本發(fā)明屬于桐花樹技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種桐花樹葉正丁醇提取物及其制備和治療結(jié)腸癌的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桐花樹(aegicerascorniculatum)，又名黑欖，紅葫，黑腳梗等，系紫金?？葡灎T果屬植物，是常見的紅樹植物，主要分布于我國廣西、廣東、福建及海南諸島，印度，中南半島，菲律賓以及澳大利亞也均有分布。桐花樹是傳統(tǒng)的中藥，民間常用其樹皮和葉子熬汁治療哮喘、糖尿病和風(fēng)濕等疾病?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)桐花樹提取物具有細胞毒性、抗真菌、止瀉、抗氧化與保肝等藥理作用。雖然，目前已有從有桐花樹莖和小枝的石油醚部位得到的衍生物具有抑制肝部腫瘤作用的報道，但對桐花樹葉正丁醇部位提取物的抗癌研究尚未見有報道。植物的不同部位及其不同溶劑提取物中所含的化學(xué)成分是有差別的，如竹茹和竹葉，竹茹來源為禾本科植物青稈竹莖的中間層，竹葉來源為禾本科植物淡竹的葉，朱梅和周惠燕等的研究表明這兩者所含化學(xué)成分是不一樣的。

結(jié)腸癌是結(jié)腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變，是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在整個惡性腫瘤中位居第3位。2017年我國癌癥中心發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示結(jié)腸癌等五大癌癥作為腫瘤死亡的主要原因，約占全部腫瘤死亡病例的70％。無論是在城市還是農(nóng)村，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率都呈現(xiàn)上升的趨勢。與三十年前相比，結(jié)腸癌標(biāo)化死亡率上升了11.2％。基于我國日益增長的人口基數(shù)，龐大結(jié)腸癌患者群必將成為整個公共衛(wèi)生事業(yè)的沉重負(fù)擔(dān)。

由于惡性腫瘤發(fā)病隱匿，結(jié)腸癌早期診斷率只有11％-15％，80％以上患者確診時已屬中晚期，而晚期結(jié)腸癌五年生存率低于20％。目前西醫(yī)治療結(jié)腸癌的方法主要有手術(shù)、放療、化療以及三者聯(lián)合治療等方案，但其毒副作用較大，且易引起腫瘤變異及耐藥。因此，從中醫(yī)藥中尋求新型、安全有效的的治療藥物是目前治療結(jié)腸癌的重要研究方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種桐花樹葉正丁醇提取物及其制備和治療結(jié)腸癌的應(yīng)用，以擴大桐花樹的使用范圍，為癌癥治療開辟新途徑。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

桐花樹葉正丁醇提取物在制備治療結(jié)腸癌藥物方面的應(yīng)用。

藥物為膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膏劑、合劑、混懸劑，該藥物以桐花樹葉正丁醇部位為活性成分，加入常規(guī)輔料按照常規(guī)工藝制成。

結(jié)腸癌源于人結(jié)腸癌細胞ht-29、sw480、dld-1。

桐花樹葉正丁醇提取物的制備方法，將桐花樹葉加入乙醇浸泡得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進行萃取，獲取下層水相，下層水相先加乙酸乙酯后加正丁醇繼續(xù)萃取，獲取上層正丁醇部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。

上述桐花樹葉正丁醇提取物的制備方法，按以下操作進行：將桐花樹葉曬干打成粗粉，加入25倍量95％乙醇浸泡7天；通過減壓濃縮得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，揮發(fā)至無乙醇味后，加入石油醚進行萃取，獲取下層水相，將下層水相加乙酸乙酯繼續(xù)萃取，得到的下層水相繼續(xù)加正丁醇繼續(xù)萃取，獲得上層正丁醇部位提取物，將上層正丁醇部位提取物水浴干燥，即得桐花樹葉正丁醇提取物。

上述制備方法得到的桐花樹葉正丁醇提取物。

為充分開發(fā)桐花樹資源，發(fā)明人建立了一種桐花樹葉正丁醇提取物的制備方法，將桐花樹葉加入乙醇浸泡得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進行萃取，獲取下層水相，下層水相先加乙酸乙酯后加正丁醇繼續(xù)萃取，獲取上層正丁醇部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。體外分子生物學(xué)實驗研究表明，桐花樹葉正丁醇提取物對人結(jié)腸癌ht-29、sw480、dld-1細胞具有增殖抑制作用，并可明顯抑制人結(jié)腸癌細胞ht-29、sw480、dld-1的克隆形成，主要是通過調(diào)節(jié)多條凋亡信號通路中的相關(guān)蛋白誘導(dǎo)癌細胞凋亡。因此，桐花樹葉正丁醇提取物在制備治療結(jié)腸癌藥物方面具有潛在應(yīng)用前景，可用于制備抗結(jié)腸癌藥物。深入開發(fā)桐花樹葉正丁醇提取物可以擴大桐花樹的使用范圍，為癌癥治療開辟新途徑。

附圖說明

圖1是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物對結(jié)腸癌細胞增殖抑制作用的結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物對人結(jié)腸癌細胞活性影響的平板克隆形成實驗結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物對人結(jié)腸癌細胞活性影響的結(jié)果柱狀圖。

圖4是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞(ht-29、sw480)凋亡結(jié)果的流式細胞儀圖。

圖5是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞人結(jié)腸癌細胞(ht-29、sw480)凋亡結(jié)果的柱狀圖。

圖6是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞(dld-1)凋亡結(jié)果的流式細胞儀圖。

圖7是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞人結(jié)腸癌細胞(dld-1)凋亡結(jié)果的柱狀圖。

圖8是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物調(diào)節(jié)凋亡信號通路蛋白表達的結(jié)果圖。

具體實施方式

一、桐花樹葉正丁醇部位提取物(nacl)的制備

1.藥材：桐花樹葉采于廣西防城港，經(jīng)廣西北部灣海洋研究中心許銘本鑒定為金牛科蠟燭果屬植物桐花樹的葉子。

2.提取與分離：將桐花樹葉曬干打成粗粉(2500g)，加入25倍量(62.5l)95％乙醇浸泡7天；通過減壓濃縮得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，揮發(fā)至無乙醇味后，加入石油醚進行萃取，獲取下層水相，將下層水相加乙酸乙酯繼續(xù)萃取，得到的下層水相繼續(xù)加正丁醇繼續(xù)萃取，獲得上層正丁醇部位提取物，將上層正丁醇部位提取物水浴干燥，即得桐花樹葉正丁醇提取物。

二、桐花樹葉正丁醇部位提取物藥效學(xué)研究

1.實驗材料

細胞株——人結(jié)腸癌細胞ht-29，sw480，dld-1由中國科學(xué)院細胞庫提供。

藥材——桐花樹葉

主要試劑和耗材——

主要試劑——

凋亡試劑盒(pharmingenfitcannexinvapoptosisdetectionkit1)：美國raybiotech公司；

細胞增殖檢測試劑盒(mts)：美國promega公司；

結(jié)晶紫染色液：中國碧云天公司；

氯仿、異丙醇、無水乙醇、水合氯醛等為國產(chǎn)分析純試劑。

主要耗材——

25cm²細胞培養(yǎng)瓶：美國bd公司；

6cm細胞培養(yǎng)皿、10cm細胞培養(yǎng)皿：美國bd公司；

細胞6孔板、24孔板、96孔板：美國bd公司；

15毫升離心管、50毫升離心管：美國bd公司；

凍存管：美國bd公司；

移液管：美國corning公司；

槍頭盒、ep管、pcr管：美國axygen公司；

主要儀器——

電動移液器、可調(diào)式移液器、低溫高速離心機：德國eppendorf公司生產(chǎn)；

細胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜、液氮罐：美國thermo科學(xué)公司；

-80℃生物超低溫冰箱：美國thermo科學(xué)公司；

超凈工作臺：蘇州金凈公司；

37℃細菌培養(yǎng)箱、烤箱：中國精宏公司；

倒置熒光顯微鏡：日本olympus公司；

掌上離心機：美國thermofisherscientific公司；

高壓滅菌鍋、-20℃生物冰箱、4℃生物冰箱：中國海爾公司；

碎冰制冰機：日本sanyo公司；

計算機：中國聯(lián)想公司；

nanodrop2000分光光度計：美國thermoscientific公司；

電磁攪拌器、酶聯(lián)免疫檢測儀：美國thermoscientific公司。

2.實驗方法

2.1細胞增殖實驗(mts)

(1)待細胞處于對數(shù)生長期時，用真空泵吸走細胞培養(yǎng)基，加入dpbs清洗細胞，棄掉dpbs后加入0.25％胰酶，待細胞大部分都可以脫離培養(yǎng)瓶時，加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吸取培養(yǎng)液將細胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放入離心機中設(shè)置1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，用真空泵吸走上清，加入5ml完全培養(yǎng)基重懸、混勻，進行細胞計數(shù)，重懸，將細胞的密度調(diào)整為2×10⁴個/ml，在96孔板中每孔加入100μl細胞懸液，即使得每個孔2000個細胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔，共設(shè)5個給藥梯度組(25，37.5，50，75，100μg/ml)，以及培養(yǎng)液對照組、dmso對照組。置于37℃，5％co2恒溫孵箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

(2)配置待測藥物母液：取待測藥物0.2g溶解于2mldmso中配成100mg/ml的母液，提取物不易溶解，需置于超聲儀超聲溶解，并用0.22μm尼龍過濾篩過濾后分裝于ep管，保存于-20℃。

(3)待細胞培養(yǎng)貼壁后，各列分別加入不同濃度梯度的桐花樹葉正丁醇部位提取物(25，37.5，50，75，100μg/ml)，對照組加入等體積的含對應(yīng)濃度dmso的完全培養(yǎng)基，以及單獨只含完全培養(yǎng)基的對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。

(4)分別在培養(yǎng)24、48、72h后，用排槍于每孔加入20μl完全融化后的celltiter96aqueousonesolutionreagent，然后將細胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，于酶標(biāo)儀上在490nm波光處處讀取吸光度值。將無細胞僅含培養(yǎng)基的孔作為空白孔，制作表格，縱坐標(biāo)為細胞活力，橫坐標(biāo)為藥物濃度，繪制出mts結(jié)果圖。并用軟件計算細胞生長抑制率，其公式為：

(5)以上實驗重復(fù)3次，用spss21檢驗統(tǒng)計分析，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性；并用graphpadprism5作線性圖，求出ic50。

2.2單細胞克隆形成實驗

(1)取對數(shù)生長期的細胞常規(guī)消化，重懸細胞，反復(fù)吹打，盡量使細胞充分分散，使分散度達到95％以上，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為200個/ml，每孔接種2ml于6孔板中，培養(yǎng)過夜。

(2)第二天加藥，設(shè)兩個藥物濃度，分別為12.5，25μg/ml，另設(shè)一個空白組(完全培養(yǎng)液)。

(3)細胞經(jīng)藥物作用4天后，棄掉培養(yǎng)液，重新給同樣的藥物。

(4)當(dāng)兩個細胞團交合時，用真空泵吸走培養(yǎng)液，加dpbs緩沖液清洗兩次，然后用4％的多聚甲醛固定15min。

(5)吸棄多聚甲醛，用結(jié)晶紫染色液染色35min。

(6)回收結(jié)晶紫，用dpbs緩沖液清洗兩次，吸走dpbs緩沖液，將六孔板用掃描儀掃描。

(7)用spss21檢驗統(tǒng)計分析本實驗重復(fù)三次的結(jié)果，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性，并用graphpadptism5作柱狀圖；

2.3細胞劃痕實驗

(1)在6孔板的背面借助直尺用marker筆畫橫線，每條線距離大約0.5cm左右，使6孔板的每個孔有5條直線經(jīng)過。

(2)將細胞消化下來的細胞離心后重懸計數(shù)后，以8×10⁵個/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置2個復(fù)孔。

(3)第二天細胞貼壁后鋪滿整個孔時，用絲裂霉素(0.5μg/m1)處理細胞，du145處理濃度為10μg/ml，pc320μg/ml，3小時后，再輔助以直尺，用10μl的槍頭均勻的于六孔板背面上標(biāo)記的線畫痕，確保畫的每條痕寬度一致，垂直背面的直線。

(4)用真空泵吸去含絲裂霉素的培養(yǎng)基，用dpbs清洗2遍六孔板后棄掉，加入完全培養(yǎng)基。給藥組濃度為12.5μg/ml，空白組為完全培養(yǎng)基。分別于22h時于顯微鏡下拍照，拍照時確保每孔每次拍照的位置保持一致。

(5)運用imagej進行傷口面積分析，計算傷口愈合率。細胞爬行的距離即0小時的寬度減去該時間點的寬度。遷移率＝1-拍照時的傷口面積/0小時傷口面積×100％。用spss21檢驗統(tǒng)計分析，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性，并用graphpadprism5作柱狀圖；

2.4細胞凋亡

(1)取對數(shù)生長期的細胞消化后接種于六孔板，于第二天給藥，設(shè)置兩個濃度組，一個對照組。藥物處理24h、48h、72h后，用bd細胞周期試劑盒處理細胞。

(2)取適量bd凋亡試劑盒中10×緩沖鹽溶液配成1×的緩沖液。分別在24、48、72h將三組細胞取出，棄去上清，加入提前預(yù)冷的dpbs清洗。加入0.25％胰酶消化細胞，用移液槍吸取培養(yǎng)液將細胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放入離心機中設(shè)置1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，去掉上清。

(3)取6個ep管，以a-f命名，用1×緩沖鹽溶液重懸各組細胞，計數(shù)后調(diào)為1×10⁶個/ml，從空白組分別取100μl細胞懸浮液于a-d四個ep管，從兩個給藥組分別取100μl細胞懸浮液于e，f管。

(4)向a，e，f管分別加入bd凋亡試劑盒中的av和pi試劑各5μl。向b管加入5μlav試劑，c管加入5μlpi試劑，混勻后置于黑暗的室溫中避光存放15min。

(5)于每個ep管中分別加入1×的緩沖鹽溶液400μl，混勻靜置15min后用流式細胞儀進行檢測。

(6)用軟件graphpadprism5分析作柱狀圖。

2.5統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用spss統(tǒng)計軟件處理分析數(shù)據(jù)，進行組間比較，*，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，**，p＜0.01差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

3.實驗結(jié)果

3.1細胞增殖實驗結(jié)果

桐花樹葉正丁醇部位提取物對人結(jié)腸癌細胞ht-29，sw480，dld-1都具有增殖抑制作用，其ic50如表1所示，細胞活性曲線如圖1所示。

表1桐花樹葉正丁醇部位提取物作用于結(jié)腸癌細胞的ic50(μg/ml)

3.2單細胞克隆形成實驗結(jié)果

桐花樹葉正丁醇部位提取物可明顯抑制人結(jié)腸癌細胞ht-29，sw480，dld-1的克隆形成，并與給藥濃度呈濃度依賴性。ht-29細胞的對照組克隆形成率為91.50％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為0.25％、50.63％；dld-1細胞的對照組克隆形成率為91.38％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為41.00％、80.88％；sw480細胞的對照組克隆形成率為88.25％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為16.50％、54.88％。細胞克隆形成數(shù)如圖2和圖3所示。

3.3流式凋亡檢測結(jié)果

桐花樹葉正丁醇部位提取物可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞ht-29，sw480，dld-1凋亡，高濃度組與對照組比較具有顯著差異(p＜0.01)，具體結(jié)果如圖4至圖7所示。

三、桐花樹葉正丁醇部位提取物抗癌機制研究

1.實驗材料

細胞株——人結(jié)腸癌細胞ht-29

藥物——桐花樹葉正丁醇部位提取物

主要試劑和耗材——

主要試劑——

ripa蛋白裂解液：美國sigma公司；

蛋白酶抑制劑：美國sigma公司；

30％聚丙烯酰胺：美國sigma公司；

過硫酸銨(aps)：美國sigma公司；

四甲基乙二胺(temed)：美國sigma公司；

蛋白上樣緩沖液(4×)：美國sigma公司；

蛋白質(zhì)預(yù)染marker：美國sigma公司；

tween-20(20％)：美國sigma公司；

絲裂霉素：美國sigma公司；

10％中性福爾馬林：美國sigma公司；

磷酸酶抑制劑(cocktail)2和3：美國sigma公司；

ripa1640培養(yǎng)基：美國gibco公司；

7.5％碳酸氫鈉：美國gibco公司；

4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)：美國gibco公司

胎牛血清：美國gibco公司；

三羥甲基氨基甲烷(trisbase)：美國6enbasebioscience公司；

十二烷基硫酸鈉(sds)：美國genbasebioscience公司；

聚偏二氟乙烯膜(0.22μmpvdf膜)：美國millipore公司；

ecl化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒：美國thermo公司；

脫脂奶粉：美國foodclub公司；

bca蛋白定量試劑盒：中國碧云天生物公司；

甲醇：中國振興化工廠；

主要耗材——

6cm細胞培養(yǎng)皿、10cm細胞培養(yǎng)皿：美國bd公司；

15毫升離心管、50毫升離心管：美國bd公司；

移液管：美國corning公司；

槍頭盒、ep管、pcr管：美國axygen公司；

主要儀器——

電動移液器、可調(diào)式移液器、低溫高速離心機：德國eppendorf公司生產(chǎn)；

細胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜、液氮罐：美國thermo科學(xué)公司；

-80℃生物超低溫冰箱：美國thermo科學(xué)公司；

超凈工作臺：蘇州金凈公司；

37℃細菌培養(yǎng)箱、烤箱：中國精宏公司；

細胞刮：由美國bd公司生產(chǎn)；

倒置熒光顯微鏡：產(chǎn)自日本olympus公司；

掌上離心機：美國thermofisherscientific公司；

高壓滅菌鍋、-20℃生物冰箱、4℃生物冰箱：中國海爾公司；

碎冰制冰機：日本sanyo公司；

計算機：中國聯(lián)想公司；

抗體——

兔抗人bcl-2克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：2870s)；

兔抗人bax克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：5023s)；

兔抗人puma克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：4976s)；

兔抗人bim克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：2933s)；

兔抗人p-akt克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：9271s)；

兔抗人akt克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：9272s)；

兔抗人gsk3β克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：9315s)；

兔抗人p-gsk3β克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：9323s)；

兔抗人parp克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：9542s)；

兔抗人cleavedparp克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：5625s)；

兔抗人cleavedcaspase-9克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：7237s)；

兔抗人caspase-7克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：9492s)；

兔抗人cleaved-caspase-7克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：8438s)；

兔抗人caspase-3克隆抗體(美國cellsignalingtechnology，貨號：9662s)；

2.實驗方法

(1)取對數(shù)生長期人結(jié)腸癌細胞ht-29分別接種于6cm培養(yǎng)皿，第二天給藥，空白組直接加等量體積的新鮮完全培養(yǎng)基，處理24h、48h、72h后，收取蛋白。

(2)用bca法測定蛋白濃度并變性。

(3)配制分離膠與積成膠后上樣進行電泳，上樣量為50μg/孔。

(4)用0.2umpvdf膜在冰盒中進行轉(zhuǎn)膜，電壓設(shè)置為90v，時間3個小時。

(5)用5％的脫脂牛奶于室溫?fù)u床上封閉膜一個小時。

(6)經(jīng)tbst清洗三遍，每遍5min，孵上相應(yīng)一抗，置于冰箱搖床上孵育過夜。

(7)第二天用tbst清洗三遍，每遍5min，孵上對應(yīng)的二抗，室溫?fù)u床上孵育1h。然后重復(fù)用tbst清洗三遍，每遍5min。

(8)進行化學(xué)發(fā)光，并用imagej等軟件進行處理分析。

3.實驗結(jié)果

桐花樹葉正丁醇部位提取物可誘導(dǎo)細胞發(fā)生線粒體凋亡以及caspase依賴性凋亡。如圖8所示，桐花樹葉正丁醇部位提取物可上調(diào)cleavedcaspase3，cleavedcaspase7，cleavedcaspase8，cleavedcaspase9，cleavedparp，p-bcl-2，puma，bad，bim，bak，bik，下調(diào)bcl-2的表達。