本發(fā)明涉及一種醫(yī)用止血凝膠敷料的制備方法，屬于醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

因戰(zhàn)爭、交通意外、運(yùn)動(dòng)或疾病等因素而引起機(jī)體出現(xiàn)各種表皮或組織創(chuàng)傷而出血。近年很多研究表明，臨床上死于失血過多的病人占很大的比例，因此制備一種能快速止血而又不與組織粘連的止血材料，為了后期的搶救和治療贏得時(shí)間，是一項(xiàng)亟待解決的問題。

目前用于創(chuàng)傷的理想敷料的主要特性一般為：無毒、不敏感、不過敏；與傷口處貼合緊密，并具有良好的吸濕特性，能維持傷口與敷料接合面環(huán)境潮濕；不要求經(jīng)常進(jìn)行更換；微生物不能透過；性價(jià)比高；提供良好的機(jī)械防護(hù)能力且與傷口不易粘附等。水凝膠是一種富含水分的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，廣泛應(yīng)用于組織工程及藥物緩釋等領(lǐng)域。相比于其他材料，水凝膠作為止血材料有著貼合性好、抗感染等優(yōu)點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)水凝膠由于缺乏孔道結(jié)構(gòu)而使其止血效果差、透氣性不佳等缺點(diǎn)。

類人膠原蛋白（lhc）是通過發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。它具有良好的細(xì)胞黏附性、促新細(xì)胞形成、加工性能好、無病毒隱患、水溶性好（避免了酸堿溶劑殘留帶來的細(xì)胞毒性）、排異反應(yīng)低等特性的一種良好的植入性醫(yī)療器械用生物材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對市場上止血材料的透氣性差、易粘連傷口等缺陷，制備出了一種可快速止血且不會與組織粘連的新型醫(yī)用止血凝膠敷料，該方法工藝簡單，制備的材料生物相容性良好，有望廣泛用于戰(zhàn)時(shí)急救包、臨床手術(shù)止血等。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種新型醫(yī)用止血凝膠敷料的制備方法：將水溶性大分子蛋白質(zhì)類人膠原蛋白（lhc）溶于水，再加入質(zhì)量比為1:3-3:1的復(fù)合交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的水溶液以及無機(jī)鹽水溶液混合均勻，并調(diào)節(jié)溶液ph值為2-5.5，置于水浴環(huán)境中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)得含鹽水凝膠；對交聯(lián)后的含鹽水凝膠進(jìn)行高壓蒸汽處理和蒸餾水浸泡洗滌，除去無機(jī)鹽和殘留的單體交聯(lián)劑，并進(jìn)行干燥和co-60滅菌處理，即獲得一種新型醫(yī)用止血凝膠敷料。

上述類人膠原蛋白溶液的濃度為50-400mg/ml。

所述的無機(jī)鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸氫鈉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鉀、氯化鉀，無機(jī)鹽水溶液濃度為10-350mg/ml，無機(jī)鹽水溶液加入體積與蛋白溶液體積的比為1:2-1:20。

所述交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物溶液和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷溶液的質(zhì)量百分比濃度均為0.1-5.0%，優(yōu)選0.5-2.0%，體積均為蛋白溶液體積的1-20%，優(yōu)選5-10%。

上述反應(yīng)液酸堿度用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)控其ph值為2-5.5；交聯(lián)反應(yīng)的溫度可為40-80℃，保持時(shí)間0.5-5h，優(yōu)選1-3h。

上述兩次高壓蒸汽處理和蒸餾水浸泡洗滌中，第一次將樣品在110-121℃下保持時(shí)間5-30min，優(yōu)選保持時(shí)間10-20min，然后超純水浸泡洗滌2-5天；第二次將樣品在110-121℃保持1-3h，優(yōu)選保持時(shí)間1.5-2.5h，然后超純水浸泡洗滌1-3天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g。

所述新型醫(yī)用止血凝膠敷料的干燥方法可為真空冷凍干燥法或超臨界二氧化碳干燥法。

上述交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物依據(jù)文獻(xiàn)（catalyticreactionsinvolvingc1feedstocks:newhigh-activityzn(ii)-basedcatalystsforthealternatingcopolymerizationofcarbondioxideandepoxides,j.am.chem.soc.1998,120,11018-11019.）的方法合成獲得，其分子式如圖1所示。

本發(fā)明醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的形成機(jī)理：蛋白質(zhì)分子含有豐富的羧基和氨基，為分子間交聯(lián)提供了兩種好的功能基團(tuán)。β-二亞胺鋅配合物分子內(nèi)螯合鋅的空軌道可與蛋白分子中的氨基形成配位鍵，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分子間交聯(lián)。β-二亞胺鋅配合物對環(huán)氧烷基具有不對稱開環(huán)催化功能，可加速1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的分子兩端環(huán)氧烷基開環(huán)并與蛋白分子中的羧基形成共價(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分子間交聯(lián)。故通過β-二亞胺鋅配合物對1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的開環(huán)催化，及兩種交聯(lián)劑對蛋白質(zhì)的分子間不同基團(tuán)間的雙交聯(lián)作用，有效實(shí)現(xiàn)和強(qiáng)化了水溶性蛋白分子間的交聯(lián)。無機(jī)鹽的加入，有效地破壞了水溶性蛋白質(zhì)的分子外水化膜，促進(jìn)了交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)反應(yīng)，此外適量無機(jī)鹽還兼扮演了成孔劑作用，進(jìn)一步優(yōu)化了水凝膠的成孔效果。

本發(fā)明利用類人膠原蛋白為主要原料通過雙交聯(lián)劑的協(xié)同共交聯(lián)作用制備了一種新型超多孔水凝膠。該水凝膠材料具有超多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率高、貫通性好且孔徑尺寸合理，能夠快速吸收血液中的水分而不吸入細(xì)胞，從而促進(jìn)血細(xì)胞凝集實(shí)現(xiàn)快速止血。該水凝膠材料具有良好的生物相容性和良好的孔道貫通性，保障了傷口透氣性，有助于促進(jìn)傷口愈合。該水凝膠材料表面相比于傳統(tǒng)的紗布或止血海綿，粗糙度較小，不易粘連；孔道良好的貫通性使得給藥非常方便；而材料較小的孔徑還能夠防止傷口感染。本發(fā)明所制備的新型醫(yī)用止血凝膠敷料可望用于戰(zhàn)時(shí)急救包、臨床手術(shù)止血等領(lǐng)域。

本發(fā)明還具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）本發(fā)明制備的止血材料能明顯縮短止血時(shí)間，這對創(chuàng)傷或術(shù)后恢復(fù)至關(guān)重要；（2）本發(fā)明制備的材料透氣性良好且具有抗菌性能，不會引起傷口感染；（3）此外，本發(fā)明制備的止血材料在完成止血后不會粘連傷口，這明顯的減小了患者的痛苦；（4）本發(fā)明制備的材料具有多孔結(jié)構(gòu)，使得給藥補(bǔ)藥非常方便。

附圖說明

圖1為合成的β-二亞胺鋅配合物的分子結(jié)構(gòu)圖；

圖2為實(shí)施例1所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料樣品的外觀圖；

圖3為實(shí)施例1所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料樣品的sem圖；

圖4為實(shí)施例1所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的透氣性考察圖；

圖5為實(shí)施例1所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料對兔耳動(dòng)脈和肝臟止血效果圖；

圖6為實(shí)施例1所使用的兩種商品化品牌的止血海綿對兔肝臟的止血效果圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的制備

步驟一：將水溶性類人膠原蛋白hlc溶于10ml蒸餾水得到濃度為100mg/ml的溶液，加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各1ml，再加入10mg/ml的kcl2ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph為4.5；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在50℃環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于121℃保持20min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持2h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品。

步驟四：將驟三中的濕凝膠在-80℃預(yù)凍3h后進(jìn)行真空冷凍干燥并進(jìn)行co-60輻照滅菌后即得到無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料成品。

對本實(shí)例中制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料進(jìn)行物化性質(zhì)表征，圖2為實(shí)施例1所制備的止血凝膠敷料凍干樣品的外觀照片，可以看出其外觀上呈不透明乳白色，表面質(zhì)地較為光滑，呈多孔結(jié)構(gòu)；圖3為制備的多孔水凝膠止血敷料的掃描電鏡（sem）圖。sem圖顯示止血敷料內(nèi)部呈為多孔結(jié)構(gòu)，孔壁為球形顆粒相互粘連而成，孔徑一般在幾十納米到幾個(gè)微米不等，孔結(jié)構(gòu)較為均勻且致密貫通。

將制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料塊置于注射器上固定的過濾裝置內(nèi)，向注射器內(nèi)吸滿5ml空氣后進(jìn)行擠壓注射器進(jìn)行空氣過濾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)過程中幾乎沒有阻力，注射器的推桿可輕松的推到底部。注射器擠壓空氣過濾實(shí)驗(yàn)展示了止血敷料的透氣性，如圖4所示，說明止血材料內(nèi)部的孔結(jié)構(gòu)是相互貫通的。該材料具有良好的透氣性和防粘連特性，若將抗菌藥物可直接通過材料直接添加并緩慢的釋放到傷口，故可在止血的過程中不會因?yàn)橥笟庑砸饌诟腥?，同樣傷口也不會因?yàn)殚L時(shí)間浸泡而潰爛。

本實(shí)例中制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料彈性好，抗壓縮能力強(qiáng)（最大壓縮應(yīng)變和壓縮應(yīng)力分別約為68.9%和5.6mpa），溶脹速率高(8s基本達(dá)到溶脹平衡)，孔隙率約為85.4%；細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示本實(shí)例中所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料具有良好的生物相容性，無細(xì)胞毒性。

實(shí)施例2醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的制備

步驟一：將水溶性類人膠原蛋白hlc溶于10ml蒸餾水得到濃度為100mg/ml的溶液，加入濃度均為2%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各1ml，再加入10mg/ml的na2so4溶液2ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph為4；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在60℃水浴環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于110℃保持20min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)110℃保持2h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，除去殘留交聯(lián)劑，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品。

步驟四：將驟三中的濕凝膠在-80℃預(yù)凍3h后進(jìn)行真空冷凍干燥并進(jìn)行co-60輻照滅菌后即得到無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料成品。

該實(shí)施例中所得的無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料與實(shí)施例1中所得的醫(yī)用止血凝膠敷料理化性質(zhì)和生物學(xué)性能相似。

實(shí)施例3醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的制備

步驟一：將水溶性類人膠原蛋白hlc溶于20ml蒸餾水得到濃度為200mg/ml的溶液，加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各4ml，再加入10mg/ml的nah2po4溶液2ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph為5.5；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在70℃環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于121℃保持20min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌4天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持3h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌1天，除去殘留交聯(lián)劑，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品；

步驟四：超臨界二氧化碳干燥法干燥步驟三中的濕凝膠，制備獲得超多孔干凝膠樣品，對干樣品進(jìn)行co-60輻照滅菌，即可得到無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料成品。

該實(shí)施例中所得的無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料與實(shí)施例1中所得的醫(yī)用止血凝膠敷料理化性質(zhì)和生物學(xué)性能相似。

實(shí)施例4醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的止血實(shí)驗(yàn)

選取新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立兔耳創(chuàng)傷出血和肝臟創(chuàng)傷出血模型，并選用本發(fā)明實(shí)例1中所得的止血凝膠敷料與市場上a、b兩種品牌的止血海綿進(jìn)行止血對比試驗(yàn)。

圖5展示了對本發(fā)明實(shí)例1中制得的無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料對兔耳止血（a-c）和肝臟止血(d-f)的效果，由圖可以明顯的看到材料止血后不僅未滲透，且未與組織未發(fā)生粘連。采用主流的a、b兩種品牌的止血海綿進(jìn)行肝臟止血對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，可以看出所選的兩種品牌止血材料基本已經(jīng)完全被出血滲透且需要的止血時(shí)間更長。實(shí)驗(yàn)的過程中表明實(shí)例1中所制備的無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料對兔耳和肝臟的止血時(shí)間分別為20-30s和30-40s，而選取的a、b兩種品牌止血海綿對兔肝臟的止血時(shí)間約為80-90s。

上述結(jié)果表明本發(fā)明制備的止血凝膠具有優(yōu)異的止血功能，主要?dú)w因于該材料的孔隙率高，孔徑均一且貫通性好，能夠快速吸收血液中的水分，使血液中的血細(xì)胞凝結(jié)在材料表面，堵住破裂血管，實(shí)現(xiàn)快速止血，促進(jìn)傷口愈合，特別適用于手術(shù)過程中造成的滲透性出血及動(dòng)脈破裂造成的大量出血。此外，由于材料本身孔徑小，因而還具有抑菌抗菌和防止傷口感染的特性。

本發(fā)明的內(nèi)容不限于上述實(shí)施案例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，不改變基本原理的調(diào)整均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。