本發(fā)明屬于中藥
技術領域：
，具體涉及一種太白三七活性物質的提取方法及其應用。
背景技術：
：三七是我國特產的名貴藥材之一，為五加科植物三七的干燥根。太白山中草藥久負盛名，特別是太白三七具有極高的醫(yī)療價值，是珍貴的民族文化遺產。太白三七為為雙子葉植物藥傘形科植物紅花芹的根，主產于云南、陜西等地，始載于本草綱目，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有活血化瘀、消腫定痛、止血化瘀等功效，三七不同生長部位含有二十多種皂苷成分，其主要活性成分為三七總皂苷，三七總皂苷具有增加冠脈血流量，保護腦組織，擴血管和降壓等作用。目前的三七總皂苷提取工藝主要有水煎醇沉法、乙醇回流法和滲漉法。其中水煎醇沉法在水煎煮過程中因三七藥材含有大量的淀粉和多糖容易糊化；醇沉后由于沉淀的吸附作用皂苷損失較大，提取率較低，且產品組分的含量不太穩(wěn)定，多用于食品的開發(fā)；滲漉法提取率較高，操作簡單，提取液所含雜質少，但是溶劑消耗過大，主要用于藥品；乙醇回流法方法簡便，工藝條件易于控制，但提取率較低，并且這幾種提取方法均要求原料選用干燥的三七根莖(剪口)、加工邊角料進行提取，明顯使提取周期延長。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種太白三七活性物質的提取方法，解決了現(xiàn)有技術中太白三七活性物質提取方法提取效率低，提取出的活性物質中雜質含量高以及活性成分損失較大的問題。本發(fā)明的第一個目的是提供一種太白三七活性物質的提取方法，包括以下步驟：步驟1，原料的預處理：將太白三七干燥粉碎后過篩，得到太白三七粉；步驟2，太白三七提取液的制備：按照1g：10～30ml的比例往太白三七粉中加入質量濃度為75～85％的乙醇溶液浸泡12～24h，然后于60℃下超聲40～60min，超聲完畢后過濾，得第一次濾液和濾渣；按照1g：10～20ml的比例往濾渣中加入質量濃度為75～85％的乙醇溶液浸泡10～12h，然后于60℃下超聲10～30min，超聲完畢后過濾，得第二次濾液；合并第一次濾液和第二次濾液，得到混合提取液，將混合提取液濃縮回收乙醇，得到太白三七提取液；步驟3，太白三七提取液的預處理：往步驟2的太白三七提取液中加入相當于太白三七提取液重量5～10倍的去離子水，于40～70℃下攪拌至太白三七提取物完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的氨水溶液，調節(jié)體系ph為8～9，得到預處理太白三七提取液；步驟4，高速逆流萃?。簩㈩A處理太白三七提取液抽入萃取塔內，然后按照太白三七提取液與正丁醇體積比為1：1～3的比例往萃取塔內均勻導入正丁醇進行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為40～60℃，循環(huán)萃取3～5次后，得到萃取液，將萃取液濃縮回收正丁醇，得到太白三七活性物質粗品；步驟5，減壓液相色譜分離：將太白三七活性物質粗品與去離子水按照1g：3～5ml的比例混合、溶解，得到太白三七活性物質粗品的水溶液，往太白三七活性物質粗品的水溶液中加入相當于太白三七活性物質粗品重量1.5～2倍的硅膠拌樣，同時用相當于太白三七活性物質粗品重量20～30倍的硅膠濕法裝柱，徑高比為1：4～6，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.3～-0.1mpa，上樣，進行硅膠柱層析，并用正丁醇和乙醇的混合溶液作為洗脫劑進行洗脫，收集餾分，將餾分濃縮，得太白三七活性物質。優(yōu)選的，所述太白三七活性物質為太白三七總皂苷。優(yōu)選的，所述步驟1中太白三七干燥粉碎后過100目篩。優(yōu)選的，所述步驟2中超聲頻率為120～180hz。優(yōu)選的，所述步驟5中所用硅膠的規(guī)格為200～300目。本發(fā)明的第二個目的是提供一種太白三七活性物質在治療心血管疾病的藥物中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種太白三七中活性物質總皂苷的提取方法，該方法通過兩次乙醇浸泡結合超聲提取，最大程度的將太白三七中的活性物質提出來，然后再采用高速逆流萃取、減壓液相色譜分離以及重結晶，最后將總皂苷的純度提高到95％以上。本發(fā)明提取出的總皂苷含量高、質量穩(wěn)定、色澤好，以其為原料制成的中藥制劑，完全滿足現(xiàn)代中藥的要求。具體實施方式為了使本領域技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方案能予以實施，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。本發(fā)明各實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)試劑。實施例1一種太白三七活性物質的提取方法，包括以下步驟：步驟1，原料的預處理：取1000g太白三七干燥后粉碎，過100目篩，得到太白三七粉；步驟2，太白三七提取液的制備：往太白三七粉中加入15l質量濃度為75％的乙醇溶液浸泡12h，然后于60℃下超聲40min，超聲完畢后過濾，得第一次濾液和濾渣；往濾渣中加入10l質量濃度為75％的乙醇溶液浸泡10h，然后于60℃下超聲10min，超聲完畢后過濾，得第二次濾液；合并第一次濾液和第二次濾液，得到混合提取液，將混合提取液濃縮回收乙醇，得到172g太白三七提取液；步驟3，太白三七提取液的預處理：往步驟2的172g太白三七提取物中加入1.2l的去離子水，于70℃下攪拌至太白三七提取液完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的氨水溶液，調節(jié)體系ph為8，得到預處理太白三七提取液；步驟4，高速逆流萃?。簩㈩A處理太白三七提取液抽入萃取塔內，然后往萃取塔內均勻導入2l的正丁醇進行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為40℃，循環(huán)萃取5次后，得到萃取液，將萃取液濃縮回收正丁醇，得到121g太白三七總皂苷粗品；步驟5，減壓液相色譜分離：將121g太白三七總皂苷粗品用450ml去離子水溶解，得到太白三七總皂苷粗品的水溶液，往太白三七總皂苷粗品的水溶液中加入200g的硅膠拌樣，同時用2500g的硅膠濕法裝柱，徑高比為1：4，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.3mpa，上樣，進行硅膠柱層析，并用正丁醇和乙醇的混合溶液作為洗脫劑進行洗脫，收集餾分，將餾分濃縮，得到92g太白三七總皂苷，即收率為9.2％，經液相色譜分析，其純度為95.37％的。實施例2一種太白三七活性物質的提取方法，包括以下步驟：步驟1，原料的預處理：將1200g太白三七干燥后粉碎，過100目篩，得到太白三七粉；步驟2，太白三七提取液的制備：往太白三七粉中加入20l質量濃度為80％的乙醇溶液浸泡18h，然后于60℃下超聲50min，超聲完畢后過濾，得第一次濾液和濾渣；往濾渣中加入15l質量濃度為80％的乙醇溶液浸泡11h，然后于60℃下超聲20min，超聲完畢后過濾，得第二次濾液；合并第一次濾液和第二次濾液，得到混合提取液，將混合提取液濃縮回收乙醇，得到210g太白三七提取液；步驟3，太白三七提取液的預處理：往步驟2的210g太白三七提取物中加入1.5l的去離子水，于50℃下攪拌至太白三七提取液完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的氨水溶液，調節(jié)體系ph為8.5，得到預處理太白三七提取液；步驟4，高速逆流萃?。簩㈩A處理太白三七提取液抽入萃取塔內，然后往萃取塔內均勻導入3.5l正丁醇進行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為50℃，循環(huán)萃取4次后，得到萃取液，將萃取液濃縮回收正丁醇，得到145g太白三七總皂苷粗品；步驟5，減壓液相色譜分離：將145g太白三七總皂苷粗品用600ml去離子水溶解，得到太白三七總皂苷粗品的水溶液，往太白三七總皂苷粗品的水溶液中加入220g硅膠拌樣，同時用3600g的硅膠濕法裝柱，徑高比為1：5，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.2mpa，上樣，進行硅膠柱層析，并用正丁醇和乙醇的混合溶液作為洗脫劑進行洗脫，收集餾分，將餾分濃縮，得到110g太白三七總皂苷，即收率為9.17％，經液相色譜分析，其純度為96.08％的。實施例3一種太白三七活性物質的提取方法，包括以下步驟：步驟1，原料的預處理：將1500g太白三七干燥后粉碎，過100目篩，得到太白三七粉；步驟2，太白三七提取液的制備：往太白三七粉中加入30l質量濃度為85％的乙醇溶液浸泡24h，然后于60℃下超聲60min，超聲完畢后過濾，得第一次濾液和濾渣；往濾渣中加入20l質量濃度為85％的乙醇溶液浸泡12h，然后于60℃下超聲10min，超聲完畢后過濾，得第二次濾液；合并第一次濾液和第二次濾液，得到混合提取液，將混合提取液濃縮回收乙醇，得到258g太白三七提取液；步驟3，太白三七提取液的預處理：往步驟2的258g太白三七提取液中加入1.8l的去離子水，于40℃下攪拌至太白三七提取液完全溶解，然后往其中加入濃度為10％的氨水溶液，調節(jié)體系ph為9，得到預處理太白三七提取液；步驟4，高速逆流萃?。簩㈩A處理太白三七提取液抽入萃取塔內，然后往萃取塔內均勻導入4.5l正丁醇進行循環(huán)高速逆流萃取，控制萃取溫度為60℃，循環(huán)萃取3次后，得到萃取液，將萃取液濃縮回收正丁醇，得到178g太白三七總皂苷粗品；步驟5，減壓液相色譜分離：將178g太白三七總皂苷粗品用600ml去離子水溶解，得到太白三七總皂苷粗品的水溶液，往太白三七總皂苷粗品的水溶液中加入360g硅膠拌樣，同時用5300g硅膠濕法裝柱，徑高比為1：6，裝柱完畢后，控制柱壓為-0.1mpa，上樣，進行硅膠柱層析，并用正丁醇和乙醇的混合溶液作為洗脫劑進行洗脫，收集餾分，將餾分濃縮，得到135g太白三七總皂苷，即收率為9.0％，經液相色譜分析，其純度為96.21％。實施例1～3均提取出了純度在95％以上的太白三七總皂苷，由于實施例1～3提取出的太白三七總皂苷性能、純度基本相同，因此僅采用實施例2提取出的太白三七總皂苷在治療心血管疾病藥物中的應用作為說明。1、實驗材料：1.1、實驗動物昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半；wistar大鼠，體重200～230g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。1.2、受試藥物實施例2提取出的太白三七總皂苷；垂體后葉素、烏頭堿、mda試劑盒、hdl試劑盒、sod試劑盒、烏拉坦。2、實驗方法及結果2.1、對正常小鼠缺氧存活時間的影響取小鼠30只，隨機分為3組，每組10只：(1)對照組：iv10ml/kg生理鹽水；(2)太白三七總皂苷低劑量組：iv5mg/kg；(3)太白三七總皂苷高劑量組：iv30mg/kg；注射30min后將小鼠放入500ml磨口瓶中，觀察小鼠死亡時間。結果見表1。表1小鼠缺氧存活時間對比試驗組別存活時間(min)對照組45.38±12.39太白三七總皂苷低劑量組73.26±16.25*太白三七總皂苷高劑量組86.46±18.17*注：與對照組相比，*p＜0.05。從表1可以看出，注射太白三七總皂苷的小鼠在缺氧條件下存活時間明顯長于未注射的小鼠，說明太白三七總皂苷能顯著提高心臟供氧能力。2.2、對烏頭堿誘發(fā)的大鼠心律失常的影響取wistar大鼠30只，隨機分為3組，每組10只：(1)模型組：iv給予等容積生理鹽水；(2)太白三七總皂苷高低劑量組：iv5mg/kg；(3)太白三七總皂苷高劑量組：iv30mg/kg。30min后用20％烏拉坦(5mg/kg)進行腹腔注射麻醉，將動物仰位固定在鼠臺上，并與bl-420生物機能實驗系統(tǒng)相連，描記心電圖。大鼠心電圖穩(wěn)定后，正常對照組舌下靜脈注射生理鹽水，其余兩組舌下靜脈注射0.04％烏頭堿1ml/kg(40μg/kg)，5s內注完，觀測室性早搏(vp)的發(fā)生時間，并統(tǒng)計室性心動過速(vt)、室顫(vf)的發(fā)生率和竇性節(jié)律恢復率，結果見表2。表2烏頭堿誘發(fā)的大鼠心律失常的對比試驗表注：與模型組相比，*p＜0.05。從表2可以看出，注射太白三七總皂苷的大鼠在烏頭堿誘發(fā)的心律失常的條件下發(fā)生時間明顯晚于未注射的大鼠，說明太白三七總皂苷對心律失常有明顯治療作用。2.3、對氯仿誘發(fā)小鼠室顫的影響取小鼠30只，隨機分為3組，每組10只：(1)模型組：iv給予等容積生理鹽水、(2)太白三七總皂苷低劑量組：iv5mg/kg；(3)太白三七總皂苷高劑量組：iv30mg/kg。給藥后2～3min內，將小鼠逐個放入含有5ml氯仿棉球的倒置燒杯內，每換一只小鼠需加入0.5ml氯仿，讓小鼠吸入氯仿直至停止呼吸，停止呼吸后立即取出并與bl-420生物機能實驗系統(tǒng)相連，記錄心電圖，計算室顫發(fā)生率，結果見表3。表3氯仿誘發(fā)小鼠室顫的對比試驗組別室顫動物數(shù)(只)室顫率(％)模型組990太白三七總皂苷低劑量組220太白三七總皂苷高劑量組00注：與模型組相比，*p＜0.05。從表3可以看出，注射太白三七總皂苷的小鼠室顫率明顯降低，說明太白三七總皂苷對室顫有明顯的抑制作用。2.4、對垂體后葉素誘發(fā)大鼠心肌缺血的保護作用健康wistar大鼠40只，隨機分為4組，每組10只：(1)對照組：iv10ml/kg生理鹽水；(2)模型組：iv給予等容積生理鹽水；(3)太白三七總皂苷低劑量組：iv5mg/kg；(4)太白三七總皂苷高劑量組：iv30mg/kg。實驗前一日進行大鼠對垂體后葉素敏感性篩選實驗。方法是：大鼠舌下靜脈注射垂體后葉素1u/kg，觀察心電圖變化情況，選取對垂體后葉素敏感大鼠用于實驗(t波明顯抬高，st段抬高超過0.1mv)。將篩選獲得的敏感大鼠用于模型組和總皂苷組，24h后開始實驗。各組均以1ml/100g灌胃，1h后用20％的烏拉坦(5ml/kg)腹腔注射麻醉，將動物仰位固定在鼠臺上，并與bl-420生物機能實驗系統(tǒng)相連，記錄心電圖。正常對照組舌下靜脈注射生理鹽水，其余兩組舌下靜脈注射垂體后葉素1u/kg后，分別于即刻、1min后觀察心電圖變化。以t波和st段改變?yōu)橹笜?，判斷心肌缺血程度和藥物作用?0min后腹主動脈取血，離心分離血清，測定血清中乳酸脫氫酶(ldh)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)含量，結果見表4。表4對心肌缺血大鼠ldh、mda和sod的影響的對比試驗組別ldh(u/ml)mda(nmol/ml)sod(u/ml)對照組8.61±1.19**2.76±0.87**96.88±9.15**模型組9.92±1.25*4.83±1.56*73.56±8.90*太白三七總皂苷低劑量組9.20±1.59**3.15±0.64**79.73±9.05**太白三七總皂苷高劑量組9.01±1.58**2.82±0.83**90.86±9.16**注：與對照組相比，*p＜0.05；與模型組相比，**p＜0.05。從表4可以看出，注射太白三七總皂苷的wistar大鼠心肌缺血程度低，說明太白三七總皂苷對心肌缺血有顯著的治療效果。本發(fā)明在制備太白三七提取液的時候，將太白三七粉用乙醇浸泡后采用超聲提取，利用超聲的空化作用以及次級效應，加速提取成分的擴散并充分與溶劑接觸，從而使太白三七中的有效成分最大限度的被提取出來，減少了損失，極大的提高了提取率?；钚晕镔|提取出來后，往含有活性物質的提取液中加水以及氨水對其進行進一步處理，從而將提取液中的黃酮類、酚類等物質進行去除，有利于后續(xù)純化。經過氨水處理后的預處理太白三七提取液再采用高速逆流萃取，并以正丁醇為溶劑，能夠將預處理太白三七提取液中的總皂苷基本提取出來。經過高速逆流萃取后，得到太白三七總皂苷的粗品，粗品中含有少量黃酮、多糖等，采用減壓液相色譜對太白三七總皂苷進行純化，由于減壓柱色譜分離可以加快層析速度，縮短洗脫時間，同時在完成一個溶劑梯度展開，抽干后還可用另一梯度溶液再次對其展開，有效的防止了各組分之間的相互交叉和影響，極大的提高了分離效率，因此，經減壓液相色譜分離后能夠得到高純度的三七總皂苷。此外，相比于常規(guī)的常壓柱色譜和快速柱色譜分離而言，設備簡單、操作簡便、分離速度快、分辨率高、分離容量大、溶劑消耗少。需要說明的是，本發(fā)明權利要求書中涉及數(shù)值范圍時，應理解為每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用，由于采用的步驟方法與實施例1～3相同，為了防止贅述，本發(fā)明的描述了優(yōu)選的實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領域的技術人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內。當前第1頁12