背景技術(shù)：

旱柳(salixmatsudanakoidz)柳花為楊柳科(salicaceae)柳屬落葉喬木旱柳的花。柳花又名“楊花”、“柳椹”、“柳蕊”。柳花可以藥食兩用，作枕芯有安神催眠之功效。若將柳花研碎，可用于制藥。《藥性論》上記載：將柳花搗碎，可用于止血、貼瘡、治療牙痛等。黃酮是柳花中一類主要的有效成分，種類多樣，包括木犀草素、槲皮素、二氫山奈酚、兒茶素、異鼠李素等。現(xiàn)代藥理學(xué)表明柳花黃酮具有抗炎、抗癌、抗氧化等作用。文獻(xiàn)表明黃花柳花總黃酮對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

越來越多的研究表明腫瘤、癌癥、帕金森、糖尿病等疾病均與人體內(nèi)過量的自由基相關(guān)，抗氧化劑對(duì)于許多自由基引起的衰老及老化相關(guān)疾病都能夠起到預(yù)防作用。

但是，目前未見有關(guān)旱柳柳花黃酮的研究報(bào)道，申請(qǐng)人采用微波法對(duì)旱柳柳花黃酮的提取工藝，提高了提取效率，得到了清除dpph自由基、abts自由基、羥自由基的有效成分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了獲得有效成分，申請(qǐng)人通過大量的試驗(yàn)，得到黃酮提取物的制備方法，制備方法如下：

1)將收集好的柳花在室溫條件下放入烘箱中烘干至其恒重，用粉碎機(jī)粉碎過篩，備用。

2)準(zhǔn)確稱取處理好的柳花粉末，加入有機(jī)溶液，微波提取，提取次數(shù)為1～2，抽濾，用相應(yīng)的提取有機(jī)溶液洗滌，即得黃酮提取物。

優(yōu)選有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇，料液比為1:20-25(g/ml)。更優(yōu)選料液比為1:25(g/ml)。

優(yōu)選乙醇或者甲醇濃度在10％～60％的水溶液。更優(yōu)選乙醇濃度為60％。

優(yōu)選微波功率為65～325w。更優(yōu)選功率為325w。

優(yōu)選微波提取2～10min。更優(yōu)選提取時(shí)間為10min。

優(yōu)選提取次數(shù)為1～2。更優(yōu)選提取次數(shù)為2次。

優(yōu)選，用粉碎機(jī)粉碎并過60-100目篩。更優(yōu)選過60目篩。

附圖說明

圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2乙醇濃度對(duì)總黃酮提取的影響

圖3微波功率對(duì)總黃酮提取的影響

圖4微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響

圖5料液比對(duì)總黃酮提取的影響

圖6提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取的影響

圖7總黃酮對(duì)dpph自由基的清除率

圖8總黃酮對(duì)羥自由基的清除率

圖9總黃酮對(duì)abts自由基的清除率

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1材料與方法

實(shí)驗(yàn)儀器

v-1100d型可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；shz-d(ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；re-52aa旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；al204電子天平(梅特勒－托利多儀器公司)；lwmc-201微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器(南京陵江科技開發(fā)有限責(zé)任公司)。

實(shí)驗(yàn)材料

蕓香葉苷(蘆丁)、過二硫酸鉀、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、95％乙醇、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸、雙氧水30％均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(abts)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)購自sigma公司；旱柳柳花(采摘自校內(nèi)中馬路旁)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品預(yù)處理

將收集好的柳花在適溫條件下放入烘箱中烘干至其恒重，用粉碎機(jī)粉碎并過60目篩，備用。

1.3.2繪制蕓香葉苷(蘆丁)標(biāo)準(zhǔn)曲線

用電子天平稱取蕓香葉苷(蘆丁)20.00mg并用無水乙醇溶解，定容到100ml的容量瓶中，制得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。用移液管準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml置于10ml比色管中，加入0.5ml5％nano2溶液，混合均勻后靜置5min；加入0.5ml10％al(no3)3溶液，5min后加入2.0ml4％naoh溶液，靜置15min；最后用無水乙醇定容。平行3次。在波長(zhǎng)510nm處，測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3黃酮含量的測(cè)定

取1ml的柳花提取液于10ml比色管中，加入5％nano2溶液0.5ml，搖勻，反應(yīng)5min。再加入10％的al(no3)3溶液0.5ml，搖勻，反應(yīng)5min。再加入2.0ml4％的naoh溶液，混勻。15min后用無水乙醇定容。平行3次。在波長(zhǎng)510nm處測(cè)吸光度。由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出柳花中黃酮的質(zhì)量，進(jìn)而求出黃酮的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出線性方程為y＝11.723x-0.0055，r²＝0.9992，結(jié)果見圖1。該回歸方程表明，蘆丁在0.01～0.06mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于黃酮濃度的計(jì)算^[12]。(y代表吸光度；x代表蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/ml)。總黃酮含量計(jì)算公式為：

黃酮含量(mg/g)＝(黃酮濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積)/樣品質(zhì)量

實(shí)施例2乙醇濃度的選擇

準(zhǔn)確稱取處理好的柳花粉末0.5g，以料液比為1:20(g/ml)分別加入10、30、50、60、70、90％乙醇溶液。在微波功率為325w的條件下提取10min。抽濾，洗滌，定容于50ml容量瓶中。相同條件下平行3次，按照實(shí)施例1中1.3.3項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算黃酮含量。

乙醇濃度選擇的結(jié)果見圖2，由圖2可知：乙醇濃度在10％～60％時(shí)，黃酮含量隨濃度的增大而增大；大于60％，黃酮含量反而隨著濃度的增加而降低，因此優(yōu)選乙醇濃度為60％。

實(shí)施例3微波功率的選擇

準(zhǔn)確稱取處理好的柳花粉末0.5g，以料液比1:20(g/ml)加入60％的乙醇溶液。在65、195、325、455、585w的微波功率下提取10min。抽濾，洗滌，定容于50ml的容量瓶。平行3次，按照實(shí)施例1中1.3.3項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算黃酮含量。

微波功率的大小代表了微波輻射強(qiáng)度的大小。微波輻射強(qiáng)度越大，越容易分解細(xì)胞壁纖維，有助于提取物的溶出，增大提取效果；但是微波功率過大又容易產(chǎn)生局部過熱，提取物變性，從而降低了提取效果。

由圖3可知，在65～325w范圍內(nèi)，功率增大促進(jìn)了柳花黃酮的提取；功率再增大，黃酮含量降低。故優(yōu)選325w為較佳的提取功率。

實(shí)施例4微波時(shí)間的選擇

稱取處理好的柳花粉末0.5g，以料液比1:20(g/ml)加入60％的乙醇溶液。在微波功率325w的條件下分別提取2、6、10、14、16min。抽濾，洗滌，定容于50ml的容量瓶。平行3次，按照實(shí)施例1中1.3.3項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算黃酮含量。

由圖4可知：當(dāng)微波時(shí)間在2～10min時(shí)，黃酮含量隨微波時(shí)間的增加不斷增大；提取時(shí)間過長(zhǎng)，提取物易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，因而10～16min黃酮含量逐漸下降，所以優(yōu)選10min為較佳的提取時(shí)間。

實(shí)施例5料液比的選擇

稱取處理好的柳花粉末0.5g，按照1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35(g/ml)的液料比加入適量60％乙醇溶液。在微波功率為325w的條件下提取10min。抽濾，洗滌，定容于50ml的容量瓶。平行3次，按照實(shí)施例1中1.3.3項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算黃酮含量。

由圖5知，隨著溶劑量增加，黃酮的溶解量增大，使得黃酮含量增大。當(dāng)料液比達(dá)到1:25(g/ml)后黃酮含量有所下降。溶劑量過大可能會(huì)溶出更多雜質(zhì)，且造成資源浪費(fèi)，所以選擇料液比為優(yōu)選1:25(g/ml)。

實(shí)施例6提取次數(shù)的選擇

稱取處理好的柳花粉末0.5g，以料液比1:25(g/ml)加入60％乙醇溶液。在微波功率為325w的條件下提取10min。抽濾，洗滌，定容于50ml的容量瓶。按照相同的方法分別提取1、2、3、4次。平行3次，按照實(shí)施例1中1.3.3項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度。

由圖6可知：在提取次數(shù)為1～2時(shí)，黃酮含量明顯增大；超過2次后，黃酮含量基本不變。因此從提取成本及提取效率看，選擇兩次為較佳的提取次數(shù)。

實(shí)施例8抗氧化實(shí)驗(yàn)

清除dpph自由基

用無水乙醇配制0.1mmol/ldpph自由基溶液。在10ml比色管中分別移入不同體積的黃酮溶液和vc溶液，再加入3.0mldpph溶液，定容。黃酮溶液和vc溶液濃度均為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55mg/ml。避光反應(yīng)30min后在517nm處測(cè)定吸光度。按照式(1)計(jì)算清除率：

清除率(％)＝[a0-(a1-a2)]/a0×100％(1)

式中：a0為未加黃酮溶液測(cè)定的吸光度；a1為待測(cè)液的吸光度；a2為不加dpph溶液測(cè)定的吸光度。

清除羥自由基

在10ml比色管中加入依次加入2.0mmol/l硫酸亞鐵溶液2.0ml，1.0mmol/lh2o2溶液2.0ml，搖勻；再加入不同量的黃酮溶液和vc溶液，混勻。最后加入6.0mmol/l水楊酸溶液2.0ml，定容。黃酮和vc溶液濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/ml。37℃條件下水浴15min后在510nm處測(cè)吸光度。按照式(2)計(jì)算清除率：

清除率(％)＝[a0-(a1-a2)]/a0×100％(2)

式中：a0為未加黃酮溶液測(cè)定的吸光度；a1為待測(cè)液的吸光度；a2為不加h2o2溶液所測(cè)定的吸光度。

清除abts自由基

將abts用超純水配制成2.0mmol/l溶液，取50ml上述溶液與200ml70.0mmol/lk2s2o8水溶液混合均勻，室溫避光放置16h，得到abts自由基溶液。將abts自由基溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02。配制黃酮和vc溶液，使?jié)舛染鶠?.01、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80mg/ml。

取0.2ml黃酮提取液，加入3.8mlabts自由基溶液混勻，10min后測(cè)定其吸光度。按照式(3)計(jì)算清除率：

清除率(％)＝[a0-(a1-a2)]/a0×100％(3)

式中：a0為未加黃酮溶液測(cè)定的吸光度；a1為待測(cè)液的吸光度；a2為不加abts自由基溶液所測(cè)定的吸光度。

正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以料液比(a)、乙醇濃度(b)、微波時(shí)間(c)、微波功率(d)為考察因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

表1實(shí)驗(yàn)因素及水平

正交設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過對(duì)單因素結(jié)果的分析，確定正交實(shí)驗(yàn)因素水平。采用四因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察料液比(a)、乙醇濃度(b)、微波時(shí)間(c)、微波功率(d)對(duì)柳花總黃酮的影響，進(jìn)一步確定最佳的提取工藝條件。正交結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3方差分析

注：f0.05(2,2)＝19.00。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，提取柳花中總黃酮的最佳工藝為a2b2c2d2，即微波功率325w，微波時(shí)間10min，乙醇濃度60％，料液比1：25(g/ml)。各因素對(duì)黃酮含量影響的順序?yàn)閎>a>c>d。方差分析結(jié)果顯示因素a、b具有顯著的影響，即料液比、乙醇濃度對(duì)黃酮的提取影響較大。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別稱取0.5g柳花粉末3份，在最佳工藝條件下提取黃酮，測(cè)吸光度，并計(jì)算柳花總黃酮的含量。3次實(shí)驗(yàn)總黃酮含量分別為41.41mg/g、41.33mg/g、41.67mg/g，平均含量為41.47mg/g，rsd為0.42％。結(jié)果精密度良好，表明該工藝穩(wěn)定，可以用于柳花中黃酮的提取。

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

dpph自由基

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7，可知黃酮清除dpph自由基的能力與提取液濃度呈正比，最大可達(dá)89.30％。相同濃度的溶液，vc對(duì)dpph自由基的清除率高于柳花提取液。雖然柳花黃酮對(duì)dpph自由基清除能力沒有vc高，但是柳花黃酮對(duì)dpph自由基還是有較強(qiáng)的清除效果。

羥自由基

由圖8可知，在0.01～0.30mg/ml濃度范圍內(nèi)，清除率隨著黃酮提取液濃度的增加而增大。當(dāng)提取液濃度為0.30mg/ml時(shí)，清除率最大，可達(dá)88.70％，清除效果較好。

abts自由基

分析圖9可知，清除abts自由基的能力隨著黃酮提取液濃度的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)提取液濃度大于0.4mg/ml時(shí)，清除率基本達(dá)到穩(wěn)定，最高可達(dá)92.12％。柳花黃酮對(duì)abts自由基也有較強(qiáng)的清除效果。