本發(fā)明涉及一種中藥材制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的制備方法。
背景技術(shù)：
絞股藍(lán)（gynostemmapentaphyllum(thunb.)makino）為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生藤本植物的干燥全草，主要分布于我國(guó)南部，號(hào)稱“南方人參”，1986年被國(guó)家科委列為待開(kāi)發(fā)的首位“名貴中藥材”，2003年被國(guó)家衛(wèi)生部列入保健品名單?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，絞股藍(lán)具有降低血脂、降血壓、防止衰老、抑制腫瘤、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，這些藥理作用主要是由絞股藍(lán)中的有效活性成分產(chǎn)生的。研究表明，絞股藍(lán)全草中含有絞股藍(lán)皂苷、絞股藍(lán)多糖、黃酮類、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和纖維素等，其中的主要活性成分為皂苷類、多糖類和黃酮類。目前，研究證實(shí)的絞股藍(lán)皂苷多達(dá)84種，其中有6種的結(jié)構(gòu)和人參皂苷相同，且在優(yōu)良體系絞股藍(lán)中，這6種皂苷的含量均高于人參。除此之外，很多絞股藍(lán)皂苷水解產(chǎn)生的次生苷，苷元和次級(jí)苷元和人參皂苷水解產(chǎn)物相同。所以，絞股藍(lán)號(hào)稱“南方人參”。
絞股藍(lán)皂苷的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)是達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類，c3位和c20位羥基上多半連接糖鏈，主要由β-d-葡萄吡喃糖、α-l-鼠李吡喃糖和β-d-木吡喃糖組成，亦有少數(shù)的α-l-阿吡喃糖，現(xiàn)在的研究主要集中在皂苷、苷元的分離和活性研究上，對(duì)皂苷側(cè)鏈上的糖鏈研究甚少。
絞股藍(lán)總皂苷的提取方法已有很多文獻(xiàn)及專利報(bào)道，如cn201410481903.6報(bào)道了一種從絞股藍(lán)中提取純化絞股藍(lán)皂苷的方法，cn103923150b報(bào)道了絞股藍(lán)皂苷及其制備方法。然而，已有的報(bào)道中沒(méi)有對(duì)其側(cè)鏈寡糖進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的制備方法。
本方案中一種絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的制備方法，包括以下步驟：
（1）將絞股藍(lán)低溫干燥后粉碎成粉末，過(guò)篩形成絞股藍(lán)粉末，將絞股藍(lán)粉末和去離子水按重量比1：40～60的比例混合后超聲波加熱進(jìn)行提取，提取結(jié)束后，澄清，過(guò)濾得到濾液；
（2）在步驟（1）的濾液中放入硅藻土進(jìn)行抽濾，得到澄清的溶液，將溶液濃縮后得濃縮液；
（3）將步驟（2）中濃縮液通過(guò)預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，用水洗脫至無(wú)色，再使用70～90%的乙醇洗脫，得到乙醇洗脫液；
（4）將步驟（3）中乙醇洗脫液濃縮，然后冷凍得絞股藍(lán)總皂苷樣品；
（5）取步驟（4）中絞股藍(lán)總皂苷樣品于反應(yīng)瓶中，用去離子水配制成含絞股藍(lán)總皂苷1%的溶液，然后在溶液中加入三氯乙酸，隨后通入氮?dú)?，密封后放入干燥箱中加熱水解，水解結(jié)束后取出，迅速冰浴降溫，然后在降溫后的水解液中加入氨水調(diào)節(jié)ph值至6.5～8；
（6）取步驟（5）中水解液，濃縮后使用預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂吸附，用水洗脫至無(wú)糖分出現(xiàn)，收集水洗脫液，將其濃縮、冷凍后得到絞股藍(lán)總皂苷側(cè)鏈寡糖。
本發(fā)明的工作原理及有益效果：本發(fā)明的工作原理是利用超聲波加熱水提后獲得絞股藍(lán)總皂苷粗提物，水提液含有大量糖類、黃酮類及植物色素類等雜質(zhì)，需要使用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)皂苷類物質(zhì)進(jìn)行純化。純化時(shí)，利用皂苷極性較小的性質(zhì)，使用高濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，大孔樹(shù)脂可以選擇d101，ab-8，nka-
具體體現(xiàn)在：（1）水提絞股藍(lán)時(shí)，加入穩(wěn)定劑檸檬酸鈉及乙二胺四乙酸混合溶液，避免提取液中皂苷類物質(zhì)絮凝成不定性沉淀或膠體，影響皂苷產(chǎn)率。（2）大孔樹(shù)脂吸附之前先通過(guò)硅藻土，吸附懸浮的微小雜質(zhì)，可以提高大孔吸附樹(shù)脂的吸附效率及產(chǎn)物純度。（3）使用凍干技術(shù)除掉濃縮物中的水分，除水率高，能除掉95～99%的水分，且干燥后的物質(zhì)疏松多孔，加溶劑后可迅速溶解，不影響化合物本身的性質(zhì)。（4）選擇三氯乙酸對(duì)絞股藍(lán)總皂苷進(jìn)行水解，相比三氟乙酸，價(jià)格便宜且易得，水解效率相當(dāng)。密封水解，水解效率高，水解之前通入氮?dú)?，避免氧氣和二氧化碳在高溫下影響水解反?yīng)，提高絞股藍(lán)總皂苷側(cè)鏈寡糖的得率。（5）選擇大孔樹(shù)脂對(duì)寡糖進(jìn)行純化，絞股藍(lán)側(cè)鏈寡糖能溶于水，收集水洗脫液富集后即得最終產(chǎn)物，且純度較高。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于絞股藍(lán)總皂苷的提取溶劑為水，溶劑成本小，無(wú)毒易獲取，藥材粉碎后加熱超聲波提取，提取時(shí)間在15～45min，大大降低提取時(shí)間，提高工作效率，縮短絞股藍(lán)總皂苷的生產(chǎn)周期；硅藻土抽濾后吸附，提高吸附效果及收率，密封加熱水解，提高水解效率，冷凍干燥技術(shù)增強(qiáng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。
進(jìn)一步細(xì)化的，所述步驟（1）的干燥溫度為35～45℃，粉碎粒徑為50～300目，提取溶劑為去離子水，超聲波功率為15～25w，熱提溫度為75～85℃，提取時(shí)間15～45min。選擇35～45℃對(duì)藥材進(jìn)行干燥，避免有效成分在高溫下變性或部分揮發(fā)性物質(zhì)受熱揮發(fā)，將藥材粉碎后超聲波，可以加速絞股藍(lán)中有效成分的溶出，70～300目的粒徑，能保證較短時(shí)間內(nèi)有效成分的較快溶出，粒徑越小，溶出度越高，但過(guò)濾難度越大。超聲波提取相對(duì)于浸提或回流提取，提取時(shí)間短，提取效率高，加熱促進(jìn)絞股藍(lán)有效成分的溶出。提取溶劑為水溶劑，獲取簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，不污染環(huán)境。
作為上述方案的優(yōu)選，所述步驟（1）的超聲波功率為20w，熱提溫度為85℃，提取時(shí)間30min。該超聲波提取操作下，寡糖的收率最高，基本在1.3%以上。
又進(jìn)一步細(xì)化的，所述步驟（2）的硅藻土抽濾具體步驟為：將2層潤(rùn)濕的定性濾紙置于玻璃砂芯漏斗上，打開(kāi)水泵，濾紙吸附在漏斗上，加入1～2cm厚的硅藻土，鋪勻，再加去離子水潤(rùn)濕后即可加樣。使用硅藻土抽濾可以將過(guò)濾后溶液中存在的懸浮微小雜質(zhì)進(jìn)行篩分及吸附，提高大孔吸附樹(shù)脂的吸附效率及產(chǎn)物純度。
再一步細(xì)化的，所述步驟（3）的大孔樹(shù)脂預(yù)處理方法為95%乙醇浸泡24h后裝柱，用95%乙醇洗至流出液與水1：5不渾濁，用去離子水洗至無(wú)醇味，再用5%hcl通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2～4h后去離子水洗至中性，再使用2%naoh通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2～4h后去離子水洗至中性，即得處理好的大孔樹(shù)脂。使用前，對(duì)大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理，除掉內(nèi)的分散劑、致孔劑、殘留雜質(zhì)等，提高吸附效率。
再進(jìn)一步細(xì)化的，所述步驟（3）的濃縮為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋轉(zhuǎn)溫度為40～50℃，轉(zhuǎn)速為100～180rpm，濃縮體積為20～50ml，冷凍方法為-80℃冰箱冷凍8～12h，凍干方法為冷凍干燥機(jī)中24～72h。使用凍干技術(shù)除掉濃縮物中的水分，除水率高，能除掉95～99%的水分，且干燥后的物質(zhì)疏松多孔，加溶劑后可迅速溶解，不影響化合物本身的性質(zhì)。相對(duì)于蒸干、煮干、真空干燥來(lái)說(shuō)，冷凍干燥不改變化合物的性質(zhì)，干燥前后化合物體積、性狀基本不變，能很好保護(hù)易氧化物質(zhì)，干燥度高，能長(zhǎng)期保存。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明：
實(shí)施例1：一種絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的制備方法，包括以下3個(gè)步驟：
步驟一、絞股藍(lán)活性成分的提取
取中藥絞股藍(lán)全草低溫干燥，粉碎過(guò)篩，粉碎粒徑為100目，將20g絞股藍(lán)粉末和800ml去離子水混合均勻，調(diào)節(jié)超聲波溫度為85℃，頻率為20w，提取30min；提取結(jié)束后，靜置澄清，過(guò)濾，收集濾液；將2層潤(rùn)濕的定性濾紙置于玻璃砂芯漏斗上，打開(kāi)水泵，讓濾紙緊緊地吸附在漏斗上，加入2cm厚的硅藻土，鋪勻，再加少量去離子水潤(rùn)濕后，將濾液抽濾；將澄清的濾液轉(zhuǎn)入500ml圓底燒瓶，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸，旋轉(zhuǎn)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為180rpm，旋轉(zhuǎn)至溶液體積約40ml。
步驟二、絞股藍(lán)皂苷的分離純化
使用95%乙醇浸泡d101型大孔樹(shù)脂24h后濕法裝柱，用95%乙醇洗至流出液與去離子水1：5不渾濁，再用去離子水洗至流出液無(wú)醇味，再用5%hcl通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2h后去離子水洗至中性，再使用2%naoh通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2h后去離子水洗至中性；將大孔樹(shù)脂柱中溶液放出，至溶液離大孔樹(shù)脂上層約1cm時(shí)停止放液，將上述步驟中濃縮液小心轉(zhuǎn)入大孔樹(shù)脂柱上層，輕輕攪動(dòng)濃縮液至濃縮液表面平整；用去離子水洗脫，洗脫至流出液呈無(wú)色，再用70～90%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至流出液呈無(wú)色，收集乙醇洗脫液；洗脫結(jié)束后，回收大孔樹(shù)脂，將收集的乙醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為40℃，轉(zhuǎn)速為120rpm，濃縮體積為20ml；將濃縮后的溶液放至-80℃冰箱冷凍8h后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中48h，得到絞股藍(lán)總皂苷，收率為3.89%。移入4℃樣品柜中保存。
步驟三、絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的提取純化
取1g絞股藍(lán)總皂苷樣品于500ml帶蓋反應(yīng)瓶中，加入100ml去離子水，加入15ml三氯乙酸混合均勻后，向反應(yīng)瓶中通入氮?dú)?min，通氣結(jié)束后立刻蓋緊瓶蓋，放入已升溫的干燥箱中水解，干燥箱溫度為120℃，水解時(shí)間12h。水解結(jié)束后取出反應(yīng)瓶，冰浴迅速降溫；然后加入氨水溶液調(diào)節(jié)水解液ph值至7.0，取活化后的薄層色譜板，用毛細(xì)管吸取水解液，在板上點(diǎn)樣，重復(fù)點(diǎn)樣3次，用展開(kāi)劑展開(kāi)點(diǎn)樣后干燥的色譜板，展開(kāi)劑為正丁醇：乙酸乙酯：水=4:1:5的上層溶液，展開(kāi)結(jié)束后用硫酸：甲醇=1:1的顯色劑顯色，觀察斑點(diǎn)的數(shù)量及位置，判斷絞股藍(lán)總皂苷上側(cè)鏈寡糖的水解；將水解成功的水解液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為180rpm，濃縮體積約為40ml，將濃縮液通過(guò)預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，洗脫液為去離子水，至洗脫液無(wú)糖分出現(xiàn)為止；洗脫結(jié)束后回收大孔樹(shù)脂，大孔樹(shù)脂的處理回收方法同步驟（2）；收集水洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為180rpm，濃縮體積約為20ml；將濃縮液放至-80℃冰箱冷凍12h后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中72h，得到絞股藍(lán)總皂苷側(cè)鏈寡糖，移入4℃樣品柜中保存。
絞股藍(lán)總皂苷側(cè)鏈寡糖的收率為1.48%。
實(shí)驗(yàn)對(duì)照
實(shí)施例2：一種絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的制備方法
步驟一、絞股藍(lán)活性成分的提取
取中藥絞股藍(lán)全草低溫干燥，粉碎過(guò)篩，粉碎粒徑為50目，將20g絞股藍(lán)粉末和800ml去離子水混合均勻，調(diào)節(jié)超聲波溫度為80℃，頻率為25w，提取45min；提取結(jié)束后，靜置澄清，過(guò)濾，收集濾液；將澄清的濾液轉(zhuǎn)入500ml圓底燒瓶，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸，旋轉(zhuǎn)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為180rpm，旋轉(zhuǎn)至溶液體積約40ml。
步驟二、絞股藍(lán)皂苷的分離純化
將上述步驟中濃縮液小心轉(zhuǎn)入預(yù)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂柱上層（大孔樹(shù)脂預(yù)處理方法同實(shí)施例1），輕輕攪動(dòng)濃縮液至濃縮液表面平整。用去離子水洗脫，洗脫至流出液呈無(wú)色，再用70～90%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集乙醇洗脫液；洗脫結(jié)束后，回收大孔樹(shù)脂，將收集的乙醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為40℃，轉(zhuǎn)速為100rpm，濃縮體積為20ml；將濃縮后的溶液放至-80℃冰箱冷凍10h后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中72h，得到絞股藍(lán)總皂苷，收率為3.06%。移入4℃樣品柜中保存。
步驟三、絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的提取純化
取1g絞股藍(lán)總皂苷樣品于500ml帶蓋反應(yīng)瓶中，加入100ml去離子水，加入15ml三氯乙酸混合均勻后，放入已升溫的干燥箱中水解，干燥箱溫度為110℃，水解時(shí)間18h；水解結(jié)束后取出反應(yīng)瓶，冰浴迅速降溫，然后加入氨水溶液調(diào)節(jié)水解液ph值至7.0；用薄層色譜法鑒定寡糖，方法同實(shí)施例1。將水解成功的水解液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為45℃，轉(zhuǎn)速為120rpm，濃縮體積約為40ml，將濃縮液通過(guò)預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，洗脫液為去離子水，至洗脫液無(wú)糖分出現(xiàn)為止；洗脫結(jié)束后回收大孔樹(shù)脂，收集水洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為120rpm，濃縮體積約為30ml；將濃縮液放至-80℃冰箱冷凍18h后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中48h，得到絞股藍(lán)總皂苷側(cè)鏈寡糖，移入4℃樣品柜中保存。
寡糖收率為1.05%。
實(shí)施例3：一種絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的制備方法
步驟一、絞股藍(lán)活性成分的提取
取中藥絞股藍(lán)全草低溫干燥，粉碎過(guò)篩，粉碎粒徑為50目，將20g絞股藍(lán)粉末和400ml75%乙醇混合均勻，調(diào)節(jié)超聲波溫度為50℃，頻率為25w，提取15min；提取結(jié)束后，靜置澄清，過(guò)濾，收集濾液；將澄清的濾液轉(zhuǎn)入500ml圓底燒瓶，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸，旋轉(zhuǎn)溫度為40℃，轉(zhuǎn)速為120rpm，旋轉(zhuǎn)至溶液體積約20ml。
步驟二、絞股藍(lán)皂苷的分離純化
將上述步驟中濃縮液小心轉(zhuǎn)入預(yù)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂柱上層（大孔樹(shù)脂預(yù)處理方法同實(shí)施例1），輕輕攪動(dòng)濃縮液至濃縮液表面平整。用去離子水洗脫，洗脫至流出液呈無(wú)色，再用70～90%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫至流出液呈無(wú)色，收集乙醇洗脫液；洗脫結(jié)束后，回收大孔樹(shù)脂，將收集的乙醇洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為40℃，轉(zhuǎn)速為120rpm，濃縮體積為20ml；將濃縮后的溶液放至-80℃冰箱冷凍12h后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中48h，得到絞股藍(lán)總皂苷，收率為4.91%，移入4℃樣品柜中保存。
步驟三、絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈寡糖的提取純化
取1g絞股藍(lán)總皂苷樣品于500ml帶蓋反應(yīng)瓶中，加入100ml去離子水，加入15ml三氯乙酸混合均勻后，放入已升溫的干燥箱中水解，干燥箱溫度為125℃，水解時(shí)間24h；水解結(jié)束后取出反應(yīng)瓶，冰浴迅速降溫，然后加入氨水溶液調(diào)節(jié)水解液ph值至7.0；用薄層色譜法鑒定寡糖，方法同實(shí)施例1。將水解成功的水解液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為40℃，轉(zhuǎn)速為120rpm，濃縮體積約為30ml，將濃縮液通過(guò)預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，洗脫液為去離子水，至洗脫液無(wú)糖分出現(xiàn)為止。洗脫結(jié)束后回收大孔樹(shù)脂，收集水洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，旋轉(zhuǎn)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為120rpm，濃縮體積約為20ml；將濃縮液放至-80℃冰箱冷凍24h后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中48h，得到絞股藍(lán)總皂苷側(cè)鏈寡糖，移入4℃樣品柜中保存。
寡糖收率為1.25%。
實(shí)施例1~3對(duì)比如下表
綜合上述分析，在實(shí)施例1的操作條件下，寡糖的收率最高。
以上所述的僅是本發(fā)明的實(shí)施例，方案中公知的具體結(jié)構(gòu)及特性等常識(shí)在此未作過(guò)多描述。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明結(jié)構(gòu)的前提下，還可以作出若干變形和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些都不會(huì)影響本發(fā)明實(shí)施的效果和專利的實(shí)用性。本申請(qǐng)要求的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以其權(quán)利要求的內(nèi)容為準(zhǔn)，說(shuō)明書(shū)中的具體實(shí)施方式等記載可以用于解釋權(quán)利要求的內(nèi)容。