本發(fā)明屬于組織工程支架領域，特別涉及一種pfb水響應形狀記憶組織工程支架及其制備方法。

背景技術：

自1980s，形狀記憶聚合物(smps)一直在迅速發(fā)展。形狀記憶聚合物，是指在某種外界剌激下這種聚合物能自發(fā)的從臨時形狀回復到初始形狀。初始形狀是從材料最初的加工過程中獲得的形狀，而臨時形狀是其在外力作用下變形并固定得到的形狀。形狀記憶聚合物可對熱、磁、電、光、濕氣，和一些化學刺激(例如ph變化)。

形狀記憶聚合物(smps)作為一類智能材料，在生物材料中占有重要的地位。在手術縫合線、支架、心臟瓣膜、藥物釋放、矯形術及光學治療等具有廣泛的應用，尤其在組織工程支架方面。例如：在2002年，a.lendein等研究顯示smp能夠作為自緊手術縫合線(self-tighteningsuture)用于微創(chuàng)手術中。作者選擇生物相容性良好且可生物降解的聚己內酯－聚對二氧環(huán)己酮共聚物，材料在20℃下對傷口進行縫合后，只需要依靠人體溫度就可以將縫合線自動收縮變緊，通過外置加熱升溫至41℃手術縫合線收縮得更加緊湊進而促進傷口的愈合。由于材料還具有可生物降解性能，因而當傷口愈合后減去了再次拆線的二次手術，避免了額外的線拆除手術給病人帶來的痛苦；michaelm等制備了一種可在37℃水中自動鋪展的網(wǎng)絲，網(wǎng)絲由丁基-丙烯酸/二甲基丙烯酸酯/二羥甲基丙酸光聚合而得。該材料可用于微創(chuàng)手術中的傷口包扎，并可根據(jù)實際操作的時間需求來調節(jié)材料中成分的比例；wardsmalliv加工了一種熱塑性形狀記憶聚合物，該聚合物可利用一種激光激發(fā)來消除凝血塊。在植入手術中，這種桿狀的smp微執(zhí)行器可植入到血管閉塞的地方，執(zhí)行器的末端接了一個光學纖維，然后通過激光加熱使其轉變到預先設置的直線型，而當展開到螺旋狀時，執(zhí)行器可伸縮并且捕捉血栓，從而消除血栓。

這些利用直接熱刺激或間接熱刺激的支架、器件在使用過程中均受溫度控制，一則溫度敏感，操作和材料的要求大大提高，二則在使用間接熱刺激時，對周圍組織有著潛在危害。而體內水的比重約為70％，水響應形狀記憶材料在體內操作時較易實現(xiàn)，且克服了上述問題；此外，在研究生物醫(yī)用的水響應形狀記憶材料時，需考慮材料的生物相容、生物降解以及生物活性等生物特性。

目前，較為熱點的水響應形狀記憶材料主要包括天然材料、基于生物大分子的復合材料以及少量共聚材料。xueliangxiao和z.q.liu報道了動物毛發(fā)的形狀記憶特點，因為動物毛發(fā)中含有大量的角蛋白，該類材料廣泛存在于自然界，并對水敏感，此外建立了形狀記憶高分子模型，有力于之后形狀記憶高分子的合成；biqiongchen等和joaof.mano等分別制備納米微晶纖維素(cncs)/聚癸二酸丙三醇酯聚氨酯(pgsu)、殼聚糖(cht)/生物活玻璃納米粒子(bg-nps)水響應的形狀記憶復合材料。

天然材料分子結構單一，不易加工，且在生物醫(yī)用過程中有潛在的排斥性；基于生物高分子的復合材料組成有限制性，物理、化學性質約束性。因此基于水響應形狀記憶材料的實用性、多樣性等特點，合成水響應形狀記憶高分子在生物醫(yī)學領域有著很大的潛力。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種pfb水響應形狀記憶組織工程支架及其制備方法，該支架使用的pfb具有良好的親水性和熱穩(wěn)定性；熱處理加工制備多孔的pfb支架，其力學性能可通過加工時間來調控；該支架在溫和條件下具有顯著的水響應形狀記憶效應；此外，由于大量裸露的羥基，pfb可功能化修飾；同時pfb也被證明有良好的生物相容性，在生物醫(yī)療領域有著潛在的應用。

本發(fā)明提供了一種pfb水響應形狀記憶組織工程支架，所述支架為由羥基化的高分子材料pfb通過交聯(lián)得到的多孔支架；其中，pfb的結構式為：

所述pfb上的羥基作為活性位點進行功能化修飾。

本發(fā)明還提供了一種pfb水響應形狀記憶組織工程支架的制備方法，包括：

(1)將重結晶的富馬酸和1,2,3,4-二環(huán)氧丁烷在無水無氧的n2環(huán)境下混合，再加入催化劑和溶劑，90℃-100℃下通過酸誘導環(huán)氧開環(huán)反應制得pfb；

(2)將pfb配制成溶液，隨后通過鹽析法交聯(lián)得到pfb水響應形狀記憶組織工程支架。

所述步驟(1)中的富馬酸和1,2,3,4-二環(huán)氧丁烷的摩爾比為1:1。

所述步驟(1)中的催化劑為四丁基溴化銨。

所述步驟(1)中的溶劑為n,n-二甲基甲酰胺。

所述步驟(2)中的交聯(lián)為熱交聯(lián)或光交聯(lián)。

首先，由天然材料、基于生物大分子的復合材料以及少量共聚材料的報道可知，水響應形狀記憶材料分子結構中可包括兩部分：一是穩(wěn)定的網(wǎng)絡結構，以確保材料的永久形態(tài)；二是分子開關，可分為氫鍵形成-氫鍵斷裂和玻璃態(tài)-高彈態(tài)之間的轉變，這一性質要求分子結構中含有親水性性官能團，極大部分是羥基和氨基。

其次，用于生物醫(yī)療的水響應形狀記憶材料還需有良好的生物特性，例如生物相容性、生物可降解性、生物活性。在本發(fā)明中，選擇聚酯材料，即pfb，一方面可滿足水響應性，另一方面可滿足其在生物醫(yī)療領域的可用性，最后，該聚合物具有可加工性，固化成型為支架，用于組織工程。

在該結構中，引入了聚酯骨架這一可生物相容材料，酯基可保證材料的生物降解特性，大量的羥基是材料呈現(xiàn)親水特點；此外，還可調節(jié)骨架中碳鏈的長度以調節(jié)材料的親水特性，根據(jù)實際需要，確定其具體的結構。

從二環(huán)氧化合物和二酸出發(fā)，一步制得羥基化的系列聚酯，通過進一步修飾可以引入羧基、氨基等豐富的功能團，為合成功能團化的可降解高分子提供了一個有力的平臺。本發(fā)明制備了一種具有水響應形狀記憶功能，其合成過程如方程式所示，且機械，降解性質優(yōu)良的新一代組織工程支架材料。

有益效果

本發(fā)明使用的pfb具有良好的親水性和熱穩(wěn)定性；熱處理加工制備多孔的pfb支架，其力學性能可通過加工時間來調控；該支架在溫和條件下具有顯著的水響應形狀記憶效應；此外，由于大量裸露的羥基，pfb可功能化修飾；同時pfb也被證明有良好的生物相容性，在生物醫(yī)療領域有著潛在的應用。

附圖說明

圖1為pfb單體的¹hnmr譜圖；

圖2為pfb單體的紅外光譜圖；

圖3a為pfb支架的紅外光譜圖；

圖3b為pfb支架的dsc曲線；

圖3c為pfb支架的孔隙率；

圖3d為濕態(tài)、干態(tài)下pfb支架的結構差異；

圖4a為不同交聯(lián)時間的支架的應力應變曲線；

圖4b為干態(tài)pfb支架最大應力和彈性模量；

圖4c-d為濕態(tài)pfb支架循環(huán)壓縮測試(5％到40％，循環(huán)5次)；

圖4e為濕態(tài)pfb支架最大應力和彈性模量；

圖5為pfb支架的水響應形狀記憶效果：其中，a：支架的原始形態(tài)及其對應的微觀結構圖；b：支架的形變狀態(tài)及其對應的微觀結構圖；c：支架的回復形態(tài)及其對應的微觀結構圖；

圖6a-c為pfb支架的固定率及回復率測試；

圖7a為pfb支架和plga支架的成骨細胞增值比例；

圖7b為pfb支架和plga支架的表面活成骨細胞比例，p<0.05；

圖7c為pfb支架和plga支架的成骨細胞形態(tài)；其中，a-c為pfb，e-g為plga，d和h分別為pfb和plga表面培養(yǎng)24h熒光圖像；

圖7d為pfb支架和plga支架的alp實驗。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1

(1)原料純化

富馬酸重結晶：稱取待純化的富馬酸60g置于燒瓶中，加入轉子，燒瓶上端接入冷凝回流裝置，升溫至80℃。逐漸加入蒸餾水，直至富馬酸全部溶解，溶液澄清。停止攪拌，倒出溶液，室溫下冷卻，待結晶析出后進行抽濾。重復上述步驟三次，將產(chǎn)物在60℃真空烘箱中干燥24h。

(2)pfb的合成

加料過程在手套箱中進行(水含量≦0.01ppm，氧含量≦0.01ppm)，稱量2.00g(17.14mmol)富馬酸，1.48g(17.14mmol)1,2,3,4-二環(huán)氧丁烷，33.15mg(0.10mmol)四丁基溴化銨，4mln’-n’二甲基甲酰胺(dmf)于25ml茄型反應瓶中，密封反應瓶拿出手套箱；其次，插氮氣球于反應瓶中，并將其置于90℃油浴鍋中攪拌(1000r/min)，反應在氮氣氛圍中進行，大約反應26h，即可得到所需聚合物pfb粉末大約2.36g，產(chǎn)率約為59％。

(3)結構表征

pfb主鏈包含較長的碳鏈和微親水的反式丁烯二酸，保持了合適的親疏水性，并通過核磁、紅外結構表征(圖1和圖2)，可以確定該聚合物的結構。

實施例2

利用鹽析法制備pfb多孔支架，具體操作如下：將干燥的氯化鈉顆粒用粉碎機磨碎，并用篩網(wǎng)篩取直徑在75-150μm的鹽粒備用，并將其填充響應的模具中，轉移至溫度為37℃，相對濕度為85％的恒溫恒濕箱內放置1.5h。然后取出置于100℃的真空烘箱中真空干燥1h，除去水分，制成鹽模。將pfb用四氫呋喃配置成100mg/ml的溶液，滴在鹽模中，待溶劑揮發(fā)后，放入真空烘箱中150℃交聯(lián)反應。交聯(lián)好的鹽模取出后放入蒸餾水中溶解，凈化后的支架冷凍干燥24h即可，此外可通過改變交聯(lián)時間來調控支架的交聯(lián)程度，分別制備pfb-24h,pfb-36h,pfb-48h。

(1)結構表征

pfb中含有大量裸露的羥基和羧基，此外主鏈含有大量的雙鍵，隨著交聯(lián)程度的增加，pfb支架中羥基和雙鍵強度逐漸減弱(圖3a)，從而表明在交聯(lián)過程中形成共價交聯(lián)網(wǎng)絡。此外，隨著加工時間的增加，支架的玻璃化轉變溫度逐漸增高(圖3b)，也表明支架的交聯(lián)度逐步提高。加工形成的pfb支架具有多孔結構，并且具有高的孔隙率，pfb-24h,pfb-36h,pfb-48h的孔隙率分別是91.08±0.01％,88.40±0.04％,91.97±0.12％(圖3c)。pfb是親水性材料，其水接觸角為25.6±1.7°，pfb支架是超親水性材料，極易吸水，水分子對其結構的影響如圖3d，支架中有大量自由水分子存在，即3400cm^-1處-oh的吸收峰，此外，水分子與材料中的-c＝o可形成氫鍵，即c＝o吸收峰發(fā)生偏移，從1708cm^-1偏移到1719cm^-1，結果表明水分子在pfb支架有兩種存在形式，即自由水和結合水。

(2)pfb支架力學性能：

實驗結果表明：干態(tài)下(圖4a,b)，在加工24h，36h后，支架的最大壓縮應力是28.12±0.45kpa,45.61±4.35kpa,支架的彈性模量是26.52±2.19kpa,182.27±22.35kpa，隨著交聯(lián)程度的增加，pfb支架的力學強度和彈性模量也隨之增加。而在濕態(tài)下，由于水分子對材料的影響，pfb支架具有良好的彈性(圖4c,d)。pfb-24h,pfb-36h在濕態(tài)下，支架的最大壓縮應力是1.68±0.01kpa,5.60±0.11kpa,支架的彈性模量是6.34±0.27kpa,20.36±0.97kpa。同時，循環(huán)壓力測試表明濕態(tài)的pfb支架可多次壓縮且回復率幾乎可達100％(圖4e)。(3)水響應形狀記憶：

為探究pfb支架的水響應形狀記憶效果，將pfb支架放入25℃蒸餾水中，其回復效果如圖5，可以看出初始的時候(圖5a)支架長度約為5.5mm，其有一定孔徑的多孔結；壓縮過后(圖5b)的長度約為1mm，支架的多孔結構幾乎消失；3分鐘內支架即可回復到5mm，其微觀的多孔結構再次出現(xiàn)(圖5c)，表明pfb支架的回復效果很好，可在短時間內實現(xiàn)宏觀與微觀的雙重回復。

通過回復率(圖6)可以更具體的探究pfb支架的形狀記憶效果。圖6a可看出pfb在初始階段的回復率也較大，越往后形變回復變緩并趨于穩(wěn)定，大于90％；支架可進行多次形變-回復，其固定率穩(wěn)定接近100％(圖6b)，而回復率也較穩(wěn)定，經(jīng)過多次后其回復率依舊可高于90％，同時也表明pfb支架的重復使用性較好(圖6c)。

(4)pfb的功能化修飾：

pfb含有大量裸露的羥基，其可作為活性位點，進行功能化修飾。以異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocynante,fitc)為分子模型探究pfb材料功能化的可能性。pfb表面添加含有fitc的丙酮溶液，40℃條件下反映3h，之后通過熒光可以觀察到fitc結合到pfb。(5)pfb細胞相容性實驗

圖7a顯示，pfb和plga之間在細胞粘附中無明顯差異。同樣地，分別在pfb和plga材料表面種植成骨細胞，實驗結果(圖7b)表明72h后pfb表面活細胞數(shù)量較多于plga，說明pfb在成骨細胞培養(yǎng)、增殖等方面有著潛在應用。利用f-肌動蛋白染色法來研究成骨細胞(圖7c)在pfb表面培養(yǎng)的形態(tài)(a-d)，其中plga-(e-h)作為對照組，實驗結果表明成骨細胞在pfb和plga表面均可較好的鋪展，表明pfb也可作為一種較好的培養(yǎng)成骨細胞的基材。堿性磷酸酶活性(alp)可表征成骨細胞的活性和功能，如圖7d所示，實驗結果表明14天時，pfb表面的成骨細胞的alp活性高于plga表面的成骨細胞。