專利名稱：:免疫刺激單克隆抗體的制作方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來說屬于免疫治療領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及治療各種適應(yīng)癥如治療癌癥中所使用的單克隆抗體?，F(xiàn)有技術(shù)下面列出的是作為現(xiàn)有技術(shù)的參考文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)與后面說明書所描述的內(nèi)容相關(guān)1.Clark，E.A.，和Ledbetter，J.A.，興奮性抗體對免疫反應(yīng)的放大作用，Imunol.，Today，7267-270，1986.2.Meuer，S.C.，Huspey，R.E.，Cantrell，D.A.，Hodgdon，J.C.，Schlornman，F(xiàn).，Smith，K.A.和Reinberg，E.L.，觸發(fā)T3-T1抗原-受體復(fù)合物導(dǎo)致T細(xì)胞克隆通過白細(xì)胞介素2依賴型自分泌途徑擴(kuò)增，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，311509-1513，1984.3.VanWauve，J.P.，DeMey，J.R.，和Gooser，J.G.，OKT3一種單克隆抗人T淋巴細(xì)胞抗體及強(qiáng)促有絲分裂特性，J.Immunol.，1242708-2713，1980.4.Jung，G.，Martin，D.E.，和Muller-Eberhard，J.H.，單克隆抗體OKT3誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，J.Immunol.139639-644，1987.5.VanLier，R.，Blocmena，E.，Brouwer，M.，VanHeijm，J.，Weinreich，S.，和Aarden，L.，抗CD2抗原I和II區(qū)的單克隆抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的單核細(xì)胞依賴性的研究，Immunology，67333-338，1989.6.Ellenhorn，J.D.，Hirsch，R.，Schreiber，H.，和Bluestone，J.A.，一種抗CD3抗體的體內(nèi)施用抑制惡性腫瘤的生長，Science(WashingtonDC)，242569-571，1988.7.Gallinger，S.，Hoskins，D.W.，Mullen.J.B.M.，Wong，A.H.C.，和Roder，J.C.，細(xì)胞免疫治療和抗CD3抗體在C57BL/6小鼠MCA-38-LD實驗性肝遷移治療中的對比，CancerRes.，502476-2480，1990.8.Ledbetter，J.A.，Martin，P.J.，Spooner，C.E.，Wofsy，D.，Tsu，T.T.，Beatty，P.G.，和Gladstone，P.，抗Tp67和Tp44抗體強(qiáng)化并維持依活化T細(xì)胞的增殖，J.Immunol.，1352331-2336，1985.9.Moretta，A.，Goggi，A.，Pende，D.，Tripodi，G.，Orengo.，A.，Pella，N.，Augugliao，R.，Bottino，C.，Ciccone，E.，和Moretta，I.，CD69介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞激活途徑抗CD69單克隆抗體觸發(fā)除表達(dá)T細(xì)胞α/β受體的溶細(xì)胞性的T淋巴細(xì)胞外的淋巴效應(yīng)細(xì)胞的活性，J.Exp.Med.，1741393-1398，1991.10.VanLier，R.A.，Brouwer，M.，和Aarden，L.A.，T細(xì)胞活化所涉及的信號。通過抗CD28和抗CD2單克隆抗體的協(xié)同作用誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，Eur.J.Immunol.13167-172，1988.11.Jenkins，M.K.，Taylor，P.S.，Norton，S.D.，和Urdahl，K.B.，CD28釋放與人T細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性IL-2相關(guān)的共刺激信號，J.Immunol.，1472461-2466，1991.12.Townsend，S.E.和Allison，J.P.，用B7轉(zhuǎn)染的黑素瘤細(xì)胞直接共刺激CD8+T細(xì)胞之后的腫瘤排斥反應(yīng)，Science(WashingtonDC)，259368-370，1993.13.Hardy，B.，Dotan，D.，和Novogrodsky，A.，一種人B淋巴母細(xì)胞的單克隆抗體激活人和鼠的T淋巴細(xì)胞，CellImmunol.，11822-29，1989.這里引用的上述任一篇參考文獻(xiàn)，是為了使讀者獲知現(xiàn)有技術(shù)的內(nèi)容。但這種引用從任何意義上都不應(yīng)被認(rèn)為這些參考文獻(xiàn)與后述權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的專利性主題有關(guān)。通過標(biāo)明上面列舉的參考文獻(xiàn)的序號引用這些參考文獻(xiàn)。發(fā)明背景各種形式的癌癥是引起人類死亡的一個主要原因。在美國有1/3的人患有癌癥，20％的人死于癌癥(1988年有494,000人)。最廣泛應(yīng)用的治療癌癥的方法有外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法。近年來，提出另一種治療方法，其以使用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(BRM)為基礎(chǔ)。所用的BRM主要包括細(xì)胞因子(例如白細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素-α(INF-α))、激活的單核細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞活素激活的殺傷細(xì)胞(LAK))和抗體。這些BRM既直接作用于腫瘤也通過增強(qiáng)非特異性或特異性免疫機(jī)制和細(xì)胞毒性機(jī)制間接作用于腫瘤。迄今為止，使用BRM沒有獲得臨床方面的實質(zhì)成功，這主要是因為BRM具有毒性和副作用。也曾提出使用抗腫瘤癌的活化免疫接種，但發(fā)現(xiàn)沒有什么效果。并且，對癌癥診斷和治療中使用的幾種單克隆抗體(mAb)進(jìn)行評估但仍沒有一種單克隆抗體在癌癥病人的標(biāo)準(zhǔn)治療程序中被證明是有效的。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能與T細(xì)胞表面決定簇結(jié)合的各種mAb能誘發(fā)這些細(xì)胞的增殖、活化或分化(1)。人們已經(jīng)證明，抗T細(xì)胞上CD3/TCR復(fù)合物的mAb的結(jié)合(2-4)，抗T細(xì)胞上CD2(5)受體抗原的mAb的結(jié)合，以及上述這兩種抗體同時與T細(xì)胞的結(jié)合會T使細(xì)胞增殖、IL-2受體得到表達(dá)，以及在T細(xì)胞中產(chǎn)生IL-2，由此增強(qiáng)這些細(xì)胞中的溶細(xì)胞過程。抗CD3mAb表明能在動物模型(6-7)中體內(nèi)引發(fā)抗腫瘤活性。人們還報道了定向抗T-淋巴細(xì)胞抗原的各種其它mAb，這些單抗在與細(xì)胞結(jié)合后，會使細(xì)胞活化。這種單抗的例子有定向抗CD5(8)的mAb，定向抗CD69(9)的mAb和定向抗CD28(10，11)的mAb。據(jù)報道，抗CD28mAb能減小鼠黑素瘤的生長速度，但并不能成功地從鼠體內(nèi)徹底消除腫瘤(12)。一種稱為“Daudi”的定向抗人B淋巴母細(xì)胞系的單克隆抗體表明刺激鼠淋巴和人外周T細(xì)胞(13)。發(fā)明概述首先，本發(fā)明提供了一種單克隆免疫刺激抗體，該抗體與B淋巴母細(xì)胞結(jié)合，誘發(fā)外周血淋巴細(xì)胞的增殖和活化，該單克隆抗體的特征在于當(dāng)被注射入長有腫瘤的動物體時，能引發(fā)抗腫瘤效果。抗腫瘤效果是一種生物效果，通過腫瘤體積縮小、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少、壽命延長或各種與癌癥相關(guān)的生理癥狀的改善來體現(xiàn)這種效果。也可通過mAb在腫瘤首發(fā)位置抑制腫瘤發(fā)生的能力來體現(xiàn)抗腫瘤效果。本發(fā)明單克隆抗體由于具有這些性質(zhì)，能用于癌癥的治療以及癌癥的預(yù)防中。首先用免疫原免疫動物，免疫原是B淋巴母細(xì)胞、裂解的B淋巴母細(xì)胞或其膜制備物。免疫接種并在免疫動物體內(nèi)形成免疫反應(yīng)后，從該動物體中提取出B淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞系并篩選出具有可以與免疫原結(jié)合的分泌抗體的細(xì)胞系。然后從所選的mAb中再進(jìn)一步篩選出能誘發(fā)外周血細(xì)胞增殖和活化的單克隆抗體。為獲得本發(fā)明的mAb，對上述篩選出的抗體再進(jìn)一步進(jìn)行篩選，以使所選抗體能夠達(dá)到抗腫瘤的效果。為篩選這種抗體，通?？墒褂冒┌Y動物模型。有時也可以在各種體外模型中檢測抗癌效果。例如，這種模型可以是實驗室中任意一種已被誘發(fā)癌癥的動物。特定相關(guān)地，特別選擇鼠作為人類治療應(yīng)用的模型，其可以誘發(fā)出人源腫瘤。后一種類型的動物模型例子有免疫損害鼠，如SCID鼠或裸鼠，這些鼠注射了或植入了來自癌癥病人的腫瘤細(xì)胞或組織。篩選時，通過與對照動物(沒有以mAb處理的或以不相關(guān)的mAb處理的類似的長有腫瘤的動物)相比較，來確定本發(fā)明mAb減小腫瘤體積、延長存活時間等能力。篩選也可包括在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ椭袡z測本發(fā)明mAb預(yù)防癌癥發(fā)生的能力。例如，對具有癌癥易發(fā)基因的動物可注射本發(fā)明mAb，然后將這種用mAb處理的組與用別的方法處理且同樣地飼養(yǎng)的對照組進(jìn)行比較，比較腫瘤發(fā)生率和動物存活率。不使用具有腫瘤易發(fā)基因的動物，可在各種以mAb處理的其它動物被實驗性地給予動物惡性腫瘤細(xì)胞之前檢測本發(fā)明mAb抑制癌癥的能力。為達(dá)到這種抗腫瘤效果，須給予實驗對象有效量的本發(fā)明mAb。術(shù)語“有效量”應(yīng)被理解為為達(dá)到治療效果所需要的mAb的量。這種達(dá)到最終治療結(jié)果所需的有效量取決于多種因素，包括例如腫瘤的類型、病人病癥的嚴(yán)重程度(即癌癥狀態(tài))以及該mAb是否與另一種試劑一同施用，該試劑以加和方式或協(xié)同方式(注意這種共同施用，如下所述)與該mAb共同起作用。可通過各種實質(zhì)上眾所周知的方法獲得分泌本發(fā)明mAb的無限增殖細(xì)胞系，如通過與無限增殖細(xì)胞系融合產(chǎn)生雜交瘤；通過EBV轉(zhuǎn)化；通過基因工程化細(xì)胞系，如CHO細(xì)胞系這樣的能以各種已知的方法獲得的細(xì)胞系來實現(xiàn)。總之，今天獲得無限增殖單克隆抗體分泌細(xì)胞系的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)技術(shù)，這里不再進(jìn)行描述。通常，當(dāng)mAb是用于治療人類疾病時，免疫原應(yīng)是來源于人的。然而，時常存在種間交叉反應(yīng)性，有時也可能使用非人源的免疫原，如來源于靈長類的免疫原進(jìn)行免疫接種后獲得mAb，用于治療人類疾病。本發(fā)明抗體應(yīng)理解為包括單克隆抗體，可以是IgG或IgM抗體、可以是該抗體的Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈抗體等等。此外，來自非人源如來自鼠的抗體可以通過各種基因工程手段進(jìn)行“人源化”(“人源化”抗體是一種抗體，其中主要部分被人源部分取代)。本發(fā)明的抗體可用于多種適應(yīng)癥的治療中，本發(fā)明優(yōu)選實施方案可用于癌癥治療。我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明單克隆抗體在減少各種腫瘤的致瘤性方面是有活性的。本發(fā)明典型的雜交瘤細(xì)胞系保藏于微生物培養(yǎng)物國家保藏中心(CollcctionNationalcdeCulturesdeMicroorganismes(CNCM))，InstitutePasteur，25，RucduDocteurRour，75724，巴黎，Ledex15，保藏號為No.I-1397，保藏時間為1994年1月28日。這里有時將此細(xì)胞系的細(xì)胞表示為“BAT-1細(xì)胞”，有時將相應(yīng)的單克隆抗體表示為“BAT-1mAb”。使用具有BAT-1mAb特性的單克隆抗體，特別是BAT-1mAb本身是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。根據(jù)其與Daudi人B淋巴母細(xì)胞系細(xì)胞的結(jié)合來篩選本發(fā)明BAT-1單克隆抗體。我們發(fā)現(xiàn)BAT-1mAb與一種蛋白物質(zhì)(以下稱“BAT-1結(jié)合蛋白”)結(jié)合，該蛋白質(zhì)的表觀分子量由SDS-PAGE測定為48-50K道爾頓。本發(fā)明的另一方面是BAT-1結(jié)合蛋白?？赏ㄟ^各種已知方法使用本發(fā)明mAb分離BAT-1結(jié)合蛋白。BAT-1結(jié)合蛋白可用于動物的免疫接種，從該動物中可得到本發(fā)明mAb。本發(fā)明也可提供一種藥物組合物，組合物中包含有效量的作為活性成分的本發(fā)明mAb和生理上可接受的載體。本發(fā)明另一方面是一種治療疾病的方法，特別是癌癥的治療方法，包括給需要治療的病人施用有效量的本發(fā)明mAb。通常以非腸道形式如靜脈內(nèi)(i.v)、腹膜內(nèi)(i.p.)或肌內(nèi)(i.m.)形式施用mAb。用于施用的載體可以是任意一種已知的載體，如鹽水溶液或任何其它合適的生理溶液。如上所述，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明mAb在減少各種腫瘤的致瘤性方面是有活性的。本發(fā)明mAb在減少致瘤性中的功效與其誘發(fā)淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒活性的能力相關(guān)。為增強(qiáng)這種細(xì)胞毒活性，有時將本發(fā)明mAb與其它試劑一同施用是有利的，所述其它試劑能以加和方式或協(xié)同方式與mAb一同起作用。例子包括各種細(xì)胞因子如IL-1(白細(xì)胞介素-1)、IL-2、IL-6和IFN-α(干擾素-α)。本發(fā)明mAb可用于多種非癌癥疾病的治療中，其中mAb對免疫系統(tǒng)細(xì)胞毒活性的激活作用或其它作用可能在如HIV感染(引起獲得性免疫缺損-AIDS的病毒)早期，在各種自動免疫失調(diào)中，或在一些遺傳性或獲得性免疫缺損的情況中具有治療效果。在癌癥治療中，可在檢測出初級或二級腫瘤之后對病人施用抗體，或者對患癌高危性人如放射環(huán)境中工作的人或具有遺傳傾向的人進(jìn)行預(yù)防治療時施用抗體。相似地，對于AIDS病人，可對受感染個體在還未產(chǎn)生任何疾病癥狀時或?qū)μ幱贖IV感染過程早期的個體施用mAb。下面將由各實施例通過描述證明抗癌治療活性的實驗來說明本發(fā)明。但應(yīng)認(rèn)為這些實施例僅用于說明目的而不起限制作用。附圖的簡要描述圖1表明BAT單克隆抗體(mAb)與人純化T-淋巴細(xì)胞結(jié)合的流動細(xì)胞計數(shù)分析結(jié)果。用第二種攜帶有熒光標(biāo)記的抗體，F(xiàn)ITC-山羊抗鼠抗體，評估BAT抗體的結(jié)合。圖1a-沒有BAT抗體時背景讀數(shù)；圖1b-抗CD3抗體；圖1c-BAT-1；圖1d-BAT-5；圖1e-BAT-2；圖1f-BAT-4。圖2表明了人外周血單核細(xì)胞(PBM)(左板)和JurkatT細(xì)胞(右板)流動細(xì)胞計數(shù)分析結(jié)果，其中細(xì)胞以BATmAb或抗CD3mAb這種初級抗體和第二種偶聯(lián)FITC的抗鼠IgG抗體進(jìn)行雙重標(biāo)記。圖2A-未經(jīng)門控的細(xì)胞；圖2A(a)-以BATmAb處理的PBM細(xì)胞；圖2A(b)-以抗CD3mAb處理的PBM細(xì)胞；圖2A(c)-以BATmAb處理的JurkatT細(xì)胞；圖2A(d)-以抗CD3處理的Jurkat細(xì)胞；圖2B-經(jīng)門控的細(xì)胞；圖2B(a)-進(jìn)入小細(xì)胞(R1)和大細(xì)胞(R2)的PBM細(xì)胞；圖2B(b)-以BATmAb處理的(R1)細(xì)胞；圖2B(c)-以抗CD3處理的(R1)細(xì)胞；圖2B(d)-以抗BATmAb處理的(R2)細(xì)胞；圖2B(e)-以抗CD3處理的(R2)細(xì)胞。圖3表明了流動細(xì)胞計數(shù)分析結(jié)果，顯示了在以偶聯(lián)FITC的BATMAB和偶聯(lián)PE的抗CD3進(jìn)行雙重標(biāo)記的人PBM上BAT結(jié)合蛋白和CD3的表面表達(dá)。圖3A-未經(jīng)門控的細(xì)胞圖3A(a)-用作陰性對照的Becton-DicklhsonSimliltest對照圖3A(b)-單純的PE-抗-CD3；圖3A(c)-單純的FITC-BATmAb；圖3A(d)-以FITC-BATmAb和PE-抗CD3抗體進(jìn)行雙重標(biāo)記；圖3B-經(jīng)門控的細(xì)胞圖3B(a)-進(jìn)入小細(xì)胞(R1)和大細(xì)胞(R2)的PBM細(xì)胞圖3B(b)-以FITC-BATmAb和PE-抗CD3雙重標(biāo)記的(R1)細(xì)胞；圖3B(c)-以FITC-BATmAb和PE-抗CD3雙重標(biāo)記的(R2)細(xì)胞；圖4為BAT-1抗體與Daudi細(xì)胞不同溶胞產(chǎn)物結(jié)合的Western印跡分析結(jié)果。圖4(1)-Daudi細(xì)胞(未處理的)的溶胞產(chǎn)物；圖4(2)-以神經(jīng)氨酸苷酶(0.2u/ml)處理的溶胞產(chǎn)物；圖4(3)-以神經(jīng)氨酸苷酶(0.4u/ml)處理的溶胞產(chǎn)物。圖5曲線表示摻入(3H)胸腺嘧啶核苷的細(xì)胞隨一系列BATmAb濃度增加培養(yǎng)6天的結(jié)果，BATmAb為BAT-1(-▲-)，BAT-2(-×-)，BAT-3(-●-)，BAT-5(-★-)，BAT-6(-◆-)，BAT-7(-■-)。圖6曲線所示實驗是在與2.5mg/mlBATmAb一起培養(yǎng)不同培養(yǎng)時間的PBM中測試的細(xì)胞毒活性的誘導(dǎo)作用。HT-29(左)或RC29(右)細(xì)胞用作靶細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比率為20∶1。對照(-○-)，BAT-1(-●-)，BAT-2(-×-)，BAT-3(-▲-)。圖7顯示了以B-16黑素瘤細(xì)胞接種的C57BL鼠的肺上排顯示的是僅以細(xì)胞接種，接種24天后的鼠肺；下排顯示的是如上述以B-16細(xì)胞接種，14天后以10μgfBAT-1mAb靜脈注射，接種24天后的鼠肺。圖8曲線是對圖7所示各項實驗的總結(jié)，顯示出用腫瘤細(xì)胞B-16黑素瘤細(xì)胞、3LLLewis肺癌細(xì)胞或MCA105纖維肉瘤細(xì)胞接種的鼠在接種后一個月肺中轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目。這一結(jié)果對用每種腫瘤所做的3-4次實驗進(jìn)行了概括總結(jié)。接種腫瘤后兩周，未用BAT-1處理的鼠(-)，用BAT-1(10μg/只)處理的鼠(+)。轉(zhuǎn)移瘤(●)；沒有轉(zhuǎn)移瘤(○)。圖9表示以3LLLewis肺癌細(xì)胞接種的鼠肺。與圖7相似；上排是僅以腫瘤細(xì)胞接種的肺；下排是接種14天后用10μgBAT-1mAb靜脈內(nèi)注射的鼠肺。圖10所示實驗與圖9相似，其中腫瘤細(xì)胞為MCA105纖維肉瘤細(xì)胞。材料和方法單克隆抗體的制備用Daudi細(xì)胞的膜制劑免疫BALB/c鼠。用甘油灌注-低滲沖法(Jett，M.，Seed，T.M.，和Jamieson，G.A.，J.Biol.Chem.，2522134，(1977))制備Daudi細(xì)胞膜。50-80×106個細(xì)胞懸浮于PBS中并于37℃溫育，逐漸用30％甘油灌注。冰上溫育5分鐘后，將其離心并重新懸浮于冷的Tris溶胞緩沖液中(含10mMTris-HCl，1mMMgCl2，1mMCaCl2，pH7.4)，4℃時混合5分鐘，700g離心。分離出上清液并在3300g(10分鐘，4℃)離心。將沉淀物再次洗滌，將含細(xì)胞膜部分的兩種上清液合并。用260μl完全弗氏佐劑乳化260μl的細(xì)胞膜制劑(3mg/ml)，并腹膜內(nèi)注射入BALB/c鼠。三周后，取出鼠脾臟，脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系NS-0以10∶1比例融合。根據(jù)Kohler和Milstein(Kohler，G.，和Milstein，C.，Nature，(London)256495，(1975)的方法，使用聚乙二醇進(jìn)行融合，并將雜交瘤生長于選擇性培養(yǎng)基中。細(xì)胞結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)從生長的雜交瘤中篩選與Daudi細(xì)胞結(jié)合的上清液(Glassy，M.C.和Surh，C.D.，J.Immunol.Method，81115(1985))。使用〔3H〕胸腺嘧啶核苷攝入分析，根據(jù)雜交瘤上清液誘導(dǎo)人PBM增殖的能力進(jìn)一步篩選陽性雜交瘤上清液。用有限稀釋法對陽性克隆進(jìn)行亞克隆、重復(fù)測試、擴(kuò)大培養(yǎng)成培養(yǎng)物。用50％硫酸銨沉淀，隨后進(jìn)一步在PBS中透析從培養(yǎng)基中純化的mAb。通過結(jié)合有抗鼠抗體的Sepharose(瑞典Pharmacia公司的一個商標(biāo))柱親和層析完成進(jìn)一步純化。培養(yǎng)基所有細(xì)胞均懸浮于補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)、丙酮酸鈉(1.1mg/ml)、L-谷氨酰胺(0.3mg/ml)和抗生素(青霉素200u/ml和鏈霉素10μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中，并于5％CO2濕度培養(yǎng)箱中溫育。所用IL-2單位為Cetus(1單位Cetus相當(dāng)于3個國際單位)。細(xì)胞制備通過ficoll-hypaque密度離心(Histopaque，Sigma公司的一個商標(biāo)，Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州，美國)從健康成年人獲取人外周血單核細(xì)胞(PBM)，用Sephadex(瑞典Pharmacia公司的一個商標(biāo))G10柱除盡PBM中的單核白細(xì)胞。通過SRBC玫瑰花結(jié)法分離T細(xì)胞。通過免疫磁性技術(shù)除盡CD3陽性細(xì)胞和Leu19陽性細(xì)胞。用PBS清洗PBM培養(yǎng)物或?qū)φ諛悠啡危渲蠵BM與BATmAb共同溫育了5-6天。未與CD3或Leu19(CD56)偶聯(lián)的抗體被加入到完全RPMI培養(yǎng)基中的細(xì)胞中，并于4℃溫育1小時，加入包被抗鼠抗體的磁珠30分鐘。利用磁性除去吸附于珠上的細(xì)胞，對未吸附的細(xì)胞分析其細(xì)胞毒性并以流動細(xì)胞計數(shù)染色。細(xì)胞毒性分析測定細(xì)胞毒性測定方法如下2-4×106個靶細(xì)胞與200μCi的51Cr-鉻酸鹽在無血清培養(yǎng)基中混合1小時。細(xì)胞用完全培養(yǎng)基洗滌3次，并最終重新懸浮于RPMI-10％FCS中，以每孔104個細(xì)胞置于培養(yǎng)板上。培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞，從正常的外周血中制備的淋巴細(xì)胞與不同mAb、同族型對照IgG或IL-2共同溫育不同時間。在測定之前，將細(xì)胞在RPMI培養(yǎng)基中洗滌三次，用1％臺盼藍(lán)對細(xì)胞活性染色，在圓底微量滴定板中以各種效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞比例將細(xì)胞與靶細(xì)胞混合，并于5％CO2中37℃溫育3小時15分。收集培養(yǎng)物上清液并在β-閃爍計數(shù)儀上計數(shù)。通過靶細(xì)胞與Triton(Sigma公司的一個商標(biāo)，Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州，美國)x-100共同溫育而達(dá)到最大同位素釋放量(MR)。通過將靶細(xì)胞單獨與培養(yǎng)基一起溫育測定自發(fā)釋放量(SR)。通過(ER-SR/MR-SR)×100計算細(xì)胞溶解的百分?jǐn)?shù)，其中ER是實驗測得的效應(yīng)細(xì)胞釋放量。人淋巴細(xì)胞亞群中細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)作用在BATmAb存在情況下培養(yǎng)PBM細(xì)胞(4×106個/ml)6天。然后將細(xì)胞洗3次，并使用包被有抗鼠f(ab’)2的磁珠除盡CD3和Leul9細(xì)胞，測試抗K562和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞毒性。流動細(xì)胞計數(shù)使用FACS440(Becton-Dickinson)通過流動細(xì)胞計數(shù)法檢測細(xì)胞表面抗原。每次測定使用106個細(xì)胞，通過與所生產(chǎn)的最適濃度的針對于人CD3、IL-2受體的鼠mAb或mAbBAT1-9連續(xù)溫育對細(xì)胞進(jìn)行染色。在這種間接染色過程中使用與FITC偶聯(lián)的山羊抗鼠F(ab’)2作為第二種抗體。每次溫育均在pH7.4含1％BSA和5％疊氮鈉的PBS中4℃時進(jìn)行30分鐘，隨后用同樣的緩沖液洗滌3次。測定104個染色細(xì)胞。BATmAb結(jié)合決定簇的檢測使用Western印跡法進(jìn)行DaudiB淋巴母細(xì)胞溶解產(chǎn)物上BATmAb結(jié)合決定簇的檢測。簡而言之，懸浮于PBS中的50×106細(xì)胞/ml以30％甘油逐漸灌注，通過連續(xù)離心分離出細(xì)胞膜。用SDS-PAGE(12％)分離細(xì)胞膜制備樣品，然后將細(xì)胞膜樣品轉(zhuǎn)移至浸泡于含1％低脂奶的PBS中的硝酸纖維素印跡膜上。室溫下將該印跡膜與BATmAb一起溫育2小時，然后再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗體70抗鼠IgG(Fab’)2一起溫育30分鐘，來檢測硝酸纖維素印跡上的BATmAb結(jié)合蛋白。然后浸洗細(xì)胞并以鄰聯(lián)茴香胺底物進(jìn)行檢測。鼠腫瘤模型使用了三種鼠腫瘤模型B16黑素瘤、Lewis肺癌(3LL)和甲膽蒽誘發(fā)的纖維肉瘤(MCA105)。向C57BL鼠(8周齡)靜脈注射50-200×106個細(xì)胞。兩周后，靜脈注射BAT-1，注射量為1-10μg/只，10天后將鼠殺死并計數(shù)所生長的肺轉(zhuǎn)移瘤。實施例實施例1a.結(jié)合特性對由B淋巴母細(xì)胞免疫接種得到的稱為BAT1-9的9個單克隆抗體(mAb)進(jìn)行篩選，首先與Daudi細(xì)胞結(jié)合，然后誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞增殖。通過ELISA和Ochterlony分析確定BATmAb的同族型。人們發(fā)現(xiàn)BAT1、2、3、6、7和9為IgG1類而BAT4和5為IgM類，BAT8為IgG2a。使用間接免疫熒光染色通過FACS分析法來分析上述mAb與純化的人外周T細(xì)胞的結(jié)合。圖1顯示了這一實驗的FACS分析結(jié)果。正如所看到的，BATmAb與外周血CD3+T細(xì)胞結(jié)合，結(jié)合程度各不相同，BAT-2為44％，BAT-5為38％，BAT-1為32％，BAT-4結(jié)合程度有些弱(13％)。來自同一供血者的純化外周血B淋巴細(xì)胞不與這些mAb結(jié)合(數(shù)據(jù)未示出)。b.BAT-1與人淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)合正如圖2所示，進(jìn)一步的FACS分析表明，BAT-1與帶CD3+的人PBM結(jié)合，還與JurkatT-細(xì)胞系的細(xì)胞結(jié)合。使用雙重標(biāo)記細(xì)胞的FACS分析法(圖3)更進(jìn)一步證實了BAT-1與帶CD3+的PBM細(xì)胞的結(jié)合。如下表1所示，BAT-1除與帶有CD3的細(xì)胞結(jié)合外，還與Leu19/NK細(xì)胞結(jié)合。表1BAT-1mAb與人淋巴樣亞群的結(jié)合使用ELISA鑒定結(jié)合情況，表示如下+(0.1-0.2OD)++(0.2-0.3OD)+++(ovcr0.3OD)實施例2BATmAb結(jié)合位點的分析和BAT-1結(jié)合蛋白的純化為測定與BAT-1mAb相作用的膜蛋白分子量，將Daudi細(xì)胞膜制備物溶解，通過SDS-PAGE分離蛋白。硝酸纖維素轉(zhuǎn)移印跡與BAT-1mAb一起溫育，再進(jìn)一步與辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗抗鼠IgG(Fab’)2抗體一起溫育并使用鄰聯(lián)茴香胺作底物檢測區(qū)帶。發(fā)現(xiàn)BAT-1結(jié)合蛋白的分子量大小約為48-50KDa(圖4)。使用與Sepharose(瑞典Pharmacia公司的一個商標(biāo))偶聯(lián)的BATmAb來純化BATmAb結(jié)合蛋白。也可使用分子生物學(xué)方法通過克隆來制備該結(jié)合蛋白，對鼠施用BAT-1的體內(nèi)實驗?zāi)軐?dǎo)致BAT抗體的誘發(fā)。實施例3BATmAb的功能特性a.BATmAb誘導(dǎo)胸腺嘧啶核苷的摻入在一系列濃度遞增的BATmAb存在情況下，對人外周血細(xì)胞培養(yǎng)6天，收獲前20小時加入〔3H〕胸腺嘧啶核苷。正如圖5所示，BATmAb濃度的逐漸增加，會使〔3H〕胸腺嘧啶核苷在PBM細(xì)胞中的摻入量稍有提高而非顯著改變。但是，大劑量的抗體會使細(xì)胞攝入的胸腺嘧啶核苷量減少。在對照實驗中，同族型匹配的抗體不會使PBL細(xì)胞中〔3H〕胸腺嘧啶核苷增加，這表明BATmAb的激動效應(yīng)取決于它們的結(jié)合特異性。例如，我們實驗室所培養(yǎng)的抗卵巢癌細(xì)胞的IgG1同族型mAb不會引起〔3H〕胸腺嘧啶核苷攝入量的增加，與也屬IgG1類的BAT1，2，3，6，7和9mAb相反。b.BATmAb誘發(fā)人PBM細(xì)胞毒性對于BATmAb一起溫育不同時間的人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)物，測試其溶解腫瘤細(xì)胞系的能力。正如下表3所示，與一系列BATmAb一起溫育一周的人PBM細(xì)胞，對人紅白血病(NK敏感性的)的K562和腎癌細(xì)胞系(NK抗性的)細(xì)胞RC-29均有細(xì)胞毒性。我們研究了由BATmAb刺激的人PBM細(xì)胞毒活性增強(qiáng)的動力學(xué)性質(zhì)。正如圖6所示，在人PBM與BATmAb一起溫育7天后，可獲得針對于人結(jié)腸癌(HT-29)和腎細(xì)胞癌(RC-29)的最大細(xì)胞毒性。表3BATmAb誘發(fā)人PBM細(xì)胞毒性tables>*靶細(xì)胞溶解百分率，所用效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞比率為5∶1c.在BAT誘發(fā)的細(xì)胞毒性中的淋巴細(xì)胞亞群的特性為評估BATmAb誘發(fā)的人PBM細(xì)胞毒性的增加是否是由于NK細(xì)胞的激活、T細(xì)胞的激活或這兩種細(xì)胞激活作用，對NK和T細(xì)胞進(jìn)行純化，并測定其BAT誘發(fā)的細(xì)胞毒性。為純化NK和T細(xì)胞，將抗Leu19和抗CD3單克隆抗體與人PBM細(xì)胞一起溫育，隨后與包被有抗鼠IgG磁珠一起溫育。這會導(dǎo)致與相應(yīng)抗體結(jié)合的細(xì)胞亞群被完全除去。正如下表4所示，在除去CD3和Leu19的細(xì)胞培養(yǎng)物中，溶解單位的數(shù)增大，這些實驗中使用BAT6和8，靶物為人紅白血病(K562)和人淋巴瘤(Daudi)。表4BAT在人淋巴細(xì)胞亞群中誘發(fā)細(xì)胞毒性實施例4BATmAb和IL-2在誘發(fā)細(xì)胞毒性中的協(xié)同作用將BATmAb和IL-2一起與PBM細(xì)胞溫育，研究人PBM細(xì)胞毒性的誘發(fā)。將次最適濃度(1u/ml)的IL-2與濃度逐漸增高的BAT-2mAb一起加入。培養(yǎng)一周后，檢測對K562和HT29腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。如下表5所示，低濃度的BAT-2在誘發(fā)PBM細(xì)胞抗兩種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性中與IL-2具有協(xié)同作用。前文已表明INF-α能增強(qiáng)MHC-I類抗原的表達(dá)。因此，施用INF-α可能會強(qiáng)化BAT的抗腫瘤效果，這是通過抗各種腫瘤細(xì)胞(帶有MHCI類抗原)的細(xì)胞毒細(xì)胞的介導(dǎo)實現(xiàn)的。表5BAT-2mAb和IL2在誘導(dǎo)人PBL細(xì)胞毒性中的協(xié)同作用實施例5BAT-1鼠的免疫刺激作用a.體外實驗mAbBAT-1表現(xiàn)出在鼠脾細(xì)胞中具有類似于在人PBL中所表現(xiàn)的刺激性質(zhì)。這些性質(zhì)包括(i)通過摻入〔3H〕胸腺嘧啶核苷測得，脾細(xì)胞在體外增殖加強(qiáng)(表6)；(ii)通過脾細(xì)胞與BAT-1和IL-2結(jié)合物一起溫育得到協(xié)同刺激作用(表6)。表6C57BL鼠脾細(xì)胞在體外與各種濃度BAT-1及白細(xì)胞介素-2(1u和10u/ml)一起溫育5天。(iii)在BAT-1存在時鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞毒性增強(qiáng)，有IL-2存在的溫育使細(xì)胞毒性進(jìn)一步增強(qiáng)(表7)。表7在各種濃度BAT-1及低濃度IL-2存在時體外培養(yǎng)C57BL脾細(xì)胞5天誘發(fā)的細(xì)胞毒性。a.B16黑素瘤細(xì)胞用作靶物。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比率為50∶1對BAT-1激活脾細(xì)胞產(chǎn)生的殺傷作用敏感的鼠腫瘤細(xì)胞包括B16黑素瘤、Lewis肺癌(3LL)、纖維肉瘤(MCA105)、腎細(xì)胞癌(MR28)和淋巴瘤(YAC)細(xì)胞(表8)。表8BAT-1在脾細(xì)胞中誘導(dǎo)的抗鼠腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性(體外試驗)a.在BAT-1mAb(1μg/ml)不存在時，體外培養(yǎng)脾細(xì)胞5天在效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比率為60∶1時測定細(xì)胞毒性b.體內(nèi)實驗正如下表9所示，BAT-1表現(xiàn)出體內(nèi)施用時具有免疫刺激作用。這些作用包括(i)刺激〔3H〕胸腺嘧啶核苷在鼠脾細(xì)胞中的摻入，鼠為十天前以BAT-1注射的鼠(表9A)。BAT施用劑量為10μg/只時可獲得最大刺激作用(10倍)。(ii)在來自以BAT-1注射鼠的脾細(xì)胞中誘發(fā)細(xì)胞毒性(表9B)。在細(xì)胞毒性分析前10天以不同劑量施用BAI-1，誘發(fā)對鼠黑素瘤(B16-F10)細(xì)胞、腎細(xì)胞癌(MR-28)細(xì)胞和淋巴瘤(YAC)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在BAT施用劑量為10μg/只時，可獲得最佳效果。表9注射BATmAb的鼠的脾細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性以不同濃度BATmAb靜脈注射鼠C57BL和BALB/c。10天后測定分離出的脾細(xì)胞的細(xì)胞毒性和〔3H〕胸腺嘧啶核苷的摻入。用來自C57BL鼠的脾細(xì)胞對B16黑素瘤靶細(xì)胞進(jìn)行測試，用來自BALB/c鼠的脾細(xì)胞對MR-29和YAC細(xì)胞進(jìn)行測試(效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞值為50∶1)。每組包括6-16只鼠，進(jìn)行3-4次獨立的實驗。對每只鼠的細(xì)胞毒性和〔3H〕胸腺嘧啶核苷摻入測三次并且計算出平均值，結(jié)果以幾只鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，給出的P值為對照鼠和以BAT處理的動物間的差值。實施例6抗鼠腫瘤的BAT-1的免疫治療效果正如表10所示，接種黑素瘤鼠在接種腫瘤細(xì)胞后14天施用BAT-1，可以使長有B16、3LL和MCA腫瘤的鼠肺中肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少a.1.使用已建立的肺轉(zhuǎn)移瘤模型，BAT-1在接種B16黑素瘤鼠中消除肺轉(zhuǎn)移瘤用50×103個B16黑素瘤細(xì)胞注射(i.v.)C57BL鼠(表10)。注射后24天在肺中生長有大量轉(zhuǎn)移瘤(實際上已達(dá)到匯合)如圖7上排所示。與之相反，如圖7下排所示，接種B16黑素瘤后兩周以BAT-1(10μg/只)注射的鼠肺實際上沒有轉(zhuǎn)移瘤。圖8總結(jié)了在上述相似條件下所做的6個相互獨立的實驗結(jié)果。表10BATmAB的抗腫瘤效果BAT誘發(fā)的肺轉(zhuǎn)移瘤減少a在第0天接種腫瘤b在第14天靜脈內(nèi)注射BATmAb(10μg/只)c在腫瘤接種后24天，使用Zeiss立體顯微鏡計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤d鼠數(shù)e(n)只鼠肺重的平均值±SDa2.在與B16腫瘤接種相關(guān)的不同時間注射BAT-1mAb的抗腫瘤效果正如表11所示，注射黑素瘤細(xì)胞的鼠，10-14天后施用BAT-1mAb，發(fā)現(xiàn)沒有轉(zhuǎn)移瘤且肺重正常。我們注意到，在腫瘤接種后5天及腫瘤施用后19天，鼠肺中轉(zhuǎn)移瘤雖然沒有完全消失但數(shù)目明顯減少。在接種腫瘤細(xì)胞的同一天注射BAT-1，沒有治療效果。表11在與B16黑素瘤接種相關(guān)的不同時間施用BATf.施用BATmAb的日期(天)，相對而言接種腫瘤的日期為第0天。b.使用已建立的肺轉(zhuǎn)移瘤模型，在接種Lewis肺癌(3LL)的鼠中，BAT-1使肺轉(zhuǎn)移瘤消除除注射2×103個3LL細(xì)胞外，實驗條件與使用B16黑素瘤的情況相似(見上所述)。圖9上排顯示了接種3LL的具有大量轉(zhuǎn)移瘤的鼠肺。圖9下排顯示接種腫瘤細(xì)胞14天后以BAT-1處理的鼠肺，正如所看到的，幾乎沒有轉(zhuǎn)移瘤。c.使用已建立的肺轉(zhuǎn)移瘤模型，在接種MCA纖維肉瘤(MCA105)的鼠中，BAT使肺轉(zhuǎn)移瘤消失實驗條件與上述3LLLewis肺癌模型中的相似。圖10上排顯示出接種MCA105的鼠肺具有大量轉(zhuǎn)移瘤。圖10下排顯示出接種腫瘤后以BAT-1處理的鼠肺，正如所示，幾乎沒有轉(zhuǎn)移瘤。實施例7BAT-1治愈生長有B16和3LL腫瘤的鼠如上所述接種B16黑素瘤細(xì)胞或3LL細(xì)胞的鼠，在接種腫瘤后25-35天死去。與此相反，正如圖11所示，腫瘤接種后14天以BAT-1(10μg/只)注射的所有鼠均能生存100多天。大多數(shù)動物在隨后5個月中沒有表現(xiàn)出疾病征兆，且病理檢查沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤。實施例8以BAT-1mAb處理的鼠脾細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移(adoptivetransfer)將來自單獨以BAT-1mAb處理的鼠，或先注射有B16黑素瘤細(xì)胞再以BAT-1mAb處理的鼠的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移入受體鼠。該受體鼠以B16黑素瘤細(xì)胞接種或以3LL腫瘤細(xì)胞接種。正如下表12所示，得自注射有BAT-1mAb鼠的脾細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移，使接受該轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞的鼠的腫瘤消退。當(dāng)108個鼠脾細(xì)胞被過繼轉(zhuǎn)移入長有腫瘤的受體鼠時，會獲得最有效的治療，其中脾細(xì)胞來自以B16黑素瘤細(xì)胞接種且14天后再注射BAT-1的鼠。正如表12所示，這種情況下，如轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目和肺重的結(jié)果所示，能從長有B16腫瘤的受體中完全消除黑素瘤細(xì)胞，使長有3LL腫瘤的受體中的腫瘤顯著消退。表12過繼轉(zhuǎn)移誘發(fā)腫瘤消退a<a向接種腫瘤后14天的受體鼠靜脈注射來自三組鼠(A，B，C)的脾細(xì)胞b靜脈注射BAT(10μg/只)后20天從鼠中轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞c條件與b相同，除了在BAT施用前14天以B16黑素瘤接種鼠d三只鼠的肺轉(zhuǎn)移瘤平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差SDe三只鼠的肺重(gr)平均值±SD這些結(jié)果表明，來自B16接種和以BAT-1處理的鼠的單純的脾細(xì)胞對B16和3LL腫瘤均呈現(xiàn)出抗腫瘤效果。因此，看來BAT-1增強(qiáng)非特異性的細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制。并且，腫瘤的存在會強(qiáng)化BAT-1誘導(dǎo)這種效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生的增加。權(quán)利要求1.一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗原結(jié)合片段保持該單克隆抗體的結(jié)合特征，該單克隆抗體是由保藏于微生物培養(yǎng)物國家保藏中心(CNCM)保藏號為No.I-1397的雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體。2.分泌權(quán)利要求1的抗體的無限增殖細(xì)胞系。3.權(quán)利要求2的無限增殖細(xì)胞系，為雜交瘤細(xì)胞系。4.權(quán)利要求3的細(xì)胞系，其為保藏于CNCM保藏號為No.I-1397的雜交瘤細(xì)胞系。5.一種用于治療癌癥、艾滋病以及其它免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的藥物組合物，它們含有作為活性成分的有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體和生理上可接受的載體。6.權(quán)利要求5的藥物組合物，含有除所說抗體外的另一種藥劑，其與所說抗體以加和方式或協(xié)同方式增強(qiáng)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的活性。7.一種能與權(quán)利要求1的抗體特異結(jié)合的蛋白物質(zhì)。8.權(quán)利要求7的物質(zhì)，其在凝膠電泳中所確立的表觀分子量約為48-50千道爾頓。專利摘要一種具有免疫刺激作用的單克隆抗體，與B淋巴母細(xì)胞特異結(jié)合，并誘導(dǎo)外圍血淋巴細(xì)胞的增殖和活化，當(dāng)將該單克隆抗體注射入長有腫瘤的動物體內(nèi)時會產(chǎn)生抗腫瘤效果。文檔編號C07K14/705GKCN1052733SQ95192406公開日2000年5月24日申請日期1995年1月30日發(fā)明者B·哈地,A·諾沃格羅斯基申請人:莫爾研究應(yīng)用有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan