本發(fā)明屬于桐花樹技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種桐花樹葉石油醚提取物及其制備和治療結(jié)腸癌的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桐花樹(aegicerascorniculatum)為紫金牛科蠟燭果屬植物，是紅樹植物中分布很廣的一種植物，生長(zhǎng)于海邊潮漲潮落的污泥灘上。目前研究顯示其化學(xué)成分主要含有萜類、甾體、黃酮、多酚等，藥理作用主要有細(xì)胞毒性，抗真菌、止瀉、抗氧化等。由于植物化學(xué)成分的多樣性與復(fù)雜性，即使是同一種植物，其不同藥用部位的功效及其所含化學(xué)成分也會(huì)存在很大差異，如麻黃和麻黃根，麻黃主要含麻黃堿和偽麻黃堿，而麻黃根則主要為大環(huán)精胺類生物堿。而對(duì)于桐花樹的研究，多見于桐花樹莖、枝和皮，且多關(guān)注于其乙醇、水提部位，對(duì)桐花樹葉石油醚部位抗癌的研究尚未見有報(bào)道。

隨著發(fā)病率以及死亡率的上升，惡性腫瘤已成為中國(guó)城市和農(nóng)村居民的第1位死亡原因。結(jié)腸癌屬于大腸癌，是消化系統(tǒng)惡性腫瘤。在我國(guó)發(fā)病率及病死率較高。近年來，城市人口結(jié)腸癌發(fā)病率比10年前上升1/3，農(nóng)村上升9％。早期診斷率只有11％～15％，80％以上患者確診時(shí)已屬中晚期，如能早期發(fā)現(xiàn)、治療，術(shù)后5年生存率可達(dá)90％以上，而晚期結(jié)腸癌五年生存率低于20％。由于癌癥多重復(fù)雜的病機(jī)，日益發(fā)達(dá)的醫(yī)療技術(shù)仍未能解決這一醫(yī)學(xué)難題。目前治療癌癥主要采用手術(shù)、放療、化療以及三者聯(lián)合治療等方案，但其毒副作用較大，且易引起腫瘤變異及耐藥性的產(chǎn)生。中醫(yī)藥在提高患者生存質(zhì)量，減輕臨床癥狀，延長(zhǎng)生存期等方面顯示出了一定的優(yōu)勢(shì)。近年來研究表明，傳統(tǒng)中醫(yī)藥作為結(jié)腸癌手術(shù)及放化療的輔助治療手段，在提高患者生存質(zhì)量，減輕臨床癥狀，延長(zhǎng)生存期等方面顯示出了一定的優(yōu)勢(shì)。如扶正抗癌方與化療藥或免疫療法聯(lián)用都能起到協(xié)同增效的作用，不僅可以減輕毒副作用，降低復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，還能增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，提高結(jié)腸癌患者體力指數(shù)。因此，從中醫(yī)藥中尋求新型、安全有效的的治療藥物是目前治療結(jié)腸癌的重要研究方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種桐花樹葉石油醚提取物及其制備和治療結(jié)腸癌的應(yīng)用，以擴(kuò)大桐花樹的使用范圍，為癌癥治療開辟新途徑。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

桐花樹葉石油醚提取物在制備治療結(jié)腸癌藥物方面的應(yīng)用。

藥物為膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膏劑、合劑、混懸劑，該藥物以桐花樹葉石油醚部位為活性成分，加入常規(guī)輔料按照常規(guī)工藝制成。

結(jié)腸癌源于人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29、sw480、dld-1。

桐花樹葉石油醚提取物的制備方法，將桐花樹葉加入乙醇浸泡得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進(jìn)行萃取獲取上層石油醚部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。

上述桐花樹葉石油醚提取物的制備方法，按以下操作進(jìn)行：將桐花樹葉曬干打成粗粉，加入25倍量95％乙醇浸泡7天；通過減壓濃縮得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，揮發(fā)至無乙醇味后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取上層石油醚部位提取物，將上層石油醚部位提取物水浴干燥，即得桐花樹葉石油醚提取物。

上述制備方法得到的桐花樹葉石油醚提取物。

為充分開發(fā)桐花樹資源，發(fā)明人建立了一種桐花樹葉石油醚提取物的制備方法，將桐花樹葉加入乙醇浸泡得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進(jìn)行萃取獲取上層石油醚部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。體外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，桐花樹葉石油醚提取物對(duì)人結(jié)腸癌ht-29、sw480、dld-1細(xì)胞具有增殖抑制作用，并可明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29、sw480、dld-1的克隆形成。因此，桐花樹葉石油醚提取物在制備治療結(jié)腸癌藥物方面具有潛在應(yīng)用前景，可用于制備抗結(jié)腸癌藥物。深入開發(fā)桐花樹葉石油醚提取物可以擴(kuò)大桐花樹的使用范圍，為癌癥治療開辟新途徑。

附圖說明

圖1是本發(fā)明桐花樹葉石油醚提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明桐花樹葉石油醚提取物對(duì)結(jié)腸細(xì)胞活性影響的平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明桐花樹葉石油醚提取物對(duì)結(jié)腸細(xì)胞活性影響的結(jié)果柱狀圖。

具體實(shí)施方式

一、桐花樹葉石油醚部位提取物(pacl)的制備

1.藥材：桐花樹葉采于廣西防城港，經(jīng)廣西北部灣海洋研究中心許銘本鑒定為金牛科蠟燭果屬植物桐花樹的葉子。

2.提取與分離：將桐花樹葉曬干打成粗粉(2500g)，加入25倍量(62.5l)95％乙醇浸泡7天；通過減壓濃縮得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，加熱揮發(fā)至無乙醇味后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取上層石油醚部位提取物，將上層石油醚部位提取物水浴干燥，即得桐花樹葉石油醚提取物。

二、桐花樹葉石油醚部位提取物對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖抑制作用研究

1.實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株——人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29，sw480，dld-1，由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

藥材——桐花樹葉

主要試劑和耗材——

主要試劑——

細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(mts)：美國(guó)promega公司；

結(jié)晶紫染色液：中國(guó)碧云天公司；

1640培養(yǎng)液：維森特公司

胎牛血清：美國(guó)gibco公司

氯仿、異丙醇、無水乙醇、水合氯醛等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

主要耗材——

25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶：美國(guó)bd公司；

10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿：美國(guó)bd公司；

96孔板：美國(guó)bd公司；

15毫升離心管、50毫升離心管：美國(guó)bd公司；

凍存管：美國(guó)bd公司；

移液管：美國(guó)corning公司；

槍頭盒、ep管、pcr管：美國(guó)axygen公司；

主要儀器——

電動(dòng)移液器、可調(diào)式移液器、低溫高速離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司生產(chǎn)；

細(xì)胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜、液氮罐：美國(guó)thermo科學(xué)公司；

-80℃生物超低溫冰箱：美國(guó)thermo科學(xué)公司；

超凈工作臺(tái)：蘇州金凈公司；

37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱、烤箱：中國(guó)精宏公司；

倒置熒光顯微鏡：日本olympus公司；

掌上離心機(jī)：美國(guó)thermofisherscientific公司；

高壓滅菌鍋、-20℃生物冰箱、4℃生物冰箱：中國(guó)海爾公司；

碎冰制冰機(jī)：日本sanyo公司；

計(jì)算機(jī)：中國(guó)聯(lián)想公司；

nanodrop2000分光光度計(jì)：美國(guó)thermoscientific公司；

電磁攪拌器、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)thermoscientific公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(mts)

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入dpbs清洗細(xì)胞，棄掉dpbs后加入0.25％胰酶進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞欲脫離瓶壁時(shí)加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吸取培養(yǎng)液將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放入離心機(jī)中離心，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基重懸、混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞重懸后調(diào)整密度為2×10⁴個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，即每個(gè)孔2000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，共設(shè)5個(gè)給藥梯度組(37.5，50，75，100，150μg/ml)，以及培養(yǎng)液對(duì)照組、dmso對(duì)照組。置于37℃，5％co2恒溫孵箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

(2)配置待測(cè)藥物母液：用分析天平稱取待測(cè)藥物溶于dmso中配成100mg/ml的母液，設(shè)置超聲儀水浴溫度60℃，超聲溶解，并用0.22μm尼龍過濾篩過濾后分裝于ep管，保存于-20℃。

(3)細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，每組細(xì)胞分別加入不同濃度梯度的桐花樹葉石油醚部位提取物(37.5，50，75，100，150μg/ml)，對(duì)照組加入等體積的含對(duì)應(yīng)濃度dmso的完全培養(yǎng)基，以及單獨(dú)只含完全培養(yǎng)基的對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。

(4)分別在培養(yǎng)24、48、72h后，用排槍于每孔加入20μl完全融化后的celltiter96aqueousonesolutionreagent，然后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，于酶標(biāo)儀上在490nm波光處處讀取吸光度值。將無細(xì)胞僅含培養(yǎng)基的孔作為空白孔扣除由于藥物顏色產(chǎn)生的誤差。并用軟件計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，其公式為：

(5)以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用spss21檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性；并用graphpadprism5作線性圖，求出ic50。

2.2單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞常規(guī)消化，加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到15ml離心管，置于離心機(jī)離心。棄掉上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻，盡量使細(xì)胞充分分散，使分散度達(dá)到95％以上。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為400個(gè)/ml，每孔接種1ml于6孔板中，培養(yǎng)過夜。

(2)第二天加入桐花樹葉石油醚部位提取物進(jìn)行處理，設(shè)兩個(gè)藥物濃度，分別為12.5，25μg/ml，另設(shè)一個(gè)空白組(完全培養(yǎng)液)。

(3)細(xì)胞經(jīng)藥物作用4天后，棄掉培養(yǎng)液，重新給予同樣的藥物。

(4)當(dāng)有細(xì)胞團(tuán)交合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，加dpbs緩沖液清洗兩次，然后用4％的多聚甲醛固定15min。

(5)吸棄多聚甲醛，用結(jié)晶紫染色液染色35min。

(6)回收結(jié)晶紫，用dpbs緩沖液清洗細(xì)胞兩次，棄掉dpbs緩沖液，待孔板晾干后，用掃描儀掃描六孔板。

(7)用spss21檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次的結(jié)果，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性，并用graphpadprism5作柱狀圖；

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用spss統(tǒng)計(jì)軟件處理分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行組間比較，*，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**，p＜0.01差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

桐花樹葉石油醚部位提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29，sw480，dld-1的增殖具有抑制作用。其ic50如表1所示，細(xì)胞活性曲線如圖1所示。

表1桐花樹葉石油醚部位提取物作用于癌細(xì)胞的ic50(μg/ml)

3.2單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

桐花樹葉石油醚部位提取物可明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29，sw480，dld-1的克隆形成，并與給藥濃度呈濃度依賴性。ht-29細(xì)胞的對(duì)照組克隆形成率為86.50％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為18.13％、81.25％；dld-1細(xì)胞的對(duì)照組克隆形成率為75.13％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為2.50％、33.75％；sw480細(xì)胞的對(duì)照組克隆形成率為100％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為13.75％、56.75％。細(xì)胞克隆形成數(shù)如圖2和圖3所示。