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Eck受體配體的制作方法

文檔序號:1045666閱讀:834來源:國知局
專利名稱:Eck受體配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明主要涉及ECK受體的配體,特別是涉及稱為eck受體結(jié)合蛋白(EBPs)的多肽配體。本發(fā)明也包括使用eck受體配體和可溶性eck受體的治療方法,以及含上述組分的藥物組合物。同時也描述了用于檢測粗樣品中受體結(jié)合活性的一種快速靈敏的方法。
肽生長和分化因子通過與細(xì)胞表面的受體特異性地相互作用在靶細(xì)胞中引起反應(yīng)。生長因子受體一般是隨細(xì)胞外區(qū),跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)而不同的膜糖蛋白。所述區(qū)域的結(jié)構(gòu)分異與功能相符(ullrich等人,Cell 61,203(1990));細(xì)胞外區(qū)似乎引起配體結(jié)合以及配體-介導(dǎo)的受體二聚作用(Cunningham等人,Science 254,821(1991);Lev等人,J.Biol.Chem.276 10866(1992)),而受體的細(xì)胞內(nèi)區(qū)或附屬成分的細(xì)胞內(nèi)區(qū)(Takeshita等人,Science 257,379(1992))引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。生長因子活性的大部分特異性由與源受體細(xì)胞外檢的結(jié)合位點的相互作用支配。嵌合受體,(用遺傳工程方法加工的含一種受體的細(xì)胞外區(qū)和第二種受體的細(xì)胞內(nèi)區(qū))保留了細(xì)胞外成分的配體特異性(Lehvaslaiho等人,EMBO J.8,159(1989))。由所述嵌合受體激活的下游信號途徑與由細(xì)胞內(nèi)成分激活的那些一致。在受體的許多可溶形式(僅由細(xì)胞外區(qū)組成的)中,保留了配體結(jié)合活性(Lev等人.ibid;Duan等人,J.Biol Chem 266,413(1991))。已經(jīng)鑒定了在血清(Fernandez-Botran FASEB J.5,2567(1991)),細(xì)胞培養(yǎng)上清液(Zabrecky等人,J.Biol.Chem.266,1716(1991))中的平截受體,并已用重組技術(shù)進(jìn)行了生產(chǎn)(Lev等人,ibid,Duan等人,ibid)。
在核酸定序和擴增技術(shù)方面的最新進(jìn)展使得數(shù)量不斷增加的編碼了以前未鑒定的生長因子的受體的基因能夠得以鑒別(Wilks Proc.Natl Acad.Sci USA 36,1603(1989);Lai等人,Neuron 6.691(1991))。結(jié)果,要求研究能確定孤兒受體(orphan receptors)生物學(xué)作用的方法,包括能鑒定這些受體配體的技術(shù)(McConnell等人,Science 257,1906(1992))。受體親和技術(shù)是解決該問題的一種方法。這種技術(shù)可以擴充分離生長因子的現(xiàn)有方法,因為若反應(yīng)微妙或不確定時,可以檢測配體。
最新的報道表明可用受體的細(xì)胞外區(qū)作為生長因子-特異性的親和劑。Bailon等人(Biotechnology 5,1195(1987))已表明可將IL-2受體α亞單位的細(xì)胞外區(qū)固定在層析介質(zhì)上并用于純化重組IL-2。該盒(kit)的細(xì)胞外區(qū)與堿性磷酸酶碎片的遺傳融合使得與該受體配體有關(guān)的細(xì)胞可被鑒定(Flanagan等人,Cell 63,185(1990))。Lupu等人(Proc.Natl.Acad Sei,USA 89,2287(1992))已報道了與固定的erbB-2基因產(chǎn)物的細(xì)胞外區(qū)結(jié)合的親和純化活性。
最初通過人上皮細(xì)胞文庫的CDNA克隆鑒定的eck基因編碼一種130KDa受體類似蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(p130eck)(Lindbreg等人,Mol Cell.Biol.10,6316(1990))。組織及細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)和mRNA篩選說明eck表達(dá)在上皮細(xì)胞中最高。從編碼其它受體類似蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的基因類推,eck可能是一種原癌基因并因此在癌的形成中起作用。eck的這種潛在作用似乎使得在人癌中,上皮細(xì)胞的出現(xiàn)頻繁。受體蛋白激酶一般通過與一種或多種配體的相互作用來激活。但是,能激活p130eck的配體還未有報道。上述配體鑒定對于確定p130eck激活在某些人癌癥的產(chǎn)生方面的作用可能是重要的。
因此,本發(fā)明的目的之一是鑒定一種或多種p130eck配體。p130eck在上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌狀態(tài)方面的可能作用,說明鑒定引起受體激活的配體對于某些上皮細(xì)胞衍生的惡性腫瘤可能有治療學(xué)意義。
本發(fā)明主要涉及eck受體配體。尤其是描述了與eck受體特異性結(jié)合的多肽(本文稱之為eck受體結(jié)合蛋白(EBPs)。通過使用固定細(xì)胞外eck受體的親和層析鑒定并分離了EBPs。本發(fā)明的EBPs通過結(jié)合也可以誘導(dǎo)受體的磷酸化,從而引起靶細(xì)胞生理學(xué)方面,如細(xì)胞生長和/或分化的改變。EBP有基本上如SEQ.ID.NO.1中所示的氨基酸序列。在一個優(yōu)選的實施方案中,EBP具有如SEQ ID.NO.1中所示的氨基酸序列的一部分。例如,EBP具有終止于150位的氨基的序列。
特異性結(jié)合eck受體的多肽(其中所述多肽具有與SEQ ID NO.1所示基本相同的氨基酸序列并在-1位有甲硫氨酸殘基)也包括在內(nèi)。作為實例,多肽是[Met-1]EBP1-150或[Met-1EBP1-159。也提供編碼所述多肽的DNA序列。EBPs也可以是具有在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列部分的類似物。上述類似物的實例是終止于167,171或180位的EBPs。
本發(fā)明也提供作為外源DNA序列原核或真核表達(dá)產(chǎn)物的EBP,即由重組DNA方法得到的eck受體結(jié)合蛋白。
本發(fā)明也包括通過檢驗與受體固定配體結(jié)合區(qū)的結(jié)合,從而檢測粗樣品中受體結(jié)合活性的方法。
同時描述含有治療有效量eck受體配體的藥物組合物。也包括eck受體配體在治療特定類型癌癥,特別是以上皮細(xì)胞增殖為特征的癌癥中的用途。也可將eck受體配體用于治療創(chuàng)傷以促進(jìn)愈合,增加血細(xì)胞生成,及刺激肝細(xì)胞和結(jié)腸隱窩細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明也包括治療有效量配體頑抗劑或可溶性eck受體用于調(diào)節(jié)eck受體配體生物學(xué)效應(yīng)的用途。上述治療在癌癥治療以及控制炎癥方面是有用的。


圖1A,固定的eck-x親和層析的SDS-PAGE分析。將來自HCT-8細(xì)胞的限制性培養(yǎng)濃縮、透濾,并載了1ml的固定eck-x柱上(每ml凝膠1mg eck-x)。若需要,在存在0.02%SDS的情況下濃縮樣品;圓括號中表示等量原體積。道1,栓載(20ml)。道2,未結(jié)合部分(20ml)。道3,PBS洗滌(50ml)。道4,PH4.0洗脫,部分1(200ml)。道5,PH4.0洗脫,部分2(200ml)。道6,PH4.0洗脫,部分3(200ml)。
圖1B。固定的eck-x親和層析的SDS-PAGE分析。將用EBP基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞上清液按對圖1A說明中的描述進(jìn)行處理和分析。
圖2.來自HCT-8細(xì)胞系的純化EBP的凝膠過濾分析。將EBP(經(jīng)固定的eck-x受體親和層析純化的)用50μg/mlBSA修正并將其注射到Superdex75柱上。用BIAcore檢測各組分的eck-x結(jié)合活性。
圖3.用EBP CDNA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞EBP的Q-Sepharose層析。用SDS-PAGE分析樣品并用抗-EBP抗體探查。
圖4.用磷脂酶C處理分析從CHO細(xì)胞表面釋放的膜-結(jié)合的EBP。-表示在沒有膦脂酶C的情況下溫育;+表示在存在磷脂酶C的情況下溫育。溫育時間是0,5和10分鐘。
圖5.125I-rEBP與表達(dá)eck的CHO19.32細(xì)胞的化學(xué)交聯(lián)。按實例5中所述處理細(xì)胞。道1,125I-rEBP+CHO 19.32。道2,125I-rEBP+CHOd-(未轉(zhuǎn)染的).道3,125I-rEBP+CHO19.32,未加交聯(lián)劑。道4,125I-rEBP+CHO19.32+50x未標(biāo)記的rEBP。
圖6.在用純化的/rEBP處理的LIM 2405細(xì)胞中,eck受體酪氨酸激酶的激活。用增加深度的純化rEBP(CHOd-/EBP)在37℃將血清-饑餓的LIM2405細(xì)胞處理10-15分鐘。將處理的細(xì)胞溶解,然后用抗-eck C-末端抗體免疫沉淀。將免疫沉淀物分成兩等份,同時溶解于7.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠中。將凝膠印到膜上,然后,用單克隆抗-磷酸酪氨酸抗體(上行)或抗-eckc-末端(下行)檢測。用箭頭指示eck多肽的遷移。
圖7.用BIAcore檢測CHO-產(chǎn)生的EBP在各種洗滌劑配方中與固定的eck受體的結(jié)合。存在在或不存在洗滌劑的情況下,用PBS將純化的EBP稀釋到100μg/ml并于3℃溫育2小時,將蛋白質(zhì)樣品稀釋到圖中標(biāo)明的濃度,并檢測eck受體結(jié)合。
圖8.單獨存在EBP及其與IL-3,促紅細(xì)胞生成素或GM-CSF相結(jié)合的情況下,骨髓培養(yǎng)物中CFU-C和CFU-MK的組成。
圖9.存在EBP,酸性FGF或KGF的情況下,3H-胸首在肝細(xì)胞培養(yǎng)物中的摻入。
本發(fā)明涉及eck受體(一種由Lindberg等人(見上文)鑒定的130KDa蛋白質(zhì)酪氨酸激酶)結(jié)合的配體。eck受體配體通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶催化區(qū)的自身磷酸化而激活受體。蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一部分。因此,能激活eck受體蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶活性的配體,在調(diào)節(jié)表達(dá)該受體的細(xì)胞生長和分化中可能是重要的。eck受體配體可能是一種多肽,肽,或與eck受體結(jié)合和/或激活eck受體的非蛋白質(zhì)分子。
本發(fā)明提供與eck受體特異性結(jié)合的新多肽。這些多肽被稱之為eck結(jié)合蛋白,或EBPs。通過使用eck受體細(xì)胞外區(qū)(eck-x)作為親和試驗劑的受體親和層析,已經(jīng)從SK-BR-3和HCT-8細(xì)胞系的限制性培養(yǎng)中分離出了EBPs。在實施例1中描述了eck-x基因的構(gòu)建和eck-x的表達(dá)及純化。在實施例3A中描述了eck結(jié)合蛋白在固定eck-x上的純化。
按由SDS-PAGE揭示的(圖1A),從HCT-8細(xì)胞系中得到的EBP存在21-27KDa范圍的幾種不同分子量形式。21-27KDa范圍內(nèi)的EBPs的N-末端定序揭示出一種單一序列(實施例3B)。酶除去碳水化合物鏈后,觀察到范圍在17-19KDa的混合物。說明不同形式可能起因于該蛋白不同的轉(zhuǎn)譯后加工。
SK-BR-3產(chǎn)生的EBP的N-末端序列與從861基因(Holzman等人Mol Cell.Biol.10,5830(1990);PCT申請No.Wo92/07094)表達(dá)預(yù)測的N-末端氨基酸序列相同。最初,經(jīng)差示雜交B61基因被鑒定為一種即早期反應(yīng)基因,通過用腫瘤壞死,α因子處理,可在培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)其表達(dá)。以EBP基因序列為基礎(chǔ),預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的成熟形式有187個氨基酸。以前還末報告過EBP-編碼的蛋白質(zhì)的分離及特征描述。認(rèn)為EBP蛋白質(zhì)作為細(xì)胞激活素誘導(dǎo)的炎癥的標(biāo)記而起作用,因此,可將其用作為檢測即將發(fā)生的炎癥反應(yīng)的診斷試劑(PCT申請No,Wo92/07094)。
克隆并定序了編碼EBP(具有實施例3B中確定的N-末端序列的)的CDNA,并正如所預(yù)料的,發(fā)現(xiàn)其與B61基因(Holzman等人,同上文)相同。在SEQ ID NO.11中列出了由Holzman等人報告的B61 DNA序列。按實施例4中的描述,在CHO細(xì)胞和大腸桿菌中表達(dá)了EBP(或EBP基因)。在CHO細(xì)胞中,由EBP基因表達(dá)了至少兩種有不同分子量的多肽。CHO細(xì)胞EBP的C末端定序表明它僅代表一種150個氨基酸殘基多肽的序列-Lys-Leu-ala-ala-COOH。將該多肽稱為EBP1-150。相當(dāng)于預(yù)測EBP蛋白質(zhì)187個氨基酸殘基的多肽,如果存在的話,代表很小量的CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。EBP基因(缺乏前導(dǎo)序列)在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)生一種在SDS-PAGE上具有對全長蛋白質(zhì)所預(yù)測的C-末端序列的產(chǎn)物。在氨基末端有一個甲硫氨酸殘基的這種多肽被稱為[Met]EBP1-187,并且除N-末端met外,在氨基酸序列方面與預(yù)測的EBP蛋白質(zhì)相同。
通過下列實驗(參見實施例5)已表明CHO細(xì)胞產(chǎn)生的rEBP與eck受體的相互作用1)CHOrEBP與天然表達(dá)eck受體的結(jié)腸癌細(xì)胞或用eck基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞交聯(lián);2)CHOrEBP與eck受體在結(jié)腸癌細(xì)胞上的平衡結(jié)合研究;和3)eck受體磷酸化對結(jié)腸癌細(xì)胞的刺激作用。由CHO rEBP誘導(dǎo)受體磷的化說明在呈現(xiàn)eck受體的細(xì)胞中,配體能夠影響生物學(xué)反應(yīng)(如生長或分化)。
顯然,可以以許多不同的分子量形式表達(dá)EBP,其中不只一種可以有生物學(xué)活性。通過人細(xì)胞系和EBP基因-轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生如圖1A和1B中所示的各種形式的EBP。如圖3所示,將來自轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的EBP被分離為22KDa(大部分)和24KDa(少量的)兩種不同分子量的形式。這些不同形式的特征描述表明是150和165個氨基酸的兩種不同EBPs,稱為EBP1-159和EBP1-165磷酸肌醇-磷脂酶C處理的EBP-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系釋放可溶性EBP,有力地說明了一種EBP的糖脂形式。分離的EBP的27KDa形式對用磷脂酶D消化敏感,從而進(jìn)一步說明這些形式是糖磷酸脂-固定的EBP的可溶形式。
本發(fā)明提供具有與eck受體特異性結(jié)合活性并有與SEQ ID NO.1所示氨基酸序列基本相同的EBP。本文所用的術(shù)語“基本相同的氨基酸序列”指SEQ ID NO.1中的氨基酸的缺失或取代,以致所得的多肽仍與eck受體特異性結(jié)合。如上所述,EBP也誘導(dǎo)eck受體的磷酸化。然而本發(fā)明包括結(jié)合eck受體并可以或不可誘導(dǎo)受體磷酸化的多肽。在優(yōu)選的實驗方案中,EBP具有如SEQ ID NO.1所示的部分氨基酸序列。例如,EBP具有終止于150位的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或具有與SEQ ID NO.1所示基本相同的氨基酸序列。優(yōu)選的,EBP是EBP1-150,即,如SEQ ID NO.1所示的+1位到150位的氨基酸序列。
具有與SEQ ID NO.1所示基本相同的氨基酸序列并在-1位有一個甲硫氨酸殘基的EBP也包括在內(nèi)。[Met-1]EBP1-150和[Met-1]EBP1-150是實例。也提供了為基編碼的DNA序列。構(gòu)建了編碼如SEQ ID NO.1中所示+1到150氨基酸殘基的平截DNA序列,并在大腸桿菌中表達(dá)。所得的蛋白質(zhì),[Met-1]EBP1-150與eck受體結(jié)合并誘導(dǎo)受體磷酸化(實施例6)。
本發(fā)明也包括有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段和類似物,其中所述片段和類似物與eck受體結(jié)合,以及編碼所述片段和類似物的DNA序列。所包括片段具有SEQ ID NO.1所示多肽的N-末端或C-末端的缺失和內(nèi)區(qū)的缺失。EBP片段的實例包括在實施例5中描述的EBP1-167,EBP1-171和EBP1-180。類似物包括在多肽中一個或多個位點的氨基酸取代物。用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的重組DNA技術(shù),可以很容易地構(gòu)建本發(fā)明的片段和類似物。通過與細(xì)胞表面上的eck可溶性受體或eck受體結(jié)合及通過eck受體的誘導(dǎo)磷酸化,很容易檢測所得片段和類似物的生物學(xué)活性。
本發(fā)明也包括其特征在于是外源DNA序列的原核或真核表達(dá)產(chǎn)物的EBP,即EBP是重組EBP。外源DNA序列可以是CDNA,基因組或合成的DNA序列。可以在培養(yǎng)中,于細(xì)胞,酵母,植物,昆蟲哺乳動物細(xì)胞中或轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)EBP。適于在各種宿主細(xì)胞中表達(dá)EBP的DNA載體是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員的熟知的。上述載體的實例是用于在CHO D-細(xì)胞中表達(dá)EBP基因的pDSRα2和用于在大腸桿菌中表達(dá)EBP基因的pCFM1156。
EBP在大腸桿菌中表達(dá)導(dǎo)致不溶性包含體的形成。生物學(xué)活性EBP的恢復(fù)需要溶解EBP聚集體,接著重折疊被溶解的蛋白質(zhì)。實施例4C描述了重折疊從大腸桿菌產(chǎn)生的EBP的方法,從而得到有eck-x結(jié)合和eck磷酸化活性的EBP??梢愿倪M(jìn)EBP重折疊的方法以提高復(fù)性蛋白質(zhì)的活性并增加活性EBP的產(chǎn)率。上述改進(jìn)包括改變用于溶解包含體的變性劑(如,用氯化胍對脲),氧化劑(可包括氧化還原配對如氧化的和還原的谷胱甘肽),或根據(jù)變性劑的稀釋方法(如將EBP以不同的蛋白質(zhì)濃度稀釋到含(改變的PH的)緩沖液的洗滌劑中)。
本發(fā)明也提供檢測粗樣品(如限制性培養(yǎng)基)中存在的能結(jié)合受體的配體的方法。該方法包括步驟a).固定受體的純化配位結(jié)合區(qū);
b).將固定的受體與含配體的限制性培養(yǎng)基接觸的;和c).通過表面胞質(zhì)團共振檢測系統(tǒng)監(jiān)控配體與固定受體的結(jié)合。
如實施例2中所述,該方法提供了一種快速靈敏地篩選細(xì)胞上清液中eck受體結(jié)合活性的方法。該篩選方法的結(jié)果列于表1。雖然該方法是用于檢測eck結(jié)合活性,但通常也可將其用于任何的受體-配體相互作用。可以固定在任何受體的配體結(jié)合區(qū)以分離受體結(jié)合蛋白。在優(yōu)選的實施方案中,配體結(jié)合區(qū)是能夠結(jié)合的細(xì)胞外區(qū)或其片段或類似物。除篩選細(xì)胞上清液外,也可用該方法篩選用于受體結(jié)合的隨機序列肽的混合物。
由本發(fā)明第一次提供了一種調(diào)節(jié)eck受體外源酶活性的方法。所述的方法包括給哺乳動物施用對eck受體有效量的配體以調(diào)整所述受體的酶活性。eck受體酶活性調(diào)節(jié)包括分化,增殖及代謝在內(nèi)的細(xì)胞功能。在優(yōu)選的實施方案中,EBP,或其片段或類似物是配體。然而,也可以用其它配體調(diào)整eck受體活性,例如多肽(不限于EBP),或肽及非蛋白質(zhì)有機分子。
本發(fā)明也包括鑒別可調(diào)節(jié)eck受體活性的化合物的方法。所述方法包括步驟a).將呈現(xiàn)受體的細(xì)胞暴露于已知配體一段足夠的時間以形成受體-配體復(fù)合物并誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo);
b).檢測細(xì)胞內(nèi)活性的范圍;和c).將檢測的活性與未暴露于配體的細(xì)胞中的活性進(jìn)行比較??赏ㄟ^靶細(xì)胞增殖,分化或代謝方面的改變來檢測eck受體活性。有關(guān)eck受體活性對造血祖代細(xì)胞,結(jié)腸隱窩細(xì)胞和肝細(xì)胞調(diào)節(jié)的方法描述見實施例9。
本發(fā)明也包括由eck受體與配體(如EBP)的相互作用而產(chǎn)生的一種分離的eck受體-配體復(fù)合物。這種相互作用可導(dǎo)致激活受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo),所述信號可調(diào)節(jié)攜帶受體的細(xì)胞的生理學(xué)狀態(tài)。優(yōu)選的是,配體作為一種生長因子刺激靶細(xì)胞的增殖,另外,配體的結(jié)合也可能不激活受體。在這種情形下,配體可能作為可激活受體并誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它分子的頡抗劑。
最初是在含顯著量上皮細(xì)胞的組織(如肺和腸)及由上皮細(xì)胞得到的細(xì)胞系(Lindberg等人,同上文)中表達(dá)eck受體。eck受體的配體可以刺激表達(dá)這種受體的細(xì)胞的生長或分化??蓪⒄T導(dǎo)攜帶eck受體的細(xì)胞分化的配體用于治療特定類型的癌癥,尤其是起因于上皮細(xì)胞增殖的那些癌癥。可單獨或與標(biāo)準(zhǔn)化療或放療結(jié)合起來,將eck受體配體用于癌癥治療。
EBP與eck受體的相互作用可能通過刺激細(xì)胞生長而與癌癥狀態(tài)的發(fā)展有關(guān),或者可能通過刺激細(xì)胞遷移及粘附而促進(jìn)新陳代謝??梢杂脦追N方法調(diào)節(jié)EBP的生物學(xué)效應(yīng)??山Y(jié)合但又不激活eck受體的EBP片段類似物可用作EBP頡抗劑。施用具有eck受體親和性的EBP頡抗劑將會釋放EBP而阻斷受體的結(jié)合和激活。也可以施用可溶性eck受體來抵消EBP的生物學(xué)作用。可溶性eck受體將會與細(xì)胞表面受體進(jìn)行結(jié)合EBP的競爭,并由此降低EBP引起的eck受體激活的程度。適用于治療用途的可溶性eck受體包括實施例1中描述的受體蛋白質(zhì)及其可結(jié)合EBP的片段和類似物。另外,抗EBP或eck受體的單克隆抗體也可以用來阻斷 細(xì)胞表面EBP與eck受體的相互作用。
已表明EBP基因在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)是由TNF-α和IL-1β(兩種前炎癥細(xì)胞激活素,它的在內(nèi)皮細(xì)胞中可激活作為炎癥反應(yīng)部分的各種功能)刺激的(Holzman等人,同上文)。治療包括施用可溶性eck受體降低在炎癥反應(yīng)期間升高的EBP水平,該治療在控制炎癥的過程中可能是有用的。
提供一種治療哺乳動物創(chuàng)傷的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。如實施例9A中所示,在大鼠創(chuàng)傷室檢測中,EBP促進(jìn)組織凈重中,總蛋白質(zhì)、總DNA和總葡糖胺聚糖的增加。由于EBP在炎癥反應(yīng)早期表達(dá),所以在損傷位點上皮細(xì)胞的恢復(fù)中,它可能起作用。
還提供了一種增加哺乳動物中血細(xì)胞生成的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。如實施例9B中所示,EBP與白介素-3(IL-3)結(jié)合可顯著增加小鼠骨髓培養(yǎng)物中的CFU-C3。為發(fā)生骨髓抑制(由于疾病或暴露于骨髓抑制劑,如化療藥物或試劑后的結(jié)果)時,可以用EBP恢復(fù)血細(xì)胞生成。在優(yōu)選的實施例方案中,將治療有效量的EBP與治療有效量的IL-3結(jié)合起來使用以增加血細(xì)胞生成。
也包括刺激哺乳動物中結(jié)腸細(xì)胞增殖的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。如實施例9C中所示,EBP刺激結(jié)腸隱窩檢測中的細(xì)胞增殖。在緩解化療后腸毒性方面,eck受體配體(如EBP)是有用的。
提供了一種刺激肝細(xì)胞增殖的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。實施例9D說明用EBP刺激肝細(xì)胞。這種刺激與使用酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)(一種已知的肝細(xì)胞生長因子)的相同檢測中見到的是可比的。對于修復(fù)由疾病或損傷引起的肝損壞,用eck受體配體治療是有用的。
本發(fā)明提供了含有治療有效量eck受體配體和藥物學(xué)可接受稀釋劑、載體、防腐劑、乳化劑和/或增溶劑的藥物組合物。本文所用的“治療有效量”指對給定的病體和給藥方式可提供治療效果的量。認(rèn)為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員能夠確定eck受體配體對于任何所需治療疾病的治療有效量。
藥物組合物包括各種緩沖液(如Tris,乙酸磷酸)的稀釋劑,增溶劑(如Tween,Polysorbate),載體(如人血清白蛋白),防腐劑(thimensol芐醇)和抗氧化劑(如抗壞血酸)。如實施例7中所示,若在存在穩(wěn)定劑的情況下配制EBP,則可延長純化稀釋的EBP與可溶性eck受體結(jié)合的能力。穩(wěn)定劑可以是一種洗滌劑,如tween-20,tween-80,NP-40,或TritonX-100。也可以將EBP摻入到聚合化合物的顆粒制劑中,以便在一段延長的時期內(nèi)有控制地釋放給患者。有關(guān)藥物組合物中組分的廣泛性綜述參見Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版,A.R.Gennaro,編.Mack,Easton,PA(1990))。
可以通過注射(皮下,靜脈內(nèi),或肌肉內(nèi)),或口服或鼻給藥來施用EBP。給藥途徑取決于所需治療的特定疾病。
提供下列實施例以便更全面地說明本發(fā)明,但不對其范圍構(gòu)成限制。
實施例1生產(chǎn)eck受體細(xì)胞外區(qū)A.構(gòu)建eck-x表達(dá)質(zhì)粒從pGEM3Z-eck(一種eck cDNA的3.4Kb EcoRⅠ-Kpn Ⅰ亞克隆)開始,在幾個步驟中得到用于哺乳動物表達(dá)eck細(xì)胞外區(qū)的質(zhì)粒(Lindberg等人,同上文)。將寡核苷酸317-11(5′-AGCTTAGATCTCC-3′;SEQ ID NO.7)和317-12(5′-AATTGGAGATCTA-3′;SEQ ID NO.8)用激酶處理并與已用HindⅢ和EcoRⅠ消化的pGEM 32-eck和pGEM 42的1.7Kb EcoRⅠ片段相連。選出僅將寡核苷酸加到eck5′末端的克隆。該克隆的特征包括Hind Ⅲ和Bgl Ⅱ位點的加入以及與eck序列相鄰的5′EcoRⅠ位點的缺失。用Hind Ⅲ和EcoRⅠ消化后,分離該克隆的插入片段并連接到寡核苷酸317-9 5′-AATTCCAGACGCTGTCCCCGGAGGGATCCGGCAACTGAG-3′(SEQ.ID.NO.9)和317-10 5′-TCGACTCAGTTGCCGGATCCCTCCGGGGACAGCGTCTGG-3′(SEQ.ID.NO.10)和用Hind Ⅲ及Sal Ⅰ消化的pGEM 42上。這樣在Asn534和Sal Ⅰ限制酶位點后,加入了一個BamHl位點,一個TGA終止密碼子。然后將含有eck外區(qū)編碼序列的Hind Ⅲ-Sal Ⅰ片段轉(zhuǎn)移到pDSRαZ(deCalerk等人,J.Biol.Chem.266,3893(1991))。
B.eck x的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)通過鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等人,Cell 11,233(1977)),將表達(dá)質(zhì)粒pDSRα-eck-x導(dǎo)入CHO細(xì)胞。以質(zhì)粒中二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的表達(dá)為基礎(chǔ)篩選單個菌落,并選出一個克隆(命名為21.021)進(jìn)行擴增。通過RNA雜交檢測eck基因的表達(dá)(Hunt等人,Erp.Hematol.19,779(1991))。
在10nM氨甲喋呤中完成eck表達(dá)的擴增。擴充細(xì)胞系21.02用以生產(chǎn)eck-x。在用非必需氨基酸,10nM氨甲喋呤和5%EBS補充的200ml DMEMHam′s F12(1∶1)中,以2×107細(xì)胞種于Roller瓶。3天后,細(xì)胞達(dá)到會合,此時,加入不含5%EBS的新鮮培養(yǎng)基。收集限制性培養(yǎng)基,7天后重復(fù),14天后,第二次收集。
C.純化eck-x將21.02細(xì)胞的限制性培養(yǎng)基濃縮并用10,000MWCO螺旋纏繞濾器(S/Y10,Amicon,Danvers,MA)對10nMTrio-HCl.PH7.4透濾。將50ml濃縮物載到陰離子交換柱(Hema-Q,顆粒大小10μm,1.6x12cm,Separon,Sunnyvale,CA)上,并用0-0.5M NaCl線性梯度的10nM Tris-HCl,PH 7.4洗脫。用SDS-PAGE和使用抗合成eck-x N-末端肽產(chǎn)生的兔抗血清進(jìn)行Western印跡從而分析各部分。收集含eck-x的部分,并對10nM Tris-HCl,PH 7.4作滲析。然后再放到Hema-Q粒上,并象前面那樣洗脫并分析。將得到的收集物濃縮到3ml(centriprep-10,Amicon,Davers,MA)并用于用PBS平衡的Superdex 200(Pharmacia,Piscataway,NJ)凝膠濾柱(2.2×90cm,流速1.0ml/分鐘)。得到含純化eck-x的收集物并將其作為進(jìn)一步實驗的基礎(chǔ)。
實施例2篩選結(jié)合eck細(xì)胞外區(qū)的限制性培養(yǎng)基在表面胞質(zhì)基因共振檢測系統(tǒng)(BIAcore,Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)按制造商說明的方法檢測eck-x的相互作用。以5μl/分鐘的流速,注射35μl 0.2M 1-2乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺-HCl,0.05M N-羥基琥珀酰亞胺從而激活傳感器芯片的葡聚糖表面。通過以5μl/分鐘,兩次連續(xù)的50μl注射而固定純化的eck-x(0.2mg/ml,在10nM醋酸鈉中,PH4)。通過注射1M乙醇胺,PH8.5來阻斷未反應(yīng)的結(jié)合位點。用電泳緩沖液(HBS,10mM Hepes,150mM NaCl,3.4mM EDTA,0.005% Tween 20,PH 7.4)洗滌表面過夜,直到達(dá)到穩(wěn)定的基值。典型的固定會導(dǎo)致建立高于原始值的基值6000-8000個反應(yīng)單位。將50μl各種限制性培養(yǎng)基樣品在無血清條件下培養(yǎng)并濃縮到5至40倍(centricon-10,Amicon,Danvers,MA),然后,以10μl/分鐘的流速注射。在相當(dāng)于每次注射結(jié)束后20秒的Sensorgran上,于報告點檢測樣品反應(yīng)。通過注射50μl 25mM 3-(環(huán)己基氨基)1-1丙烷磺酸,PH10.4,在樣品間再生固定的eck-x表面。
用固定在BIAcore傳感器芯片上的純化eck-x篩選具受體結(jié)合活性的濃縮限制性培養(yǎng)基。在幾種限制性培養(yǎng)基(包括HCT-8,SK-BR-3,和HT-29細(xì)胞系的)中觀察到結(jié)合活性(見表1)。
表1.用BIAcore和抗-EBP Western印跡檢測細(xì)胞培養(yǎng)物上清液eck-x 結(jié)合活性 抗-EBP細(xì)胞系 濃度 (BIAcore 反應(yīng)單位 WesternA704 40X 49 -TE671 40X 115 -CCD18CO 40X 25 -CCFSTTG1 40X 35 -HCT-8 40X 180 ++GMO-0948 40X 10 -SK-BR-3 40X 270 ++HT-29 40X 310 ++MDA-MB-453 30X 80 ++FF-1 30X 55 -WS-1 25X 55 -BRL-3A 25X 125 -GMO1391 25X 20 -HT-1080 20X 230 +AG-2804 20X 170 +BUD-8 20X -10 -AG-3022 20X 175 +HFL-1 20X 15 -LIM-1863 20X 75 -PAEC 20X -10 -HOs 10X 95 -33CO 10X -10 -
按實施例2中所述,用BIAcore檢測樣品(50μl注射液)與固定的eck-x的結(jié)合。用兔抗-EBP(大腸肝菌)抗血清追溯分析相同樣品的等份(10μl)。
實施例3純化并特征描述來自限制性培養(yǎng)基的eck受體結(jié)合蛋白(EBP)A.固定的eck-x受體親和層析用0.1M NaHCO3,0.5M NaCl,PH8.3滲析純化的eck-x,并得到2mg/ml的終深度。以每ml凝膠1mgeck-x的配體密度將蛋白質(zhì)固定在CNBr-激活的Sepharose 4B(Pharmacia,Piscataway,NJ)上(Kenny等人,inNew Protein Techniques,J.M Walker,編The Humana Perss,Clifton,NJ(1988))。
將來自SK-BK-3或HCT-8細(xì)胞系的限制性培養(yǎng)基濃縮20培,并做PBS透濾(SIY 10.螺旋筒,Amiccom)。使?jié)饪s物以0.1ml/分鐘流速直接裝在固定eck-x的柱(1×1cm,每ml樹脂1mg eck-x)上。用10ML PBS洗滌該柱,接著用0.05M醋酸鈉,0.5M NaCl,PH4.0洗脫。將洗脫物倒入0.01%SDS中,濃縮,并在centricon-10超濾裝置(Amicon)上用10mM Tris-HCl,PH8.0作緩沖液交換。將樣品與SDS-PAGE樣品緩沖混合由centricon-10收集,并直接裝到聚丙烯酰胺凝膠上。將凝膠用銀染色(Merrill Meth.Enzymol.182,477(1991))或印到PVDF膜上(Problot,Applied Biosystems,F(xiàn)oster CA)進(jìn)行N-末端序列分析(Faussset等人,Electrophoresis12,22(1991))。
圖1中表示出典型電泳后的SDS-PAGE分析。柱的PH4.0洗脫液(道5所示)表現(xiàn)出明顯富集了近似分子量為21-27KDa的幾種蛋白質(zhì)。當(dāng)以相似體積的非限制性培養(yǎng)基通過同樣的柱時未發(fā)現(xiàn)這樣的蛋白質(zhì),這表明該21-27KDa蛋白質(zhì)是由該細(xì)胞產(chǎn)生的,相比之下,在該非限制性培養(yǎng)基中也觀察到了HCT-8或SKBR-3的PH4.0洗提組份中存在較高分子量蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)代表了與柱的非特異性反應(yīng)和來源于細(xì)胞培養(yǎng)所用的血清。
B.EBP的N-末端序列分析在液體-脈沖自動測序儀(477型,Applied Biosystems,F(xiàn)oster City CA)上完成N-末端序列分析。用Brownlee C-18反相柱(0.21×25cm)通過聯(lián)機的微孔高效液體層析(Model 123,Applied Biosystems)分析所得的乙內(nèi)酰苯硫脲基(Phenylthiohydantoinyl)氨基酸。PVDF印跡的定序循環(huán)和序列分析的最佳條件是以Applied Biosystems提供的說明為基礎(chǔ)的。
在凝膠21-27KDa區(qū)中電印跡蛋白質(zhì)的N-末端序列分析揭示出一種單一序列(SEQ.ID.NO.13)NHz-Asp-Arg-His-Thr-Val-Phe-Trp-[Asn]-Ser-Ser-Asn-Pro-Lys-Phe-Arg-Asn-Glu-Asp-Tyr-Thr-Ile-His-Val-Gln以NBRF蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的同源檢索為基礎(chǔ)的計算機(Devereu等人,Nucleic Acid Res.12,387(1984))明確地測定該序列屬于EBP(Holzman等人,同上文)。
C.EBP的結(jié)構(gòu)特征描述由于N-末端測序檢測出單一序列,所以用SDS-PAGE觀察到的EBP的多種形式可能是由該分子其它區(qū)的轉(zhuǎn)澤后修飾引起的。循環(huán)8(N)的定序率被大大地降低,說明該位點有效的糖基化。然而,這種蛋白質(zhì)的明顯不均質(zhì)性不可能完全歸因于糖基作作用的不同,因為用N-聚糖酶,神經(jīng)氨糖酸酶,和0-聚糖酶結(jié)合起來消化rEBP,當(dāng)用SDS-PAGE分析時得到Mr17-19KDa(前用SDS-PAGE分析)形式的混合物。由于EBP基因編碼22KDa的蛋白質(zhì)(Holzman等人,ibid),這種結(jié)果說明EBP可能要經(jīng)蛋白水解加工。
D.EBP與可溶性eck受體的相互作用PH4.0洗脫收集物的凝膠過濾分析說明全部的eck-結(jié)合活性(由BIAcore反應(yīng)測量的)可能歸因于近似分子量為22KDa(圖2)的洗脫物質(zhì)。從該柱的說明組份的SDS-PAGE分析確證,EBP是與受體結(jié)合活性一起被共洗脫的。在其它實驗中,純化EBP不能與用該藥盒受體細(xì)胞外區(qū)激活的BIAcore表面結(jié)合,盡管這些表面能結(jié)合rSCF(該藥盒配體)。
E.篩選其它細(xì)胞系的eck結(jié)合蛋白質(zhì)分離并鑒定EBP后,制備該蛋白的抗血清,完成原篩選的追溯分析(表1)。Western印跡分析確認(rèn)EBP以高水平存在于三種篩選中標(biāo)為陽性的限制性培養(yǎng)基(SK-BR-3,HCT-8,HT-29)中。幾種其它的細(xì)胞系(AG-3022,AG-2804,和HT-1080)標(biāo)記為陽性,但通過Western分析只能檢測到痕量的加工過的EBP。這些細(xì)胞系不生產(chǎn)可由抗-EBP抗血清檢測的29KDa蛋白質(zhì)。
實施例4EBP的克隆、表達(dá)及特征描述用來自人臍形靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)文庫(Clontech Laboratories,Palo Alto,CA)的熱破裂的噬菌體作為模板,通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Saiki等人,Science 230,1350(1985);Mullis等人,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51;263)擴增人EBP基因。以公知的EBP核酸序列(Holzman等人,ibid)為基礎(chǔ)設(shè)計引物以產(chǎn)生能插入大腸桿菌或CHO細(xì)胞表達(dá)載體的PCR片段。
A.克隆用于大腸桿菌表達(dá)的EBP用下列所示的寡核苷酸引物386-4和386-5386-4) 5′AAG CAT ATG GAT CGC CAC ACC GTC TTC TGG 3′(SEQ.ID.NO.2)386-5) 5′GAA GGA TCC TTA TCA CGG GGT TTG CAG CAG CAG AA 3′(SEQ.ID.NO.3)通過PCK得到用于大腸桿菌表達(dá)的EBP全長形式的基因。該形式?jīng)]有信號肽并包括起始密碼子甲硫氨酸以及對于克隆到表達(dá)質(zhì)粒pCFM 1156(Fox等人,J.Biol.Chem.263,18452(1988))中所必需的限制位點。將入gtll/HUVEC文庫(Clontech)的10μl樣品在70℃加熱至5分鐘,然后快速在濕冰上冷卻。將破碎的噬菌體用作100μl體積中含386-4和386-5引物各300皮摩爾,1 X Tag Ⅰ聚合酶緩沖液(Promega,Madison,WI),dNTP各0.77mM和2.5單位TagⅠ聚合酶(Promega)和PCR反應(yīng)的模板。將該反應(yīng)產(chǎn)物用酚/氯仿提取,乙醇沉淀,再懸浮于20μl蒸餾水中,然后用限制內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)消化。將該片段連接到已用相同兩種酶消化的質(zhì)粒載體pCFM1156中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌株FM5(ATCCNO.53911)中。當(dāng)將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從30℃移到42℃時,EBP以高水平表達(dá)。
按有關(guān)全長基因的描述,除在PCR中用寡核苷酸469-11取代38-5外,構(gòu)建經(jīng)設(shè)計在大腸桿菌中表達(dá)EBP的150個氨基酸形式的基因。寡核苷酸469-11有序列5′GAAGGATCCCTATTATGCTGCAAGTCTCTTCTCCTG 3′(SEQ.ID.NO.4)B.克隆用于CHO細(xì)胞表達(dá)的EBP從細(xì)胞系SK-BR-3中分離總RNA,并用于制備CDNA。將3μg總RNA與3μg隨機引物(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)混合,在65℃溫育5分鐘,然后在冰上簡短地冷卻。然后將RNA-引物混合物用于在由50mM Tris-HCl(PH8.3),75mM KCl,3mM MgCl2,10mM DTT,每dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)各125μm,200單位反轉(zhuǎn)錄酶(Superscript,BRL)組成的CDNA反應(yīng)物(終體積20μl)中。將反應(yīng)物在37℃溫育1小時。
合成兩種寡核苷酸并與SK-BR-3 CDNA一起通過PCR擴增EBP編碼區(qū)。
386-2)5′GAA TTC AAG CTT CAG GCC CCG CGC TAT GGA G 3′(SEQ.ID.NO.5)386-3)5′GAA TTC TCT AGA TCA TCA CGG GGT TTG CAG CAG CA 3′(SEQ.ID.NO.6)PCR含1μl CDNA反應(yīng)物的上述兩種寡核苷酸各500ng,10mM Tris-HCl(PH8.3),50mM KCl dNTP各200μm和1.25單位Tag聚合酶(Perkin Elmer Cetus,CA)。將DNA擴增35個循環(huán)(94℃30秒,50℃1分鐘,72℃1分鐘),用酚提取1次,用酚-氯仿提取1次,沉淀,經(jīng)微離心形成沉淀,并用限制酶Hind Ⅲ和XbaⅠ(Boerhinger Mannheim)消化。將DNA用凝膠純化(Geneclean Ⅱ,Biolol.La Jolla,CA),并與已預(yù)先用相同限制酶消化的質(zhì)粒pDSRα2(deClerck等人,ibid)相連。將連接的DNA轉(zhuǎn)染到感受態(tài)HB101細(xì)菌(BRL)中,并分離質(zhì)粒DNA(Qiagen,Chatsworth,CA)。通過使用合成引物在雙鏈質(zhì)粒DNA上的雙脫氧鏈終止反應(yīng)(Sanger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463(1977))法確定該DNA序列,該序列相當(dāng)于EBP DNA序列。
用在BIAcore上表現(xiàn)eck-x結(jié)合活性的EBP基因轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液,并且可通過固定eck-x受體親和層析從上清液中回收EBP。未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞,或用含有內(nèi)缺失的EBP基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞不表現(xiàn)受體結(jié)合活性。
C.從大腸桿菌和CHO細(xì)胞中純化重組EBP按實施例3A中所述,通過固定的eck-x受體親和層析,從CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化重組EBP。用5mM CHAPS(用于結(jié)構(gòu)分析和交聯(lián)研究)或Q5mg/mlBSA(用于磷酸化研究)將純化EBP作PBS滲析。用受體親和層析純化的CHO細(xì)胞產(chǎn)生的EBP含兩個主要的帶,次一些幾個次要的帶(圖B)。
用常規(guī)層析也可純化從CHO細(xì)胞得到的重組EBP。將CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液濃縮并對10mM Tris,PH8.5透濾,并將其用于陰離子交換柱(Q-Serharose,Pharmacia-LKB)。用在10mM Tris-HCl,PH8.5中的NaCl線性梯度洗脫該柱。通過Western印跡分析各部分表明已將兩個主要的EBP帶與另一個分開。用含主要EBP帶的各部分制成分離收集物,將收集物通過凝膠過濾層析(Superdex-75,Pharmaia-LKB)作進(jìn)一步純化。
用下列方法純化大腸桿菌重組EBP。將表達(dá)EBP1-150或EBP1-187基因的細(xì)胞懸浮于10mM Tris-HCl,PH7.4并用French壓力器溶解。用J6-B(JS-4.2旋轉(zhuǎn)器)于4000rpm將溶解物離心30分鐘。將不可溶的沉淀(含未折疊的EBP1-150或EBP1-187)保留作進(jìn)一步加工。將沉淀在2%脫氧膽酸鈉,5mMEDTA,10mM Tris-HCl,PH8.5中,于4℃懸浮30分鐘。如所述離心懸浮液并除去上清液。將不可溶的沉淀懸浮于10mM Tris-HCl PH7.4中,混合,并如上述離心。將不可溶沉淀溶解于2%月桂基肌氨酸鈉,10mM CAPS,PH10,以溶解EBP1-150或EBP1-187。加入CuSO4直到50μm的終濃度。并于4℃將混合物攪拌過夜,然后用Dowex 1×4樹脂處理以除去洗滌劑。
SDS-PACE分析表明大部分EBP1-150或EBP1-187已被氧化并且是單體。然而,EBP1-187的凝膠過濾分析表明該蛋白質(zhì)表現(xiàn)為高分子量非共價聚集體。相反,凝過濾分析表明重折疊的EBP1-150相當(dāng)于單體或二聚物。
按實施例2中所述,用BIAcore檢測大腸桿菌中生產(chǎn)的EBP1-180和EBP1-150與固定ekc-x的結(jié)合。EPC1-187聚集體與eck-x表面結(jié)合很弱(如果算的說)。重折疊的EBP1-150對BIAcore上的eck-x表面表現(xiàn)出高親和性。
另外,可以用下列方法重折疊在腸桿菌中表達(dá)的EBP1-150。將細(xì)胞糊懸浮于9體(v/w)的冷Super-Q水中。用Gaulin勻漿器以9,000Psi的壓力溶解懸浮的細(xì)胞糊。將溶胞物立即在4℃以3,500XG離心30分鐘。除去上清液并保留含EBP包含體的沉淀。將沉淀懸浮于10體積(v/w)8M脲,0.1M Tris PH8.5中,并攪拌1小時。進(jìn)行離心以除去不可溶的部分。由于可溶解性包含體的兩步稀釋,影響重折疊。首先,將包含體稀釋到10體積(v/w)的3M脲,0.1M Tris,PH8.5(含0.0005%CuSO4作為氧化劑)中。于4℃攪拌過夜。將該物質(zhì)用3體積(v/v)20mM Tris,PH9.2稀釋,并緩慢攪拌溫育24小時。在40℃以15,000×G離心30分鐘以除去沉淀。
然后將上清液加到Q-Sepharose Fast Flow柱中,并用5倍柱體積的20mM Tris,PH9.2洗滌。用在20mM Tris,PH9.2中的0-0.5M的NaCl線性梯度洗脫柱。收集含EBP的部分,并濃縮,經(jīng)Superdex-75層析。用1×PBS洗脫EBP。
通過其在BIAcore檢測中與固定eck-x結(jié)合能力所測量的,所得的純化EBP具有的特異性活性是純化CHO-產(chǎn)生的EBP的30-40%。通過該方法重折疊并純化的大腸桿菌產(chǎn)生的EBP可誘導(dǎo)位于細(xì)胞表面的eck的磷酸化。
D.特征描述來自大腸桿菌和CHO細(xì)胞表達(dá)的重組EBP將經(jīng)CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液的受體層析,或大腸桿菌的RP-HPLC而純化的重組EBP用胰蛋白酶消化并用RP-HPLC分析。雖然C-末端肽(氨基酸155-187)可以從大腸桿菌中表達(dá)的EBP1-187基因中回收,但在哺乳動物產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)中不能對其進(jìn)行檢測。純化CHO EBP的羧肽酶消化說明,可檢測的C-末端序列僅僅是-lys-arg-Lue-ala-COOH(SEQ ID NO.12),說明是在氨基酸150的末端。
E.EBP的其它形式按實施例3中所述從SK-BR-3細(xì)胞系分離的EBP在SDS-PAGE上遷移的范圍是21-27KDa(見圖1A)。CHO細(xì)胞上清液中的重組EBP在eck-x層析后,以兩個主要種類和一些次要的形式存在(實施例4和圖1B)。著手進(jìn)行進(jìn)一步的CHO-產(chǎn)生的EBP的不同分子量形式特征描述純化CHO細(xì)胞上清液的重組EBP,表現(xiàn)出22KDa和24KDa兩個帶及第3個27KDa次要的帶(見圖3)。用糖苷酶處理純化的EBP并未改變這些帶的相對遷移,這說明它們并不是通過改變N-或O-連接的碳水化合物而簡單產(chǎn)生的。以前的C-末端定序說明22KDa帶是一種150個氨基酸的多肽,稱為EBP1-150。通過C-末端定序發(fā)現(xiàn)24KDa帶是159個氨基酸長。該形式叫做EBP1-150。
研究表達(dá)EBP的CHO細(xì)胞是否存在EBP的膜結(jié)合形式。通過用質(zhì)粒pDSRα-EBP轉(zhuǎn)染CHOd-細(xì)胞建立重組CHO細(xì)胞系36.44。細(xì)胞生長在用1X非必需氨基酸和1X青霉素,鏈霉素,谷氨酰胺和10%熱炎活的滲析胎牛血清補充的EMEM∶F12懸浮培養(yǎng)基中生長。用在1ml磷酸緩沖鹽中的4μg/ml磷脂酶C(Calbiochem,La Jolla,CA),將106細(xì)胞等份于37℃處理不同的時間。將細(xì)胞在14.000RPM沉淀1分鐘。取出上清液進(jìn)行分析。將細(xì)胞沉淀溶解于RIPA緩沖液(150mMNaCl;1%NP-40∶0.5%脫氧膽酸鹽50mM Tris-HCl PH8.0;0.1%SDS;1.74μg/ml PMSF的抑蛋白酶肽,胃蛋白酶抑制劑,亮抑蛋白酶肽各1ng/ml;18.4μg/ml原鋇酸鹽)。將樣品放到14% Tris-Glycine凝膠上,印到PVDF膜上,并用兔抗EBP-多克隆抗體檢測。圖4說明存在磷脂酶C的情況下,將EBP釋放到上清液中。這些實驗說明EBP的27KDa形式有糖磷脂固定端。
實施例5EBP類似物除由全長EBP基因產(chǎn)生的不同形式重組EBP外,構(gòu)建具有不同多肽長度的EBP類似物。尤其是,按如下構(gòu)建有167,171和180個氨基酸的EBP。合成寡核苷酸421-12,421-13和421-14用以作為PCR引物分別導(dǎo)入氨基酸180,171和167后的終止密碼子。分別用各種引物和pDSRα-EBP質(zhì)粒及寡核苷酸386-2;按實施例4B所述完成PCR反應(yīng)
421-12 5′-GAATTCTCTAGATTATCATGGAAGGAGCAGCACAGTCCAG-3′(SEQ.ID.NO.14)421-13 5′-GAATTCTCTAGATTATCATGGGAAGAGGCGTGGGGCAGC-3′(SEQ.ID.NO.15)421-14 5′-GAATTCTCTAGATTATCATGGGGCAGCACTGTGACCGATGC-3′(SEQ.ID.NO.16)使用描述過的用于表達(dá)EBP的方法,在用改變的DNA序列轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞中表達(dá)所得的類似物。在存在血清的情況下使細(xì)胞生長至?xí)希S后將培養(yǎng)基換成無血清的并使其積累。48小時時,收集限制性培養(yǎng)基并溶融粘附的細(xì)胞。將限制性培養(yǎng)基和溶解物等份經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并經(jīng)Western印跡。EBP1-187和EBP1-180表現(xiàn)出與溶胞物和上清液中抗體反應(yīng)的相似蛋白質(zhì)特性。表達(dá)EBP1-171和EBP1-167的細(xì)胞在上清液中有EBP積累,但在溶胞產(chǎn)物中沒有。按實施例2中所述用BIAcore分析EBP類似物與eck-x的結(jié)合,按實施例6中所述分析EBP類似物的eck受體磷酸化活性。
實施例6重組EBP與eck受體的相互作用A.交聯(lián)研究按下文所述用125I放射性標(biāo)記CHO-細(xì)胞產(chǎn)生的EBP以用于交聯(lián)和結(jié)合研究。將5或10μg的EBP的0.1M磷酸鈉(Na3PO4,PH8.0)溶液加到5mCi干125I-Bolton-Hunter試劑(NEN,Boston,MA)中,使終體積為50μl或100μl并將試管在4℃溫育1小時。通過加入0.3ml 0.2M甘氨酸的0.1M Na3PO4終止反應(yīng),接著在4℃溫于5分鐘。在10ml含(用0.1M Na3PO4-0.25%明膠平衡的)Sephadex G-25M(Pharmacia)的PD10柱上,經(jīng)凝膠過濾層析從未摻入的試劑中分離標(biāo)記的蛋白質(zhì)。125I-EBP的特異性活性范圍為4-19cpm/pg。
按下文完成EBP與LIM 2405(天然表達(dá)eck受體的細(xì)胞系)或CHO19.32(用全長eck受體克隆轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞)的交聯(lián)。使細(xì)胞在懸浮液中生長達(dá)到培養(yǎng)基中約5×105細(xì)胞/ml的密度。使LIM2405細(xì)胞在含5%FCS,1μg/ml胰島素,1μg/ml氫化可的松,10μm硫甘油和2nML-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中生長到在T-175燒瓶達(dá)到約90%融合,弄碎取出用于交聯(lián)研究。將細(xì)胞離心出并再懸浮于PBS以得到單一細(xì)胞懸浮液。對于每個交聯(lián)反應(yīng),將2×106細(xì)胞與約20ng的125I-EBP在1ml總體積中混合。將該混合物在4℃溫育1小時以便在加入20μl10nM二琥珀酸酰亞胺/底物(DSS)作為交聯(lián)劑前,使EBP與細(xì)胞表面受體結(jié)合。然后用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞洗滌3次,離心收集,計算摻入細(xì)胞沉淀中的放射性量以評估交聯(lián)程度。然后,通過用100μlPBS,1m MEDCA,0.5%WP-40,1mM苯基甲基磺?;?PMSF,Sigma,St.Louis,Mo)在4℃處理10分鐘來溶解細(xì)胞。通過離心除不可溶的物質(zhì),并收集含受體/配體復(fù)合物的可溶部分。這些樣品或者直接上SDS-PAGE柱或者先用抗eck受體C末端部分的抗體(Lindberg等人,同上文)免疫沉淀。通過在加到細(xì)胞中之前,將競爭劑與標(biāo)記的EBP混合完成與未標(biāo)記EBP或不相關(guān)蛋白質(zhì)(FGF)的競爭。
如圖5中所示,可以將125I-EBP與CHO19.32細(xì)胞(道1)交聯(lián),而不與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(道2)交聯(lián)。交聯(lián)產(chǎn)生145KDa蛋白質(zhì)的檢測,以及可代表受體二聚物或更高級復(fù)合物的高分子量形成。超過50倍摩爾的未標(biāo)記rEBP能夠就結(jié)合和交聯(lián)(道3)進(jìn)行競爭。在其它實驗中,濃度為1μg/mL的重組成纖母細(xì)胞生長因子對rEBP交聯(lián)沒有影響。對于LIM2405細(xì)胞系,得到了相似的交聯(lián)結(jié)果。
B結(jié)合研究為了測量相關(guān)的動力學(xué)數(shù)據(jù),將CHO19.32細(xì)胞(2×106細(xì)胞/ml)與3.8nM125I-EBP和PBS-BSA(1mg/ml)一起在0℃溫育。取出齊等份,通過蔗糖梯度離心確定細(xì)胞結(jié)合的125I-EBP。從含380nM未標(biāo)記EBP的平行反應(yīng)中,測量到非特異性結(jié)合。
通過將CHO19.32或LIM2405細(xì)胞(0.5×106細(xì)胞/ml)與不同量的125I-EBP在0℃一起溫育1小時,確定平衡結(jié)分常數(shù),并按上述確定結(jié)合的EBP,用Scatehard的方法(Annal.N.y.Acad.Sci.51,660(1949))分析數(shù)據(jù)。從含超過50倍的未標(biāo)記EBP的相同反應(yīng)中確定非特異性結(jié)合。
125-rEBP與LLM2405細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)結(jié)合的Scatehard分析說明,在細(xì)胞表面上,有近似單一類型的kd為2.8×10-8M±0.3×10-8的受體。平均說LIM2405細(xì)胞在細(xì)胞表面含1.3×106EBP受體。EBP與固定eck-X表面的BIAcore分析得出估計的kd為2.4×10-8M±0.4×10-8。
C.p130eck自身磷酸化研究將LIM2405結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系(Whitehead等人,Lmmunol,and Cell Biol.70,227(1992))保持于含5%EBS1μg/ml胰島素,10μg/ml氫化可的松和(Oμ Mα-硫甘油的RPMl1640中,并通過胰蛋白酶化次傳代,然后稀釋(1∶5)到新鮮培養(yǎng)基中。檢測前,將2.5×LIM2405細(xì)胞種到6孔盤(Falcon # 3046),并于37℃濕育24小時。除去培養(yǎng)基,并用含0.03%BSA,1μg/ml胰島素,10μg/ml氫化可的松和10μMα-硫甘油的無血清培養(yǎng)基代替,然后溫育12-18小時。在一些實驗中,處理前,在無磷酸RPMI1640(Flow)中用32P-在磷酸鹽2mCi/ml)標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)物。以不同的濃度將生長因子貯備溶液預(yù)稀釋到2.0ml無血清培養(yǎng)基中,然后加熱到37℃。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)物,并除去上清液培養(yǎng)基。迅速處理并在37℃將細(xì)胞培養(yǎng)物溫育10-15分鐘。然后從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)物,放在冰上,并抽吸細(xì)胞上清液。
將處理過的細(xì)胞培養(yǎng)物冷卻到0℃,然后用冰冷的PBS(GIBCO)洗滌一次。抽吸殘余的PBS,加入1.0ml冰冷的RIPA緩沖液(10mM磷酸鈉,PH7.4,150mM氯化鈉,0.1%+二烷基硫酸鈉,1%NP-40,1%脫氧膽酸鹽,1%Trasylol,2m MEDTA,50mM氟化鈉和100mM原釩酸鈉)來溶解細(xì)胞。溫育10分鐘后,將溶解物移到1.5ml試管并以10,000xg離心30分鐘澄清的。將澄清的溶解物上清液轉(zhuǎn)移到新試管中,并用1.0μg/ml的親和純化的兔抗-Eck C未端區(qū)抗體在0℃免疫沉淀2小時。將免疫復(fù)合物于4℃經(jīng)30分鐘吸附到Protein-G Sepharose珠(Pharmacia)上,用含0.5M Licl的冰-冷的RIPA緩沖液洗滌兩次,用0.1M Tris-HCl,PH8.0(含0.5M Licl)洗滌1次,用RIPA洗滌1次。用SDS-PAGE樣品緩沖液溶解所得的免疫沉淀并貯存用于進(jìn)一步分析。
如前所述(Boyle等人,Meth′Enzymol.201,110(1991))將處理得到的抗-eck免疫沉物和未處理的LIM2405細(xì)胞溶解物放在7.5%聚丙烯酰胺凝膠上分析。電泳后,將凝膠電印跡(Kamps Meth.Erzyrnol 201 110(1991))到Immobilon P(Millipore)上,然后在含0.1%Tween-20(TBST)和5%BSA的Tris-緩沖鹽中將印跡濕溫育1小時以阻斷膜上的非特異性結(jié)合位點。在含3%BSA,1%卵白蛋白的TBST中,將一級抗體,或者抗磷酸酪氨酸抗體(4G10,UBI,Lake Plaid,NY),或抗-eck C末端稀釋到1.0μg/ml,并與印跡在溫育1小時。此后,用TBSI潤濕印跡,然各用TBST,洗滌一次10-15分鐘,然后再洗滌2次,各5分鐘。然后將印跡同與辣根過氧化物酶(Amers-ham,Arlingten Heights,IL)結(jié)合的二級抗體的1∶5000稀釋液一起單獨的TBST中濕育20-30分鐘,然后按前述用TBST洗滌。通過化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(ECL,Amorsham)于室溫暴露于Kodak·X-OMAT X射線膠片0.5-5分鐘,來檢測免疫復(fù)合物。
用SDS-PAGE分析來自32P-標(biāo)記的LIM2405細(xì)胞的eck受體免疫沉淀物,不用固定直接干燥凝膠。暴露于X-射線膠片后,分離標(biāo)記的eck受體,按描述(Boyle等人,MethEnzymol,201,110(1991))確定磷酸氨基酸含量。
CHO細(xì)胞-產(chǎn)生的rEBP以劑量依賴方式最佳濃度在100ng/ml和1mg/ml之間刺激完整LIM2405細(xì)胞中的eck受體磷酸化(圖6,上行),在總細(xì)胞eck蛋白質(zhì)水平中,似乎是適度的劑量-依賴型降低(圖6,下行),說明暴露于可溶性EBP后,受體的下降調(diào)節(jié)。用EBP處理LIM2405細(xì)胞不會導(dǎo)致EGF受體的虛假磷酸化,EGF處理也不會誘導(dǎo)eck磷酸化。此外,分析用rEBP處理的LIM2405細(xì)胞的總細(xì)胞蛋白質(zhì),僅僅誘導(dǎo)的磷酸蛋白質(zhì)是Mr130 kd的多肽,相當(dāng)于成熟的eck受體。
在完成用于CHO-細(xì)胞產(chǎn)生的rEBP分析后,接著檢測大腸桿菌rEBP1-150有關(guān)LIM2405細(xì)胞上eck受體的自身磷酸化。根所據(jù)用相同量的CHO-產(chǎn)生的rEBP和大桿菌產(chǎn)生的EBP1-150處理細(xì)胞,觀察到兩種重組EBP形式在誘導(dǎo)磷酸化方面均有活性。
實施例7重組EBP的制劑用BIAcore測量EBP與固定的可溶性eck細(xì)胞外區(qū)的結(jié)合,發(fā)現(xiàn),純化EBP的稀釋溶液迅速失去與eck受體的結(jié)合能力,除非將它與保護(hù)試劑如洗滌劑配制在一起。
在PBS中稀釋到100μg/ml并于3℃溫育2小時的重組EBP會喪失約50%的其eck結(jié)合活性。通過在洗滌劑如1mM CHAPS,0.1%NP-40,0.1% Tween 20,0.1% triton-x100,或0.1% tween 80中配制EBP,可以避免這種活性丟失。(見圖7)通過將該蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)載體如胎牛血清一起溫育也可以避免稀釋EBP eck結(jié)合活性的丟失。
以2-5mg/ml保持在洗滌劑溶液中的EBP的eck結(jié)合活性于3℃至少穩(wěn)定一星期,10-500μg/ml的蛋白質(zhì)溶液,若于-20℃貯存,或使其經(jīng)多次冷凍融解循環(huán),則失去活性。
實施例8在組織和細(xì)胞系中表達(dá)EBP和eck受體用Lindberg等人(同上文)描述的方法,已在大鼠的各種組織器官中,在mRNA水平研究了EBP的表達(dá)。在肺,腸,肝,卵巢和腎中,EBP的表達(dá)最高。在肌肉,胃和腦中也檢測到低水平的表達(dá)。
在細(xì)胞系中,有關(guān)EBP和eck受體的表達(dá)研究都已做過。在Western分析中,用親和純化的抗-人EBP單克隆抗體免疫印跡細(xì)胞上清液,從而檢測EBP表達(dá)。如表2所示,在許多癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了EBP??捎脦追N方法(包括全細(xì)胞溶胞物的免疫印跡和用來自溶胞物的抗-eck抗體免疫沉淀)檢測eck表達(dá)。(Lindberg等人,同上文)。表2中的結(jié)果說明在許多上皮細(xì)胞系中都表達(dá)過eck,此外,在成纖維細(xì)胞和黑瘤細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)eck。
表2表達(dá)EBP的細(xì)胞系細(xì)胞系 細(xì)胞類型CaCO2結(jié)腸腺癌FADU 鱗狀細(xì)胞癌T47D 乳癌
MDAMD361 乳腺癌THP-1 單核細(xì)胞性白摁病SKBR3 乳腺癌CaOV4 腺癌MDAMB453 乳腺癌Caki1 腎癌HBL100 乳房HT29 結(jié)腸腺癌JEGI 絨膜癌293 胚胎腎A704 腎腺癌Caki2 腎腺癌CaOV3 卵巢腺癌SKOV3 卵巢腺癌A172 成膠質(zhì)細(xì)胞癌A431 表皮癌BSCI 腎BT20 乳癌PC3 前列腺腺癌JAR 絨膜癌A498 腎癌LNCaP 前列腺腺癌BT474 乳癌SW480 結(jié)腸腺癌
SW620 結(jié)腸腺癌MCF7 乳腺癌T24 膀胱癌5637 膀胱癌Du145 前列腺癌SKNSA 成神經(jīng)細(xì)胞癌L929 結(jié)締組織G401 腎腫瘤THP-1 單核細(xì)胞性白血病CCDIILu 肺HT29 結(jié)腸腺癌SKOV3 卵巢腺癌A172 成交質(zhì)細(xì)胞瘤A431 表皮癌JAR 絨膜癌GM4312A 成纖維細(xì)胞Wi38 肺UT7 前巨核細(xì)胞(premegakaryocyte)CHOK1 卵巢HS249T 黑瘤M14 黑瘤N1H3T3 成纖維細(xì)胞實施例9EBP的生物學(xué)活性A.在大鼠創(chuàng)傷腔檢測中的EBP活性研究在大鼠皮下植入的創(chuàng)傷腔中,重組CHO-產(chǎn)生的和大腸桿菌產(chǎn)生的EBP對肉芽組織形成的影響。
將雄性無Sprague-Dawley特異性病原體大鼠(300-350g;Charles River Breeding Laboratories,Inc.)用于該研究。通過膜腔內(nèi)注射用戊巴比妥鈉(50mg/Kg體重)麻醉大鼠。用無菌手術(shù)技術(shù),在大鼠的背部表面切一個3cm中線切口。通過在該動物一側(cè)鈍切,于膜肌下形成一個袋。然后皮下插入一個3cm長×1cm直徑的無菌不銹鋼絲網(wǎng)柱。所用的創(chuàng)傷腔與Schilling等人(Surgery 46,702-710(1959))描述的并由Hunt等人(Am.J.Surg H4,302-307(1967))用作創(chuàng)傷愈合模式的那些相似,用創(chuàng)傷鉗合上該切口。大鼠術(shù)后存活很好,沒有術(shù)后不適的跡象。創(chuàng)傷腔植入后的起初3天。將大鼠隨機分成5個組。此時開始每天注射1)10μgCHO-產(chǎn)生的EBP,2)1μgCHO-產(chǎn)生的EBP,3)8μg大腸桿菌產(chǎn)生的EBP,4)5μg重組血小板產(chǎn)生的生長因子(PDGE),或5)0.1ml無菌PBS和1mMCHAPS,并共持續(xù)9天。通過室外邊緣的硅酮間隔,直接注射到創(chuàng)傷腔中,腔植入12天后,用CO2窒息處死這些大鼠。處死后,立即手術(shù)取出腔并小心打開。然后將其中的肉芽組織稱重,并貯存于-70℃以作進(jìn)一步加工。
將肉芽組織樣品融溶并用Polytron勻漿器在2ml冰冷的蒸餾水中勻漿約1分鐘。接著,將2ml冰冷的10%三氯乙酸加到勻漿物中并于4℃溫育1小時。將TCA-沉淀的樣品于4℃離心(500g,10分鐘)用2ml冰-冷的5%TCA洗滌一次,最后用含50mM乙酸鈉的2ml冰-冷95%乙醇洗滌。將樣品用2ml乙醇∶乙醚(3∶1v/v)在20℃脫脂兩次。每次脫脂后,離心樣品(500×g,10分鐘)并除去上清液。然后將沉淀溶解于1N氧化鈉中,并將體積加到10ml。
取一份溶解的肉芽組織并按Bradford的方法(Anal Biochem.72,248-25(1976))檢測,從而確定總蛋白質(zhì)。用牛血清白蛋白(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)及為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
用Burton的比色法(Biochem.J.62,315(1956))按脫氧核糖確定總DNA含量??傊?,加入0.5mlZNHCl中和1ml溶解的樣品(在N NaOH中)。用10%高氯酸在90℃提取1ml中和溶液15分鐘。將1ml的最后提取物加到2ml激活的二苯胺(Sigma Chemical.St.Louis,MO)試劑中,并在室溫溫育過夜后測定600nm的吸收值。用水解的小牛胸腺DNA(Sigma)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。該DNA含量是創(chuàng)傷腔中細(xì)胞數(shù)的近似指數(shù),同時認(rèn)為細(xì)胞類型和細(xì)胞循環(huán)也影響DNA含量。
用硫酸軟骨素作為標(biāo)準(zhǔn),測定總葡糖氨聚糖(GAGs)。利用染料1,9-二甲基亞甲基藍(lán)(Farndale等人,Conn,Tiss.Res 9.247-248(1982))吸收光譜的改變完成GAGs的分光光度檢測。
用6N HCl將溶解的肉芽組織在110℃水解24小時后,將總膠原蛋白含量確定為羥基脯氨酸量(膠原蛋白含量的指數(shù))。干燥200μl樣品水解物的各等份,在200μl緩沖液中重新制成,并用Beekman 6300氨基酸分析儀通過氨基酸分析來分析羥基-L-脯氨酸。用外標(biāo)準(zhǔn)的羥基-L-脯氨酸(Sigma)完成定量分析。
通過變量的單向分析來分析數(shù)據(jù)。然后用雙尾未配對的Student′s t試驗對比各組的平均值來分析顯著性差異。將統(tǒng)計學(xué)顯著性確定為P<0.05。將所有值均表達(dá)成平均值±SEM。
與溶劑-處理(PBS和1mMCHAPS)的對照大鼠相比,CHO-產(chǎn)生的rEBP以每室每天10μg的劑量連續(xù)9天和rPDGF以每天5μg的劑量(×9天)均顯著提高創(chuàng)傷腔肉芽組織的凈重,總蛋白,總DNA和總GAG含量(見表3)。植入后12天,收集全部的創(chuàng)傷腔。該時間點是肉芽組織形成的高峰和膠原蛋白形成的早期。與溶劑處理的對照大鼠室相比,CHO-產(chǎn)生的rEBP(以每室每天1μg的劑量)在肉芽組織凈重和GAG含量方面有顯著的增加。然而,對于1μg rEBP劑量,在總蛋白,DNA和羥基脯氨酸方面與對照沒有顯著區(qū)別。
膠原蛋白的積累可以是影響創(chuàng)傷強度的唯一最重要的因素。PDGF處理的腔與對照腔相比在羥基脯氨酸含量方面有82%的增加(并因此得出膠原蛋白的合成)。CHO、-產(chǎn)生的rEBP以1μg/室/天在羥基脯氨酸方面有21%的增加,以10μg/室/天則在羥基脯氨酸方面有35%的增加,盡管這些增加并沒有統(tǒng)計學(xué)的顯著的。
B.鼠血細(xì)胞生成中的EBP活性將來自BDF小鼠的未分離骨髓懸浮液鋪在0.3%瓊脂糖中的無血清培養(yǎng)基(Iscove′s改性的Dulbecco′s培養(yǎng)基)中,并在96孔平板中以1×105/ml細(xì)胞濃度于37℃,5%CO2溫育10天。每孔總體積是50μl。以標(biāo)明的數(shù)量加入EBP和其它生長因子,并在溫育的第10天將菌落劃線。結(jié)果列于表8。
與單獨用IL-3相比,EBP(以1μg/ml的劑量)可促進(jìn)IL-3依賴性鼠CFU-C的形成約2倍。CFU-C代表CFU-G,CFU-GM和CFU-M。單獨的EBP對CFU-M或EFU-E/CFU-E未表現(xiàn)刺激作用。
C.結(jié)腸隱窩檢測(Colon Crypt Assay)牛的EBP活性取出5只(BDF)小鼠的結(jié)腸,并用非酶(EDTA)提取法分離隱窩(Crypts)簡而言之,洗滌結(jié)腸并在含0.04%次氯酸鈉的PBs溶液中放20分鐘。通過在含3mM EDTA和0.5mMDTT的PBs溶液中于37℃溫育該組織1小時使隱窩分離。將隱窩在37℃經(jīng)胰酶消化(在PBS中0.2%)90分鐘以得到單細(xì)胞懸浮液。用PBS洗滌細(xì)胞,計數(shù),用臺盼藍(lán)排除法確定成活力(該實驗是85%)。然后將細(xì)胞鋪在上層是0.37%Sigma低融點瓊脂,底層是0.5%瓊脂的頂層。在瓊脂中所用的RPMI培養(yǎng)基有1×ITS(胰島素,轉(zhuǎn)鐵蛋白,硒,Gibco)存在。在存在1%胎牛血清(FCS)和下列濃度標(biāo)明的生長因子的情況下進(jìn)行培養(yǎng)TGFα,500ng/ml;bFGF,60ng/ml;EBP,500ng/ml。對照培養(yǎng)不含生長因子和/或FCS。各種培養(yǎng)條件的每一個均完成一式三份,并每過幾天劃線。
隱窩細(xì)胞與1%FCS和EBP或1%FCS和bFGF一起培養(yǎng)后,得到陽性結(jié)果。在兩種條件下,細(xì)胞群很大且群內(nèi)的單個細(xì)胞看起來健康。在一些情況下,細(xì)胞群象隱窩形。若將EBP和bFGF與FCS一起加入,很少且很小的細(xì)胞群與存在1%FCS時單獨加入該兩種生長因子之一的情況相象。開始,EBP與hFGF結(jié)合似乎誘導(dǎo)細(xì)胞生長,但生長方面的刺激作用是短暫的。在單獨用EBP的平板中(沒有血清),偶爾有大細(xì)胞群,但它們很稀疏,細(xì)胞很大,而約一半的細(xì)胞在群內(nèi)不能存活。
這些結(jié)果說明,EBP涉及結(jié)腸隱窩細(xì)胞的增殖,分化或再生。
D.EBP對細(xì)胞一級培養(yǎng)物的活性通過Segien描述的原位兩步膠原酶預(yù)融合技術(shù)(Methods in Toxicol.,Vol.lA,231-243(1993))分離肝細(xì)胞。簡而言之,將預(yù)融合的肝分散于冰冷Hank′s緩沖液中,通過尼龍網(wǎng)過濾,以50xg重復(fù)離心從非實質(zhì)細(xì)胞中分離肝細(xì)胞。通過臺盼藍(lán)排除法確定肝細(xì)胞有遠(yuǎn)大于85%的可存活。在用大鼠尾膠原蛋白包被的平板上培養(yǎng)肝細(xì)胞并鋪在含5%FCS,10-7M胰島素,10-8M地塞米松,谷氨酰胺,青霉素和鏈霉素的Williams E中。
使細(xì)胞在含培養(yǎng)基的血清中粘附3-4小時,然后轉(zhuǎn)移到無血清培養(yǎng)基中。加入適當(dāng)濃度的EBP或其它生長因子,并在3H-胸苷存在的情況下將細(xì)胞溫育24到48小時。溫育后,確定3H-胸苷摻入到細(xì)胞中的程度。被檢測的生長因子是10ng/ml的角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(KGF),20ng/ml的酸FGF(aFGF),和20ng/ml的EBP。結(jié)果列于圖9。EBP刺激的3H-胸苷摻入量與由aFGF誘導(dǎo)有大約相同。KGF和EBP的結(jié)合對肝細(xì)胞生長的刺激不超過單獨用KGF觀察到的水平。在這項特別的實驗中,無血清值通常不高的(約3倍)。
以優(yōu)選實施方案的方式,已描述了本發(fā)明,本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會理解發(fā)生的變化和改變。因此,所附的權(quán)利要求將覆蓋在本發(fā)明要求范圍內(nèi)的全部上述等同變化。
序列目錄(1)一般資料;
(Ⅰ)申請人;Bartley,Timothy DudleyFox,Gqry Michael
Boyle,William TamesWeleher,Andrew AveryParker,Vann Phillips(Ⅱ)發(fā)明題目;eck受體配體(Ⅲ)序列數(shù)16(Ⅳ)有關(guān)地址;
(A)收信人Amgen Ine(B)街道;Amgen Center1840 Dehavilland Drive(C)城市;Thausand Oaks(D)州;California(E)國家;USA(F)郵編;91320-1789(Ⅴ)計算機可讀形式;
(A)介質(zhì)類型;Diskette,3.5 in.,DS,2.0Mb(B)計算機;Apple Macintosh(C)操作系統(tǒng);Macintosh OS 7.0(D)軟件;Microsoft Word Uersion 5.1a(Ⅵ)目前的申請資料;
(A)申請?zhí)?
(B)申請日;
(C)分類號;
(2)SEQ ID NO1的資料(1)序列特征;
(A)長度;205個氨基酸(B)類型;氨基酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);未知的.
(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO1Met Glu Phe Leu Trp Ala Pro Leu Leu Gly Leu Cys Cys Ser-15 -10 -5Leu Ala Ala Ala Asp Arg His Thr Val Phe Trp Asn Ser Ser1 5 10Asn Pro Lys Phe Arg Asn Glu Asp Tyr Thr Ile His Val Gin15 20Leu Asn Asp Tyr Val Asp Ile Ile Cys Pro His Tyr Glu Asp25 30 35His Ser Val Ala Asp Ala Ala Met Glu Gln Tyr Ile Leu Tyr40 45 50Leu Val Glu His Glu Glu Tyr Gln Leu Cys Gln Pro Gln Ser55 60 65Lys Asp Gln Val Arg Trp Gln Cys Asn Arg Pro Ser Ala Lys70 75 80His Gly Pro Glu Lys Leu Ser Glu Lys Phe Gln Arg Phe Thr85 90Pro Phe Thr Leu Gly Lys Glu Phe Lys Glu Gly His Ser Tyr95 100 105Tyr Tyr Ile Ser Lys Pro Ile His Gln His Glu Asp Arg Cys110 115 120Leu Arg Leu Lys Val Thr Val Ser Gly Lys Ile Thr His Ser125 130 135Pro Gln Ala His Val Asn Pro Gln Glu Lys Arg Leu Ala Ala140 145 150Asp Asp Pro Glu Val Arg Val Leu His Ser Ile Gly His Ser155 160Ala Ala Pro Arg Leu Phe Pro Leu Ala Trp Thr Val Leu Leu165 170 175Leu Pro Leu Leu Leu Leu Gln Thr Pro180 185
(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征;
(A)長度;30個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO2AAGCATATGG ATCGCCACAC CGTCTTCTGG(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度;35個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO3GAAGGATCCT TATCACGGGG TTTGCAGCAG CAGAA(2)SEG ID NO4 的資料(ⅰ)序列特征(A)長度;36個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序述描述;SEQ ID NO4GAAGGATCCC TATTATGCTG CAAGTCTCTT CTCCTG
(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特征;
(A)長度;31個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO5GAATTCAAGC TTCAGGCCCC GCGCTATGGA G(2)SEQ ID NO6的資料;
(ⅰ)序列特征(A)長度;35個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO6GAATTCTCTA GATCATCACG GGGTTTGCAG CAGCA(2)SEQ ID NO7的資料(ⅹ)序列特征;
(A)長度;13個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO7AGCTTAGATC TCC
(2)SEQ ID NO8的資料;
(ⅰ)序列特征;
(A)長度;13個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO8AATTGGAGAT CTA(2)SEQ ID NO9的資料;
(ⅰ)序列特征;
(A)長度;39個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO9AATTCCAGAC GCTGTCCCCG GAGGGATCCG GCAACTGAG(2)SEQ ID NO10的資料;
(ⅹ)序列特征;
(A)長度;39個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO10TCGACTCAGT TGCCGGATCC CTCCGGGGAC AGCGTCTGG
(2)SEQ ID NO11的資料(ⅰ)序列特征;
(A)長度;1480個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11
(2)SEQ ID NO12 的資料;
(ⅰ)序列特征;
(A)長度;5個氨基酸(B)類型;氨基酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);未知(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO12Lys Arg Leu Ala Ala(2)SEQ ID NO13的資料;
(ⅰ)序列特征;
(A)長度;23個氨基酸(B)類型;氨基酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);未知(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No13Asp Arg His Thr Val Phe Asp Asn Ser Ser Asn Pro Lys Phe1 5 10Arg Asn Glu Asp Tyr Ile His Val Gln15 20(2)SEQ ID NO14 的資料;
(ⅰ)序列特征;
(A)長度;40個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性
(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO14GAATTCTCTA GATTTCATGG AAGGAGCAGC ACAGTCCAG(2)SEQ ID NO15 的資料;
(ⅰ)序列特征;
(A)長度;39個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO15GAATTCTCTA GATTATCATG GGAAGAGGCG TGGGGCAGC(2)SEQ ID NO16 的資料;
(ⅰ)序列特征;
(A)長度;41個核苷酸(B)類型;核酸(C)鏈型;單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);線性(ⅹⅰ)序列描述;SEQ ID NO16GAATTCTCTA GATTATCATG GGGCAGCACT GTGACCGATG C
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合eck受體并具有與SEQ ID NO1所示基本相同的氨基酸序列的純化及分離的多肽。
2.誘導(dǎo)eck受體磷酸化的權(quán)利要求1的多肽。
3.具有SEQ ID NO1所示的終止于150位的氨基酸序列或具有與終止于150位SEQ ID NO∶1所示基本相同的氨基酸序列的權(quán)利要求1的多肽。
4.其中氨基酸的序列是SEQ ID NO∶1中所示的+1位到150位的權(quán)利要求3的多肽。
5.在-1位有一個甲硫氨酸殘基的如權(quán)利要求的多肽。
6.選自[Met-1]EBP1-150和[Met-1]EBP1-159的如權(quán)利要求5的多肽。
7.選自EBP1-167EBP1-171和EBP1-180的如權(quán)利要求1的多肽。
8.權(quán)利要求1的多肽,其特征在于它是外源DNA列的原核或真核表達(dá)產(chǎn)物。
9.權(quán)利要求8的多肽它是CHO細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求8的多肽,其中外源序列是cDNA序列。
11.權(quán)利要求8的多肽,其中外源序列是基因組DNA序列。
12.權(quán)利要求8的多肽,其中外源序列是合成的DNA序列。
13.權(quán)利要求8的多肽,其中外源DNA序列由自我復(fù)制的DNA質(zhì)?;虿《据d體攜帶。
14.權(quán)利要求8的多肽,它是大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)物。
15.有一個N-末端甲硫氨酸殘基的權(quán)利要求8的多肽。
16.編碼特異性結(jié)合eck受體的多肽的DNA序列,其中所述多肽在一1位有一個甲硫氨酸殘基并且具有與SEQ ID NO∶1所示基本相同的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的DNA序列編碼[Met-1]EBP1-150和[Me-1]EBP1-159。
18.編碼EBP1-167,EPB1-171和EBP1-180的DNA序列。
19.一種分離的eck受體-配體復(fù)合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的受體-配體復(fù)合物,其中配體是權(quán)利要求1的多肽。
21.檢測粗樣品中能結(jié)合受體的配體的方法,包括步驟;a)固定受體的純化配體結(jié)合區(qū);b)將固定的受體與含配體的限制性培養(yǎng)基接觸;和c)用表面胞質(zhì)基因共振檢測系統(tǒng)檢測配體與固定受體的結(jié)合。
22.權(quán)利要求21的方法,其中受體是eck受體。
23.調(diào)節(jié)哺乳動物中eck受體外源活性的方法,包括給所述哺乳動物施用有效量的eck受體配體以調(diào)節(jié)所述受體有活性。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法,其中所述配體是權(quán)利要求1的多肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法,其中所述eck受體活性的調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)包括分化,增殖以及代謝內(nèi)的新陳代謝。
26.一種用于鑒別可調(diào)節(jié)eck受體活性的化合物的方法,包括步驟;a)將呈現(xiàn)受體的細(xì)胞暴露于已知配體中一段足夠的時間以使受體-配體復(fù)合形成并誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo);b)確定細(xì)胞內(nèi)活性的程度;和c)將測得的活性與未暴露可配體細(xì)胞中的活性進(jìn)行比較。
27.一種治療患者中癌癥的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。
28.一種治療患者中癌癥的方法,包括施用治療有效量的權(quán)利要求和27的配體,所述配體與eck受體結(jié)合,但不使其磷酸化。
29.一種治療患者中癌癥的方法,包括施用治療有效量的eck可溶性受體。
30.權(quán)利要求27,28或29的任一種方法,還包括治療有效量的化療或放射治療。
31.一種治療患者中炎癥的方法,包括施用治療有效量的eck可溶性受體。
32.一種治療患者中炎癥的方法,包括施用治療有效量的eck受體,其中所述配體與eck受體結(jié)合,但不使其磷酸化。
33.一種治療哺乳動物創(chuàng)傷的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。
34.一種治療哺乳動物中增加血細(xì)胞生成的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法,其中配體是權(quán)利要求1的多肽。
36.一種刺激結(jié)腸細(xì)胞增殖的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法,與癌癥療法結(jié)合起來使用。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的方法,其中配體是權(quán)利要求1的多肽。
39.一種刺激肝細(xì)胞增殖的方法,包括施用治療有效量的eck受體配體。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法,其中配體是權(quán)利要求1的多肽。
41.一種藥物學(xué)組合物,含有治療有效量的eck受體配體和藥物學(xué)可接受的稀釋劑,輔劑或載體。
42.一種藥物學(xué)組合物,含有治療有效量的eck可溶性受體和藥物學(xué)可接受的稀釋劑輔劑或載體。
43.一種組合物含有權(quán)利要求1的多肽和一種洗滌劑。
全文摘要
公開了與eck受體結(jié)合的配體。尤其是公開了與eck受體特異性結(jié)合的多肽(eck受體結(jié)合蛋白或EBP
文檔編號A61P43/00GK1094446SQ9312132
公開日1994年11月2日 申請日期1993年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月13日
發(fā)明者T·D·巴特利, G·M·福克斯, W·J·博伊樂, A·A·韋爾徹, V·P·帕克 申請人:安姆根有限公司
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