專利名稱:一種植物提取物兒茶素在制備抗病毒藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制藥領域，具體涉及一種植物提取物兒茶素在制備治療或預防禽流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒幾種常見呼吸道病毒感染中的應用。
發(fā)明背景急性呼吸道感染是人類最常見的疾病，約80％以上是由病毒引起的，是導致世界范圍內老人和小孩發(fā)病與死亡的主要原因。引起呼吸道感染的病毒種類很多，其中較為常見的是流感病毒(Flu)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)、和腺病毒(AdV)。近年來，禽流感病毒已經(jīng)突破物種屏障感染人類。由于病毒的變異，呼吸道病毒感染的發(fā)病率持續(xù)不衰，并出現(xiàn)大流行，開發(fā)研制有效防治呼吸道病毒感染的新藥已成為各國學者研究的重要任務。
眾所周知，目前很多化學合成的抗病毒藥物由于毒副作用和長期應用的耐藥性而限制了其臨床應用。比如，目前臨床上常用金剛烷胺及其結構衍生物甲基金剛乙胺預防和治療流感，它雖能干擾病毒M2蛋白跨膜區(qū)功能而阻止病毒穿入細胞和脫去衣殼，但因存在神經(jīng)毒性，易產生耐藥毒株和對B型流感病毒無效等缺陷，限制了其在臨床上的廣泛應用。目前經(jīng)FDA批準用于防治RSV感染的藥物僅有病毒唑，通過抑制RNA合成發(fā)揮抗病毒作用。但病毒唑靜脈給予時存在骨髓細胞毒性，因此只能通過氣霧劑經(jīng)呼吸道少量給予，應用中常出現(xiàn)白細胞減少，劑量過大時可致頭痛、不可逆貧血等副作用。并且近年來隨著對其療效的爭議，其臨床應用受到限制。
因此，尋找一種高效、安全、副作用少的抗呼吸道病毒新藥勢在必行。中藥用于病毒性疾病的治療已有幾千年的歷史，是我國特色的醫(yī)藥寶庫，也是我國自主創(chuàng)新研究的最重要源頭。半個世紀以來，各國學者努力從天然植物中尋找高效無毒副作用的抗病毒藥物，已初見成效。迫切需要深入挖掘中醫(yī)藥的巨大潛力，發(fā)揮中醫(yī)藥在這方面的優(yōu)勢。
茶多酚是從茶葉中提取的一類組成復雜、相對分子質量不同、性質與結構差異很大的多羥基酚類混合物，約占茶葉干重的18％～36％。其中以兒茶素為主的黃烷醇類化合物是茶多酚的主體部分，占茶多酚總量的60％～80％，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表兒茶素(EC)，尤其是EGCG最引人注目，在茶葉生物化學中研究最廣泛、最深入。EGCG是茶葉特有的兒茶素，含量最高，占茶多酚制品的40％～50％，它是2-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯，同時因其結構中有6個鄰位酚羥基而有優(yōu)于其他兒茶素的許多性質。現(xiàn)代科學研究表明EGCG具有顯著的抗突變、抗氧化作用，能增強機體免疫力，抑制腫瘤生長，抑制肝脂和膽固醇的增長，對痢疾、傷寒、金黃色葡萄球菌也有很強的抑制作用。EGCG的抗腫瘤作用已經(jīng)得到了各國相關研究人員的認可，現(xiàn)已被列為一種潛在的抗癌新藥在中美等國進行研究。國外有文獻報道EGCG體外可通過抑制HIV-1逆轉錄酶的活性發(fā)揮抗HIV的作用，體外可通過抑制細胞內內涵體或溶酶體的酸化影響流感病毒的感染性，但到目前為止，國外尚未見兒茶素體外抗其它呼吸道病毒和體內抗病毒的報道，國內尚未見兒茶素抗病毒的研究報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是在于提供一種兒茶素的新用途，即在制藥中的新應用。
本發(fā)明的目的在于提供兒茶素作為制備治療或預防呼吸道病毒感染的藥物中的應用。
涉及兒茶素作為制備治療或預防禽流感病毒的藥物中的應用。
還涉及兒茶素作為制備治療或預防呼吸道合胞病毒的藥物中的應用。
還涉及兒茶素作為制備治療或預防科薩奇病毒感染的藥物中的應用。
還涉及兒茶素作為制備治療或預防腺病毒感染的藥物中的應用。
本發(fā)明中的兒茶素是以綠茶提取物為原料，經(jīng)有機溶劑多次萃取，去除咖啡因等雜質，再用HPLC分離得到(兒茶素富集和EGCG單體純化新工藝研究，張星海，茶葉，2002，28(3)136～137)，并經(jīng)紫外、紅外、質譜等現(xiàn)代分析手段確證。本發(fā)明中提取的兒茶素單體為類白色粉末，其中EGCG分子量為458.4，ECG分子量為442。兒茶素易溶于水和DMSO，以無菌雙蒸水配置成20mg/ml儲存濃度，-20℃避光保存，短期內性質穩(wěn)定，療效不變。兒茶素對HEp-2細胞和MDCK細胞的毒性作用表現(xiàn)為細胞折光性增加，細胞變圓，破碎，脫落。且藥物對細胞的毒性作用在一定范圍內隨著藥物濃度的增加，細胞存活率降低。
本發(fā)明者在長期的中藥抗病毒實驗研究中首次發(fā)現(xiàn)了兒茶素具有體內、體外抑制流感病毒的活性，并就兒茶素抗其他幾種常見呼吸道病毒進行了長時間的研究，從而完成了本發(fā)明。其目的是提供了兒茶素的一種新的藥物用途，即兒茶素在治療禽流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒等幾種常見呼吸道病毒感染中的應用。
兒茶素具有很好的體內、體外抗禽流感病毒的作用。體外藥效學實驗結果顯示EGCG和ECG具有很強的抑制禽流感病毒的活性，其作用方式是多途徑的，不僅能很好地預防禽流感病毒感染MDCK細胞(TI＝12.6)，直接殺傷病毒(TI＝7.1)，還對禽流感病毒穿入細胞后具有抑制作用(TI＝12.1)。其中預防禽流感病毒感染細胞和對病毒穿入細胞后的抑制作用較強，表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，MDCK細胞形態(tài)皺縮，變長，折光性增強，胞核圓縮和破裂等典型CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。其中抑制禽流感病毒作用EGCG＞ECG＞EGC＞EC。體內實驗中，EGCG 0.05 g·kg-1·d-1、0.1g·kg-1·d-1連續(xù)灌胃給藥5d，能延緩流感病毒感染小鼠體重的下降，減輕小鼠肺組織病變程度，顯著降低肺炎小鼠的肺指數(shù)和肺內流感病毒滴度(與病毒對照組相比P＜0.05)，對流感病毒引起的肺炎有很好的治療作用；與病毒對照組相比，0.1g·kg-1·d-1EGCG治療組小鼠死亡率明顯下降。體內實驗結果也證明EGCG抑制禽流感病毒作用強于ECG.。本研究證明兒茶素具有很好的體內、體外抗禽流感病毒的作用。
體外藥效學實驗結果顯示EGCG和ECG具有很強的抗呼吸道合胞病毒(RSV)的活性，其作用方式是多途徑的，其中直接殺傷病毒和對RSV穿入細胞后的抑制作用較強，表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，RSV所致CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。且EGCG作用強于ECG.。EGCG作用于RSV感染晚期的一個或多個環(huán)節(jié)。病毒感染后給藥，8μg/mlEGCG能顯著降低培養(yǎng)液中感染性RSV病毒滴度。體內實驗中，EGCG 0.05g·kg-1·d-1、0.1g·kg-1·d-1連續(xù)灌胃給藥5d，能延緩RSV感染小鼠體重的下降，減輕小鼠肺組織病變程度，顯著降低肺炎小鼠肺內RSV病毒滴度(與病毒對照組相比P＜0.05)，對RSV引起的肺炎具有很好的治療作用。
EGCG和ECG具有體外直接滅活柯薩奇病毒B3(CVB3)的作用，實驗結果顯示隨著藥物濃度的增加，細胞皺縮、變圓、脫落等典型CPE逐漸減弱，而培養(yǎng)上清中CVB3病毒滴度降低，病毒抑制率則明顯增高。體內實驗中，EGCG 0.05g·kg-1·d-1、0.1g·kg-1·d-1連續(xù)灌胃給藥5d，能延長CVB3感染小鼠平均存活時間，降低小鼠死亡率(與病毒對照組相比p＜0.05)。研究結果顯示兒茶素具有很好的體內、體外抗CVB3的作用。
體外藥效學實驗結果顯示兒茶素具有很強的抗腺病毒7型(AdV-7)的活性，其作用方式是多途徑的，不僅能很好地預防AdV-7感染HEp-2細胞(TI＝5.8)，直接殺傷病毒(TI＝17.0)，還對AdV-7穿入細胞后具有抑制作用(TI＝12.2)。其中直接滅活病毒和對AdV-7穿入細胞后的抑制作用較強，表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，HEp-2細胞形態(tài)腫脹變圓，折光度增強等典型CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。其中抑制腺病毒作用EGCG＞ECG＞EGC＞EC。EGCG能抑制AdV-7病毒蛋白的合成，作用于AdV-7感染晚期的一個或多個環(huán)節(jié)。病毒感染后8～16小時給藥，8μg/mlEGCG能顯著降低培養(yǎng)液中感染性AdV-7病毒滴度。體內實驗中，EGCG 0.05g·kg-1·d-1、0.1g·kg-1·d-1連續(xù)灌胃給藥5d，能延長AdV-7感染小鼠平均存活時間，降低小鼠死亡率(與病毒對照組相比P＜0.05)。本研究證明兒茶素具有很好的體內、體外抗AdV-7的作用。
將EGCG、ECG單體或混合物按照常規(guī)制劑技術制成薄膜包衣片，通過口服方式給藥預防或治療呼吸道病毒感染。也可以制成膠囊劑、顆粒劑、分散劑，通過口服、鼻腔或口腔噴霧方式給藥。進一步臨床實驗，經(jīng)51名符合呼吸道病毒感染臨床診斷標準的患者服用，300mg/次，2次/d，歷時5d，結果表明兒茶素在呼吸道感染發(fā)病后早期使用可以縮短疾病的持續(xù)時間，減輕癥狀的嚴重程度，對呼吸道病毒感染所致的支氣管炎、肺炎也有很好的治療作用，而且安全性和耐受性好，適合在臨床推廣使用。
具體實施方式實施例1本發(fā)明中的兒茶素是以綠茶提取物為原料(綠茶市場可購買)，經(jīng)有機溶劑多次萃取，去除咖啡因等雜質，再用HPLC分離得到(請見兒茶素富集和EGCG單體純化新工藝研究，張星海，茶葉，2002，28(3)136～137)，并經(jīng)紫外、紅外、質譜等現(xiàn)代分析手段確證。本發(fā)明中提取的兒茶素單體為類白色粉末，其中EGCG分子量為458.4，ECG分子量為442。兒茶素易溶于水和DMSO，以無菌雙蒸水配置成20mg/ml儲存濃度，-20℃避光保存，短期內性質穩(wěn)定，療效不變。兒茶素對HEp-2細胞和MDCK細胞的毒性作用表現(xiàn)為細胞折光性增加，細胞變圓，破碎，脫落。且藥物對細胞的毒性作用在一定范圍內隨著藥物濃度的增加，細胞存活率降低。提取的兒茶素單體為類白色粉末(提取的兒茶素為現(xiàn)有技術可得)，將提取的白色粉末易溶于水和DMSO，以無菌雙蒸水配置成10mg/ml和5mg/ml儲存濃度用于動物實驗，每天灌胃給藥1次，每次0.1mL，連續(xù)給藥5d。
將提取的兒茶素單體800g、藥用淀粉200g按比例配伍，過篩并充分混勻后，加入93％乙醇約1000ml(占基量的10％)制成軟材，濕法制粒后，于75～80℃下烘干，隨后進行整粒，加入硬脂酸鎂進行最后混合、壓片，片劑進行薄膜包衣，即得成品片劑2000片。
實施例2兒茶素對HEp-2細胞和MDCK細胞的毒性作用在96孔板上，每孔加入0.1ml、2×105濃度的HEp-2和MDCK細胞，24h待細胞長成單層后，加入不同濃度的含藥維持液繼續(xù)培養(yǎng)。每天于倒置顯微鏡下觀察細胞變化，72h后，MTT法檢測細胞存活率。每一藥物濃度均重復4孔。同時設正常細胞對照。每次實驗重復3次。
細胞存活率(％)＝(實驗組平均A值/細胞對照組平均A值)×100％。用統(tǒng)計軟件SPSS11.5進行數(shù)據(jù)分析并計算藥物的半數(shù)細胞毒性濃度(CC50)。
藥物對兩種細胞的毒性作用均表現(xiàn)為細胞折光性增加，變圓，破碎，脫落，并且吸光值下降。藥物對細胞的毒性作用在一定范圍內隨著藥物濃度的增加，細胞存活率降低，結果見表1。
表1EGCG、ECG對HEp-2細胞和MDCK細胞的毒性作用
表1實驗結果顯示，EGCG和ECG在32μg/mL范圍內未見明顯的細胞毒性，從而確定該藥物濃度為抗MDCK細胞和HEp-2細胞敏感病毒實驗的最高允許濃度。
實施例3兒茶素體外抗禽流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒的藥效學研究擬定從以下3種方式檢測兒茶素對禽流感病毒H5N1、RSV Long株、CVB3和AdV-7的抑制作用。I組(藥物對病毒感染的預防作用)用不同濃度的藥物預先處理單層細胞24h，PBS洗滌2次后以100TCID50/0.1mL的病毒每孔0.1ml攻擊，吸附1h，棄病毒液，PBS洗滌2次，加細胞維持液培養(yǎng)，每天于倒置顯微鏡下觀察細胞變化；待病毒對照孔CPE達80％以上且細胞對照正常時，用MTT法檢測細胞存活率，每一藥物濃度均重復4孔，同時設正常細胞對照和病毒對照。以Probit回歸方法計算藥物半數(shù)有效濃度(IC50)。II組(藥物對病毒的直接殺傷作用)將不同濃度的藥物與100TCID50.(0.1ml)-1的病毒液等量混合作用2h，再將其感染單層細胞，吸附1h后，棄上清，PBS洗滌2次，加入細胞維持液同上法繼續(xù)培養(yǎng)和檢查。III組(藥物對病毒穿入細胞后的抑制作用)先用100TCID50.(0.1ml)-1的病毒每孔0.1ml感染細胞，吸附1h后，吸去病毒，加入不同濃度的含藥維持液，繼續(xù)培養(yǎng)和檢查。
采用治療指數(shù)(treatment index，TI)作為評價指標，衡量藥物對Flu-A、RSV、CVB3和AdV-7的抑制效力，TI＝CC50/IC50。
研究結果表明，EGCG和ECG具有很強的抑制禽流感病毒的活性，其作用方式是多途徑的，不僅能很好地預防Flu-A感染MDCK細胞(TI＝12.6)，直接殺傷病毒(TI＝7.1)，還對Flu-A穿入細胞后具有抑制作用(TI＝12.1)，結果見表2。其中預防Flu-A感染細胞和對病毒穿入細胞后的抑制作用較強，表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，MDCK細胞形態(tài)皺縮，變長，折光性增強，胞核圓縮和破裂等典型CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。且EGCG作用強于ECG.。
如表2所示，EGCG和ECG具有很強的抗RSV的活性，其作用方式是多途徑的，其中直接殺傷病毒和對RSV穿入細胞后的抑制作用較強，表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，RSV所致CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。且EGCG作用強于ECG.。
EGCG和ECG具有體外直接滅活CVB3的作用，實驗結果顯示隨著藥物濃度的增加，細胞皺縮、變圓、脫落等典型CPE逐漸減弱，而培養(yǎng)上清中CVB3病毒滴度降低，病毒抑制率則明顯增高。
體外藥效學實驗結果顯示EGCG和ECG具有很強的抗AdV-7的活性，其作用方式是多途徑的，不僅能很好地預防AdV-7感染HEp-2細胞(TI＝5.8)，直接殺傷病毒(TI＝17.0)，還對AdV-7穿入細胞后具有抑制作用(TI＝12.1)。其中直接滅活病毒和對AdV-7穿入細胞后的抑制作用較強，表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，HEp-2細胞形態(tài)腫脹變圓，折光度增強等典型CPE逐漸減弱，病毒抑制率明顯升高。且EGCG作用強于ECG.。EGCG能抑制AdV-7病毒蛋白的合成，作用于AdV-7感染晚期的一個或多個環(huán)節(jié)。病毒感染后8～16小時給藥，8μg/mlEGCG能顯著降低培養(yǎng)液中感染性AdV-7病毒滴度。
表2EGCG、ECG體外抗FLU-A、RSV、CVB3和AdV-7的藥效學結果
實施例4兒茶素體內抗禽流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒的實驗研究每種病毒以如下兩種方式進行EGCG體內抗病毒實驗研究40只雌性BALB/c小鼠(17-19g)隨機分成4組①正常動物對照組，灌服生理鹽水；②病毒感染模型組，灌服生理鹽水；③兒茶素高劑量治療組(0.1g·kg-1·d-1)；④兒茶素低劑量治療組(0.05g·kg-1·d-1)。
小鼠經(jīng)乙醚麻醉，以15LD50病毒液滴鼻感染，每只0.05mL，正常動物對照組用生理鹽水代替病毒液滴鼻感染。感染后2h開始灌胃給藥，每天灌胃給藥1次，每次0.1mL，連續(xù)給藥5d。最后一次給藥后小鼠禁食8h，稱重，摘除眼球放血脫頸椎處死動物，打開胸腔摘取全肺，生理鹽水洗滌2次，稱重，逐個計算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。將小鼠部分肺臟組織放入10％福爾馬林液中固定，按常規(guī)方法組織切片(HE染色)，觀察小鼠肺組織的病理變化。取各組肺組織置勻漿器中加生理鹽水(肺重(g)/生理鹽水(mL)＝1/9)，在冰浴中研磨制成勻漿，反復凍融兩次釋放病毒，離心后取上清按常規(guī)方法進行病毒滴定。
肺指數(shù)＝小鼠肺重/小鼠體重×100％肺指數(shù)抑制率＝(病毒對照組肺指數(shù)一給藥組肺指數(shù))/病毒對照組肺指數(shù)×100％40只雌性BALB/c小鼠(17-19g)隨機分成4組，分組同上，小鼠經(jīng)乙醚麻醉，以20LD50病毒液滴鼻感染，每只0.05mL，正常動物對照組用生理鹽水代替病毒液滴鼻感染。感染后2h開始灌胃給藥，每天灌胃給藥1次，每次0.1mL，連續(xù)給藥5d。觀察動物感染后的發(fā)病癥狀，連續(xù)觀察21天，記錄各組動物的死亡數(shù)和存活天數(shù)。
體內實驗結果顯示EGCG 0.05g·kg-1·d-1、0.1g·kg-1·d-1連續(xù)灌胃給藥5d，能減輕禽流感病毒感染小鼠肺組織病變程度，顯著降低肺炎小鼠的肺指數(shù)和肺內流感病毒滴度(與病毒對照組相比P＜0.05)；結果見表3。與病毒對照組相比0.1g·kg-1·d-1EGCG治療組小鼠死亡率明顯下降，平均存活時間(MDD)顯著延長，結果見表4。
EGCG 0.05g·kg-1·d-1、0.1g·kg-1·d-1連續(xù)灌胃給藥5d，能延長RSV、CVB3和AdV-7感染小鼠的MDD，降低小鼠死亡率(與病毒對照組相比P＜0.05)，結果見表4。
本研究證明兒茶素具有很好的體內抗流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒的作用。
表3 EGCG對FLU-A、RSV、CVB、AdV-7感染小鼠肺指數(shù)的影響
*p＜0.05，給藥組與病毒對照組比較；**p＜0.01，給藥組與病毒對照組比較表4EGCG對FLU-A、RSV、CVB、AdV-7感染小鼠死亡率的影響
aMean day to death of mice dying prior to day 21.
*p＜0.05，給藥組與病毒對照組比較；**p＜0.01，給藥組與病毒對照組比較實施例5兒茶素治療流行性感冒的臨床研究采用隨機、雙盲和安慰劑對照的臨床實驗設計。受試對象為年齡≥18歲，≤65歲；發(fā)熱≥37.8℃；符合流感疑似病例診斷標準；出現(xiàn)癥狀后不超過36h，共入組162人。合格的受試者隨機接受兒茶素膠囊治療或安慰劑治療，300mg/次，2次/d，歷時5d。實驗結果顯示按照規(guī)定服用藥物并完成所有隨訪且實驗室檢查證明為呼吸道病毒感染的病例，實驗組為51例，對照組為46例。兩組疾病緩解率經(jīng)生存分析Logrank檢驗，試驗組緩解率高于對照組。試驗組疾病持續(xù)時間中位數(shù)為76h，對照組疾病持續(xù)時間中位數(shù)為98h，兩組比較差異有顯著性(P＜0.01)。試驗組癥狀總分下降值的曲線下面積中位數(shù)為758，對照組中位數(shù)為632，兩組經(jīng)Wilcoxon檢驗差異有顯著性(P＜0.01)。所有受試對象未出現(xiàn)明顯的可能與研究藥物有關的不良反應。實驗結果表明兒茶素在流感發(fā)病后早期使用可以縮短疾病的持續(xù)時間，減輕癥狀的嚴重程度，對呼吸道病毒感染引起的支氣管炎、肺炎也有很好的治療作用，而且安全性和耐受性好，適合在臨床推廣使用。
權利要求
1.兒茶素在制備治療或預防呼吸道病毒感染的藥物中的應用。
2.兒茶素在制備治療或預防禽流感病毒感染的藥物中的應用。
3.兒茶素在制備治療或預防呼吸道合胞病毒感染的藥物中的應用。
4.兒茶素在制備治療或預防科薩奇病毒感染的藥物中的應用。
5.兒茶素在制備治療或預防腺病毒感染的藥物中的應用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種植物提取物兒茶素在制藥中的用途，以綠茶提取物為原料，經(jīng)有機溶劑萃取，去除咖啡因等雜質，再用HPLC分離得到兒茶素，具體講是表沒食子兒茶素沒食子酸酯或表兒茶素沒食子酸酯，及其混合物為功效成分的制劑在制備治療或預防禽流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒幾種常見呼吸道病毒感染的藥物中的應用。
文檔編號A61P31/00GK1994294SQ200610166569
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月30日
發(fā)明者楊占秋, 石麗橋 申請人:武漢大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan