本發(fā)明涉及一種微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法及應(yīng)用，屬于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)。

背景技術(shù)：

1、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted?laser?desorptionionization-time?of?flight?mas?spectrometry，maldi-tof?ms)是近年來(lái)發(fā)展的全新用于微生物鑒定和分型的生物質(zhì)譜技術(shù)。其通過(guò)離子的質(zhì)荷比(m/z)與離子的飛行時(shí)間成正比的原理來(lái)分析離子，測(cè)定樣品分子量并分析混合生物大分子的軟電離技術(shù)。其通過(guò)采集2000～20000m/z區(qū)間的微生物蛋白分子指紋圖譜并與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白圖譜進(jìn)行識(shí)別比對(duì)，從而判斷細(xì)菌的種屬。與基于免疫和核酸的檢測(cè)相比，maldi-tof-ms具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，而且使用的試劑成本相對(duì)較低，不需要專門培訓(xùn)的人員操作，是一種高通量篩選鑒定方法，一次運(yùn)行能識(shí)別大量菌株并在數(shù)分鐘內(nèi)得出結(jié)論。maldi-tof-ms在微生物檢測(cè)鑒定中的應(yīng)用越來(lái)越深入，質(zhì)譜檢測(cè)相關(guān)的技術(shù)指南和專家共識(shí)也已經(jīng)出版發(fā)行，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)日趨成熟，在對(duì)微生物進(jìn)行菌種鑒定的過(guò)程中獲得了海量的核糖體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，但是如何對(duì)獲得的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的數(shù)據(jù)挖掘是一個(gè)技術(shù)難題。

2、在臨床抗感染治療中，細(xì)菌耐藥是一個(gè)世界性的難題，如何通過(guò)菌種鑒定的途徑同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌是否耐藥，在公布日為2023年02月03日，公布號(hào)為cn115678958a的中國(guó)發(fā)明專利中通過(guò)4個(gè)質(zhì)譜峰進(jìn)行區(qū)分cskp(碳青霉烯類敏感的肺炎克雷伯菌)和crkp(碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌)；也有研究通過(guò)40個(gè)特征峰構(gòu)建kpc-crkp自建質(zhì)譜庫(kù)的方法解決該問(wèn)題。自2020年以來(lái)，不斷有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌如：肺炎克雷伯菌中已有耐藥表型和毒力表型的融合，那么能否在利用maldi-tof-ms進(jìn)行菌種鑒定和耐藥檢測(cè)的同時(shí)，有效挖掘核糖體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)以實(shí)現(xiàn)包括細(xì)菌毒力狀況的檢測(cè)，逐漸成為目前亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法有效挖掘maldi-tof-ms質(zhì)譜獲得的微生物核糖體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)問(wèn)題。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法在鑒定耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌毒力水平中的應(yīng)用，為現(xiàn)有技術(shù)提供一種快速、簡(jiǎn)便的鑒定耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌毒力水平的方法。

3、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中一種微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法所采用的技術(shù)方案是：

4、一種微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法，包括以下步驟：

5、s1、樣本前處理：將待分析的微生物樣本進(jìn)行培養(yǎng)并根據(jù)預(yù)設(shè)表型分組，然后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)獲得核糖體蛋白質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)集；

6、s2、質(zhì)譜數(shù)據(jù)集預(yù)處理：對(duì)s1獲得的核糖體蛋白質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理，獲得微生物樣本的共同質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)集；

7、s3、質(zhì)譜數(shù)據(jù)集基礎(chǔ)分析：對(duì)s1和s2獲得的質(zhì)譜譜圖進(jìn)行質(zhì)量控制分析、種群代表性質(zhì)譜峰生成及主成分分析，獲取微生物樣本的種群核糖體蛋白表達(dá)譜；

8、s4、質(zhì)譜數(shù)據(jù)集差異性分析：對(duì)s2中所述微生物樣本的共同質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)集進(jìn)行矩陣分析及數(shù)據(jù)處理篩選出差異性質(zhì)譜峰，結(jié)合s3中所述微生物樣本的種群核糖體蛋白表達(dá)譜進(jìn)行層次聚類分析輸出可視化熱圖，進(jìn)一步做簇類分析；

9、s5、質(zhì)譜數(shù)據(jù)集分子標(biāo)記篩選：對(duì)s4獲得差異性質(zhì)譜峰篩選分析得到候選分子標(biāo)記，對(duì)不同候選分子標(biāo)記進(jìn)行組合分析及臨床診斷效能評(píng)價(jià)確定微生物預(yù)設(shè)表型分組的連鎖分子標(biāo)記。

10、上述方案的有益效果在于：本發(fā)明的微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法為開拓性發(fā)明。本發(fā)明以耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌為具體檢測(cè)對(duì)象，以其毒力為具體的分析表型，開發(fā)出一種微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法。本發(fā)明將耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌依據(jù)毒力水平分為無(wú)毒力組、中間毒力組和高毒力組，將微生物質(zhì)譜檢測(cè)中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集經(jīng)質(zhì)量控制分析及數(shù)據(jù)處理后共獲取389個(gè)共有質(zhì)譜峰，進(jìn)一步通過(guò)矩陣分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)130個(gè)差異性蛋白峰，繼續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析篩選出3個(gè)聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰用于區(qū)分不同毒力水平的細(xì)菌，形成了一種大樣本量、高重現(xiàn)性、完整可靠的核糖體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析方法。

11、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s1中所述預(yù)設(shè)表型包括微生物的毒力或耐藥性。

12、上述方案的有益效果在于：致病微生物的毒力和耐藥性為是臨床醫(yī)學(xué)研究和病原微生物研究中，對(duì)于致病微生物重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域，而且研究的比較深入，對(duì)于相關(guān)毒力和耐藥性有明確且清晰的劃分。

13、優(yōu)選地，當(dāng)預(yù)設(shè)表型為微生物毒力或耐藥性時(shí)，可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中公開的相應(yīng)毒力或耐藥性檢測(cè)的方法，如：熒光定量pcr、藥物敏感性鑒定，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后進(jìn)行分組。

14、具體地，在進(jìn)行實(shí)際分析時(shí)，所述預(yù)設(shè)表型還可以為細(xì)菌的st分型、表面抗原分型(血清分型)等。

15、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s1中所述數(shù)據(jù)集的子集要求鑒定百分比≥75％、質(zhì)譜峰數(shù)量為100-200。

16、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s2中所述微生物樣本的共同質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)集來(lái)自于不同的生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。

17、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s3中所述質(zhì)量控制分析包含原始質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)集和共同質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)集。

18、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s4中所述差異性質(zhì)譜峰的篩選如下：①排除所有菌株中出現(xiàn)頻率100％的質(zhì)譜峰；②排除所有菌株內(nèi)出現(xiàn)頻率＜20％的質(zhì)譜峰。

19、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s4中所述簇類分析從預(yù)設(shè)表型分組和質(zhì)譜峰分布上雙向綜合分析。

20、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s5中所述候選分子標(biāo)記的篩選如下：①待分析質(zhì)譜峰在預(yù)設(shè)表型分組的目標(biāo)組內(nèi)pop＜20％；②待分析質(zhì)譜峰在預(yù)設(shè)表型分組其他組內(nèi)表達(dá)相對(duì)較高。

21、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s5中所述組合分析使用排列組合的方法，公式如下：

22、

23、式中，m表示候選蛋白聯(lián)合標(biāo)記組合種類數(shù)量，n表示可供篩選的候選分子標(biāo)記數(shù)量。

24、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s5中所述組合分析后使用分子標(biāo)記的臨床診斷效能評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。

25、具體地，包括靈敏性、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值的評(píng)估。

26、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，s1中待分析的微生物樣本培養(yǎng)至至少f2代。

27、上述方案的有益效果在于：在待分析的微生物樣本培養(yǎng)至f2代后，取同一樣本的不同后代(如：同一種菌株的不同菌落)進(jìn)行分組檢測(cè)，獲得質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，能夠減小實(shí)驗(yàn)分析過(guò)程中的誤差。

28、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中一種微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法在鑒定耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌毒力水平中的應(yīng)用所采用的技術(shù)方案是：

29、一種微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法在鑒定耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌毒力水平中的應(yīng)用。

30、上述方案的有益效果在于：本發(fā)明微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法在鑒定耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌毒力水平中的應(yīng)用為開拓性發(fā)明。通過(guò)使用本發(fā)明的深入分析方法篩選出了耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌高毒力菌株的聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰、中間毒力菌株的聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰和無(wú)毒力菌株的聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰。經(jīng)過(guò)分析驗(yàn)證，由上述三個(gè)聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰組成的蛋白分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確、快速地鑒定出待測(cè)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的毒力水平。這樣既能充分利用在菌種鑒定中獲得的大量核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，又能直接將分析的結(jié)果用于臨床試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的延伸化分析，這將對(duì)臨床抗感染的精準(zhǔn)治療帶來(lái)極大提升，并提早了精準(zhǔn)治療的時(shí)間窗和降低了患者的治療成本，甚至挽救患者生命。而且相較于蛋白和核酸的檢測(cè)，利用三個(gè)聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰組成的蛋白分子標(biāo)記進(jìn)行耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌毒力的鑒定，無(wú)需額外實(shí)驗(yàn)操作及檢驗(yàn)成本，無(wú)檢測(cè)時(shí)間上的延遲，適合大規(guī)模、高通量檢測(cè)鑒定。

31、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，對(duì)待測(cè)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集進(jìn)行深度分析，根據(jù)不同毒力的聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰對(duì)待測(cè)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的毒力水平進(jìn)行判定。

32、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，高毒力耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰(m/z)為2368.64-2525.54-3130.11-3611.80、中間毒力耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰(m/z)為2761.26-11178.83-11212.18-11873.99、無(wú)毒力耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰(m/z)為2502.75-2580.52-4401.36-11178.83。

33、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述高、中間和無(wú)毒力耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌聯(lián)合標(biāo)記質(zhì)譜峰中每個(gè)質(zhì)譜峰檢測(cè)數(shù)據(jù)的容忍度為800ppm。

34、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

35、1、本發(fā)明微生物核糖體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的深度分析方法中篩選的聯(lián)合質(zhì)譜峰蛋白分子標(biāo)記通過(guò)在微生物質(zhì)譜檢測(cè)的基礎(chǔ)上分析該菌種鑒定的質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)來(lái)判定其毒力狀況，是臨床實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的延伸化分析。

36、2、本發(fā)明中的三組聯(lián)合質(zhì)譜峰蛋白標(biāo)記可直接應(yīng)用于臨床診療，無(wú)需額外實(shí)驗(yàn)操作及檢驗(yàn)成本，無(wú)檢測(cè)時(shí)間上的延遲，直接在臨床常規(guī)微生物質(zhì)譜菌種鑒定的同時(shí)比對(duì)其檢測(cè)的質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)：2368.64-2525.54-3130.11-3611.80、2761.26-11178.83-11212.18-11873.99、2502.75-2580.52-4401.36-11178.8，即可判定耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的毒力水平。

37、3、本發(fā)明的目的在于提供一種大樣本量、高重現(xiàn)性、完整可靠且操作簡(jiǎn)便的微生物核糖體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集分析方法。與現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相比較，本發(fā)明中用于研究的每株菌株都有多個(gè)生物學(xué)試驗(yàn)，將多個(gè)質(zhì)譜譜圖合并后產(chǎn)生的代表性質(zhì)譜譜圖作為該菌株的質(zhì)譜數(shù)據(jù)集，從而保證了后續(xù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果的高重現(xiàn)性和高穩(wěn)定性；本發(fā)明可進(jìn)行大樣本量的數(shù)據(jù)分析處理，在發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)分子的基礎(chǔ)上直接篩選出區(qū)分相關(guān)表型的分子標(biāo)記。