本發(fā)明屬于糖尿病并發(fā)癥緩解制劑制備領(lǐng)域，具體涉及一種改善糖尿病足微循環(huán)的組合制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素引起的一組以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。病情嚴重或應(yīng)激時可發(fā)生急性嚴重代謝紊亂，長期碳水化合物以及脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂可引起多系統(tǒng)損害，導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官慢性進行性病變、功能減退及衰竭等。糖尿病急性并發(fā)癥如糖尿病酮癥酸中毒、低血糖、高滲高血糖狀態(tài)、乳酸性酸中毒等，糖尿病慢性并發(fā)癥如大血管病變：可引起冠心病、缺血性或出血性腦血管病、腎動脈硬化、肢體動脈硬化等，再如微血管病變：主要表現(xiàn)在視網(wǎng)膜、腎、神經(jīng)和心肌組織，其中尤以糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)橹匾偃缟窠?jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥：周圍神經(jīng)病變最為常見，自主神經(jīng)病變可影響胃腸、心血管、泌尿生殖系統(tǒng)功能，出現(xiàn)排汗異常、胃輕癱、腹瀉、便秘等，另外需要關(guān)注的糖尿病慢性并發(fā)癥是糖尿病足，糖尿病足輕者足部畸形、皮膚干燥和發(fā)涼、胼胝，重者可出現(xiàn)足部潰瘍、壞疽，糖尿病足是糖尿病患者殘疾和致死的主要原因。

2、糖尿病足致病因素復(fù)雜，難治愈、高致殘、高致死及復(fù)發(fā)率嚴重影響糖尿病患者的健康和生命。糖尿病足的發(fā)病機制中，缺血、神經(jīng)病變和感染是導(dǎo)致足潰瘍和組織壞死的三個主要因素。微循環(huán)障礙是糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生的重要生理基礎(chǔ)之一，微循環(huán)障礙表現(xiàn)為血管結(jié)構(gòu)改變、血管舒張功能障礙、血液流變學(xué)異常，以上會導(dǎo)致能量代謝障礙、山梨醇積聚和肌醇耗竭以及氧化應(yīng)激等。顯然，改善微循環(huán)有助于緩解糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)展進程。

3、前列腺素及前列腺類似物制劑（前列腺素e1、貝前列素鈉），己酮可可堿等，以及胰激肽源酶和磷酸二酯酶抑制劑等藥物可通過不同機制改善微循環(huán)障礙，增加神經(jīng)組織血流灌注，從而減輕神經(jīng)組織缺血缺氧性損傷。部分藥物會帶來不同程度的副作用，加重糖尿病患者的心理負擔。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于以上問題，本發(fā)明以富血小板血漿為出發(fā)點，通過葡萄糖酸鈣等刺激，獲得含有豐富生長因子等活性物質(zhì)的外泌體，并將魚精蛋白納米顆粒進行載裝，獲得的生物活性物質(zhì)具有較強的抑菌能力。本發(fā)明采用生物活性玻璃及羥乙基纖維素等對生物活性物質(zhì)進行穩(wěn)定，延長生物活性物質(zhì)的體外壽命。最終制備的組合制劑，安全性較高，對細胞毒害較小，抑菌效果較佳，能較快促進創(chuàng)口愈合，微循環(huán)指標顯示能刺激足部血流量變化，改善足部動脈堵塞情況等。

2、一種改善糖尿病足微循環(huán)的組合制劑，包含以下質(zhì)量份數(shù)的原材料：3-6份生物活性物質(zhì)、10-15份生物活性玻璃45s5、5-8份生物活性玻璃1393、3-5份羥乙基纖維素、6-10份改性后羧甲基纖維素、1-3份γ-氨基丁酸、0.8-2份甘油。

3、所述生物活性物質(zhì)是將魚精蛋白與富血小板血漿來源的外泌體混合負載后獲得，具體制備方法如下：

4、m1.將魚精蛋白溶于蒸餾水中，獲得質(zhì)量百分比濃度為1-1.5%的魚精蛋白水溶液，靜置過夜后加熱至40-50℃，加入無水乙醇，以150-200rpm的轉(zhuǎn)速在室溫下持續(xù)攪拌處理15-20h，結(jié)束后真空蒸餾去除無水乙醇，獲得液體1，加入戊二醛水溶液，攪拌分散后靜置5-10min，高速離心獲取沉淀，沉淀采用pbs緩沖液充分清洗，再次高速離心后獲取沉淀即為物質(zhì)1；

5、m2.獲取富血小板血漿，將富血小板血漿與葡萄糖酸鈣溶液混合，在37℃水浴下孵育10-15min，結(jié)束后采用超速離心法獲取外泌體，外泌體采用pbs緩沖液重懸，然后與磷酸酶及絲素蛋白混合，獲得物質(zhì)2；

6、m3.將步驟m1獲得的物質(zhì)1與步驟m2獲得的物質(zhì)2按照質(zhì)量比1：8-10混合，4℃下充分預(yù)冷，1000-1200kv下進行電穿孔5-8ms，結(jié)束后37℃孵育30-45min即獲得生物活性物質(zhì)。

7、較佳地，步驟m1中無水乙醇的加入量為魚精蛋白水溶液體積的0.2-0.3倍，戊二醛水溶液的加入量為液體1體積的0.1-0.2倍，戊二醛水溶液的質(zhì)量百分比濃度優(yōu)選3-4%，高速離心在4℃下進行，離心優(yōu)選在8000-10000g離心力下進行。

8、較佳地，步驟m2中富血小板血漿：葡萄糖酸鈣溶液的體積比為10：1-1.5，葡萄糖酸鈣溶液的質(zhì)量百分比濃度優(yōu)選6-8%，外泌體：pbs緩沖液：磷酸酶：絲素蛋白的質(zhì)量比為1：400-600：80-120：50-80。

9、較佳地，步驟m1與m2中所用pbs緩沖溶液的ph為7.0，均需在4℃下預(yù)冷后使用。

10、所述改性后羧甲基纖維素的制備方法如下：

11、l1.將羧甲基纖維素添加至吡啶中，攪拌至分散均勻，將氯化甜菜堿酰氯加入，室溫環(huán)境下以120-180rpm的轉(zhuǎn)速攪拌24-36h，獲得物質(zhì)3；

12、l2.將步驟l1所獲物質(zhì)3采用丙酮進行沉淀，沉淀物用無水乙醇充分清洗，減壓干燥至恒重后獲得改性后羧甲基纖維素。

13、較佳地，步驟l1中羧甲基纖維素：吡咯：氯化甜菜堿酰氯的質(zhì)量體積比為1：50-60：0.2-0.3。

14、較佳地，步驟l2中丙酮和無水乙醇用量不做限制，常規(guī)操作用量即可，減壓干燥優(yōu)選在55-60℃下進行。

15、所述改善糖尿病足微循環(huán)的組合制劑的制備方法如下：

16、v1.稱量羥乙基纖維素溶于水，充分混勻，加入生物活性玻璃45s5和生物活性玻璃1393，攪拌至分散均勻，獲得組分1；

17、v2.稱量γ-氨基丁酸、甘油、改性后羧甲基纖維素，加水后攪拌至分散均勻，加入生物活性物質(zhì)，獲得組分2；

18、v3.將步驟v2所獲組分2緩慢加入到步驟v1所獲組分1中，即獲得組合制劑。

19、較佳地，步驟v1中水的加入量為羥乙基纖維素質(zhì)量的20-30倍，步驟v2中水的加入量為改性后羧甲基纖維素的10-20倍。

20、本發(fā)明的有益效果如下：

21、現(xiàn)有研究表明富血小板血漿對緩解傷口潰瘍具有較佳效果，優(yōu)勢在于血小板激活后會通過脫顆粒作用，釋放出血小板源生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、纖維連接素等多種營養(yǎng)成分，這些營養(yǎng)成分能促進潰瘍的愈合以及血管再生等。此外血小板活化后還會釋放出抗菌肽、趨化因子、殺菌蛋白等多種具有抗菌效果的活性物質(zhì)，具有一定抗感染能力。來源于本體的富血小板血漿，還能避免患者因使用外源性物質(zhì)而發(fā)生免疫排斥，不會帶來嚴重不良反應(yīng)。但富血小板血漿也存在一定的應(yīng)用局限性，如其在局部供血較好的神經(jīng)性糖尿病足患者中治療效果要好于缺血性潰瘍患者，體外壽命較短等。鑒于富血小板血漿的應(yīng)用優(yōu)勢，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，采用葡萄糖酸鈣作為激動劑，刺激富血小板血漿釋放大量生長因子等活性物質(zhì)，然后進一步獲取其外泌體，采用磷酸酶及絲素蛋白來穩(wěn)定外泌體，延長活性物質(zhì)的存在時間。此外，本發(fā)明特將魚精蛋白制成納米顆粒，并通過電穿孔方式載裝到外泌體中，使得最終獲取的生物活性物質(zhì)具有較強的抑菌能力，能抵抗糖尿病足潰瘍的發(fā)展進程。生物活性玻璃及羥乙基纖維素等能延長生物活性物質(zhì)的體外壽命，能促進生物活性物質(zhì)發(fā)揮治療效果，改性后羧甲基纖維素相比未改性的羧甲基纖維素，具有更好的生物降解性能，使得整體組合制劑的安全性更高。本發(fā)明獲得的組合制劑，對細胞毒害較小，抑菌效果較佳，能較快促進創(chuàng)口愈合，微循環(huán)指標顯示能刺激足部血流量變化，改善足部動脈堵塞情況等。