本發(fā)明屬于生物材料和組織工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于

膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備方法。

背景技術(shù)：

膠原蛋白屬于結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在體內(nèi)以膠原纖維的形式存在。從新鮮的豬跟腱、牛跟腱等提取的膠原，能保持三股螺旋結(jié)構(gòu)，在模擬生理條件下能再形成纖維，能明顯激活細(xì)胞的生長，存在很好的生物活性及組織修復(fù)功能。但是由于存在力學(xué)強度差，易降解等特點大大限制了在醫(yī)學(xué)及組織工程上的應(yīng)用，因此提高膠原海綿的支架性能實現(xiàn)廣泛應(yīng)用尤其重要。

tempo氧化的納米纖維素分散液（tocn）具有比表面積大、長徑比高、機械強度高等特點，較玻璃纖維、鋼絲等材料具有更高的抗張強度。在復(fù)合材料制備中常常起到增強作用，同時在醫(yī)藥，組織工程等方面均具有很好的應(yīng)用前景。

組織工程首先需要材料具有良好的生物相容性，需要細(xì)胞在材料內(nèi)部長期生長而不影響組織功能的形成。納米纖維素與膠原海綿制備成的混合材料具有較好的機械強度，能夠避免膠原海綿遇液體易塌陷的缺點，同時便于細(xì)胞粘附及觀察，在長期三維培養(yǎng)過程中細(xì)胞依然能夠保持較好的生長狀態(tài)和細(xì)胞密度。綜上所述，膠原海綿-納米纖維素混合支架為細(xì)胞三維生長提供了良好的支架材料，為組織工程進一步應(yīng)用提供重要基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，現(xiàn)提供一種結(jié)果可靠、操作簡便、可重復(fù)性強，能夠長時間有效促進細(xì)胞的三維生長及增殖

的基于膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：基于膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備方法，其創(chuàng)新點在于：經(jīng)過膠原海綿的制備、納米纖維素的制備、膠原海綿-納米纖維素的制備和培養(yǎng)步驟，完成基于膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備方法；具體步驟如下：

（1）膠原海綿的制備：除脂，分離牛蹄筋、豬蹄、魚皮、軟骨、肌腱或皮膚組織在胃蛋白酶的醋酸溶液中消化完全，最后透析凍干得到膠原海綿；

（2）納米纖維素的制備：將紙漿粉碎后溶于蒸餾水中得到漿紙溶液，然后向漿紙溶液中加入一定量的tempo/nabr充分混勻，然后加入naclo氧化，反應(yīng)結(jié)束后離心去除上層液體，并離心洗滌數(shù)次，將下層納米纖維素溶于水溶液中超聲分散得到納米纖維素分散液；

（3）膠原海綿-納米纖維素的制備：將納米纖維素與膠原海綿進行混合，在800-1000r/min轉(zhuǎn)速下充分?jǐn)嚢杌靹?，然后將混合液放入容器中預(yù)凍4小時，然后取出放于冷凍干燥機中繼續(xù)凍干48小時，得到膠原海綿-納米纖維素；

（4）培養(yǎng)：將膠原海綿-納米纖維素稱重后放于48孔板，將293a、huvec、bmsc、u87和hepg2這5種細(xì)胞均勻生物打印于支架上，然后在10%fbs培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天，取樣檢測，完成基于膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備。

進一步的，所述步驟（1）中的透析選用截留分子為3500的透析袋，所述凍干溫度為4℃。

進一步的，所述步驟（2）中的漿紙選用去離子水進行清洗干凈，從而去除漿紙表面上的殘留雜質(zhì)。

進一步的，所述步驟（2）中的tempo在溶液中的濃度為0.4毫摩爾/升，所述nabr在溶液中的濃度為4毫摩爾/升、所述naclo在溶液中的濃度為3.8毫摩爾/升。

進一步的，所述步驟（4）中的fbs培養(yǎng)液浸沒膠原海綿，所述fbs培養(yǎng)液的更換時間為每兩天更換一次。

進一步的，所述步驟（4）中的檢測方法為：采用livedead試劑盒檢測膠原海綿材料對細(xì)胞相容性的影響，檢測14天內(nèi)細(xì)胞在膠原海綿上的生長增殖及功能形成情況。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供的基于膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備方法，結(jié)果可靠、操作簡便、可重復(fù)性強，能夠長時間有效促進細(xì)胞的三維生長及增殖，同時對各類人體三維微組織的生成，尤其是對肝癌組織功能的形成有一定的作用，從而能夠為肝組織工程的科學(xué)研究以及肝癌的臨床治療提供有益的參考。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的膠原海綿-納米纖維素細(xì)胞支架的形態(tài)圖；

圖2為本發(fā)明膠原海綿-納米纖維素細(xì)胞支架對各類細(xì)胞的生物相容性的形態(tài)圖；

圖3為本發(fā)明hepg2細(xì)胞在支架上第2天、第8天及第14天時的顯微形態(tài)。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點及功效。

如圖1所示為本發(fā)明的膠原海綿-納米纖維素細(xì)胞支架的形態(tài)圖；

基于膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備方法，經(jīng)過膠原海綿的制備、納米纖維素的制備、膠原海綿-納米纖維素的制備和培養(yǎng)步驟，完成基于膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備方法；具體步驟如下：

（1）膠原海綿的制備：除脂，分離牛蹄筋、豬蹄、魚皮、軟骨、肌腱或皮膚組織在胃蛋白酶的醋酸溶液中消化完全，最后透析凍干得到膠原海綿，透析選用截留分子為3500的透析袋，凍干溫度為4℃；

（2）納米纖維素的制備：先將漿紙選用去離子水進行清洗干凈，從而去除漿紙表面上的殘留雜質(zhì)，然后將紙漿粉碎后溶于蒸餾水中得到漿紙溶液，然后向漿紙溶液中加入一定量的tempo/nabr充分混勻，然后加入naclo氧化，反應(yīng)結(jié)束后離心去除上層液體，并離心洗滌數(shù)次，將下層納米纖維素溶于水溶液中超聲分散得到納米纖維素分散液，tempo在溶液中的濃度為0.4毫摩爾/升，nabr在溶液中的濃度為4毫摩爾/升、naclo在溶液中的濃度為3.8毫摩爾/升。

（3）膠原海綿-納米纖維素的制備：將納米纖維素與膠原海綿進行混合，在800-1000r/min轉(zhuǎn)速下充分?jǐn)嚢杌靹?，然后將混合液放入容器中預(yù)凍4小時，然后取出放于冷凍干燥機中繼續(xù)凍干48小時，得到膠原海綿-納米纖維素；

（4）培養(yǎng)：將膠原海綿-納米纖維素稱重后放于48孔板，將293a、huvec、bmsc、u87和hepg2這5種細(xì)胞均勻生物打印于支架上，然后在10%fbs培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天，fbs培養(yǎng)液浸沒膠原海綿，fbs培養(yǎng)液的更換時間為每兩天更換一次，取樣檢測。

圖2為24h內(nèi)膠原海綿-納米纖維素細(xì)胞支架對293a,r-bmsc,huvec,u87,hepg2三維培養(yǎng)過程中生物相容性的影響，結(jié)果該支架對多種細(xì)胞生物相容性均較好，可見細(xì)胞分布均勻，形態(tài)清楚。

為了進一步了解本發(fā)明方法的效果，對膠原海綿-納米纖維素細(xì)胞支架進行了相應(yīng)的檢測及鑒定。

（1）livedead試劑盒檢測海綿材料對細(xì)胞的生物相容性

培養(yǎng)24小時后，將海綿材料取出，滴加pbs清洗3次，孵育livedead試劑15分鐘后，滴加pbs清洗3次除去殘留試劑，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

（2）細(xì)胞在膠原海綿-納米纖維素上的3d培養(yǎng)

將膠原海綿-納米纖維素均勻剪成48孔大小置于孔板底部，紫外照射滅菌，將200μl細(xì)胞混懸液均勻生物打印于海綿上，細(xì)胞密度為2x10⁶/ml，每隔2天換液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天、8天及14天時顯微鏡拍攝細(xì)胞在海綿上的生長形態(tài)，具體形態(tài)如圖3所示，由圖3可知，細(xì)胞在海綿上聚集生長，細(xì)胞之間形成相互聯(lián)系，且14天時細(xì)胞生長依然良好，細(xì)胞生長過程中開始聚集成球。

本發(fā)明提供的基于膠原海綿-納米纖維素的三維細(xì)胞支架的制備方法，結(jié)果可靠、操作簡便、可重復(fù)性強，能夠長時間有效促進細(xì)胞的三維生長及增殖，同時對各類人體三維微組織的生成，尤其是對肝癌組織功能的形成有一定的作用，從而能夠為肝組織工程的科學(xué)研究以及肝癌的臨床治療提供有益的參考。

上述實施例只是本發(fā)明的較佳實施例，并不是對本發(fā)明技術(shù)方案的限制，只要是不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動即可在上述實施例的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的技術(shù)方案，均應(yīng)視為落入本發(fā)明專利的權(quán)利保護范圍內(nèi)。