本發(fā)明屬于藥物技術，具體地涉及一種菊科類型環(huán)肽作為cgas-sting信號通路抑制劑的應用，以及其在制備治療相關疾病藥物中的應用。

背景技術：

固有免疫是宿主機體免疫系統(tǒng)的第一道防線。在漫長的生物進化過程中，宿主細胞中的模式識別受體能夠識別入侵病原微生物的保守組分病原相關分子模式，如核酸分子、lps等，感知到病原微生物的入侵，侵染信號通過下游接頭蛋白、激酶和轉(zhuǎn)錄因子傳遞，誘導i型干擾素和促炎癥細胞因子的表達，最終清除入侵的病原微生物。過去幾十年的研究已經(jīng)詳細解析了宿主細胞識別以及清除“非己”rna的信號轉(zhuǎn)導機制，而最近幾年才開始對識別“非己”dna的信號轉(zhuǎn)導機制進行研究，特別是cgas-sting信號通路。

sting(stimulatorofinterferongenes)，又名為tmem173,mita,eris或mpys，作為胞內(nèi)應答dna入侵的關鍵節(jié)點分子，在胞質(zhì)dna刺激下，它響應來自胞質(zhì)dna受體的信號，對于誘導產(chǎn)生干擾素的過程中發(fā)揮了關鍵性的作用。宿主細胞的dna識別受體識別外源或內(nèi)源的“非己”dna后將信號傳遞給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的節(jié)點分子sting，隨后sting迅速二聚化并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到核外周小體上。在這個過程中，激酶tbk1也會被招募并轉(zhuǎn)移到核外周小體上激活，被激活的tbk1磷酸化轉(zhuǎn)錄因子irf3，隨后irf3發(fā)生二聚化并進入細胞核激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，參與多種生物效應，包括抗病毒、炎癥反應、免疫應答及腫瘤發(fā)生發(fā)展等重要的生理病理過程。

正常激活的cgas-sting信號通路有助于機體識別和清除入侵的dna病原微生物，但是異常過度激活的cgas-sting信號通路會造成機體發(fā)生炎癥及自身免疫性疾病等，如aicardi-goutieres綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或狼瘡樣疾病。因此研究調(diào)控cgas-sting信號通路以維持固有免疫處于正常穩(wěn)定的狀態(tài)至關重要。目前的研究主要集中在cgas-sting信號通路關鍵分子的翻譯后修飾以及尋找新的調(diào)控分子，而小分子化合物參與調(diào)控cgas-sting信號通路的研究還比較少，但具有十分重要的應用價值，這也成為重點關注的研究方向之一。

現(xiàn)有技術中未見cgas-sting信號通路抑制劑的報道，亦未見菊科類型環(huán)肽作用于該通路和制備治療自身免疫性疾病藥物的報道。菊科類型環(huán)肽在菊科植物中存在的種類不多，目前僅從菊科紫菀屬植物紫菀(astertataricusl.f.)中分離得到15個。菊科類型環(huán)肽類化合物的提取分離具有一定的特點，主要是因為該類化合物的極性小、溶解性不好且含量較低，難以得到純度較高的環(huán)肽類成分。近年來，從紫菀屬植物中分離環(huán)肽類成分已有若干方法公開發(fā)表，如徐會敏等報道，用甲醇回流提取菊科紫菀屬植物紫菀的根莖后，得甲醇浸膏，加水混懸后，用乙酸乙酯和正丁醇反復萃取，乙酸乙酯部分反復利用正反向硅膠柱層析、sephadexlh-20富集得到總環(huán)肽部位，再結合hplc對其進行分離純化，得到一系列環(huán)肽。參見xu,h.m,etal.astinsk-p,sixnewchlorinatedcyclopentapeptidesfromastertataricus,tereahedron2013,69,7964-7969。專利cn102174083b也公開了類似的制備方法。但是這些方法普遍存在提取效率低，過程復雜，樣品損失量較大，重復性和可控性差等缺點。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一類菊科類型環(huán)肽化合物作為cgas-sting信號通路抑制劑的應用；以及其在制備治療cgas-sting信號通路異常激活的疾病的藥物中的應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術方案：

菊科類型環(huán)肽化合物或其藥理學上容許的鹽作為cgas-sting信號通路抑制劑的應用。

菊科類型環(huán)肽化合物或其藥理學上容許的鹽作為cgas-sting信號通路抑制劑在制備治療cgas-sting信號通路異常激活的疾病的藥物中的應用。

其中，所述菊科類型環(huán)肽化合物優(yōu)選為下述結構式所示的菊科類型環(huán)肽astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)，

進一步優(yōu)選的，所述菊科類型環(huán)肽為astinc。

所述菊科類型環(huán)肽化合物或其藥理學上容許的鹽能夠抑制isd刺激下cgas-sting信號通路下游基因ifnβ、ifnα4和cxcl10的表達，從而達到抑制cgas-sting信號通路。

所述的藥理學上容許的鹽包括與無機酸、有機酸、堿金屬、堿土金屬或者堿性氨基酸形成的鹽。

進一步的，本發(fā)明的所述菊科類型環(huán)肽或其藥理學上容許的鹽，可以列舉例如與鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸、氫溴酸等無機酸，或者馬來酸、富馬酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、甲磺酸、對苯甲磺酸、己二酸、棕櫚酸、單寧酸等有機酸，鋰、鈉、鉀等堿金屬，鈣、鎂等堿土金屬，賴氨酸等堿性氨基酸形成的鹽。

本發(fā)明所述的治療cgas-sting信號通路異常激活的自身免疫性疾病的藥物，可以由菊科類型環(huán)肽化合物或其藥理學上容許的鹽，與藥學上可接受的載體組合后制備而成。制備的藥物劑型可以為片劑、膠囊、口服液、針劑、注射用凍干劑或粉針劑等。由于菊科類型環(huán)肽可從紫菀中提取分離，而片劑、膠囊、口服液、針劑、注射用凍干劑或粉針劑等藥物劑型的制備也是本領域的常規(guī)知識。因此，由菊科類型環(huán)肽化合物與相應載體制備的各種藥物劑型也能夠由本領域技術人員實現(xiàn)。

上文中所述的藥學上可接受的載體是指藥學領域常規(guī)的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；黏合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂黏土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂、以及聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

本發(fā)明化合物可以以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其他液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。

所述藥物中，優(yōu)選含有重量比為0.1％～99.5％的活性成分菊科類型環(huán)肽或其藥理學上容許的鹽，最優(yōu)選含有重量比為0.5％～95％的活性成分。

本發(fā)明所述藥物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度等變化，其日劑量可以是0.01～10mg/kg體重，優(yōu)選0.1～5mg/kg體重，可以一次或多次施用。

本發(fā)明是通過在mef細胞中檢測astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)對dna類似物isd刺激激活的cgas-sting信號通路下游基因表達的影響，以及在hsv-1誘導的小鼠血清中ifnβ蛋白表達的影響；發(fā)現(xiàn)菊科類型環(huán)肽能在體內(nèi)外抑制cgas-sting信號通路，是該通路的第一個抑制劑，可用于制備治療相關疾病的藥物。所述cgas-sting信號通路異常激活的疾病包括自身免疫性、炎癥性疾病和癌癥等，如aicardi-goutieres綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。

本發(fā)明中所述的astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)的制備方法可參照xu,h.m,etal.astinsk-p,sixnewchlorinatedcyclopentapeptidesfromastertataricus,tereahedron2013,69,7964-7969，以及專利cn102174083b中公開的類似的制備方法。但是上述方法普遍存在提取效率低，過程復雜，樣品損失量較大，重復性和可控性差等缺點，本申請中對制備方法做了改進，改進后的制備方法概括地說就是，甲醇浸膏直接經(jīng)硅膠柱層析，勿需萃取，既簡化了分離過程，又減少了樣品損失；通過正反相硅膠柱層析可以簡便的除去部分色素及其它低極性成分；利用sephadexlh-20凝膠色譜，可分開一部分與環(huán)肽分子量相差很大的小分子成分，同時快速富集環(huán)肽；利用高效液相色譜(hplc)純化及重結晶技術，即可成功分離得到環(huán)肽。另外，本方法僅利用實驗室或工業(yè)上常規(guī)的層析材料，包括正反相硅膠、sephadexlh-20等?？傊景l(fā)明提取分離方法可控性和重現(xiàn)性好，樣品損失少，成本較低，操作方便，可分離得到微量環(huán)肽，溶劑可以反復回收利用，適用于工業(yè)生產(chǎn)。具體制備見實施例部分。

有益效果：本發(fā)明首次揭示了菊科類型環(huán)肽化合物是一種cgas-sting信號通路抑制劑，能夠有效抑制dna類似物isd刺激下cgas-sting信號通路下游基因ifnβ、ifnα4和cxcl10的表達；由此可應用于制備治療cgas-sting信號通路異常激活的疾病的藥物，由于本發(fā)明所述的菊科類型環(huán)肽化合物為天然化合物，其劑型和用藥方式多樣化，具有廣泛的臨床應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的菊科類型環(huán)肽化合物的制備方法流程圖；

圖2a為本發(fā)明的菊科類型環(huán)肽化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)在mef細胞中對dna類似物isd刺激激活的ifnβmrna表達的抑制作用；

圖2b為astinc(3)在mef細胞中對dna類似物isd刺激激活的cgas-sting信號通路下游基因ifnβ，ifnα4和cxcl10的表達的影響；

圖3為本發(fā)明的菊科類型環(huán)肽化合物astinc(3)對hsv-1誘導的小鼠血清中ifnβ蛋白表達的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容。

本實施例中使用的設備、材料、試劑除有特殊說明以外，均可以通過市場購買獲取。

實施例1

菊科類型環(huán)肽化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)的制備：(制備方法流程見圖1所示)

取紫菀(astertataricusl.)干燥根及根莖10kg，經(jīng)干燥、粉碎及甲醇浸泡過夜后，用甲醇熱回流提取，共提取三次，第一次4小時，第二次4小時，第三次3小時，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮得甲醇浸膏4.6kg。該浸膏經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/甲醇(100:0，9:1，8:2，7:3，1:1，0:100)梯度洗脫，利用環(huán)肽tlc檢測方法合并含環(huán)肽各餾分，得總環(huán)肽部位(212.6g)；以下的每一過程都須結合環(huán)肽tlc檢測方法來指導分離純化?？偔h(huán)肽部位經(jīng)硅膠柱層析，用100:1-8:2的氯仿/甲醇梯度洗脫，根據(jù)環(huán)肽點的不同合并為五個組分fr.1–fr.5。對fr.1(64g)經(jīng)硅膠柱層析，12:1-1:1的石油醚/丙酮梯度洗脫，分離得到三個組分fr.1-1–fr.1-3；fr.1-2(10g)經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，1:1的氯仿/甲醇為洗脫劑，所富集的含有環(huán)肽的部分再經(jīng)硅膠柱層析，10:1-3:1的氯仿/乙酸乙酯梯度洗脫，得到三個組分fr.1-2-1–fr.1-2-3；fr.1-2-1(34mg)組分經(jīng)odshplc半制備柱純化，20％乙腈和5‰三氟乙酸為流動相，得到astinl(10)(5mg)；fr.1-2-2(231mg)再經(jīng)硅膠柱層析，1:3的氯仿/乙酸乙酯為洗脫劑，得到astink(9)(20mg)。對fr.2(15g)經(jīng)硅膠柱層析，2:1-1:2的石油醚/丙酮梯度洗脫，得到五個組分fr.2-1–fr.2-5；其中fr.2-2(2.8g)再經(jīng)硅膠柱層析，7:1的氯仿/甲醇等度洗脫，得到四個組分fr.2-2-1–fr.2-2-4；fr.2-2-1(786mg)經(jīng)sephadexlh-20層析，1:1的氯仿/甲醇為洗脫劑，得環(huán)肽組分經(jīng)odshplc半制備柱純化，35％乙腈和5‰三氟乙酸為流動相，得到astinf(6)(10mg)，astinh(8)(15mg)和astinm(11)(7mg)；fr.2-3(1.1g)經(jīng)sephadexlh-20層析，1:1的氯仿/甲醇為洗脫劑，得環(huán)肽組分再經(jīng)硅膠柱層析，20:1-5:1的氯仿/甲醇梯度洗脫，得到四個組分fr.2-3-1–fr.2-3-4，其中fr.2-3-4(41mg)經(jīng)odshplc半制備柱純化得到astinn(12)(5mg)；fr.2-4(789mg)經(jīng)硅膠柱層析，20:1-5:1氯仿/甲醇梯度洗脫，得到astind(4)(200mg)；fr.2-5(971mg)經(jīng)sephadexlh-20層析，1:1的氯仿/甲醇為洗脫劑，得兩組分fr.2-5-1–fr.2-5-2；其中fr.2-5-1(128mg)經(jīng)硅膠柱層析，25:1的乙酸乙酯/甲醇等度洗脫，得到astina(1)(12.7mg)；fr.2-5-2(78mg)經(jīng)反復硅膠柱層析，用氯仿/丙酮洗脫分離得到astino(13)(3mg)。對fr.3(30g)經(jīng)硅膠柱層析，1:1-1:2的石油醚/丙酮梯度洗脫，得到三個組分fr.3-1–fr.3-3；其中fr.3-1(8g)再經(jīng)硅膠柱層析，3:1-5:1的氯仿/乙酸乙酯為洗脫劑進行梯度洗脫，合并得到五個組分fr.3-1-1–fr.3-1-5。其中fr.3-1-2(3g)經(jīng)sephadexlh-20層析，1:1的氯仿/甲醇為洗脫劑，合并環(huán)肽部分，該部分經(jīng)甲醇重結晶得到化合物astinc(3)(1.4g)；fr.3-2(12g)經(jīng)rp-18柱層析，10％-80％的甲醇/水梯度洗脫，得到三個組分fr.3-2-1–fr.3-2-3；fr.3-2-2(4.1g)經(jīng)sephadexlh-20層析，1:1的氯仿/甲醇為洗脫劑，得到富集環(huán)肽的部分；該部分再經(jīng)硅膠層析，20:1-5:1的氯仿/甲醇為洗脫劑梯度洗脫，得到四個組分fr.3-2-2-1–fr.3-2-2-4；fr.3-2-2-2(821mg)經(jīng)odshplc半制備柱純化，45％乙腈和5‰三氟乙酸為洗脫劑，得到astinp(14)(12mg)和astine(5)(200mg)；fr.3-2-2-3(44mg)經(jīng)odshplc半制備柱純化，15％乙腈和5‰三氟乙酸為洗脫劑，得到asting(7)(12mg)。fr.3-2-2-4(1.3g)經(jīng)硅膠柱層析，1:3-1:9的氯仿/乙酸乙酯梯度洗脫，將環(huán)肽部分富集，該部分經(jīng)sephadexlh-20層析純化后，再經(jīng)硅膠柱層析，15:1-5:1氯仿/甲醇梯度洗脫，得到化合物astinb(2)(786mg)。

實施例2

實施例1制備所得菊科類型環(huán)肽化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)在mef細胞中檢測對dna類似物isd刺激激活的cgas-sting信號通路下游基因表達的影響。實驗原理、方法和結果如下：

實驗原理：在固有免疫信號轉(zhuǎn)導通路中，cgas-sting信號通路能夠識別入侵機體的外源dna病原微生物。外源dna刺激能夠誘導下游i型干擾素基因和干擾素刺激基因的表達。因此，在外源dna(dna類似物isd)刺激下，通過檢測通路下游基因ifnβ，ifnα4和cxcl10的表達可以反映cgas-sting信號通路的激活情況，從而評價化合物對cgas-sting信號通路激活的影響。

實驗方法：(1)細胞培養(yǎng)：mef細胞使用含有10％胎牛血清(gibco)及含50u/ml盤尼西林和50μg/ml鏈霉素的dmem(invotrogen)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5％的co2，每兩天傳代一次；(2)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染與化合物處理：將mef細胞鋪于12孔細胞培養(yǎng)板中，用10μm相應的化合物和等量的dmso預處理細胞6小時后，用lipo2000(invotrogen)轉(zhuǎn)染5μgisd刺激細胞，6小時后棄去培養(yǎng)液，用pbs將細胞離心收集于ep管中；(3)rna抽提：用500μltrizol將(2)中細胞裂解，然后加入100μlchcl3萃取裂解液中的rna，4℃12000g離心15min，轉(zhuǎn)移200μl最上層清液到新的ep管中，加入等體積的異丙醇將rna沉淀出來，靜置10min后，4℃12000g離心10min，去掉上清，加入1ml含75％乙醇的depc水清洗沉淀，4℃7500g離心5min，去掉上清，并在室溫干燥沉淀5min，然后用適量的depc水溶解rna進行后續(xù)實驗；(4)實時熒光定量pcr檢測下游基因表達：以(2)中抽提得到細胞總rna為模板，以oligodt為引物，通過逆轉(zhuǎn)錄得到cdna。使用powersybrgreenpcrmastermix(abi)試劑進行實時熒光定量pcr，以gadph作為內(nèi)參基因。

實驗結果見圖2。其中，圖2a為本發(fā)明的菊科類型環(huán)肽化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)在mef細胞中對dna類似物isd刺激激活的ifnβmrna表達的抑制作用；圖2b為astinc(3)在mef細胞中對dna類似物isd刺激激活的cgas-sting信號通路下游基因ifnβ，ifnα4和cxcl10的表達的影響。

實驗結果顯示，菊科類型環(huán)肽化合物能夠抑制dna類似物isd刺激下cgas-sting信號通路下游基因ifnβ，ifnα4和cxcl10的表達，其中astinc活性最好，說明菊科類型環(huán)肽能抑制cgas-sting信號通路活性，是目前發(fā)現(xiàn)的第一個該通路的抑制劑。

實施例3

實施例1制備所得菊科類型環(huán)肽化合物astinc(3)對hsv-1誘導的小鼠血清中ifnβ蛋白表達的影響。

實驗原理：機體內(nèi)ifnβ蛋白的表達是固有免疫抗感染反應的標志事件，ifnβ表達后能夠激活干擾素受體(ifnr)信號轉(zhuǎn)導通路誘導干擾素刺激基因等細胞因子和炎癥因子的表達，然后通過招募nk細胞或進一步激活適應性免疫反應等分子機制，最終清除入侵的病原微生物。因此，在dna病毒hsv-1感染小鼠后，通過檢測小鼠血清中ifn-β的表達量可以反映機體抗固有抗感染免疫反應的激活情況，從而評價化合物對機體固有抗感染免疫反應活性的影響。

實驗方法：(1)構建hsv-1感染小鼠模型：取6-8周齡的野生型小鼠，通過尾靜脈注射的方式將100μl滴度為1×10⁷的hsv-1注射入小鼠體內(nèi)，6h后收集獲得血清進行后續(xù)實驗；(2)化合物處理小鼠方式：通過尾靜脈注射的方式向野生型小鼠注射一定濃度的化合物，每隔一天注射一次，注射3次；(3)眼眶取血法收集小鼠血液獲得血清：用毛細管刺破小鼠眼眶毛細血管，通過毛細管引流收集200μl外周血到ep管中，室溫靜置過夜，然后3000rpm離心10min，取上清；(4)elisa檢測血清中ifnβ蛋白含量：根據(jù)verikine試劑盒(pblassayscience)的實驗操作手冊上的方法步驟檢測小鼠血清中的ifnβ蛋白的含量。

實驗結果見圖3。

實驗結果表明，菊科類型環(huán)肽化合物astinc(3)能夠明顯降低hsv-1誘導的小鼠血清中ifnβ蛋白含量，說明菊科類型環(huán)肽能在體內(nèi)抑制cgas-sting信號通路活性。

實施例4

實施例1所得化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)，加入4％的硫酸乙醇溶液，ph＝4，過濾，干燥，制成硫酸鹽化合物1-14。

實施例5

實施例1所得化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)，加入4％的鹽酸溶液，ph＝4，過濾，干燥，制成鹽酸鹽化合物1-14。

實施例6

實施例1所得化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)，加入4％的酒石酸溶液，ph＝4，過濾，干燥，制成酒石酸鹽化合物1-14。

實施例7

實施例1所得化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)，加入4％的檸檬酸溶液，ph＝4，過濾，干燥，制成檸檬酸鹽化合物1-14。

實施例8

片劑：實施例1所得化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)或?qū)嵤├?-7所得的鹽10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸鎂5mg。

制備方法：將化合物或其鹽、乳糖和淀粉混和，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為10mg。

實施例9

安瓿劑：實施例1所得化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)或?qū)嵤├?-7所得的鹽2mg，氯化鈉10mg。

制備方法：將化合物或其鹽和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。

實施例10

注射用凍干劑：實施例1所得化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)或?qū)嵤├?-7所得的鹽10mg，碳酸氫鈉2mg，甘露醇252mg。

制備方法：將碳酸氫鈉、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30分鐘除熱原，過濾除去活性碳，在濾液中加入化合物或其鹽，超聲處理使溶解，用1n鹽酸調(diào)節(jié)ph為5.0-7.0，微孔濾膜濾過，加注射用水，分裝，冷凍干燥，上塞，軋蓋，即得。

實施例11

膠囊劑：實施例1所得化合物astinsa-h(1-8)和astinsk-p(9-14)或?qū)嵤├?-7所得的鹽10mg，乳糖187mg，硬脂酸鎂3mg。

制備方法：將化合物或其鹽與助溶劑混和，過篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。