本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及一種抗腹膜纖維化和感染的腹膜透析液及其制備方法。
背景技術：
腹膜透析作為一種治療終末期腎臟病(endstagerenaldisease，esrd)患者的方法，由于其居家治療，操作簡便，減少血源性疾病傳播，保護殘存腎功能等特殊優(yōu)點，近年來已得到廣泛的應用。其原理是以腹膜為半透膜,以不斷更換新鮮透析液來達到清除體內過多的水分及毒素的目的。相比于血液透析的透析膜而言,腹膜的孔徑較大,因而可清除大、中、小分子的毒素。
但是，目前市售的腹透液為了保持滲透梯度，常采用高濃度的葡萄糖溶液。然而，臨床實踐表明高濃度的葡萄糖會刺激腹膜，導致腹膜間皮細胞損傷，釋放tgf-β，vegf等生長因子，使間皮細胞逐漸失去上皮細胞表型，出現(xiàn)成纖維細胞特征，最終發(fā)生纖維化并導致腹膜超濾衰竭。腹膜損傷、感染、纖維化、超濾衰竭等問題不斷挑戰(zhàn)著腹膜透析技術的進一步發(fā)展。
通過選擇新的成分用于腹膜透析液中，研究合理的配方，以便配制出具有更好的生物相容性和抗腹膜纖維化作用的新型腹膜透析液，這是目前本技術領域亟待解決的技術問題。
zl201310452564.4，公開日2013年12月25日，公開了一種腹膜透析液，通過向常規(guī)腹膜透析液中添加濃度為0.01－5％w/v的吡非尼酮可延緩現(xiàn)有腹膜透析液中高濃度葡萄糖造成的腹膜纖維化進程。
zl201610665296.8，公開日2017年1月11日，公開了一種腹膜透析液，通過向常規(guī)腹膜透析液中添加濃度為0.01－5％w/v的氟非尼酮延緩現(xiàn)有腹膜透析液中高濃度葡萄糖造成的腹膜纖維化進程效果優(yōu)于吡非尼酮，用藥量也比吡非尼酮少。
目前已揭示莪術二酮具有調節(jié)免疫，抗腫瘤，抗病原，鎮(zhèn)痛等作用，但是目前尚未公開將莪術二酮應用到腹膜透析液中的相關研究。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術存在的問題，提供一種抗腹膜纖維化和感染的腹膜透析液，通過選擇新的成分用于腹膜透析液中，并篩選出合理的配方，使其具很好的穩(wěn)定性、抗腹膜纖維化和抗感染作用，提高超濾效率。
本發(fā)明的技術方案如下：
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種抗腹膜纖維化和感染的腹膜透析液，包括電解質和滲透劑，其創(chuàng)新點在于，所述的腹膜透析液還包括莪術二酮。
所述的電解質包括氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂中的至少一種；所述的滲透劑包括葡萄糖、葡聚糖、果糖、木糖醇、山梨糖醇、多聚糖中的至少一種或多種。
所述腹膜透析液還含有緩沖堿，所述緩沖堿為乳酸鹽、碳酸氫鹽、檸檬酸鹽、異檸檬酸鹽、蘋果酸鹽中的至少一種或多種。
所述腹膜透析液還含有醋酸鈉，醋酸鈉的加入有助于莪術二酮在整個體系中的穩(wěn)定，而且對抗纖維化和抗感染起協(xié)同作用。
優(yōu)選地，所述腹膜透析液中的主要成分濃度范圍如下：
鈉離子80-300meq/l
氯離子80-110meq/l
鈣離子0-4.0meq/l
鎂離子0-4.0meq/l
緩沖堿30-150meq/l
葡萄糖0-5％w/v
醋酸鈉0.1％-2％w/v
莪術二酮0.03％-2％w/v
腹膜透析液的ph值為6.0－8.0。
優(yōu)選地，前段述腹膜透析液中的莪術二酮含量為0.05％-1.5％w/v，醋酸鈉0.3％-1.5％w/v、腹膜透析液的ph值為6.0－7.0。
本發(fā)明的第二個目的在于，制備前段所述抗腹膜纖維化和感染的腹膜透析液的方法，包括如下步驟：
(1)將藥學上可接受的無水葡萄糖、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂溶于處方量20％的水中，水的溫度為40-60℃,用藥用級鹽酸溶液調節(jié)ph為2.8-3.5，微孔濾芯過濾，冷卻至室溫待用；
(2)將藥學上可接受的醋酸鈉、乳酸鈉溶于處方量30％的水中，通入co2，控制壓力為0.05-0.2mpa，至ph為6.0-6.5，水的溫度為30-40℃，微孔濾芯過濾，冷卻至室溫待用；
(3)將莪術二酮加入到步驟(2)冷卻至室溫的混合液中，以超聲頻率為30－80khz進行超聲分散，超聲分散時間為3－20分鐘，待用；
(4)將步驟(1)和步驟(3)得到的溶液進行混合，然后補充水至全量，再以超聲頻率為40－150khz進行超聲分散，超聲分散時間為10－30分鐘。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術的有益效果是：本發(fā)明腹膜透析液加入莪術二酮，采用合理配方和制備方法，使得本發(fā)明的腹膜透析液具有更好的抗腹膜纖維化和抗感染作用，提高超濾作用；加入醋酸鈉能夠使莪術二酮在整個體系中具有更好的穩(wěn)定性，而且對抗感染起協(xié)同作用。
具體實施方式
下面對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
本發(fā)明具體實施例的腹膜透析液配方參見下表1：
制備實施例1-3所述腹膜透析液的方法，包括如下步驟：
(1)將藥學上可接受的原料溶于處方量20％的水中，水的溫度為40-60℃,用藥用級鹽酸溶液調節(jié)ph為3.2，微孔濾芯過濾，冷卻至室溫待用；
(2)將藥學上可接受的醋酸鈉、乳酸鈉溶于處方量30％的水中，通入co2，控制壓力為0.1mpa，至ph為6.5，水的溫度為35-40℃，微孔濾芯過濾，冷卻至室溫待用；
(3)將莪術二酮加入到步驟(2)冷卻至室溫的混合液中，以超聲頻率為48-50khz進行超聲分散，超聲分散時間為15分鐘，待用；
(4)將步驟(1)和步驟(3)得到的溶液進行混合，然后補充水至全量，再以超聲頻率為110－115khz進行超聲分散，超聲分散時間為10－30分鐘。
對比例0-3的制備方法根據(jù)對比例0-3的原料參照上述方法進行。
實驗1對抗纖維化的評價
一、實驗目的
通過對比分析指標：大鼠腹膜厚度和大鼠腹水和血液中tgf-β1濃度，以評價本發(fā)明實施例1-4中腹膜透析液的抗腹膜纖維化效果。
二、實驗方法
(1)大鼠腹膜厚度的測定
將對比例0和實施例1-4所述的腹膜透析液裝入三層共擠輸液用膜制袋中，濕熱滅菌，滅菌溫度115℃，滅菌時間30min。
將雄性sd大鼠90只按隨機數(shù)字表分為9組，即a組-i組，每組10只，其中，a組作為正常對照組，腹腔注射20ml生理鹽水；其余均采用余均采用4.25％葡萄糖透析液+脂多糖致腹膜纖維化模型，b組為模型對照組，腹腔注射20ml常規(guī)腹膜透析液(即對比例0所述透析液)，c組-i組，分別腹腔注射20ml實施例1-4,對比例1-3所制得的腹膜透析液，上述各組腹膜注射均為1次/d，觀察4周。
上述含葡萄糖透析液+脂多糖致腹膜纖維化模型的造模方法為：每日大鼠腹腔內直接注射4.25％含糖透析液20ml,并在第8、10、12天加入脂多糖75μg。
4周后取大鼠壁層腹膜組織，采用vangieson氏法染色即(vg法染色)：切片脫蠟至水，用weigert氏蘇木精染20min，流水沖洗10min，染vangieson氏液1min，用體積分數(shù)95％乙醇快速分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，封固。光學顯微鏡觀察，鏡下測量腹膜膠原厚度。
(2)血液中tgf-β1濃度的測定：
在無菌條件下用一次性無菌注射器抽取腹水，同時經(jīng)下腔靜脈采血。
采用雙抗體夾心elisa法對轉化生長因子tgf-β1濃度進行測定，具體方法為：將標準品、待測樣品加入到預先包被tgf-β1單克隆抗體透明酶標包被板中，37℃反應90分鐘，洗滌除去未結合的成分，再用抗體稀釋液稀釋的生物素抗大鼠tgf-β1抗體每孔加入0.1ml(1:100)，37℃反應60分鐘后，0.01mpbs洗滌除去未結合的成分，然后加入稀釋液稀釋的親和素過氧化物酶復合物每孔0.1ml(1:100)，37℃反應30分鐘，親和素和生物素特異性結合，0.01mpbs洗去未結合的酶結合物，tmb顯色液0.1ml加入每孔，反應15分鐘，底物(tmb)在辣根過氧化物酶(hrp)催化下轉化為藍色產(chǎn)物，加入終止液變黃，顏色的深淺與樣品中的tgf-β1濃度呈正相關，用酶標儀在450nm測定od值，根據(jù)標準品的濃度和樣品的od值計算待測轉化生長因子β1的濃度。
結果判定：將酶標板在酶標儀上，于450nm讀數(shù)，以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，生成標準曲線和直線回歸方程式，根據(jù)公式計算未知樣品的濃度，并記錄。
三、實驗結果
(1)大鼠腹膜厚度的試驗結果如下表2(
注：*p<0.05，與模型對照組b組比較。
從表2可知：與b組-模型對照組相比，c組-i組的腹膜厚度均有所減少或差異不大(g組-對比例1)，其中，與模型對照組b組相比：c組-f組的腹膜增厚降低差異顯著，且實驗期間sd大鼠的死亡率低；g組未加入莪術二酮腹膜增厚有所降低,但是差異不顯著；h組、i組的腹膜增厚降低，且差異顯著，說明濃度3-5％w/v的莪術二酮，有效延緩腹膜增厚的效果，但因g-h組濃度過高，實驗結束后，致死率達40％-60％。另外，h組、i組同為莪術二酮較高濃度組，h組與i組相比，腹膜增厚無顯著性差異(p>0.05)，可以看出當莪術二酮濃度大于2％時，對腹膜厚度影響較小。
(2)大鼠血液中tgf-β1濃度的試驗結果如下表3：
注：*表示p<0.05，與模型對照組b組比較。
從表3可知：與b組-模型對照組相比：c組-f組、h組、i組中腹水和血清中的tgf-β1值均有所降低,其中，與模型對照組b組相比：c組-f組、h組、i組的tgf-β1值差異顯著，且p<0.05，具有統(tǒng)計學意義；e組與f組比較，無顯著性差異(p>0.05)；h組、i組雖tgf-β1值顯著降低，但其致死率較高；g組因未加入莪術二酮的，與模型對照組相比，雖然tgf-β1值有所降低，但無顯著性差異。
實驗2對超濾的評價
一、滅菌方法：藥液裝入三層輸液用共擠膜所致袋中，濕熱滅菌，滅菌溫度115℃，滅菌時間30min。
二、試驗方法：
將雄性sd大鼠90只按隨機數(shù)字表分為9組，每組10只：
a組正常對照組腹腔注射20ml生理鹽水，b組為模型對照組，腹腔注射20ml常規(guī)腹膜透析液(即對比例0所述透析液)，c組-i組，分別腹腔注射20ml實施例1-4,對比例1-3所制得的腹膜透析液，上述各組腹膜注射均為1次/d，觀察4周。
三、超濾量的測定：4周后向大鼠腹腔灌注對比例0中的腹透液20ml，2h后處死，準確測量超濾量ml(超濾量＝最后出水量-20ml)。
a組正常對照組、b組模型對照組、c-i組超濾量分別為(4.39±1.41)ml，(-1.18±1.23)ml，(3.81±1.07)ml，(4.06±1.71)ml，(4.11±1.64)ml，(4.27±1.79)ml，(-0.89±1.17)ml，(4.35±1.61)ml，(4.43±1.72)ml；
可見，與a組正常對照組相比，b組的超濾量明顯降低；其中，c-f組、h組、i組比b組模型對照組超濾量提高，其中d-f組與g組相比，超濾量明顯增加；加入莪術二酮的d-f組與a組超濾量無顯著差異，說明莪術二酮可緩解長期透析造成的超濾衰竭，h組、i組說明當莪術二酮濃度從2％繼續(xù)增加時，超濾效果沒有顯著差異。
實驗3對穩(wěn)定性的評價
將對比例0中加入1％莪術二酮作為對照組二，將實施例3的腹膜透析液作為實驗組。
試驗方法：1、將對照組一、二、實驗組的藥液裝入三層輸液用共擠膜所致袋中，濕熱滅菌，滅菌溫度115℃，滅菌時間30min，每組5袋。
2、將藥袋置于40℃±2℃，相對濕度20％±5％條件下，于0、1、2、3、6個月取樣檢測藥袋中藥液的ph值、5-羥甲基糠醛、滲透壓摩爾濃度、可見異物、失水率、無水葡萄糖、乳酸鈉、氯化鈣、氯化鎂、總鈉、總氯含量，各項質量指標在各個考察時間點均符合貨架期標準的規(guī)定，與對照組1相比均未發(fā)生”顯著變化”，數(shù)據(jù)變異性小，產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。
3、針對本發(fā)明的莪術二酮在腹膜透析液體系中的穩(wěn)定性作出的檢測結果如下：
可見，加入醋酸鈉能夠使莪術二酮在整個體系中具有更好的穩(wěn)定性。
實驗4對抗感染的評價
步驟1、對若干體重為50g±1g的健康小鼠切除腎的大部分來誘發(fā)腎衰竭，具體操作為先以苯巴比妥(50mg/kg)腹腔注射麻醉，使小鼠仰臥，下肢交叉固定于手術臺上以暴露背部左腎區(qū)，從距左脊肋骨1.5cm處做斜向外方切口，然后腹膜取腎，暴露腎臟，分離腎周脂肪后，弧形切除約80％左腎組織，主要切除皮質部分，用明膠海棉壓迫止血片刻，再滴加數(shù)滴纖維蛋白原和凝血酶溶液，稍等片刻，當切面上不再有活動性出血后復位剩余左腎，縫合。一周后切除約80％右腎。
步驟2、每天用5ml對比例0的腹膜透析液定時注入若干只切除腎大部分的腎衰竭小鼠的腹腔留置，注入4h后取出透析液，15天后，選出感染程度為tnf-α50-60ng/ml，60-70ng/ml，70-80ng/ml的小鼠各3組，共9組每組10只小鼠；
步驟3、再分別用對比例0、對比例1的腹膜透析液繼續(xù)對tnf-α50-60ng/ml，60-70ng/ml，70-80ng/ml的6組小鼠進行每天腹腔注射留置4h再取出作為對照組，其中對比例0處理的為對照組1-3，對比例1處理的為對照組4-6，另3組tnf-α50-60ng/ml，60-70ng/ml，70-80ng/ml的小鼠作為實驗組采用本發(fā)明實施例3的腹膜透析液進行每天腹腔注射留置4h再取出透析液處理，如此實驗3天后、5天后、10天后測定大鼠腹腔液中tnf-α平均含量(測定方法請參見《腸球菌小鼠腹膜炎模型的建立》吳利先,黃文祥,孫小平，重慶醫(yī)科大學學報2007年第32卷第1期)，結果如下表所示。
由上表的結果可知，感染后的小鼠發(fā)生了急性炎癥,急性期細胞因子tnf-α急劇升高,在腹膜透析液未加入莪術二酮的對照組1-3中，小鼠的腹膜炎癥越來越嚴重，而在腹膜透析液加入醋酸鈉未加入莪術二酮的對照組4-6，小鼠的腹膜炎癥得到一定程度緩解，在加入莪術二酮的實驗組1-3中，小鼠的腹膜炎癥得到有效緩解；而且，從對照組4-6與實驗組1-3的數(shù)據(jù)可以看出，醋酸鈉和莪術二酮對抗感染起協(xié)同作用。
上述實施例只是本發(fā)明的較佳實施例，并不是對本發(fā)明技術方案的限制，只要是不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動即可在上述實施例的基礎上實現(xiàn)的技術方案，均應視為落入本發(fā)明專利的權利保護范圍內。