混合物于4℃下用Low-ProfileRoller(由LifeScience生產)旋轉混合約5小時。白介素2按日本未審查專利申請公開No.78799/1986所述方法得到并按日本未審查專利申請公開No.115528/1985所述方法提純。這種白介素2為N端連有甲硫氨酸的白介素和N端未連甲硫氨酸的白介素的混合物。這樣操作后，加入10ml5%甘露糖醇的水溶液，之后輕微攪拌約1分鐘并后續(xù)在約2，000rpm轉速下離心分離5分鐘，此后將上層清液廢棄。這一系列操作重復3次以進行洗滌。向所得微膠囊中加入30mgD-甘露糖醇，再將混合物溶于0.5ml蒸餾水中，然后輕微攪拌。所得懸浮液凍干。
實施例11將5.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，800，GPC數均分子量2，805，由WakoPureChemical生產)和782mg苯甲酸鋅加入6.625g(5ml)二氯甲烷中，混合物于室溫下搖蕩3小時而得到s/o乳液。將該乳液倒入1000ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，在此之后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
在玻璃試管中稱量2mg(約1.7×108IU)凍干α-干擾素并將其溶于3ml 0.5mM鹽酸溶液中。向該溶液中加入302mg上述生物可降解的基質，然后于15℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生產)旋轉混合約5小時。這樣操作后，加入10ml 5%甘露糖醇水溶液，之后輕微攪拌約1分鐘并后續(xù)在約2，000rpm轉速下離心分離5分鐘，此后將上層清液廢棄。這一系列操作重復3次以進行洗滌。所得微膠囊中加入30mg D-甘露糖醇和0.5ml蒸餾水，然后輕微攪拌而得到懸浮液，再凍干而得到微膠囊(約310mg)。
為了測定所得微膠囊中的α-干擾素含量，用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫試驗封閉劑)對微膠囊進行萃取，然后進行EIA。微膠囊中α-干擾素含量為3，610，000IU/mg微膠囊。
實施例12按基本上同于實施例11的方法得到粉狀乳酸-乙醇酸共聚物基質，只是用995mg水楊酸鋅代替苯甲酸鋅。微膠囊也按同于實施例11的方法得到，只是應用304mg基質。
微膠囊中α-干擾素含量為1，930，000IU/mg微膠囊。
比較例1將2mg凍干粉狀α-干擾素溶于2ml含0.5%牛白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水中(EIA測定其濃度為175，000，000IU/ml)。
比較例2將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，900，GPC數均分子量2，600，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.5ml濃度已預先調為2g/ml的氯化鋅水溶液后，用均化器(Polytron)將溶液攪拌約30秒鐘而得到w/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到w/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
然后，按同于實施例7的方法，在不同pH值下讓α-干擾素滲入生物可降解基質中并隨后凍干。
比較例3將4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%計，GPC重均分子量5，900，GPC數均分子量2，600，由WakoPureChemical生產)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.2g碳酸鋅后，用旋渦混合器將溶液攪拌約30秒鐘而得到s/o乳液。將該乳液倒入800ml已預先調為18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生產)水溶液中，然后在高速渦輪攪拌器中以6，000rpm攪拌而得到s/o/w乳液，此后于室溫下攪拌5小時而使二氯甲烷揮發(fā)并使油相固化。于約2，000rpm速度下離心分離(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，將上層清液廢棄。剩余物分散在蒸餾水中并進行離心分離。收集到的可生物降解基質再分散于少量蒸餾水中后，將分散液凍干而得到粉末(約2.0g)。
然后，按同于實施例7的方法，在不同pH值下讓α-干擾素滲入生物可降解基質中并隨后凍干。
試驗例1將約40mg實施例1得到的微膠囊分散在0.5ml分散劑(含2.5mg羧甲基纖維素、0.5mg多乙氧基醚和25mg甘露糖醇的蒸餾水，其中三種物質均溶解)中而得到注射制劑，然后在8周齡雄性SD大鼠的背上用22號針頭皮下注射(微膠囊劑量133mg/kg)。注射后，以恒定間隔從尾部采血并按酶免疫分析法(EIA)測定血清中的α-干擾素濃度。結果表明，1星期內，血中濃度幾乎保持不變。
試驗例2按同于試驗例1的方法給大鼠注射實施例2得到的約30mg微膠囊，并按酶免疫分析法(EIA)測定血清中α-干擾素濃度。結果表明，1星期內，血中濃度幾乎保持不變。
試驗例3將約22mg實施例4得到的微膠囊和約64mg實施例5得到的微膠囊分別分散在0.5ml分散劑(5g羧甲基纖維素、2g多乙氧基醚(表面活性劑)和25g甘露糖醇，全部溶于1l蒸餾水)中而得到注射制劑，然后在8周齡雄性SD大鼠的背上用18號針頭進行皮下注射(α-干擾素用量為約50，000，000IU/大鼠)。注射后，以恒定間隔從尾部取血并按EIA測定血清中α-干擾素濃度。作為對比，給大鼠皮下注射比較例1得到的α-干擾素水溶液(α-干擾素用量約為50，000，000IU/大鼠)。在注射比較例1的微膠囊的試驗組中，血清中干擾素濃度到注射后第3天就已下降到檢測極限。在注射實施例4或5的微膠囊的試驗組中，血中最初的高濃度之后，濃度在1星期內幾乎保持不變。
試驗例4α-干擾素溶液pH和各種鋅鹽對α-干擾素向生物可降解基質中的滲透效率(微膠囊中干擾素含量)的影響按以下所述檢驗。
實施例7(乙酸鋅)、比較例2(氯化鋅)和比較例3(碳酸鋅)所得微膠囊分別用含10%乙腈的25%BlockAce溶液萃取后進行EIA以確定α-干擾素含量。如

圖1所示，在用乙酸鋅時，在α-干擾素處于相對物理穩(wěn)定狀態(tài)的pH條件下α-干擾素滲透效率高。
試驗例5
α-干擾素溶液pH和乙酸鈣鹽對α-干擾素向生物可降解基質中的滲透效率(微膠囊中干擾素含量)的影響按同于試驗例3的方法檢驗。如圖2所示，在α-干擾素處于相對物理穩(wěn)定狀態(tài)的pH條件下α-干擾素滲透效率高。
根據本發(fā)明生產方法，可使水溶性多肽滲入生物可降解基質中，同時又不會讓水溶性多肽與有機溶劑接觸，并且可在不影響水溶性多肽的生物活性的情況下將水溶性多肽制成藥物制劑。此外，應用脂族羧酸的金屬鹽可有效地使水溶性多肽滲入生物可降解基質中。本發(fā)明緩釋制劑用于注射時可在幾天至1個月(如約1-2星期)內顯示出優(yōu)異的緩釋效果。
圖1示出了干擾素溶液pH和各種鋅鹽與微膠囊中干擾素含量之間的關系，其中●代表乙酸鋅(實施例7)，○代表氯化鋅(比較例2)，而△代表碳酸鋅(比較例3)。
圖2示出了干擾素溶液pH和乙酸鈣(實施例5)與微膠囊中干擾素含量之間的關系。
權利要求
1.一種制備緩釋制劑的方法，該方法包括在水性溶液中使水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中。
2.根據權利要求1的方法，其中生物可降解的基質是通過將生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金屬鹽混合制備的。
3.根據權利要求2的方法，其中脂族羧酸是脂族單羧酸。
4.根據權利要求2的方法，其中水溶液金屬鹽是多價金屬鹽。
5.根據權利要求1的方法，包括在水溶性多肽已水性滲透到生物可降解的基質中后干燥所述生物可降解的基質的步驟。
6.根據權利要求5的方法，其中干燥步驟是冷凍干燥。
7.根據權利要求1的方法，其中水溶性多肽是細胞素。
8.根據權利要求7的方法，其中細胞素是干擾素。
9.根據權利要求1的方法，其中生物可降解的基質呈細顆粒形式。
10.根據權利要求1的方法，其中生物可降解的基質是由生物可降解的聚合物制備的。
11.根據權利要求10的方法，其中生物可降解的聚合物是脂族聚酯。
12.根據權利要求11的方法，其中脂族聚酯是由α-羥基羧酸衍生的共聚物。
13.根據權利要求12的方法，其中共聚物是乳酸-乙醇酸共聚物。
14.一種緩釋制劑，它是通過使水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中產生的。
15.一種緩釋制劑，它是通過將生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金屬鹽混合，然后使水溶性多肽滲透到所得生物可降解的基質中產生的。
16.根據權利要求14的緩釋制劑，其中制劑是供注射用的。
全文摘要
一種緩釋制劑的制備方法，包括在水溶液中使水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中。按本發(fā)明制備方法使水溶性多肽滲透到生物可降解的基質中時無需使水溶性多肽與有機溶劑接觸。因此，制備水溶性多肽時不會影響該水溶性多肽的生物活性，這就使該水溶性多肽可有效地用作藥物。
文檔編號A61K9/16GK1106653SQ9410832
公開日1995年8月16日 申請日期1994年7月5日 優(yōu)先權日1993年7月5日
發(fā)明者豬狩康孝, 山本一路, 岡本加世子, 山縣豐 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社