專利名稱:應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及到一種應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
豬痕是由豬痕病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，它對(duì)全世界的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大威脅。不同年齡、性別和品種的豬均能感染，死亡率高達(dá)80 90%。在我國(guó)，豬瘟流行呈現(xiàn)典型豬瘟和非典型豬瘟共存、持續(xù)感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合癥共存等現(xiàn)象。豬瘟新的流行形式給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)提出了新的挑戰(zhàn)，免疫接種仍是防制豬瘟的重要措施。
當(dāng)前豬瘟活疫苗的生產(chǎn)主要采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝。雖然該工藝已經(jīng)使用數(shù)十年，且已成熟穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)至今仍存在培養(yǎng)細(xì)胞密度低、細(xì)胞碎片與雜蛋白多、培養(yǎng)病毒滴度低、產(chǎn)品質(zhì)量不均一、不穩(wěn)定以及生產(chǎn)效率低、成本高等缺陷，這與當(dāng)前豬瘟活疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)需要越來越不相適應(yīng)。
專利公開號(hào)為CN 101492657A的專利申請(qǐng)，公開了豬瘟活疫苗ST細(xì)胞培養(yǎng)方法，生產(chǎn)工藝為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。專利公開號(hào)為CN 101181637A的專利申請(qǐng)，公開了用細(xì)胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其細(xì)胞系為ST、PK-15和IBRS-2細(xì)胞系，生產(chǎn)工藝為細(xì)胞培養(yǎng)瓶單層培養(yǎng)。專利公開號(hào)為CN101695571 A的專利申請(qǐng)，公開了一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法及制品，其生物反應(yīng)器為TideCell固定床微載體生物反應(yīng)器。但是利用攪拌式生物反應(yīng)器，采用逐級(jí)放大的倒罐式操作技術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞的高密度培養(yǎng)以制備疫苗，未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了克服豬瘟活疫苗現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的缺陷，提供了一種應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備占地面積小、生產(chǎn)規(guī)模大；培養(yǎng)速度快、生產(chǎn)效率高；生產(chǎn)機(jī)械化，易于自動(dòng)控制；培養(yǎng)設(shè)備密閉，不易污染；副產(chǎn)物少，疫苗的副反應(yīng)??；生產(chǎn)的病毒液效價(jià)高，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝相比，收獲的病毒液滴度增加了 5 10倍，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定。
本發(fā)明的技術(shù)方案為:
應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟:(I)將微載體和生物反應(yīng)器經(jīng)滅菌后，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種制苗用細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待微載體上的細(xì)胞形成致密的單層，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入病毒維持液并接種豬瘟病毒，繼續(xù)培養(yǎng)使病毒繁殖；(2)接毒后18h，連續(xù)收獲病毒培養(yǎng)液，合并病毒培養(yǎng)液加凍干保護(hù)劑制備豬瘟活疫苗。
病毒的接種量為培養(yǎng)體積的I 2%。
所述的生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為:pH 6.5 7.8、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌速度30 lOOrpm。考慮到細(xì)胞培養(yǎng)的最適條件，優(yōu)選的pH7.0 7.4、細(xì)胞培養(yǎng)階段溫度設(shè)定37°C，病毒培養(yǎng)階段溫度設(shè)定35°C、溶氧50%、攪拌速度30 l00rpm。
所述的微載體為Cytodex系列微載體,微載體的使用密度為2 25g/L。
所述的制苗用細(xì)胞為SK6細(xì)胞、ST細(xì)胞或PK-15細(xì)胞。
所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液為含體積濃度為8 10%小牛血清的DMEM或DMEM/F12，病毒維持液為含體積濃度為1 2%小牛血清的DMEM或DMEM/F12。
所述的生物反應(yīng)器容積為14 150L，或，制苗用細(xì)胞經(jīng)過14L 40L或14L 40L 150L逐級(jí)放大培養(yǎng)后，即通過胰酶將14L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞消化下來，作為種子細(xì)胞接種到40L的生物反應(yīng)器，再將40L生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞消化下來作為種子細(xì)胞接種到150L生物反應(yīng)器，如此形成生物反應(yīng)器之間的逐級(jí)放大培養(yǎng)，從而避免了單純的用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)種子細(xì)胞而容易造成污染和增加勞動(dòng)強(qiáng)度的缺陷，于40L或150L生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬瘟病毒；或直接用14L、40L的生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒。
所述生物反應(yīng)器的培養(yǎng)采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式，灌注的速率根據(jù)細(xì)胞的密度為每天0.5 5個(gè)工作體積。細(xì)胞接種病毒后，可以采用灌注的方式不斷收獲培養(yǎng)上清病毒液。
所述的生物反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器。
本發(fā)明采用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)豬瘟活疫苗，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比，自動(dòng)化控制程度高，生產(chǎn)可實(shí)時(shí)監(jiān)控；節(jié)省人力，降低成本；生產(chǎn)用地少，規(guī)模易于擴(kuò)大；生產(chǎn)的病毒滴度高，批間差異小，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，副反應(yīng)小。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的工藝流程圖。
圖2為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施方式
以下是本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案，以進(jìn)一步的闡述本發(fā)明，但不能解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
生物反應(yīng)器:美國(guó)NBS公司14L和40L生物反應(yīng)器；
微載體:Cytodex-l (通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)；
豬瘟病毒:豬瘟兔化弱毒株；
細(xì)胞生長(zhǎng)液:含體積濃度為8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術(shù)有限公司)；
病毒維持液:含體積濃度為1%小牛血清的DMEM ;(北京清大天一生物技術(shù)有限公司)；
細(xì)胞培養(yǎng):分別在14L生物反應(yīng)器內(nèi)，按照10g/L的濃度加入Cytodex-1微載體，水化后，用PH 7.2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗幾遍，滅菌后加入細(xì)胞生長(zhǎng)液平衡、接種SK6細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的方法參數(shù)為:pH 7.2、溫度37°C、溶氧50%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時(shí)取樣觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定葡萄糖的消耗，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到1.5 X 106/ml時(shí)，開始灌注，灌注的速度依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5 5個(gè)工作體積逐漸，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)4d，細(xì)胞的密度達(dá)到7 X 106/ml。
微載體培養(yǎng)的放大:待14L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到7X 106/ml，將長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體收集到特定密閉容器中，用含質(zhì)量濃度為0.02% EDTA的PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次，加入37°C預(yù)熱的含質(zhì)量濃度為0.02% EDTA、質(zhì)量濃度為0.25%胰酶的胰酶消化液，消化8min,排出多余的胰酶溶液，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，終止殘余胰酶的消化，啟動(dòng)容器攪拌使其充分分散消化的細(xì)胞，然后將消化分散的細(xì)胞懸液接種到40L的生物反應(yīng)器，按照上述的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。
病毒繁殖:當(dāng)40L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到8 X 106/ml，棄去微載體培養(yǎng)灌中的細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入病毒維持液并接種豬瘟病毒；接毒后6h開始灌注培養(yǎng)，以維持病毒繁殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，18h后開始收獲病毒液，可連續(xù)收獲21d。測(cè)定病毒含量3X106RID/ml，將收獲的病毒液置于2 8°C中，或保存在-15°C。
制備疫苗:將上述收獲的病毒液合并，按病毒液與凍干保護(hù)劑的體積比為1:1加入質(zhì)量濃度為5%蔗糖脫脂乳凍干保護(hù)劑，凍干制備成凍干活疫苗。
實(shí)施例2
生物反應(yīng)器:美國(guó)NBS公司14L和40L生物反應(yīng)器；
微載體:Cytodex-l (通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)；
豬瘟病毒:豬瘟兔化弱毒株；
細(xì)胞生長(zhǎng)液:含體積濃度為10%小牛血清的DMEM/F12 (Hyclone)；
病毒維持液:含體積濃度為2%小牛血清的DMEM/F12 (Hyclone)；
細(xì)胞培養(yǎng):分別在14L生物反應(yīng)器內(nèi)，按照10g/L的濃度加入Cytodex-1微載體，水化后，用PH 7.2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗幾遍，滅菌后加入細(xì)胞生長(zhǎng)液平衡、接種PK-15細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。每天定時(shí)取樣觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定葡萄糖的消耗，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到1.5X106/ml時(shí)，開始灌注，灌注的速度依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5 5個(gè)工作體積，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)4d，細(xì)胞的密度達(dá)到7 X 106/ml。
微載體培養(yǎng)的放大:待14L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到7X 106/ml，將長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體收集到特定密閉容器中，用含質(zhì)量濃度為0.02% EDTA的PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次，加入37°C預(yù)熱的含質(zhì)量濃度為0.02% EDTA、質(zhì)量濃度為0.25%胰酶的胰酶消化液，消化IOmin，排出多余的胰酶溶液，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，終止殘余胰酶的消化，啟動(dòng)容器攪拌使其充分分散消化的細(xì)胞，然后將消化分散的細(xì)胞懸液接種到40L的生物反應(yīng)器，按照上述的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。
病毒繁殖:當(dāng)40L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到8 X 106/ml，棄去微載體培養(yǎng)灌中的細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入病毒維持液并接種豬瘟病毒；接毒后6h開始灌注培養(yǎng)，以維持病毒繁殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，18h后開始收獲病毒液，可連續(xù)收獲21d，測(cè)定病毒含量為3X IO6RID/ml,將收獲的病毒液置于2 8°C中，或保存在-15°C。
制備疫苗:將上述收獲的病毒液合并，按病毒液與凍干保護(hù)劑的體積比為1:1加入質(zhì)量濃度為5%蔗糖脫脂乳凍干保護(hù)劑，凍干制備成凍干活疫苗。
權(quán)利要求
1、應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟:(I)將微載體和生物反應(yīng)器經(jīng)滅菌后，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種制苗用細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待微載體上的細(xì)胞形成致密的單層，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入病毒維持液并接種豬瘟病毒，繼續(xù)培養(yǎng)使病毒繁殖，其中，所述的微載體為Cytodex系列微載體,微載體的使用密度為2 25g/L ;所述的生物反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器，所述的生物反應(yīng)器容積為14 150L，所述制苗用細(xì)胞經(jīng)過14L 40L或14L 40L 150L逐級(jí)放大培養(yǎng)后，再將其置于40L或150L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)豬瘟病毒；所述豬瘟病毒的接種量為培養(yǎng)體積的I 2% ；(2)接毒后18h，連續(xù)收獲病毒培養(yǎng)液于-15°C以下保存，合并病毒培養(yǎng)液加凍干保護(hù)劑制備豬瘟活疫苗。
2、根據(jù)權(quán)利要求
1所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于:所述的生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為:pH 6.5 7.8、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌速度 30 IOOrpnio
3、根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于:所述的制苗用細(xì)胞為SK6細(xì)胞、ST細(xì)胞或PK-15細(xì)胞。
4、根據(jù)權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于:所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液為含體積濃度為8 10%小牛血清的DMEM或DMEM/F12，病毒維持液為含體積濃度為I 2%小牛血清的DMEM或DMEM/F12。
5、根據(jù)權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于:所述生物反應(yīng)器的培養(yǎng)采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式，灌注的速率根據(jù)細(xì)胞的密度為每天0.5 5個(gè)工作 體積。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，包括如下步驟(1)將微載體和生物反應(yīng)器經(jīng)滅菌后，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種制苗用細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待微載體上的細(xì)胞形成致密的單層，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入病毒維持液并接種豬瘟病毒，繼續(xù)培養(yǎng)使病毒繁殖；(2)接毒后18h，連續(xù)收獲病毒培養(yǎng)液于-15℃以下保存，合并病毒培養(yǎng)液加凍干保護(hù)劑制備豬瘟活疫苗。本發(fā)明具有工藝參數(shù)可控性好，細(xì)胞培養(yǎng)密度高，病毒滴度高，疫苗安全性好、質(zhì)量穩(wěn)定可靠，生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/187GKCN102038944 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010282143
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2010年9月15日
發(fā)明者漆世華, 劉漢平, 秦紅剛, 肖敏, 溫文生, 段振華, 王威, 張萍 申請(qǐng)人:武漢中博生物股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2),