本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物材料技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種具有孔隙大小自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力的膠原海綿制備方法及膠原海綿。

背景技術(shù)：

膠原是哺乳動物中含量最高、分布最廣泛的結(jié)構(gòu)性蛋白。作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原與聚多糖等成分一起組成具有高度細(xì)胞親和力和適度承力能力的細(xì)胞外微環(huán)境(細(xì)胞外基質(zhì))，為細(xì)胞的增殖、遷移和代謝提供不可或缺的生物場所。同時，膠原還以纖維、纖維束等形式參與皮膚、跟腱、角膜、血管等器官的構(gòu)建并發(fā)揮重要生物功能。由于膠原具有優(yōu)異的生物相容性、可降解性和良好的生物力學(xué)性能，近年來在生物醫(yī)學(xué)材料、醫(yī)學(xué)組織工程和醫(yī)學(xué)美容等領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。在這些領(lǐng)域中，膠原通常作為生物支架材料、空腔填充材料、藥物載體材料或細(xì)胞外基質(zhì)補(bǔ)充材料，用于創(chuàng)面覆蓋促愈合、人造器官構(gòu)建、藥物緩釋、皮膚美容除皺等。其中，膠原海綿是應(yīng)用最為廣泛的膠原類醫(yī)用產(chǎn)品，主要用于創(chuàng)面止血、空腔填充、促傷口愈合、燒燙傷創(chuàng)面覆蓋和促進(jìn)缺失皮膚組織再生等臨床領(lǐng)域。通常，膠原海綿的制造工藝包括膠原提取、純化、濃縮、交聯(lián)和凍干成型、滅菌和包裝等步驟。

膠原海綿的性能與制造工藝密切相關(guān)。膠原溶液濃度越高，則干燥后的膠原海綿空隙越致密、孔徑越小，海綿材料的形狀穩(wěn)定性和抗拉伸能力越強(qiáng)?；瘜W(xué)交聯(lián)或纖維重組技術(shù)經(jīng)常用于提高膠原海綿的生物穩(wěn)定性(熱穩(wěn)定性、耐酶降解性能)，以適應(yīng)海綿產(chǎn)品應(yīng)用的需要。其中，化學(xué)交聯(lián)方法可以在膠原分子內(nèi)或分子間形成共價鍵交聯(lián)，從而大幅提高膠原的生物穩(wěn)定性；而纖維重組技術(shù)是利用膠原特有的分子自組裝性能，通過在適宜條件下促進(jìn)膠原分子纖維化的方法提高膠原產(chǎn)品的生物穩(wěn)定性能。

在臨床應(yīng)用中，對膠原海綿類產(chǎn)品的性能指標(biāo)除了要求生物安全性、功能有效性外，還要求產(chǎn)品具有良好的形狀穩(wěn)定性、機(jī)械力學(xué)性和可降解性。為保證產(chǎn)品功能的持續(xù)性，往往還要求膠原海綿具有適宜的耐降解性。在促創(chuàng)面愈合和皮膚組織再生的應(yīng)用中，特別強(qiáng)調(diào)膠原海綿應(yīng)具有良好的促細(xì)胞增殖和組織再生能力。大量研究證實，組織創(chuàng)面的愈合和再生與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，而細(xì)胞附著微環(huán)境的空隙構(gòu)造與細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)。皮膚組織中最主要的成纖維細(xì)胞呈紡錘形，長度約50-80μm，直徑5-15μm。因此，理想的促細(xì)胞增殖生物敷料空隙物理尺寸應(yīng)大于100μm方能為成纖維細(xì)胞提供適宜的增殖、遷移和代謝空間。但是，過大的空隙尺度往往導(dǎo)致材料比表面積變小，細(xì)胞附著空間不足，同時直接導(dǎo)致材料機(jī)械強(qiáng)度大幅降低，材料形狀穩(wěn)定性和易操作性變差。目前，膠原海綿制造往往采用高濃度膠原溶液經(jīng)化學(xué)交聯(lián)和凍干致孔的方式制備。這種制備工藝通過提高膠原濃度和引入化學(xué)交聯(lián)的方法能有效增強(qiáng)材料的機(jī)械力學(xué)性能、形狀穩(wěn)定性能和耐降解性能。但是，由于過高的膠原濃度和化學(xué)交聯(lián)導(dǎo)致的分子聚集和收縮效應(yīng)，使材料空隙致密，且空隙尺度過小(一般小于50μm)，不能很好滿足細(xì)胞增殖、遷移所需的空隙尺度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能兼顧材料機(jī)械力學(xué)性能、適度耐降解性能和適宜空隙構(gòu)造的膠原海綿材料制備方法，以滿足醫(yī)用敷料、燒燙傷皮膚替代等醫(yī)用材料對產(chǎn)品各項性能的要求。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一方面提供一種具有孔隙大小自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力的膠原海綿制備方法，其特征在于，該制備方法包括：

(1)在冰浴條件下，用第一醋酸水溶液溶解天然膠原蛋白，并調(diào)節(jié)膠原溶液ph值至6-8，得到第一膠原溶液；

(2)向所述第一膠原溶液中添加戊二醛水溶液，混合均勻后恒溫培養(yǎng)，靜置得到纖維化并化學(xué)交聯(lián)的膠原膠；

(3)將所述膠原膠轉(zhuǎn)移至蒸餾水溶液中反復(fù)漂洗，去除未參與反應(yīng)的戊二醛，隨后冷凍干燥后得到大孔膠原海綿框架；

(4)用第二醋酸水溶液溶解天然膠原蛋白，得到第二膠原溶液；

(5)將所述大孔膠原海綿框架置入所述第二膠原溶液中，在抽真空條件下浸潤，隨后瀝干并冷凍干燥，得到初級膠原海綿，將所述初級膠原海綿再次置入所述第二膠原溶液中，在抽真空條件下浸潤，隨后瀝干并冷凍干燥，得到膠原海綿。

本發(fā)明的另一方面提供一種所述的具有孔隙大小自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力的膠原海綿制備方法制備的膠原海綿。

本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明通過兩次向大孔膠原海綿框架中導(dǎo)入高濃度膠原，增強(qiáng)了海綿材料密實性，提高了材料的機(jī)械強(qiáng)度、形態(tài)穩(wěn)定性和應(yīng)用操作性，有利于在使用初期為創(chuàng)面提供良好的隔絕效果和較大的細(xì)胞附著面積；另一方面，在產(chǎn)品使用的中后期，隨著內(nèi)源性酶的作用，導(dǎo)入的未經(jīng)化學(xué)交聯(lián)的膠原能快速降解，而原始的交聯(lián)的大孔膠原海綿框架依然留存，形成的大孔隙構(gòu)造能為后續(xù)細(xì)胞的增殖、遷移繼續(xù)提供適宜的生物空間；

(2)通過成纖維細(xì)胞的體外增殖實驗結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)7天時，與普通膠原海綿相比，成纖維細(xì)胞在本發(fā)明的方法制備的膠原海綿材料中細(xì)胞增值率提高顯著；

(3)與普通膠原海綿相比，本發(fā)明的膠原海綿可以智能化的適應(yīng)不同應(yīng)用階段對材料機(jī)械性能、致密性和空隙大小的需求，能較好的滿足臨床醫(yī)學(xué)的產(chǎn)品技術(shù)要求，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后具體實施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的上述以及其它目的、特征和優(yōu)勢將變得更加明顯。

圖1a示出了本發(fā)明的一個實施例的大孔膠原海綿框架的微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察圖。

圖1b示出了本發(fā)明的一個實施例的膠原海綿的微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察圖。

圖1c示出了對比例1的海綿產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察圖。

圖1d示出了對比例2的海綿產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察圖。

圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的實施例和對比例的膠原海綿產(chǎn)品抗拉伸實驗數(shù)據(jù)圖。

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的實施例1和對比例的膠原海綿產(chǎn)品在膠原酶溶液中的體外酶降解實驗數(shù)據(jù)圖。

圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的實施例和對比例膠原海綿產(chǎn)品的mtt細(xì)胞增殖實驗數(shù)據(jù)圖。

具體實施方式

下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。雖然以下描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，然而應(yīng)該理解，可以以各種形式實現(xiàn)本發(fā)明而不應(yīng)被這里闡述的實施方式所限制。相反，提供這些實施方式是為了使本發(fā)明更加透徹和完整，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整地傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。

本發(fā)明的一方面提供一種具有孔隙大小自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力的膠原海綿制備方法，該制備方法包括：

(1)在冰浴條件下，用第一醋酸水溶液溶解天然膠原蛋白，并調(diào)節(jié)膠原溶液ph值至6-8，得到第一膠原溶液；

(2)向所述第一膠原溶液中添加戊二醛水溶液，混合均勻后恒溫培養(yǎng)，靜置得到纖維化并化學(xué)交聯(lián)的膠原膠；

(3)將所述膠原膠轉(zhuǎn)移至蒸餾水溶液中反復(fù)漂洗，去除未參與反應(yīng)的戊二醛，隨后冷凍干燥后得到大孔膠原海綿框架；

(4)用第二醋酸水溶液溶解天然膠原蛋白，得到第二膠原溶液；

(5)將所述大孔膠原海綿框架置入所述第二膠原溶液中，在抽真空條件下浸潤，隨后瀝干并冷凍干燥，得到初級膠原海綿，將所述初級膠原海綿再次置入所述第二膠原溶液中，在抽真空條件下浸潤，隨后瀝干并冷凍干燥，得到膠原海綿。

區(qū)別于現(xiàn)有的膠原海綿制造工藝，本發(fā)明采用兩步法制備膠原海綿。首先，利用較低濃度的膠原溶液為原料，結(jié)合膠原纖維化和化學(xué)交聯(lián)步驟，得到具有較大空隙構(gòu)造且具有良好耐降解性能的大孔膠原海綿框架；隨后，向該大孔膠原海綿框架中導(dǎo)入高濃度膠原，填充原有大孔隙，形成致密、具有較大比表面積和良好機(jī)械強(qiáng)度的膠原海綿材料。

作為優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的大孔膠原海綿框架的孔徑大于100μm。

作為優(yōu)選方案，步驟(3)和步驟(5)中的冷凍干燥的工藝條件包括：將膠原膠或浸潤后的大孔膠原海綿框架置于-60℃條件下預(yù)凍12-24小時，隨后抽真空至絕對壓強(qiáng)2-20pa條件下干燥48-96小時，完成水分子的升華。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述第一膠原溶液的濃度為1-5mg/ml。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，調(diào)節(jié)膠原溶液ph值的方法為用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行透析。調(diào)節(jié)膠原溶液ph值時的溫度為2-6℃。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，步驟(2)中，添加戊二醛水溶液至所述第一膠原溶液中的戊二醛的濃度為0.05-0.20wt％。所述戊二醛水溶液的濃度優(yōu)選為5wt％。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述恒溫培養(yǎng)的溫度為25-40℃，靜置的時間為12-48h。

作為優(yōu)選方案，所述恒溫培養(yǎng)在水浴或恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述第二膠原溶液的濃度為8-15mg/ml。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述步驟(5)條件包括：真空度為0.08-0.1mpa，浸潤時間為0.5-2h。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述天然膠原蛋白為ⅰ型膠原蛋白。

所述天然膠原蛋白包括從哺乳動物、魚類、兩棲動物、家禽中提取、分離純化的膠原蛋白。所述天然膠原蛋白優(yōu)選為草魚魚皮的ⅰ型膠原蛋白、牛跟腱的ⅰ型膠原蛋白、豬皮ⅰ型膠原蛋白、牛蛙ⅰ型膠原蛋白等。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述第一醋酸水溶液的濃度為0.05-0.3mol/l，所述第二醋酸水溶液的濃度為0.4-0.6mol/l。

本發(fā)明的另一方面提供一種所述的具有孔隙大小自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力的膠原海綿制備方法制備的膠原海綿。

與普通膠原海綿相比，本發(fā)明的膠原海綿可以智能化的適應(yīng)不同應(yīng)用階段對材料機(jī)械性能、致密性和空隙大小的需求，能較好的滿足臨床醫(yī)學(xué)的產(chǎn)品技術(shù)要求，具有良好的應(yīng)用前景。

以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明：

實施例1

在冰浴條件下，用0.1mol/l的醋酸水溶液溶解提取自草魚魚皮的ⅰ型膠原蛋白，在4℃條件下對磷酸鹽緩沖溶液透析使膠原溶液的ph調(diào)整為7.0，得到濃度為2mg/ml的第一膠原溶液；向第一膠原溶液中添加濃度5wt％的戊二醛水溶液至所述第一膠原溶液中的戊二醛的濃度為0.1％，混合均勻后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置12小時得到纖維化并化學(xué)交聯(lián)的膠原膠；將上述膠原膠轉(zhuǎn)移至蒸餾水溶液中反復(fù)漂洗，去除未參與反應(yīng)的戊二醛，隨后冷凍干燥后得到大孔膠原海綿框架，備用(如圖1a所示)，所述大孔膠原海綿框架的孔徑大于100μm；用0.5mol/l醋酸水溶液溶解草魚膠原蛋白，得到濃度為8mg/ml的第二膠原溶液；在真空干燥器中，將大孔膠原海綿框架浸入8mg/ml的第二膠原溶液中浸潤1小時，同時抽真空，真空度為0.09mpa，脫出大孔膠原海綿框架空隙中的空氣并促進(jìn)膠原溶液導(dǎo)入，瀝干并冷凍干燥，得到初級膠原海綿；將所述初級膠原海綿再次浸入8mg/ml的第二膠原溶液中浸潤1小時，同時抽真空，真空度為0.09mpa，瀝干并冷凍干燥，得到膠原海綿(如圖1b所示)；其中，所述冷凍干燥為將膠原膠或浸潤后的大孔膠原海綿框架置于-60℃條件下預(yù)凍18小時，隨后抽真空至絕對壓強(qiáng)10pa條件下干燥72小時，完成水分子的升華。

實施例2

在冰浴條件下，用0.1mol/l的醋酸水溶液溶解提取自牛跟腱的ⅰ型膠原蛋白，在4℃條件下對磷酸鹽緩沖溶液透析使膠原溶液的ph調(diào)整為7.0，得到濃度為5mg/ml的第一膠原溶液；向第一膠原溶液中添加濃度5wt％的戊二醛水溶液至所述第一膠原溶液中的戊二醛的濃度為0.1wt％，混合均勻后置于35℃水浴中，靜置48小時得到纖維化并化學(xué)交聯(lián)的膠原膠；將上述膠原膠轉(zhuǎn)移至蒸餾水溶液中反復(fù)漂洗，去除未參與反應(yīng)的戊二醛，隨后冷凍干燥后得到大孔膠原海綿框架，備用，所述大孔膠原海綿框架的孔徑大于100μm；用0.5mol/l醋酸水溶液溶解牛跟腱膠原蛋白，得到濃度為13mg/ml的第二膠原溶液；在真空干燥器中，將大孔膠原海綿框架浸入13mg/ml的第二膠原溶液中，浸潤1小時，同時抽真空，真空度為0.09mpa，脫出大孔膠原海綿框架空隙中的空氣并促進(jìn)膠原溶液導(dǎo)入，瀝干并冷凍干燥，得到初級膠原海綿；所述初級膠原海綿再次浸入13mg/ml的第二膠原溶液中，浸潤1小時，同時抽真空，真空度為0.09mpa，瀝干并冷凍干燥，得到膠原海綿；其中，所述冷凍干燥為將膠原膠或浸潤后的大孔膠原海綿框架置于-60℃條件下預(yù)凍18小時，隨后抽真空至絕對壓強(qiáng)10pa條件下干燥72小時，完成水分子的升華。

對比例1

用0.5mol/l的醋酸水溶液溶解提取自牛跟腱的ⅰ型膠原蛋白，得到膠原濃度為13mg/ml的膠原溶液，冷凍干燥后得到未經(jīng)化學(xué)交聯(lián)處理膠原海綿(如圖1c所示)。

對比例2

用0.5mol/l的醋酸水溶液溶解提取自牛跟腱的ⅰ型膠原蛋白，得到膠原濃度為13mg/ml的膠原溶液，向膠原溶液中添加濃度為5wt％的戊二醛水溶液至所述膠原溶液中的戊二醛的濃度為0.1％，混合均勻后將膠原溶液靜置交聯(lián)12小時。得到的交聯(lián)膠原膠用蒸餾水反復(fù)漂洗去除殘留的戊二醛后冷凍干燥得到化學(xué)交聯(lián)處理的膠原海綿(如圖1d所示)。

測試?yán)?

對實施例1、對比例1、對比例2的膠原海綿產(chǎn)品和實施例1的大孔膠原海綿框架，進(jìn)行電鏡掃描，獲得各膠原海綿產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察圖。

如圖1a-圖1d所示，實施例1中采用低濃度制備得到的膠原海綿框架具有大且寬松的空隙結(jié)構(gòu)，經(jīng)過導(dǎo)入高濃度膠原溶液后，制得的膠原海綿產(chǎn)品的空隙明顯變小、致密且分布均勻，其孔隙構(gòu)造與對比例1和對比例2比較接近。

測試?yán)?

圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的實施例和對比例的膠原海綿產(chǎn)品抗拉伸實驗數(shù)據(jù)圖，其中，每組測定材料樣品數(shù)n＝3。

對實施例和對比例的膠原海綿產(chǎn)品進(jìn)行拉伸實驗。

如圖2所示，未經(jīng)化學(xué)交聯(lián)處理的對比例1樣品抗拉伸強(qiáng)度最低，而戊二醛交聯(lián)處理后的對比例2膠原樣品抗拉伸強(qiáng)度明顯提高。采用本發(fā)明方法制備得到的實施例1和實施例2膠原海綿抗拉伸強(qiáng)度接近于對比例2。

測試?yán)?

對實施例1、對比例1和對比例2制得的膠原海綿產(chǎn)品進(jìn)行體外酶降解測試實驗。

如圖3所示，由于未經(jīng)過戊二醛交聯(lián)處理，對比例1在膠原酶溶液中水解速度快而且呈現(xiàn)持續(xù)水解狀態(tài)；而對比例2由于經(jīng)過戊二醛交聯(lián)處理，雖然水解仍然呈現(xiàn)持續(xù)狀態(tài)，但水解速率明顯降低；與對比例不同，實施例1樣品呈現(xiàn)明顯的分步水解行為，在初期，水解速率較快，這是導(dǎo)入的、未交聯(lián)膠原的降解現(xiàn)象，而在后期降解速率明顯降低，這是膠原海綿框架中交聯(lián)膠原的降解行為。

測試?yán)?

對實施例和對比例進(jìn)行成纖維細(xì)胞增殖實驗，其中，成纖維細(xì)胞為鼠尾nih3t3細(xì)胞，培養(yǎng)7天，樣品數(shù)n＝8。

如圖4所示，與對比例相比，實施例1和實施例2的促細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)(p＜0.01)，說明該制備方法具有明顯的效果。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。